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PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。下面是我整理的关于pcr技术论文，希望你能从中得到感悟!

技术的研究进展

摘要 PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点，已被广泛地应用于水产、微生物检测等许多领域。该文从PCR技术的原理及应用方面进行了综述，并对其发展做出了展望。

关键词 PCR技术;研究进展;应用

中图分类号 Q819 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2012)10-0047-02

PCR(polymerase chain reaction，PCR)即聚合酶链式反应，它是一种体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。1985年，美国Karray等学者首创了PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2-3]。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR(mutiplex PCR)技术[4]、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术[5]、单分子PCR技术[6]。

1 PCR技术原理

PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列、人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94 ℃的条件下变性解链;第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55 ℃退火;第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链[7]。经过这个循环后，合成了新链，可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物的量以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00万~200万倍[1]。PCR反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生。

2 PCR技术的分类

在传统PCR技术的基础上，根据人们的需要以及各个领域的应用要求，又衍生出很多种类的PCR技术。新技术在各领域广泛应用并逐渐改进，为进一步的研究提供了基础。

实时荧光定量PCR技术

1996年，学者经过研究，在传统PCR技术的基础上，首创了实时荧光定量PCR技术，新技术已经应用至医学领域、分子生物学和其他基础研究领域。实时荧光定量PCR技术基于传统技术的优势，还具有实时性、准确性、无污染，实现了自动化操作和多重反应，是PCR技术研究史上从定性到定量的飞跃[8]。

荧光定量PCR技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助于荧光信号，累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[9]。实时监测这一特点是常规PCR技术所不具有的，因为其对扩增反应不能进行随时的检测。常规PCR技术的扩增终产物需要在凝胶电泳等条件下才能进行，无法对起始模板进行准确的定量，而荧光定量PCR技术的反应进程可以根据荧光信号的变化做出准确的判断[10-11]。一个PCR循环反应结束之后，定量PCR仪可以收集1个荧光强度信号，荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化情况，这样就可以得到1条荧光扩增曲线[12]。荧光信号在指数扩增阶段，PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，然后进行定量分析[13]。

多重PCR技术

多重PCR(mutiplex PCR)技术是PCR技术的一种，为同一管中加入多对特异性引物，与PCR管内的多个模板反应，在一个PCR管中同时检测多个目标DNA分子。多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段[14]。

在同一反应体系中，多重PCR技术进行多个位点的特异性扩增时，引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面，如果能选择适宜的反应体系和反应条件，可极大地提高多重PCR的扩增效果[15]。主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提质量也影响多重PCR扩增效率，如DNA抽提不干净或降解都将影响PCR扩增效果[16]。

单分子PCR技术(SM-PCR)

单分子PCR技术是在传统PCR技术的基础上发展的，基本循环过程相同，但在反应条件、模板数量、DNA 聚合酶选择、引物设计方面具有不同点。该技术是以少量或单个DNA分子为模板进行的PCR[17]。

单分子PCR技术反应中，DNA 模板浓度极低，这就要求模板有较高的质量。因为这是试验成败的决定性因素。在设计引物时，应该严格控制GC的含量和Tm值，同时尽量避免引物间存在可配对序列。在反应混合物模板数极低的情况下，若引物之间存在少量配对序列，扩增时极易形成二聚体，使反应无法进行，得不到所需要的产物[18]。由于单分子PCR技术反应的变性温度(96~98 ℃)大多比常规PCR技术(94 ℃)略高，因而对DNA 聚合酶热稳定性的要求也更加严格，需要有较好的热稳定性，以防止温度过高而使其失活。其变性时间(5~15 s)、退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术[17]。

3 PCR技术的应用

PCR技术在水产上的应用

基因表达是检测某个基因在不同发育期或不同组织中的表达量变化，或受到某种试验处理过程中的影响而出现表达量变化的情况。有学者应用real-time PCR技术研究碳水化合物含量对翘嘴红鲴糖代谢酶G6Pase、GK以及PEPCK表达量的影响[19-21]，研究结果可为翘嘴红鲴饲料配方中的最合适糖含量提供理论依据。孙淑娜等[22]研究叶酸拮抗剂对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响，表明叶酸拮抗剂对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。Sawyer et al[23]以斑马鱼的未受精卵、胚胎、仔鱼和成鱼为研究材料，采用实时荧光定量PCR技术，检测了P450aromA和P450aromB在不同组织的表达量，表明在各组织中均有2种基因的表达，但表达量显著不同，呈现组织特异性。

PCR技术在微生物检测上的应用

1990年，Bej et al[24]在利用多重PCR的方法检测了Leg-ionella类菌种和大肠类细菌，其结果是通过点对点方法固定的多聚dT尾捕捉探针和生物素标记的扩增DNA进行杂交来检测的。张志东等检测口蹄疫病毒(FMDV)持续性感染的带毒动物，表明实时荧光定量PCR技术具有快速检测、准确、客观等优势，较优于传统的检测方法[25-26]。Metzger-Boddien et al[27]对PCR-ELISA的方法进行了评价，结果显示，样品中沙门氏菌的检出率可以达到98%。

4 展望

传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来，已被广泛应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进与完善，荧光定量PCR技术将会逐渐完善并广泛应用。多重PCR技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中具有重要作用;未来的研究主要集中在去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面，其次是整合应用多重PCR与其他技术，必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景。

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PCR是分子生物学的关键技术，又是常规技术。它的出现极大地推动了分子生物学的发展，旋即被迅速推广并应用到生命科学的各个领域。 关键词：PCR、发展简史、基本原理、基本操作、主要应用 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）是体外扩增DNA序列的技术。它与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个分子生物学实验工作的基础。在这三种技术中，PCR方法理论上出现最早，实践中应用也最广泛。PCR技术使对微量的核酸（DNA或RNA）操作变得简单易行，同时还可以使核酸研究脱离活体生物。PCR技术的发明是分子生物学的一项革命，它极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。 PCR技术发展简史 人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。 1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。 但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学 分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。 PCR技术的基本原理和操作 1. PCR的基本原理 PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。 2. PCR的基本成分 PCR包括7种基本成分：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子。 模板DNA：包括基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、预先扩增的DNA、cDNA和mRNA分子等几乎所有形式的DNA和RNA都能成为PCR技术反应的模板。除此之外，PCR反应还可以直接以细胞为模板。 特异性引物：是一段与模板DNA链结合的寡核苷酸片段，对于DNA的扩增起到引发的作用。 热稳定DNA聚合酶：这是PCR技术实现自动化的关键。热稳定DNA聚合酶是从两类微生物中分离的：一类是嗜热和高度嗜热的真细菌，另一类是嗜热古细菌。现在又出现了一种兼顾了几种DNA聚合酶特点的混合型酶。 脱氧核苷三磷酸（dNTP）：是DNA合成的原料，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。 二价阳离子：常用到Zn2+和Mg2+,作为构成热稳定性DNA聚合酶的成分之一。 缓冲液：一般使用Tris-Cl缓冲液，标准的为10mmol/L,并将其调节到之间。 一价阳离子：一般使用50mmol/L的KCl溶液，有利于改善扩增的产物质量。 PCR的基本操作 PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。PCR技术的基本反应由三个步骤组成： 1. 变性：通过加热使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除； 2. 退火：将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合； 3. 延伸：将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成DNA链延伸。 以上三部为一个循环，新合成的DNA分子又可以作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的。 PCR的主要应用 最初建立PCR是为了扩增已知序列的靶基因。因为在PCR方法问世以前，要获得一个靶基因，必须建立基因文件库，然后从成千上万的菌落中通过Southern blot 杂交筛选含有靶基因的克隆。这样既费时又费钱，特别是在克隆真核生物基因时难度更大。自从建立了PCR方法以后，使克隆已知序列的基因变得非常容易。为了适应分子生物学的快速发展，PCR方法也得到了不断发展，现在PCR已应用到生命科学的各个领域。 1. 基础研究方面的应用 目前从事分子生物学的实验室和研究人员，几乎每天都在使用PCR，可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。因此，PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法，可用于达到以下目的： l 扩增目的基因和鉴定重组子； l 克隆基因； l 基因功能和表达调控的研究； l 基因组测序； l 制备单链模板； l 致突变； 2. PCR在临床上的应用 l 在遗传学上的应用：人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变，使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点，通过PCR结合限制片段长度多态性分析（PCR-RFLP），就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。例如，血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病，患者体内缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变，产生了一个新的PstI酶切点，因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。 l 在肿瘤研究中的应用：PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。例如，差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物，并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。另一方面，在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR技术检测微小残留病灶，以进一步改进治疗方案。此外，由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化，因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。 l 检测病原体 l 在基因分型中的应用：当进行器官移植时并须先组织配型工作，此时常应用序列特异性寡核苷酸多态性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）对人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）进行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段长度多态性也可以用于对HLA的分型。 3. 在法医学中的应用 例如：最早应用DNA限制性片段长度多态性结合PCR-RFLP来进行法医学个体识别和亲子鉴定。目前发现在真核生物基因组编码和非编码序列中的短串联重复序列的重复次数在个体间存在着差异，因此可以使用短串联重复PCR技术对其进行分析。使用PCR技术进行法医鉴定的优点是样品用量小并且适于对高度降解材料的检测。除刚才提到的之外，可变数目串联重复序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法医学个体识别和亲子鉴定。 所以，综上所述，PCR的确是一种分子生物学研究的基础技术。在它30多年的发展中衍生出了诸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突变PCR和定量PCR等十几种不同的技术方法。PCR技术可以为基因工程提供目的基因，并广泛地应用于个体识别、亲子鉴定、免疫配型、疾病诊断等方面。可以说，PCR已经渗透到了生命科学的各个领域。21世纪是生物工程的世纪。我相信，在今后的发展中PCR技术会不断地得到扩充和完善，PCR技术也将发挥着越来越重要的作用。 参考书目：黄留玉，PCR最新技术原理、方法及应用，北京，化学工业出版社，现代生物技术与医药科技出版中心，2005年

生物学划分为两个时代：PCR前时代和PCR后时代，这是《纽约时报》对穆利斯先生发明PCR技术的评价。1983年，Kary B. Mullis提出了PCR技术的构想， 1985年，他们在Science发表了相关的论文。论文由Mullis的同事Randall K. Saiki领衔发表，1988年Saiki等分离纯化了Taq DNA聚合酶，并将其应用于PCR反应，使PCR变得更加简单、易行和稳定，随后PCR技术迎来了蓬勃发展的时期。PCR根据其分析精度，大致经历了以下三个阶段：（I）终点PCR：定性分析（II）定量PCR：相对定量（III）数字PCR：绝对定量

早期PCR主要用于定性分析，根据反应终点产物的有或无检测靶标序列存在与否，这种PCR可以称为终点PCR，在基因鉴定、病原核酸检测等领域具有广泛应用。

1990年，Simmonds等就通过对终点产物的梯度稀释对HCV、HIV等病原体进行了粗略的拷贝数鉴定，这可能是最早的定量PCR研究。不过需要澄清一下，这里所说的定量PCR还不是指荧光定量PCR，那时还没有将荧光物质用于PCR产物的监控。直到1992年，罗氏公司的R Higuchi等在Nature发表论文，介绍了将溴化乙锭（EB）用于PCR产物动态监控的方法，这可能是最早的荧光定量PCR技术了。1996年，ABi公司公布了基于Taqman探针的qPCR技术。1997年，Wittwer等比较了（i）基于双链特异性染料SYBR Green I（ii）基于5’-核酸酶和双标探针（iii）基于Cy5的分子信标的qPCR的特点。这些研究为后来qPCR的广泛应用奠定了基础。

一般，人们习惯把qPCR分为相对定量和绝对定量，不过本质上来说，qPCR只能用于相对定量，绝对定量的实现往往需要借助“外力”。 PCR扩增是一种指数扩增，理想状态下，产物浓度与起始浓度存在如下关系：N T = N 0 ×2 n （N 0 代表起始浓度，N T 代表终点浓度，n代表循环数），对公式两边取以对数可得：log N T = logN 0 + n×log2（log代表以自然常数e为底的对数），如果我们把PCR终点的判断信号固定成一个统一的值（即qPCR中的荧光阈值），那么循环数与起始浓度的对数就成了线性关系，这就是qPCR相对定量的基本原理。不过有两个因素：（1）人的肉眼无法准确的判断PCR终点信号，于是出现了特殊的设备—荧光PCR仪；（2）不同的靶标基因的扩增效率不同，因此无法直接比较，因此催生了 ∆∆ Ct法。

真正的绝对定量PCR称为数字PCR（dPCR，1999年Kinzler等首次提出数字PCR的概念），它是在终点PCR和极限稀释的基础上通过泊松分布计算得出拷贝数的绝对定量方法。在Simmonds等的研究中，他们通过将DNA分子稀释到单拷贝，然后根据PCR的终点信号和泊松分布规律，计算了靶标基因的分子数目，不过他们没有进一步发展该技术，很长一段时间内该技术都是以分子计数的特点应用的。dPCR一方面因受到qPCR的长期压制，另一方面受到检测仪器的限制，直到2006年以后才逐渐显示出技术复苏的景象。

1993年，Zachar等在《核酸研究》上介绍了利用PCR对靶标基因进行相对定量的数学原理；2001年，Livak KJ等介绍了2 - ∆∆ Ct 法的推导过程，局限性及应用。

当然这些原理很简单，即使不看论文也很容易理解。因为PCR的指数扩增，当我们把终点的判断标准固定时，起始模板量高的样本最先到达，起始模板量低的样本消耗更多的循环数，并且每相差一个循环，代表起始浓度相差2倍，即N1/N2 = 2 -(Ct1-Ct2) 。检测不同样本时， ∆ Ct可能受样本量差异的影响，因此引入了内参基因的校正。内参基因，也叫管家基因或者看家基因，一般认为他们在生物体不同时空组织中保持恒定表达，那么两个样本内参基因的 ∆ Ct就代表了样本量的差异，靶标基因的 ∆ Ct – 内参基因的 ∆ Ct即为靶标基因的真实表达量差异，这就是2 - ∆∆ Ct 法。

但是有几个问题需要注意：（1）PCR并非全程都是指数增长期，比较必须在对数扩增期进行（2）一般默认对数增长期扩增效率是100%，这并不严谨，尤其是一些扩增困难的模板，效率可能与100%差异很大，纵向分析某基因的表达量（如基因A在不同生产阶段/不同组织的表达量）时，仍使用2 - ∆∆ Ct 可能并不太准确（3）不同靶标基因的扩增效率是不同的，因此横向比较不同靶标基因时，可能造成较大的误差。

鉴于此，我们在设计引物时，应该尽可能使靶标的长度、GC%、Tm保持接近，从而保证相近的扩增效率。 PrimerBank 和 qPrimerDB 分别是国外和国内比较优秀的qPCR引物检索网站，收录了大量物种的qPCR引物数据，具有一定参考价值。此外，Pfaffl等(2001)，Rao(2013)等对2 - ∆∆ Ct 法进行了一些校正，采用的方法主要就是通过对同一模板梯度稀释进行扩增效率校正，具有一定参考意义。

qPCR绝对定量有两种方法：（1）先获得一个拷贝数已知的参照基因，再获得靶标基因与该参照的比值，然后根据已知值获得检测样本的确切数目，从这个角度看绝对定量就是借助了“拷贝数已知”这一外力的相对定量。1990年，Gilliland等就描述了这一原理。（2）Simmonds等报道的方法，将DNA模板做极限稀释，一直到PCR体系中仅含有一个模板分子，此时只需要乘以稀释倍数就可以得到样本中靶标基因的拷贝数。这一方法是dPCR的技术原型，在实际操作中很有困难，首先需要很多稀释梯度，其次普通的10-20uL体系中仅含有一个模板分子经常很难扩增成功。

绝对定量最广泛的应用是分子计数，如RNA分子数的精确测定，DNA基因组上的基因拷贝数鉴定等。Southern杂交法是外源基因拷贝数鉴定使用最广泛的方法，但随着qPCR技术的不断发展，基于qPCR绝对定量的拷贝数鉴定的报道逐渐增多，并且大量研究表明qPCR方法与Southern杂交得到的结果基本一致甚至更加精确。Song等(2002)利用qRT-PCR估计了转基因玉米愈伤组织和植物中的转基因拷贝数，该研究还使用Southern杂交重新测量了玉米愈伤组织和植物中的“精确”转基因拷贝数，结果qRT-PCR的测量结果与“精确”结果有较高相关性，因此，他们认为 qRT-PCR可以作为一种评估转基因玉米拷贝数的有效手段。

拷贝数鉴定的关键是获得一个拷贝数已知的标准品，质粒容易提取和纯化，因此常用于构建绝对定量的标准品。把携带靶标基因的重组质粒提纯到极高的纯度，精确测定其核酸浓度，根据公式：N = × 10 23 (copy/mol) × M DNA (g) / (DNA length(bp) × 650(g/mol/bp)) 即可计算出标准品拷贝数，式中N代表分子数目，M DNA 代表质粒重量。以此标准品绘制logN与Ct的标准曲线，然后根据靶标基因的Ct值即可反推出靶标基因的精确个数。同时我们要从基因组上选择一个基因拷贝时已知的参照基因，按同样方式绘制标准曲线、进行分子计数，然后测定统一样本中把靶标基因与参照基因的分子数，带入上述公式即可得到靶标基因的实际拷贝数。一般，应该选择基因组上拷贝数较低，物种内保守性极高的基因作为参照基因。

拷贝数鉴定具有多种形式，双标准曲线并不是必需的，如果能够确认靶标基因与参照基因的扩增效率都接近100%，也可使用2 - ∆∆ Ct 法测量靶标基因的拷贝数，林维石等(2013)就通过该方法得到了与Southern杂交一致的拷贝数鉴定结果。

基因分型的方法有很多，Landegren等(1998)在报道中综述了多种用于基因分型的技术方法，其中发展到现在应用最为广泛的就是qPCR法和测序法。测序法最为准确，并且能够发现新基因型，是基因分型或SNP检测的金标准，但它比较慢，且操作比较繁琐。qPCR检测操作简单且速度极快，目前有十分广泛的应用。

qPCR法基因分型的基本原理是：3’-末端不匹配的引物无法正常扩增靶标基因。1989年，Wu等和Newton等先后报道了ASPCR法和法用于检测等位基因，这种方法容易理解，假设已知SNP位点为A/T，如果3’-A引物PCR产物产生终点信号可判断为A基因型，3’-T引物产生终点信号为T基因型，两种引物均产生信号即为杂合型。1995年，Livak等报道了利用不同荧光标记的探针检测SNP的方法，这种方法中，分别针对两种基因型设计两条不同荧光标记的探针，并设置纯和基因型的对照，随着PCR扩增如果荧光信号靠近A参照代表A基因型，靠近B参照代表B基因型，如果位于A和B之间则为杂合型（如下图）。

2003年，Papp等报道了一种基于高分辨率溶解曲线的SNP分型方法，这种方法也是基于3’-末端不匹配的引物，A基因型设计正常长度的引物，B基因型则在引物5’端添加10-15bp的高GC序列，经过PCR扩增后，不同基因型产物的Tm就会发生变化，依赖于qPCR仪的高分辨率溶解曲线，可以快速区分基因型。

1995年以后，qPCR相关的研究论文数量呈指数式增长，成为分子生物学最热门的领域之一。近年来，随着分子诊断行业的崛起，qPCR在医疗领域发挥着越来越重要的作用。qPCR在快速发展的同时，也产生了一些问题，如判断标准不一致，检测精确度没有统一标准，RNA检测假阳性较严重等。2009年，多个科研院所及医疗单位合作发布了qPCR的 MIQE指南 ，该指南规范了qPCR的常用术语，如Ct应称为Cq，RT-PCR应写作RT-qPCR等，并对分析的敏感性、特异性、精度等进行了规范性要求，此外指南还对样本处理、核酸提取、逆转录、qPCR甚至数据分析都作了详尽的规范。该指南由9部分组成，共85个参数，以确保以qPCR实验的实用性、准确性、正确性和可重复性。虽然该指南已经有些年份，但遵守这些规范能够让你的研究更易重复，也有助于审稿人和编辑快速评估你的稿件。

注：指南的内容和附表可以在这里获取：

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