呕吐毒素检测论文

呕吐毒素主体成分为DON（脱氧雪腐镰刀菌烯醇），属于单端孢霉烯族化合物，主要由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌、雪腐镰刀菌等镰刀菌产生。另外，头孢菌属、漆班菌属、木霉属等的菌株都可产生该毒素。单端孢霉烯族毒素共有150多种，是一类强有力免疫抑制剂，所引起典型症状是采食量降低，所以这类毒素又叫饲料拒食毒素。呕吐毒素（DON）是其中最重要一种毒素，主要来自镰刀菌属（Fusarium），尤其是禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）和黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）。由于它可以引起猪的呕吐，故又名呕吐毒素（vomitoxin，VT）呕吐毒素对人和动物均有很强的毒性，能引起人和动物呕吐、腹泻、皮肤刺激、拒食、神经紊乱、流产、死胎等。DON的污染广泛存在于全球各国，中国、日本、美国、前苏联、南非等均有发现。DON主要污染小麦、大麦、燕麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品，如面包、饼干、麦制点心等。另外，在动物的奶、蛋中均有发现DON残留。DON对于粮谷类的污染状况与产毒菌株、温度、湿度、通风、日照等因素有关。小麦赤霉病主要分布在潮湿的温带地区，中国大部分地区又恰恰处于这一地带，这是中国DON污染较严重的原因之一，在多雨年份DON的污染状况则更为严重，赤霉病麦中毒也是中国最主要的真菌性食物中毒之一。呕吐毒素对中国谷物类原料的污染相当普遍，其次是油籽类原料。从内蒙、宁夏、黑龙江、辽宁、湖南、湖北、河北、广东等省市采集31份玉米、21份全价饲料、27份植物蛋白饲料。被检的玉米样本中呕吐毒素检出率达100%，平均含量达820μg/kg;被检全价料中呕吐毒素的检出率达100%，平均含量为1020μg/kg;蛋白质饲料中呕吐毒素检出率达87%，平均含量为240μg/kg。

呕吐毒素快速检测仪CSY-E96D呕吐毒素快速检测仪采用固相酶联免疫吸附ELISA的原理,即酶联免疫法；可定量快速检测饲料、动物中含有的呕吐毒素含量，呕吐毒素快速检测仪广泛应用于养殖场、肉产品深加工企业、检验检疫单位使用

呕吐毒素对人和动物均有很强的毒性，能引起人和动物呕吐、腹泻、皮肤刺激、拒食、神经紊乱、流产、死胎等，猪是对呕吐毒素最敏感的动物，家禽次之，反刍动物由于瘤胃微生物的作用，耐受力最强。对生长肥育猪而言，含有12~14g/t呕吐毒素的饲料饲喂后10~20min即会出现呕吐、不正常的焦虑和磨牙现象，含毒量19g/t以上即完全拒食。研究表明，不同种类动物的LD50（mg/kg）为：小鼠经口腹腔注射；新生大鼠经口；大鼠径口；北京雏鸭皮下注射；而致吐剂量为：北京雏鸭皮下注射；狗皮下注射经口；猪腹腔注射；鸽子经口。 几乎所有的单端孢霉烯族毒素都有可引起鸭雏、猫、狗、猪、鸽子等动物的呕吐。猪对DON的致吐作用最敏感，约为其他动物的100-200倍。DON还可引起拒食反应。致呕吐作用的机理除了DON对粘膜的刺激作用外，同时也有对中枢神经的作用。曾有人以含DON毒素18-20mg/kg的赤霉病小麦，按﹪的不同比例混入饲料中，喂养大鼠18个月，发现高比例组动物睾丸、子宫、肝、肾脏受到一定的损害。 DON化学性能非常稳定，一般不会在加工、储存以及烹调过程中破坏，在实验室条件下可长期贮存保持毒力不变，有较强的热抵抗力，121℃高压加热25min仅有少量破坏。酸性环境不影响其毒力，但是加碱或高压处理可破坏部分毒素含有呕吐毒素谷物类加工产品，在加工过程中，由于技术限制不可能完全去除，人类食用含有一定量呕吐毒素粮油食品后，会出现胃部不适、眩晕、腹胀、头痛、恶心、呕吐，手足发麻、全身乏力、颜面潮红、以及食物中毒性白细胞缺乏症。症状严重者可见呼吸、脉搏、体温及血压的波动，四肢发软、步态不稳、形似醉酒，故有的地方称其为“醉谷病”。 呕吐毒素的产毒菌株适宜在阴凉、潮湿的条件下生长。广泛存在于大麦、小麦、玉米和燕麦中。不同动物对呕吐毒素的敏感程度不同，猪是对呕吐毒素最敏感的动物，断奶仔猪尤其敏感。饲料中的微量毒素就会引起猪拒食、生长下降以及对传染病的抵抗力下降，饲料中含1mg/kg以上的呕吐毒素时可引起猪拒食、嗜睡、生长严重受阻、体增重减慢、免疫机能减退、肌肉协调性丧失以及呕吐等症状。此外，呕吐毒素可在人和动物体内蓄积，具有致畸性、神经毒性、胚胎毒性和免疫抑制作用。 呕吐毒素主要在胃肠道吸收，经血液循环进入肝脏代谢后经肾脏随尿液排出，造成各器官的广泛损伤。呕吐毒素在人体中的半衰期为2～4h，代谢迅速，8h后就检测不到呕吐毒素和它的代谢物。 呕吐毒素可引起雏鸭、猪、猫、狗、鸽子等动物的呕吐反应，严重者可造成死亡。呕吐毒素的急性毒性与动物的种属、年龄、性别、染毒途径有关，雄性动物对毒素比较敏感。急性中毒的动物主要表现为站立不稳、反应迟钝、竖毛、食欲下降、呕吐等，还可引起动物的拒食反应，其中猪对呕吐毒素最为敏感。呕吐毒素能引起猪食欲减退或废绝，呕吐，体重下降，流产，死胎和弱仔，抑制免疫机能和降低机体抵抗力。对生长肥育猪而言，含有14mg/kg呕吐毒素的饲料饲喂后10~20min即会出现呕吐、不正常的焦虑和磨牙现象，呕吐现象仅发生在第1天。而且呕吐毒素含量在0~14mg/kg的试验中，饲粮中每增加1mg/kg呕吐毒素，生长肥育猪的采食量减少6%，在含毒量10mg/kg以上即完全拒食。对于呕吐毒素的慢性毒性世界研究都比较少。有人用大鼠进行了为期2年的染毒试验，呕吐毒素的浓度为0、1、5、10mg/kg，雄性、雌性大鼠各分为4组，试验结束后发现，各组动物均未见死亡，动物体重增加与染毒剂量呈负相关。雌性大鼠的血浆中IgA、IgG浓度较对照组饲料中呕吐毒素的危害与防治增高，生化指标、血液学指标也可见明显异常。病理学检查还发现有肝脏肿瘤、肝脏损害。 长期摄入被DON污染的病麦或粗毒素对动物有一定的毒性，可影响动物的生长、繁殖率和子代的存活率，甚至可使生长停滞，形成“僵鼠”，并产生对心、肝、肾的伤害，严重时损害造血系统造成死亡。但不同种属、性别的动物对DON的敏感程度不一，猪是最敏感的动物，反刍动物比其它动物受的影响小，奶牛的健康状况、产奶量、摄食量几乎不受影响，牛奶中也检测不到DON及其脱氧产物。 在很多物种上已经得到证实，DON可以通过胎盘转移到胎儿。怀孕母猪感染DON后在胎儿的血浆、肝和肾中均检测到DON。用DON纯品灌喂Swis小鼠，引起明显的胚胎毒作用和骨骼畸形：DON在10~15mg/kg剂量时胎儿100%吸收，在5mg/kg的剂量时胎儿吸收率为80%。在大鼠妊娠期5~19d中饲喂5mg/kg的DON会降低胎儿的发育，母鼠采食量和平均日增质量都显著降低，胎儿质量、母体子宫质量和头臀长降低，胸骨、趾骨、背骨和椎骨等骨化能力下降，这些可能是由于母体毒性和胎儿大小减小造成的。在啮齿动物上的致畸和繁殖试验证实DON影响大鼠的体质量增长，导致吸收胎增多、骨骼形成不良及仔鼠出生后存活率的降低。刚断奶的幼鼠除了在血浆和体组织中检测到DON质量浓度明显高于成年鼠以外，DON诱导幼鼠脾和肺中产生的IL-6和TNF-α质量浓度也比成年鼠的高，持续的时间更长，且脾中IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA表达量比成年鼠高出2~3倍，这些均表明幼鼠对DON引起的多种影响的反应比成年鼠敏感，所以DON对幼鼠机体组织造成的负荷更大。Vesely等研究了DON对于3日龄鸡胚的毒性作用，发现其胚胎毒性剂量范围很窄（1~3mg/kg），DON致使试验组鸡胚头部畸形，身体发育畸形，畸形率明显高于对照组。 有调查显示，中国饲料和原料霉菌毒素污染超标的比例为60%~70%，其中呕吐毒素的超标比例接近70%，在被检的玉米、麸皮和DDGS样品中呕吐毒素的检出率均高达90%以上，分别为、和100%。豆粕的检出率较低为。麸皮和豆粕中呕吐毒素未见超标，其平均含量分别为和，属于轻度污染。玉米中呕吐毒素的超标率为，毒素平均含量为，其最高含量为，属于中度污染。DDGS中呕吐毒素的超标率为，毒素平均含量为，最低含量为，最高含量为，属于中度污染。玉米和DDGS中呕吐毒素的平均含量极显著高于麸皮和豆粕（P<），DDGS中呕吐毒素的平均含量显著高于玉米（P<），麸皮中呕吐毒素的平均含量极显著高于豆粕（P<）。被检配合饲料中呕吐毒素的检出率为，仔猪料、中猪料、妊娠母猪料和哺乳母猪料的检出率高达100%。其中，乳猪料呕吐毒素未见超标，其平均含量为，显著低于其他种类全价料（P<），属于轻度污染。仔猪料、中猪料、大猪料、妊娠母猪料和哺乳母猪料均有不同程度的超标，超标率分别为、、、和，其最高含量分别为、、、和，属于中度污染。 小麦面粉中呕吐毒素色谱图图册参考资料。 DON的污染广泛存在于全球各国，中国、日本、美国、前苏联、南非等均有发现。DON主要污染小麦、大麦、燕麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品，如面包、饼干、麦制点心等。另外，在动物的奶、蛋中均有发现DON残留。DON对于粮谷类的污染状况与产毒菌株、温度、湿度、通风、日照等因素有关。小麦赤霉病主要分布在潮湿的温带地区，中国大部分地区又恰恰处于这一地带，这是中国DON污染较严重的原因之一，在多雨年份DON的污染状况则更为严重，赤霉病麦中毒也是中国最主要的真菌性食物中毒之一，这也越来越引起了人们的重视。 DON毒性较低，但它最易出现，广泛存在于温热带地区的饲料中，因此在谷物中DON中毒发病率最高。例如：在日本，小麦和大麦中的DON浓度为40ppm；在加拿大，安大略地区白色冬小麦中的DON浓度为。对一些亚洲国家的未加工的农产品和加工过的饲料样品进行检测时发现，中国的饲料样本中，含有一定量的呕吐毒素。超过70%的样本被呕吐毒素污染。2000年的样本中呕吐毒素的最高含量达到4582μg/kg。2003年中国配合饲料样品中呕吐毒素的阳性检出率为100%，平均含量为600μg/kg；据估计，2005年中国饲料原料的呕吐毒素检出率为100%，对人类的健康产生威胁。美国食品及药物管理局（FDA）规定食物中呕吐毒素的安全标准是1000μg/kg，呕吐毒素的含量超过l000μg/kg就会对人及一些动物健康产生损害。 呕吐毒素对中国谷物类原料的污染相当普遍，其次是油籽类原料。从内蒙、宁夏、黑龙江、辽宁、湖南、湖北、河北、广东等省市采集31份玉米、21份全价饲料、27份植物蛋白饲料。被检的玉米样本中呕吐毒素检出率达100%，平均含量达820μg/kg;被检全价料中呕吐毒素的检出率达100%，平均含量为1020μg/kg;蛋白质饲料中呕吐毒素检出率达87%，平均含量为240μg/kg。据顾薇2003年研究发现，从中国送来的样本中，超过70%的样本被呕吐毒素污染，1998-1999年、2000年和2001年，呕吐毒素的平均浓度分别为548，607和378μg/kg}2000年的样本中呕吐毒素的最高含量达到4582μg/kg。据奥特奇公司研究结果，2005年中国饲料原料呕吐毒素检出率为100%，超标率（最高为）。 镰刀菌属霉菌属于田间霉菌，野外菌株，通常在作物生长期间就被污染，其最适生长温度为5~25℃，由于镰刀菌属霉菌的上述特点，呕吐毒素的分布与对饲料原料的污染也呈现出一些特点:1）镰刀类霉菌主要在田间污染谷物类原料作物和油籽类原料作物。呕吐毒素则是在刚收获后的谷物呕吐毒素污染较为严重。2）呕吐毒素对中国谷物类原料的污染相当普遍，其次是油籽类原料。3）呕吐毒素的污染程度存在地区和年份的区别。由于温度、湿度等的差别，不同地区、同一季节收获的玉米所带菌属有较大差别，同一地区、不同季节、不同年份的玉米所带菌属也不一样。北方地区的玉米（如河南、山西等地的部分玉米）以镰刀菌为主要菌属，而东北玉米以圆弧青霉为主要菌属，镰刀菌次之。所以，华北地区的部分玉米呕吐毒素的污染较重一些，而东北玉米相对较轻一些。就年份而言，与收获时的降雨量有关。如2003年，华北部分地区，由于下雨太多，造成部分玉米呕吐毒素污染严重，少数玉米用于生产饲料，严重影响饲料的适口性，导致饲料退货。而2004年因收获时天气较好，呕吐毒素没有达到危害的程度。2005年的新玉米，部分玉米又有不同程度的超标。 研究表明，DON可能对免疫系统有影响。DON既是一种免疫抑制剂，又是一种免疫促进剂，其作用与剂量有关。在体内DON可以抑制对病原体的免疫应答，同时又可以诱发自身的免疫反应。DON引起实验动物免疫系统的疾病与人类lgA肾病及其相似，同时DON还可以诱发辅助性T细胞超诱导产物-细胞因子的产生，激活巨噬细胞、T细胞产生炎症前细胞因子。 动物毒力学试验研究表明：不同畜种的动物对DON的敏感程度按顺序是：猪>小鼠>大鼠>家禽和反刍动物。DON对人畜会产生广泛的毒性效应，低剂量摄入会造成食欲下降、生长缓慢、发育不良和病死率升高等现象；大量或长期摄入会发生急性中毒、呕吐、直肠出血和腹泻，与肠道炎症极其相似。呕吐毒素对动物机体毒性主要分为免疫毒性和细胞毒性。DON在低质量浓度时能诱导辅助性T细胞超诱导产物—炎性细胞因子和趋化因子在巨噬细胞中的表达。高质量浓度DON可抑制免疫，诱导免疫细胞凋亡，抑制其增殖，同时还影响免疫细胞因子的分泌、减弱免疫应答、抑制淋巴细胞增殖、吞噬作用和巨噬细胞的杀菌作用。 胸腺是T细胞发育、分化、选择和成熟的场所。原胸腺细胞经过前胸腺细胞、CD4-CD8-双阴性细胞。CD4+CD8+双阳性细胞和CD4+CD8-或CD4-CD8+2个单阳性胸腺细胞亚群这5个阶段，发育分化为成熟的T细胞。因此T细胞在胸腺整个发育过程中会先后经历阳性选择和阴性选择，经过阳性选择的单阳性胸腺细胞既可识别异己抗原又可识别自身抗原，但识别自身抗原这一特性对机体是有害的。只有与自身抗原亲和力低和不识别自身抗原的胸腺细胞才会经过阴性选择后进一步分化为成熟的T细胞，反之就会发生细胞凋亡。所以T细胞在胸腺活化时会引发胸腺细胞的阴性选择和凋亡，而且在T细胞活化或胸腺细胞阴性选择期间，DON促使抑制免疫的基因表达升高，所以胸腺对DON有高敏感性。在小鼠口服5、10和25mgDON/kg体质量各3、6和24h后，Sandra分析基因时证实在前胸腺细胞阶段DON选择性的使抑制免疫的基因（抑制线粒体、核糖体或蛋白质合成的基因）高度表达，也证明了在胸腺细胞发育成T细胞过程中双阳性CD4+CD8+阶段对DON最敏感，高质量浓度DON能明显诱导胸腺细胞凋亡，抑制其增殖。 但是，在T细胞活化反应期间，用低质量浓度DON刺激胸腺细胞3h，很多基因，如：钙依赖基因和核内转录因子（NFkB）的靶基因被刺激表达，诱发内质网钙储存的消耗，活化NFkB，导致大量钙离子依靠钙转运蛋白流过细胞膜，胞内钙质量浓度增加，激活钙调磷酸酶，使活化T细胞核因子（NFAT）去磷酸化，DON诱导NFAT转至胸腺细胞核内，活化更多基因，促进T细胞活化和增殖。 巨噬细胞在动物机体的免疫防御中起着关键作用，作为机体免疫应答的组成部分，构成免疫防御的第一道防线，同时也参与机体的获得性免疫。巨噬细胞被活化后产生不同的炎性因子，并表达一些特定的细胞表面受体或白细胞分化抗原（CD）。研究表明：低质量浓度DON可提高个别炎性因子的分泌和产生，高质量浓度DON则诱导巨噬细胞的凋亡。肿瘤坏死因子（TNF）-α是巨噬细胞活化的主要因子，依赖剂量提高细胞表面受体（CD14、CD54和CD119）和人类白细胞抗原（HLA-DP/DQ/DR）的表达，而DON被证实不论质量浓度高低均会干扰TNF-α活化巨噬细胞的过程，起到免疫毒性的效果。DON在细胞因子受体和两面神激酶（JAK）水平上作用于细胞因子信号抑制因子（SOCS），抑制细胞因子受体（TNF-α受体）的信号转导，进而抑制多种细胞因子共用的信号转导途径—酪氨酸激酶/信号转导子和转录激活子（JAK/STAT）的信号转导，干扰TNF-α刺激巨噬细胞活化的过程。鼠巨噬细胞中脂多糖（LPS）诱导一氧化氮聚合酶（iNOS）的表达，干扰素（IFN）-β是该诱导过程不可缺少的信号，IFN-β的表达引起STAT、干扰素调控蛋白和iNOS表达。DON还可以抑制iNOS和IFN-β的激活和表达，直接或间接抑制NO和IFN-β的产生。 DON诱导淋巴组织表达的TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎症细胞因子可损害生育能力，尤其是TNF-α已证实会影响猪和牛卵母细胞的发育。卵母细胞在减数分裂过程中与其周围的卵丘细胞（滤泡细胞在卵母细胞发育时凸向滤泡腔所形成）形成卵胞质，在卵胞质结构和分子的变化及2种细胞间的相互作用下卵母细胞逐渐成熟。不论卵丘细胞的来源—滤泡细胞的大与小，其对卵母细胞成熟过程的作用都是不会改变的，所以卵丘细胞的扩增和死亡是卵母细胞获得发育能力的关键因素。在猪卵母细胞成熟过程中，用DON感染其卵母卵丘细胞复合体（COCs）后，检测发现大量卵丘细胞死亡的同时卵母细胞潜在的发育能力下降，由此推测DON对卵母细胞的毒性是通过抑制卵丘细胞增殖和控制卵丘细胞周期间接作用而导致的。减数分裂中纺锤体是在第一次分裂中期形成的，纺锤体形成是微管的动态组成。微管合成的异常和受精后染色体的异常分裂会造成胚胎发育受到抑制。Schoevers等在DON感染后的COCs中发现，随着DON质量浓度的增加，到达第二次分裂中期的卵母细胞显著减少，而且显微镜检测出很多卵母细胞的核染色质和微管发生畸变，说明成熟卵母细胞在中期I到中期II对DON最敏感。当卵母细胞感染高质量浓度（2μmol）DON时，畸变发生在减数分裂纺锤体形成时期—中期I（在此质量浓度下卵丘细胞增殖被完全抑制）；若是低质量浓度，畸变更容易发生在末期I或中期II。DON也会在以下3个阶段损害卵母细胞发育以降低胚胎发育：1）减数分裂纺锤体的形成过程中；2）减数分裂纺锤体形成前（因为DON已经在卵母细胞成熟前21h中降低了其发育潜力）；3）受精过程中。DON还可通过直接影响动粒蛋白（纺锤体形成的关键点）而干扰减数分裂纺锤体形成，使减数分裂停滞在中期I或末期I。