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DNA甲基化是细胞分裂过程中遗传的一种表观遗传标记，影响细胞的生物学功能。而单细胞水平上的全基因组甲基化分析将有助于深入了解转录调控和细胞异质性。 单细胞DNA甲基化研究怎么做？ 来自韩国的科研人员在《 Biomolecules 》发表综述文章， 介绍了单细胞DNA甲基化分析方法，包括实验策略和数据分析；此外，还介绍了相关科研应用并讨论了未来的发展。 注：此篇综述没有介绍5mC分析方法，虽然介绍了许多多组学方法，但每种方法的单独分析过程未作深入讨论。 亚硫酸氢盐转化法被认为是DNA甲基化分析的金标准。 由于它的高转化率（>99%）、可重复性和通过商业试剂盒的简单易用性而受到研究人员的青睐。然而，亚硫酸氢盐转化法采用了导致DNA降解的苛刻反应条件，PBAT的开发即是为了解决降解造成的损失问题。RRBS和WGBS是流行的全基因组甲基化分析方法。 这两种方法都包括亚硫酸氢盐转化和NGS制备。主要区别在于，RRBS使用适当的限制性内切酶和大小选择来筛选富含GC的区域。WGBS（特别是MethylC-seq）的优势在于能够覆盖基因组中的大部分CpGs。与RRBS相比，WGBS的纯化和筛选过程相对简单。在WGBS中防止亚硫酸氢盐转化过程中的降解损失被认为是相对重要的，因此许多基于WGBS的单细胞方法往往是基于PBAT的。 多组学方法是根据甲基化分析方法与其他分析方法（RNA、染色质可及性）相结合来区分的。 例如scM&T-seq是基因组和转录组测序（G&T-seq）与scBS-seq的结合，G&T-seq是一种基于Smart-seq2识别DNA和RNA的方法。此外，应用于单细胞甲基化分析方法的技术，如PBAT，也可以类似地应用于NOME-seq，NOMe-seq可以根据核糖体的存在与否，利用GpC甲基转移酶的染色质可及性差异，确认双硫酸盐转化的DNA中开放染色质和CpG甲基化。scCOOL-seq、iscCOOL-seq和scNome-seq可以一起监测染色质可及性和CpG甲基化。通过转化以外的方法观察甲基化主要分为两类：利用甲基胞嘧啶的亲和结合和利用限制性内切酶对甲基胞嘧啶的敏感性。MBD-seq和MeDIP-seq是具有代表性的基于亲和性的方法。 基于亲和力的方法不适合在单细胞规模上应用 ，因为这些方法基于DNA片段产生平均DNA甲基化谱，这不允许区分单个细胞中DNA甲基化模式的差异。然而，与基于亲和力的方法不同， 基于MSRE的方法可以被改进， 使用MSRE的单细胞方法的细化可以在Methyl-seq中看到，scCGI-seq测量甲基化的方式与Methyl-seq类似。在测序实验之后，包括RRBS或WGBS，需要对数据进行预处理。预处理步骤可分为 数据质控（QC）、序列修剪和比对 ，例如使用 FastQC 测量总体的基本测序数据质量，使用 Trim Galore！、fastp和Trimmomatic 等软件修剪，下表列出了常用的比对工具。甲基化分析的主要目的是探索构成样本、器官和疾病状态（包括癌症）之间差异的表观遗传学证据。为了发现这些差异，需要一个暗示此概念的数值，一个广泛使用的术语是β值。在甲基化调用后，进行后续分析，如可视化分析的t-SNE，聚类分析，以及识别差异甲基化胞嘧啶（DMCs）或差异甲基化区域（DMRs） 上述方法主要依赖于单个CpG位点的甲基化水平。最近的甲基化分析利用了每个reads的甲基化模式来诊断疾病，尤其是癌症。这种新的分析概念是基于甲基化的生物学特性，即除非出现从头甲基化，否则相邻CpG位点之间有保持甲基化的趋势。 该读取模式方法能够检测具有疾病信号的DNA分子，并且具有增加疾病信号检测机会的可能性。 例如，一项大型液体活组织检测研究设计了一个集成分类器，根据读取模式分析对肿瘤类型进行分类，并在早期癌症的检测中显示出显著的结果。此外，通过甲基化模式对肿瘤衍生的DNA分子进行量化是观察肿瘤负担的另一种方法。生殖细胞或胚胎细胞的成熟受到特定基因表达的影响，这与DNA中的甲基化水平相关。例如基于植入前的胚胎细胞的甲基化特征，利用单细胞甲基化测序，通过对早期胚胎系追踪的研究，研究植入前细胞甲基化的机制及其现象。研究团队观察到非CpG甲基化在卵母细胞成熟过程中不断积累，说明非CpG甲基化与CpG甲基化在卵母细胞成熟过程中的作用不同。在疾病患者中，DNA甲基化的模式与健康人不同。在各种疾病中，癌症尤其具有正常细胞所不具有的DNA甲基化模式，从而导致基因表达水平的差异。在对具有这种异质性的癌症研究中，需要使用多组学方法，将基因组变异和RNA表达结合起来进行分析。例如一个研究小组最近开发了一种称为scTrio-seq2的方法，它整合了单细胞转录组和单细胞甲基化测序数据。多项研究表明使用单细胞甲基化测序（sc-methyl-seq）的多组学方法可以克服先前方法的局限性，并且具有更好的鉴别能力。因此，sc-methyl-seq可用于各个领域，以解决与生物过程和疾病相关的基本问题。 单细胞DNA甲基化研究仍存在一些问题。其中第一个问题是亚硫酸氢盐转化的降解问题，这是目前的金标准。然而，在数量有限的单细胞尺度上，由于降解而造成的损失比在体积尺度上更严重。为了解决这个问题，采用了PBAT等技术，但其性能无法与使用大量DNA的方法相比。近年来，利用TET酶活性的方法，如TAPS和EM-seq，已经被开发出来，并作为一种解决慢性降解问题的方法而受到关注。另一个问题是一个明确的标准分析过程还没有建立。由于这些挑战，目前最好的方法是引入多组学方法进行交叉验证。 随着数据采集的成本正在逐渐降低和数据联盟的建立（例如国际人类表观基因组联盟（IHEC）等），全面数据的积累可以提供一个了解甲基化的机会。关于甲基化证据的积累将使大家有可能找到因不同组织类型、不同实验或环境条件以及异质性疾病（如癌症）而波动的甲基化热点区域。此外，通过积累的数据发现细胞类型的特异性标记，将有利于通过单细胞DNA甲基化数据的可视化来进行细胞异质性分析，包括在t-SNE图中分配细胞集群。相信对甲基化及其在疾病中的生物学作用之间关系的理解将随着未来进一步的数据而得到揭示。首发公号：国家基因库大数据平台 参考文献 Ahn J, Heo S, Lee J, et al. Introduction to Single-Cell DNA Methylation Profiling Methods[J]. Biomolecules, 2021, 11(7): 1013.
m6A RNA甲基化是最常见、最丰富的真核生物mRNA转录后修饰。研究表明，m6A 在不同组织，细胞系中是一个复杂的调控网路，m6A RNA 甲基化参与 RNA 的代谢过程，并与肿瘤的发生和发展密切相关。本期着重解读两篇癌症中的 m6A 研究，看一下 m6A RNA 甲基化如何玩转高分期刊。 2020年10月，南京医科大学汪秀星课题组和美国 UCSD Jeremy Rich 等课题组在Cancer Discovery上发表题为“The RNA m6A reader YTHDF2 maintains oncogene expression and is a targetable dependency in glioblastoma stem cells”的研究论文。该研究为靶向治疗胶质母细胞瘤提供了新的治疗机会。 研究背景 胶质母细胞瘤（GBM）代表了最常见的原发性，内在性脑肿瘤，患者的平均生存期限制在一年以上。鉴于胶质母细胞瘤干细胞（GSC）在治疗抗性，血管生成，免疫逃逸和侵袭中的作用，临床和临床前观察表明，靶向GSC可以改善肿瘤预后神经肿瘤学上的精准医学研究。 研究方法 研究结果 1. 在 GSC 中上调的致癌转录本以 RNA m6A 修饰为标志 作者利用 MeRIP-seq 对 GSC 和神经干细胞（NSC）进行 m6A 标记的检测，结果发现，与非肿瘤对应物相比，GSCs 的m6A 分布发生了改变。通过38个 GSCs 和5个 NSCs 的队列中的 RNA-seq 数据进行 GSEA 分析，具有 m6A 峰的基因在GSC 高度富集，而且在 GSC 中获得的具有 m6A 峰的基因均被上调。相反，相对于 NSC、GSC 中丢失 m6A 峰的基因通常在 GSC 中被下调。而且，在 GSC 中，与癌症干细胞相关的重要基因上获得了 m6A 峰，包括表达增加的 OLIG2 和 MYC 。 2. YTHDF2 在 GSC 中表达上调，对 GSC 的维持至关重要 作者为研究 m6A YTHDF 在胶质母细胞瘤中的功能作用，利用 CRIPR 技术检测了 YTHDF2 ，相对于对照 sgRNA，敲除 YTHDF2 会降低细胞活力及减少 GSCs 中细胞球形成。为研究了 YTHDF2 耗竭是否会诱导 GSC 分化，正交实验发现，shRNA 介导的 YTHDF2 敲低会降低 GSC 的活性，过表达的 YTHDF2 可以挽救 GSC 的活性。结果表明， YTHDF2 是胶质母细胞瘤维持的一个特异性和有效的调节因子。 3. YTHDF2 通过 m6A RNA 修饰支持 GSCs 中的基因表达 作者利用 RNA-seq 检测 YTHDF2 的下游靶点，敲除 YTHDF2 可引起 GSCs 中广泛基因表达的改变， MYC 靶点显著富集，而且，GSCs 中获得 m6A 峰的基因更频繁地下调。通过 qPCR 也验证了 YTHDF2 敲除对 MYC、VEGFA mRNA 水平降低的作用。为了预测 YTHDF2 在 GSCs 中的作用，作者结合 TCGA 胶质母细胞瘤基因表达数据，发现 YTHDF2 相关基因 MYC 和 E2F 靶点以及 G2M 调节因子和氧化磷酸化介质高度富集。这些数据表明 YTHDF2 作为与 m6A 差异修饰相关的转录程序的调节因子。 4. YTHDF2 通过保持 MYC 转录稳定发挥 GSC 特异性依赖作用 为了确定 YTHDF2 介导作用于 GSCs 中 MYC 的特异性，作者比较了在 NSCs 和 GSCs 之间 YTHDF2 缺失的影响。NSCs 中 YTHDF2 敲低并不影响 MYC mRNA 水平，但降低了 GSCs 中 MYC mRNA 水平。而且， YTHDF2 耗竭降低了GSC 的活性，而不影响 NSCs。因此， YTHDF2 代表了一种 GSC 特异性依赖，通过 MYC 基因的特异性稳定支持胶质母细胞瘤的生存。 5. IGFBP3 是 GSCs 中 YTHDF2-MYC 轴的下游靶点 因为 IGFBP3 是 YTHDF2 耗尽后最高下调基因之一，作者研究了 IGFBP3 是否调控 YTHDF2-MYC 轴下游的细胞活力。 IGFBP3 的缺失降低了 GSC 的活性和细胞球形成。 IGFBP3 过表达挽救了 GSCs 免于 YTHDF2 下调介导的细胞死亡。最后，作者利用20个胶质母细胞瘤和20个非肿瘤脑组织中 IGFBP3 的表达进行验证，观察到 GSC 中 IGFBP3 mRNA 表达升高。结果表明， IGFBP3 是 GSCs 中 YTHDF2-MYC 信号轴的关键下游效应子。 6. YTHDF2-MYC-IGFBP3 轴促进体内肿瘤生长 为了探讨在体内靶向 YTHDF2 治疗的潜在益处，作者利用 CRISPR 敲除技术对原位异种移植物的小鼠进行检测。结果表明，与携带对照 sgRNA 的 GSCs 的小鼠相比，敲除 YTHDF2 延长了肿瘤潜伏期并减少了肿瘤体积。 IGFBP3 过 表达恢复了 YTHDF2 缺失的 GSCs 体内成瘤能力。 研究结论 通过结合体外和体内的 GSCs 研究，该研究阐明了 m6A 介质在 GSCs 中的功能，并确定 YTHDF2 是 GSCs 特异性依赖，通过稳定 MYC 转录物调控 GSCs 中的葡萄糖代谢。这些发现为靶向治疗胶质母细胞瘤提供了新的治疗机会。 2020年4月，上海交通大学医学院附属仁济医院洪洁团队在 Molecular Cancer 上发表了题为“m6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression”的研究论文。研究表明，靶向 METTL3 及其通路为高糖代谢的 CRC 患者提供了另一种合理的治疗靶点。 研究背景 结直肠癌 (CRC) 是全球第四大常见恶性肿瘤和第三大癌症死亡原因，而以乳酸作为糖酵解的最终产物，被认为是治疗癌症的一种有前途的方法。m6A 调控基因的改变在多种人类疾病的发病机制中起着重要的作用，但 m6A 修饰是否在 CRC 的葡萄糖代谢中起作用尚不清楚。 研究方法 研究结果 1. METTL3 与结直肠癌糖酵解密切相关 为了探讨结直肠癌（CRC）中 m6A 修饰与糖酵解代谢之间的相关性，作者对47例 CRC 患者进行 RT-PCR分析，CRC患者中FDG 摄取与 METTL3 表达之间存在最显着的相关性。进一步分析发现 CRC 患者中 FDG 摄取与 METTL3 免疫组化染色存在显著相关性。最后，作者利用 RNA-seq 比较 METTL 3 敲除和野生型(WT) HCT116 CRC 细胞的基因表达谱， METTL3 敲除细胞表现出更高的 METTL3 表达。这些结果表明 METTL3 可能介导 CRC 患者糖溶解代谢和癌变。 2. METTL3 在结直肠癌中促进糖酵解代谢 为了弄清 METTL3 的改变是否直接影响糖酵解代谢，研究发现敲除 METTL3 可显著降低 HCT116 和 SW480 细胞的胞外酸化速率(ECAR)水平，过表达 METTL3 显著提高了 DLD1 细胞的乳酸生成、葡萄糖吸收和 ECAR 水平。为了阐明 Mettl3 诱导的 CRC 糖酵解是否依赖于其甲基转移酶功能，作者通过 Mettl3 野生型和突变型的研究，发现 Mettl3 的 MTase 结构域的缺失阻断了 Mettl3 诱导的糖酵解过程。这些数据表明 Mettl3 通过其甲基转移酶结构域调控结直肠癌糖酵解代谢。 3. 在结直肠癌中， METLC3 诱导的增殖依赖于糖酵解的激活 METLC3 的敲除消除了 HCT116 细胞的细胞增殖和集落形成，并且降低了 HCT116 肿瘤的生长和异种移植小鼠模型中的肿瘤重量。在功能分析中， METTL3 的过表达增加细胞增殖、集落形成、肿瘤的生长和肿瘤的重量。2-DG（糖酵解途径的抑制剂）处理在体外和体内显着阻断了 METTL3 诱导的细胞增殖和菌落形成，这些结果表明 Mettl3 通过调控结直肠癌糖代谢促进 CRC 进展。 4. METTL3 在结直肠癌中的潜在靶点 为了鉴定 METTL 3 的潜在靶标，作者选择了 METTL3 敲除和 WT HCT116 细胞进行 MeRIP-seq和RNA-seq，最常见的motif ' GGAC '在 m6a 峰中显著富集，大部 分 METTL3 结合位点位于 CDS区，在 5'UTR 和 3'UTR 高度富集，并且 m6A在转录水平上发生了全局低甲基化。联合RNA-seq数据，确定了429个低甲基化的 m6A 基因，其 mRNA 转录被下调，595个低甲基化的 m6A 基因，其 mRNA 转录被上调。基于甲基化水平与 mRNA 表达水平都下降，找到与糖酵解密切相关的靶基因 HK2 和 SLC2A1(GLUT1) 。 6. HK2 和 SLC2A1 是 METTL3 在 CRC 中重要的功能靶基因 作者通过 HCT116 WT 和 mettl3 敲除细胞转染 control、 HK2 或 SLC2A1 过表达实验发现， HK2 或 SLC2A1 的异位表达部分恢复了敲除 mettl3 细胞的增殖、集落形成能力和肿瘤生长，而且，也能恢复 HCT116 mettl3 敲除细胞中乳酸产量的下降。同时，在体外和体内，过表达 SLC2A1 显著恢复了 HCT116 mettl3 敲除细胞葡萄糖摄取下降的趋势。因此， HK2 和 SLC2A1 介导了 CRC 细胞中 METLL3 的调节功能。 研究结论 METTL3 是 CRC 的一种功能性和临床致癌基因。 METTL3 通过 m6A- IGF2BP2/3— 依赖机制稳定 CRC 中 HK2 和 SLC2A1 的表达。靶向 METTL3 及其通路为高糖代谢的 CRC 患者提供了另一种合理的治疗靶点。 参考文献 [1] Dixit D, Prager B, GimpleShen R, et al. The RNA m6A reader YTHDF2 maintains oncogene expression and is a targetable dependency in glioblastoma stem cells[J]. Cancer Discovery, 2020. [2] Shen C, Xuan B, Yan T, et al. M6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression[J]. Molecular Cancer, 2020, 19(1).
蜜蜂在出生时候都一样，但是吃食蜂王浆的最后变成了蜂王，没有吃食则成了工蜂；同卵双胞胎基因组相同，但依然会显示出肉眼可见的差异；睡眠不足会导致人类基因组中DNA甲基化的水平产生变化， 这种表观遗传的印记还可能传递给我们的后代。这些现象都是如何解释呢？ 我们都知道通过中心法则，有的基因可以表达有的基因表达则不表达，而表观遗传可能决定着这些基因的表达方式表达时间等。 表观遗传学可以定义为研究基因表达的可遗传变化，这种变化独立于原始DNA序列的变化，会受环境等因素的影响而发生改变。基因表达的表观遗传调控是由DNA甲基化、组蛋白修饰等机制介导。 DNA甲基化是哺乳动物中研究最深入的表观遗传修饰之一。1983年，Feinberg 与Vogelstein发现肠癌组织中特定基因的甲基化水平降低，同年，Gama-Sosa等人证实肿瘤样品中5-甲基胞嘧啶的减少，自此科学界开始广泛研究甲基化与癌症的关系，并取得了很多突破性的进展。 在正常细胞中，DNA甲基化拥有调节基因表达和沉默的重要作用。动物基因组中，甲基化主要发生在CG位点上，是一种共价修饰方式，DNA复制后，硫-腺苷-L-蛋氨酸（S-adenosylmethionine）通过酶反应把-CH3基团添加到基因组胞嘧啶上。哺乳动物中，基因组中约60%-90%的CpG核酸位点DNA甲基化，在真核生物DNA中,5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基，通常情况，未甲基化的CpG成簇地组成CpG岛,位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点，人类大约有 30 亿个碱基对，基因组中大约有 2800 万个 CpG 位点。 通过以上对DNA甲基化的表述不难看出DNA修饰在转录调节中起着关键作用，因此这一机制的缺陷可能导致包括癌症在内的各种疾病也就不足为奇了。在癌症发生时，抑癌基因启动子区域表现为高甲基化，基因启动子甲基化以后基因表达就会减弱甚至关闭。恶性肿瘤中大多数基因的开关由DNA甲基化调控，几乎所有肿瘤发生时都会伴随DNA甲基化的异常发生，通常情况下高甲基化与低甲基化并存。如肿瘤细胞中抑癌基因启动子通常为高甲基化，抑制抑癌基因表达使其丧失抑癌功能，从而促进癌症的发生。而低甲基化则通常是整个基因组低甲基化或原癌基因启动子的低甲基化，前者染色体结构稳定性降低，导致癌变发生，后者则激活原癌基因，诱导细胞癌变。在肿瘤细胞中，基因组整体甲基化水平降低至 20~50%，与正常细胞相比，约有 10~60% 的 CpG 位点甲基化状态发生了改变。 2020年全球新诊断癌症1930万例，其中癌症死亡人数为1000万人。这意味着什么呢？意味着全世界1/5的男性和1/6的女性会在一生中的某一时刻患上癌症，其中1/8的男性和1/11的女性将死于癌症。 全世界范围内，前五名的癌症是乳腺癌，肺癌，结直肠癌，前列腺癌，胃癌，而最引人注目的一点莫过于乳腺癌!在所有癌症发病占比中，乳腺癌首次超越肺癌站上了冠军的位置。 早在2018年的统计报告中，癌症所致死亡在中国还屈居第二，而来到2020年，中国人的死亡原因排名中癌症已经跃居第一。 随着人类对抗癌症的严峻形势，肿瘤早筛的市场应运而生，甲基化几乎发生在所有的肿瘤当中，所以针对于不同肿瘤靶点的甲基化试剂盒受到了广泛关注，其中肠癌因其具有明确的早筛临床意义，以及相对成熟的技术路径，相对其他癌种的早筛产品走的更快，也为降低肠癌的死亡率做出了很重要的贡献。 2014年，Exact Sciences结合多学科原理，建立了多靶点粪便DNA检测方法，推出了Cologuard，用于肠癌筛查并获得了FDA审批。包括7个DNA点突变位点（KRAS），以及2个DNA甲基化位点（NDRG4和BMP3）2017年以来，我国也有近十个甲基化试剂盒面向市面，涵盖肠癌、胃癌等癌种，肠癌的早筛试剂盒因其检测样本获取简单，样本无需复杂处理，操作便利，准确快速，无侵入创伤性，成为早期结直肠癌很有前景的筛查方法之一。我搜索数据发现，目前在注册阶段的甲基化试剂盒有几十个。2021年，北京市率先将甲基化检测纳入医保范畴，足见甲基化试剂盒的研发前景广阔。DNA甲基化标记物被认为是一种预测因素。它们不仅可用于早期疾病的筛查，还可用于确定个体对化疗的反应。此外，在治疗或治疗性手术后监测DNA甲基化谱可能可以给治疗有效性的评估和检测疾病复发提供证据。 基于此，甲基化试剂盒的研发已经成为各大IVD企业争相开发的模块，而在甲基化研发阶段，获得稳定的阳性和阴性对照至关重要，早期使用体外构建质粒或亚硫酸盐转化的 DNA作为企业参考品已经逐渐退出甲基化试剂盒研发的舞台，若使用来自临床的样本作为对照又受限于该标准品的不稳定和难获取的特性。所以寻找稳定的甲基化/非甲基化细胞株以及构建去甲基化/甲基化细胞株成为企业较为倾向的对照品，来源于细胞株的对照品可以实现稳定的供应，且成本较低。 说到基因编辑细胞， CRISPR技术 在基因编辑细胞的工作中大放异彩，不仅有Cas9对基因的特定编辑， Cas9的核酸酶 发生双突变后可以产生“钝化”和“死亡”Cas9，即“dCas9”，这种核酸酶失去切割DNA的功能，但在gRNA的指导下仍能以相同的精确度靶向和结合DNA。切割失活的Cas9连上转录抑制和激活元件，可以达到基因组特定位点的修饰， dCas9蛋白可以与效应器阻遏（如蛋白和激活剂结构域）形成融合蛋白，这样，dCas9可以将这些效应器带到启动子区域、调控区域或编码区域，对任何基因进行精确定点调控而不造成DNA损伤, 如结合TET1（DNA甲基化羟化酶）可以特异性催化DNA的去甲基化，从而调节基因的表达. 海星生物利用CRISPR技术可以对特定基因的甲基化进行编辑，此外也可以构建去甲基化的广泛使用细胞株，海星生物也致力于建立细胞平台，整合甲基化细胞株，助力甲基化试剂盒研发。 参考文献：Kulis M, Esteller M. DNA methylation and cancer. Adv Genet. 2010;70:27-56. doi: . PMID: 20920744.
1923 年开始在汽油中加入铅用作抗爆剂以后, 更加速了全球性铅的污染。因此可以说如今世界上已难找到土壤铅含量不受人类活动影响的一片“净土”。Kabata - Pendias 和Rendias[5 ]报道在靠近公路的某一块土壤铅含量高达7000μg/ g。潘如圭等[6 ]研究了汽车尾气中铅对公路两侧蔬菜的污染情况。试验结果表明: 在公路两侧200 m 范围内生长的蔬菜均受到汽车尾气中铅的污染。管建国[7 ]等研究了在金属冶炼厂周围和公路两侧200 m 范围内蔬菜的受污染情况, 发现所调查的普通叶菜的铅含量均超过国家食品卫生标准。彭珊珊等[8 ]对我国一些常用茶中Pb 进行了测定, 结果表明茶叶中的铅超过一般标准, 应引起重视。土壤中的铅大部分形成PbS , 少部分形成PbCO3 、PbSO4 和PbCrO4 等无机化合物, 或与有机物螯合。铅的无机化合物大多难以溶解, 而且因受到下列因素影响, 铅在土壤中的迁移能力也很弱: (1) 土壤有机质对铅的络合作用。土壤有机质的—SH , —NH2 基因能与铅离子形成稳定的络合物。(2) 土壤粘土矿物对铅的吸附作用。粘土矿物的阳离子交换位点可对铅离子进行交换性吸附。另外, 铅离子进入水合氧化物的配位壳, 直接通过共价键或配位键结合于固体表面。由于铅在土壤中迁移能力弱, 而且溶解度低, 因而人为因素造成的铅污染大多停留在土壤表层, 随土壤深度的增加其含量急剧降低, 20 cm 以下趋于自然水平。进入土壤中的铅有可能被植物吸收, 或溶解到地表水中, 通过食物链和饮用水进入动物和人体, 进而影响人类健康。近年来的研究发现, 铅对人类健康的影响具有不可逆性和远期效应[9 ] 。Page[2 ]等研究表明, 人体血铅与土壤铅含量存在一定关系:0112 (Pb - B , μg/ 100mg) = ln (Pb - S ,μg/ g) - 4185这一关系式仅说明了某一地区的特殊情况, 并无广泛适用价值, 但它足以表明土壤铅含量与人体健康有直接关系。2 铅污染土壤的修复技术由于铅对人体具有很强的毒性, 近年来对铅污染土壤的修复引起了人们的普遍关注。铅污染土壤的修复技术可以分为两大类: 物理化学修复技术和生物修复技术。物理化学修复技术又可分为隔离包埋技术、固化稳定技术、Pyrometallurgical Separation 、化学稳定技术和电动修复技术等。生物修复技术又可分为微生物修复技术和植物修复技术等。211 隔离包埋技术(isolation and containment)该法采用物理方法将铅污染土壤与其周围环境隔离开来, 减少铅对周围环境的污染或增加铅的土壤环境容量。具体措施为: 以钢铁、水泥、皂土或灰浆等材料, 在污染土壤四周修建隔离墙, 并防止污染地区的地下水流到周围地区。其中以水泥最为便宜, 应用也最为普遍。为减少地表水的下渗, 还可以在污染土壤上覆盖一层合成膜, 或在污染土壤下面铺一层水泥和石块混合层。212 固化稳定技术(solidification and stabilization)固化稳定技术包括两个方面: 采用化学方法降低铅在土壤中的可溶性和可提取性, 同时采用物理方法将污染土壤包埋在一个坚固基质中。Wheeler 报道[10 ]将水泥、炉渣和石灰混合物加入污染土壤中, 搅拌均匀凝固之后, 形成一个大石块, 将污染土壤包埋在其中。也有人采用电导产热原理给土壤加热升温, 当土壤冷却后, 土壤凝固成玻璃样块状结构, 称之为玻璃化。该方法包括三个具体步骤: (1) 在土壤两端插上电极电流通过土壤形成环路, 土壤温度上升并熔化。(2) 在自然冷却过程中, 土壤凝固形成玻璃样土块。(3) 在土块上覆盖一层干净土壤。这一技术已经实际应用于铅污染土壤的修复。·13 · 广东微量元素科学 2001 年 GUANGDONG WEILIANG YUANSU KEXUE 第8 卷第9 期 © 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights Pyrometallurgical Separation在一定温度下, 金属就会熔解或升华为气态。Pyrometallurgical separation 技术利用这一原理,将铅等重金属从污染土壤中“蒸发”出来以达到净化土壤的目的。“蒸发”出来的金属可以再回收或固定, 同时富含金属的剩余炉渣也可用于进一步提炼[11 ] 。铅污染土壤在高温熔化之前要进行预处理, 以促进铅的熔解。这一技术主要应用于具有较高回收效率的严重污染土壤(5 %～20 %) 。214 化学稳定技术(chemical stabilization)化学稳定技术就是应用化学反应将污染土壤中的重金属氧化或还原, 从而达到降低土壤中重金属的活性[11 ] 。对于铅污染土壤, 可用还原剂(二氧化硫、亚硫酸盐或硫酸亚铁) 将铅离子还原, 以减少土壤中铅的可提取量。这一技术也可作为其他修复技术(如固化稳定技术) 的前处理步骤。但必须注意的是, 还原剂的施用可能会造成二次污染。初步研究表明, 施用石灰调节土壤PH7 可降低铅在土壤中的溶解度, 减少植物对铅的吸收[13 ] 。研究表明, 施用羟基磷灰石[14 ] 、水合氧化锰[15 ] 、磷灰岩[16 ,17 ]也可促进铅的沉淀, 减少土壤中的可溶态和可提取态铅。Vidac 和Pohland[18 ]已将这一技术运用于地下水的修复。215 电动修复技术(electrokinetice technology)在污染土壤两端插上电极, 接通电源后, 土壤中的带电粒子向电性相反的电极移动, 最终积聚或沉淀在电极上, 以达到清除污染土壤中重金属的目的。在欧洲, 这一技术不仅应用于铅污染土壤[19 ] , 同时也应用于铜、锌、铬、镍和镉等污染土壤的修复。216 微生物修复技术(microremediation)微生物修复主要是借助微生物的生化反应来清除或稳定环境中的有害物质。根据原理不同可分为生物还原沉淀、生物甲基化和生物吸附三种。生物还原沉淀是应用硫酸还原菌(SRB) 将硫酸根还原为HS - 再与铅生成不溶性的Pb2S。生物甲基化是利用微生物将土壤中的重金属甲基化,甲基化的金属更容易蒸发, 可做为Pyrometallurgical Separation 的预处理。生物吸附是利用细菌细胞和藻类来吸附地下水或其他污染水体中的有害物质。Leusch 等[20 ]报道一种海藻( S . f luitans )对铅的最大吸附量可达到369 mg/ g。Rahmani 等[21 ]研究了浮萍(Lemna minor) 对污染水体中铅的清除能力。结果表明浮萍在亚致死水平下也能有效清除水体中的铅。217 植物提取修复技术(phytoextration)植物提取修复技术主要是利用超积累植物, 将土壤中各种过量元素或化合物大量转移到植株体内特别是地上部分, 从而修复污染土壤[22 ] 。超积累植物相当于一个太阳能驱动泵将土壤中的过量元素不断泵到植株体内[23 ] 。植物修复技术可分为两种, Salt 等[24 ]把利用超积累植物来吸收土壤重金属的方法称之为持续植物提取(continuous phytoextraction) ; 而把利用螯合剂来促进植物吸收土壤重金属的方法称之为诱导植物提取(inducced phytoextraction) 。21711 持续植物提取(continuous phytoextraction)运用持续植物提取技术来修复铅污染土壤的关键是植物超积累铅的能力。一般认为, 只有铅积累量达到1000μg/ g (干重) 才能称为铅超积累植物[25 ] 。已见报道的铅超积累植物有Brassica .nigua [26 ] , Brassica . pekinensis [27 ] , Brassica . juncea [27 ]和T. rotungifolium [28 ] 。其中T. rotungi2folium 的铅积累量最大, 可达到8200μg/ g (干重) [28 ] 。目前对于植物吸收、运输和积累铅以及耐铅胁迫的机制研究甚少。Liu 等[29 ]研究发现印度芥菜( Brassica juncea) 可在根部积累大量的铅但只有极少部分运输到地上部。原因一方面可能是由于根部细胞内存在高浓度磷酸盐或碳酸盐,在细胞内近中性pH 条件下, 铅主要以磷酸盐或碳酸盐形式沉淀在根细胞壁或细胞内; 另一方面·14 · 广东微量元素科学 2001 年 GUANGDONG WEILIANG YUANSU KEXUE 第8 卷第9 期 © 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.铅从根部向中柱迁移的过程还会受到内皮层凯氏带的阻拦。Wozny 等[30 ]认为铅进入中柱后随蒸腾流被动运输到地上部分。运输过程中铅可能会与中柱内的阳离子交换位点结合, 从而被固定在茎部中柱内。研究表明, 铅可与多种小分子有机物螯合[31～33 ] 。推测铅也有可能与各种小分子有机酸、植物螯合肽结合, 减少与阳离子交换位点结合的机会, 从而增加进入了叶部的数量。作者在对浙江西部的某一铅锌矿土壤进行调查时, 发现一种可高浓度积累铅和锌的植物, 据初步调查结果, 其地上部分锌和铅的最高积累量分别达到了5000μg/ g 和1182μg/ g。对于这种植物超积累锌和铅的生理生化机制, 正在进一步的研究中。21712 诱导植物提取(inducced phytoextraction)对于在土壤中极难移动的铅元素, 施用螯合剂可促进植物对其的吸收。施用螯合剂诱导植物超富集作用被称为螯合诱导修复技术。Romheld 和Marschner[34 ]认为螯合物与金属结合后, 金属螯合物可以从内皮层裂口处进入根内, 然后被迅速地转移到茎叶。在用14C - EDTA - Pb 作标记的试验中, Blaylock 等[35 ]发现, 在含这种标记物的介质中生长的植物地上部能快速积累铅, 表明铅与螯合物结合有利于植物对铅的吸收。Salt 等[36 ]认为金属与螯合物结合后阻止了金属的沉淀和吸附, 从而提高了金属的可提取性。螯合诱导修复技术既可选用一般植物也可选用超积累植物。在土壤铅浓度为2500μg/ g 的污染土壤上种植玉米和豌豆, 加入EDTA 后, 植物地上部铅的浓度从500μg/ g 提高到10000μg/ g ; 而且EDTA 还能极大的提高铅从根系向地上部的运输能力,每千克土中加入110 g EDTA , 24 h 后, 玉米木质部中铅的浓度是对照的100 倍, 从根系到地上部的运输转化量是对照的120 倍[37 ] 。不同螯合剂促进植物对铅吸收的效应与螯合剂促进铅从土壤解吸的效应相一致: EDTA > HEDTA >DTPA > EGTA > EDDHA。螯合诱导技术对超积累植物吸收金属的强化效应也很明显。印度芥菜是一种可富集多种金属的植物。Blaylock 等[35 ]研究了柠檬酸、苹果酸、乙酸、EDTA、EGTA、CDTA 对印度芥菜( Brassica juncea) 吸收Cd 和Pb 的效应,发现土壤酸化与施加螯合物相结合可显著增加铅的吸收效率。Vassil 等[38 ]报道用铅和EDTA 共同处理印度芥菜, 其地上部分含量高达55 mmol/ kg (干重) , 相当于培养液铅浓度的75 倍。对印度芥菜茎部提取液的直接测定证明, 茎部的大部分铅是与EDTA 结合的形式运输的。由于螯合剂的价格一般较贵, Blaylock 等[35 ]指出螯合剂( EDTA 和乙酸) 将使每吨铅污染土壤修复成本增加715 美元。此外螯合剂在增加土壤中重金属生物有效性的同时, 也增加了重金属离子的移动性。因而对于螯合诱导修复技术的环境风险应加以系统评价。由于已发现的铅超积累植物种类极少, 而且植物生长慢、生物量小, 因而螯合诱导修复技术比持续提取技术更引人注目。但不论哪种植物修复技术都具有其它物理化学方法所没有的优点:(1) 成本低。据估计, 如果某种植物的茎部铅积累量达到1 % , 且每年产量40 t/ hm2 , 那么通过10 年种植将土壤铅含量从114 %下降为014 %所需费用是245000 美元, 而用物理化学修复技术则需要1600000 美元。(2) 植物利用太阳能, 不破坏生态平衡, 同时还能美化环境, 易为公众所接受。(3) 将富铅植物残体用于植物炼矿, 可产生经济效益。相比之下, 虽然植物修复技术所需时间较长, 而且植物的生长要受到环境的影响, 但这些缺点都不成为重要问题。可以预言, 植物修复将成为一种应用广泛、环境良好和经济有效的修复铅污染土壤的方法。参考文献：[3 ] 陈怀满等. 土壤- 植物系统中的重金属污染[M] . 北京: 科学出版社, 1996.[4 ] Nriagu J O , Acyna J M. Quantitative assessment of worldwide contamination of air , water and soil by trace metal[J ] . Nature , 1988 , 333 : 134～139.[5 ] Kabata - Rendias A , Rendias H. Trace elements in the soil and plant [M] . Florida CRC Press , 1994.[6 ] 潘如圭, 宋佩扬. 汽车尾气中铅对蔬菜污染的研究[J ] . 江苏环境科技, 1998 , 11 (3) : 9～11 , 28.[7 ] 管建国, 潘如圭. 蔬菜铅污染状况及其防治对策[J ] . 南京农专学报, 1998 , 14 (3) : 22～27.[8 ] 彭珊珊, 石燕. 茶叶中的铅[J ] . 广东微量元素科学, 1998 , 5 (6) : 32～33.[9 ] 沙拉麦提, 沙达提. 儿童的铅接触及危害[J ] . 新疆环境保护, 1996 , 18 (1) : 36～38.[10 ] Wheeler P. Leach repellent [J ] Ground Engng , 1995 , 28 : 20～22.[11 ] USEPA. Engineering Buttetin : Technology Alternatives for the Remediation of Soils Contaminated with Arsenic ,Cadmium , Mercury and Lead [M] . U S Envionmental Protection Agency. Office of Emergency and RemedialResponse , Cincinnati . OH. 1996.[12 ] Evando C R , Dzombak D A. Remediation of metals - comtaminated soils and groundwater . Technology Evalua2tion Report , TE97 - 01 [ R ] . Pittsburgh P A. Ground - water Remediation Technologies Analysis Center ,1997.[13 ] Hooda P S , Alloway B J . The effect of liming on heavy metal concentrations in wheat , carrots and spinach grownon previously sludge - applied soils [J ] . J Agric Sci , 1996 , 127 : 289～294.[14 ] Ma L Q. Factors influencing the effctiveness and stability of aqueous lead immobolization by hydroxyapatite [J ] .J Environ Gual , 1996 , 25 (6) : 1420～1429
表观遗传学，包括组蛋白共价修饰(covalent histone modification)、DNA甲基化修饰(DNA methylation)、RNA甲基化修饰(RNA methylation)、基因组印记(genomic imprinting)、基因沉默(gene silencing)、RNA编辑(RNA editing)及非编码RNA(noncoding RNA)等，是 指在核苷酸序列不发生改变的情况下，生物表型或基因表达发生了稳定的可遗传变化 。 RNA甲基化 作为表观遗传学研究的重要内容之一，是指发生在RNA分子上不同位置的甲基化修饰现象， 6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A) 和 5-甲基胞嘧啶(C5-methylcytidine，m5C) 是真核生物中最常见的两种RNA转录后修饰。RNA甲基化在调控基因表达、剪接、RNA编辑、RNA稳定性、控制mRNA寿命和降解等方面可能扮演重要角色。 相对于DNA甲基化，RNA甲基化更加复杂、种类繁多、普遍存在于各种高级生物中。已知绝大部分真核生物中，mRNA在5’ Cap处存在甲基化修饰，作用包括维持mRNA稳定性、 mRNA前体剪切、多腺苷酸化、 mRNA运输与翻译起始等。而3’ polyA发生的修饰有助于出核转运、翻译起始以及与polyA结合蛋白⼀起维持mRNA的结构稳定。但是这些修饰只发生mRNA的头部和尾部，关于RNA的内部修饰（internal modification）在许多种类的RNA中都有发⽣。无论是mRNA还是lncRNA，都大量存在m6A修饰。m6A能够加速mRNA前体的加工时间，加快mRNA在细胞中的转运速度和出核速度。主要学习研究较多的m6A。RNA的m6A甲基化⼀共有大三类酶参与： Writers、 Erasers和Readers ，需要相关研究的可以学习相关文献。 检测m6A的方法非常多，如包括MeRIPseq、 miCLIP-seq、 SCARLET、 LC-MS/MS等。2012年之后，两篇发表于Nature和Cell上的论⽂可以说是第⼀次从转录水平上，大范围高通量地鉴定了人和小鼠m6A的甲基化水平（Dominissini 2012和Meyer 2012）。这两篇独立发表的论文采用的 核心方法就是 将m6A抗体与带有m6A的mRNA片段相结合 后进行高通量测序 。通过对下机数据的分析，来鉴定mRNA上m6A程度较高的区域，分辨率约为100nt。这种方法我们称之为MeRIP-seq（ me thylated R NA i mmuno p recipitation sequencing）或m6A-seq。 MeRIP-seq建库步骤 ： 1. 提取total RNAs，并用Oligo-dT磁珠对total RNAs带有polyA的mRNA进行富集（通常要求Total RNA 300ug，人鼠可以做微量2ug 但结果可能会出现map率低dup率高 建库步骤与常量也有区别）； 2. 用磁珠进行富集，得到带有polyA的mRNA。之后加入片段化试剂，将完整的mRNA进行片段化。或者使用超声波仪直接进行片段化； 3. 将片段化后的RNA分成两份。⼀份加入带有m6A抗体的免疫磁珠，对含有m6A甲基化的mRNA片段进⾏富集。另⼀份作为control，直接构建类似常规的转录组测序文库（这一步就是IP步骤，片段化程度、抗体抓取效率都会影响到后期实验结果；这里的control通常称为Input）；4. 对m6A抗体免疫磁珠进行富集，带有m6A的mRNA片段进行回收后，按照转录组的建库流程构建常规的测序文库； 5. 分别将构建好的2个测序文库，即m6A-seq library和RNA-seq library分别进行高通量测序。测序平台保持一致，推荐Hiseq X ten或Novaseq； 6. 对下机数据进行生物信息学分析，对发生m6A甲基化程度较高的区域进行peak calling。由于不能做到单个碱基的分辨率，所以只能对大致的区域进行分析。从下图中我们可以发现，与右侧常规的转录组测序结果相比，在基因上有两处区域存在非常明显的高甲基化峰； 7.接下来会进行一些常规分析，如peak区域基因注释，差异peak分析。 以上就是关于m6A-seq的标准步骤，现在是不是对m6A-seq有了一个非常直观的认识呢？ 再次强调下，这种测序方法只能鉴定高甲基化的区域，并不能做到单碱基的分辨率。 思路1 老数据挖掘 第一步：先从原有的转录组数据中，挖掘到差异表达的甲基化酶； 第二步：对挖掘到的甲基化酶如METTL3或FTO等进⾏qPCR验证，并进行m6A-seq分析哪些基因甲基化水平发生改变； 第三步：在细胞（动物模型可选）中对这些酶进行敲低和过表达，进行常规的qPCR和WB检测相关酶表达情况，并用LC-MS/MS法检测RNA整体m6A水平； 第四步：继续对这些敲低和过表达的细胞进行转录组测序/小RNA测序或表达谱芯片/小RNA芯片，分析哪些基因出现差异表达变化和可变剪切变化； 第五步：找到甲基化酶调控的靶基因，进行敲低和过表达，看甲基化酶缺陷的细胞或动物模型表型能否补救； 第六步：在确定上一步靶基因确实受到甲基化酶调控后，对靶基因上的motif进行点突变后进行验证； 第七步：鉴定新型的甲基化酶（可选）。 思路2 研究甲基化修饰差异基因 第一步：直接进行m6A-seq和转录组测序，找到时间顺序或差异表达的基因并用qPCR、 WB等⽅法验证，此外找到m6A有差异的基因； 第二步：对甲基化酶进行敲低和过表达，检测RNA整体的m6A水平，之后可进行转录组或小RNA测序等方法检验甲基化酶敲低和过表达对mRNA或miRNA整体的影响，并着重研究第⼀步中感兴趣的m6A有差异的靶基因； 第三步：对靶基因进行敲低或过表达，是否能够对甲基化酶异常表达后的表型进⾏恢复； 第四步：对靶基因上motif进行点突变后进⼀步确认直接受到甲基化酶调控； 第五步：鉴定新型的甲基化酶（可选）。 当然根据不同的研究目的还有许多其他的研究思路，可根据自身实验设计进行延申和拓展。m6A相关SCI论文根据不同实验手段IF2~20不等，实验手段：m6A-seq、转录组测序/表达谱芯片、 LC-MS/MS 或 m6A 比色法、小RNA 测序/小RNA芯片、qPCR、 WB、敲降/过表达、靶基因验证、动物实验、临床实验/药物实验等。 学习资源来源网络，侵删。 参考学习： 1、 高通量RNA甲基化测序数据处理与分析研究进展 2、 RNA修饰检测技术 Roundtree, Ian A et al. “Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation.” Cell vol. 169,7 (2017): 1187-1200. doi: Helm, M, & Y. Motorin. "Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate.” Nature Reviews Genetics (2017):275.
最佳回答：酯化的速度的大小排序：苯甲酸，邻甲基苯甲酸，2,6-二甲基苯甲酸。原因是甲基是电子基团，导致羧基电离度降低，酸性弱。
找了一篇专利描述，不知道对你有没有些微帮助。
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一种利用固体核磁碳谱检测煤结构参数的定量分析方法与流程
文档序号：11197378
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本发明涉及固体核磁碳谱分析技术领域，特别涉及一种利用固体核磁碳谱检测煤结构参数的定量分析方法。
背景技术：
煤是一种由多种官能团、多种化学键组成的复杂有机大分子。了解煤大分子结构模型对认识煤的物理化学性质有重要意义。从煤有机分子的碳结构角度，可以揭示煤液化产物的碳结构变化，为推导煤液化反应机理奠定良好的基础。对煤组成结构深入研究，与工艺性能相结合，能更好的指导工业生产，实现煤炭清洁高效的利用。
煤中只有少部分是可溶于各种溶剂的小分子化合物，其余的大部分是不能被溶解的大分子骨架结构。运用固体核磁共振技术可以在对煤进行非破坏性研究情况下，直接检测煤样，得到煤碳结构参数。由于13C核天然丰度低，13C的NMR信号弱、探测灵敏度低，而且由于外磁场中核的各种相互作用以及固体中化学位移各向异性，磁核之间的直接偶极相互作用引起了谱线增宽、不对称线型，分辨率下降情况。直到70年代中期，随着固体核磁交叉极化(CP)和魔角旋转(MAS)等技术发展，固体13C-NMR逐渐应用于煤的研究中。CP技术增强了稀核信号，提高灵敏度，解决碳原子的纵向弛豫时间(T1)太长的问题；而MAS技术则消除化学位移的各向异性；边带压制技术(TOSS)消除样品快速旋转时使得某些原子核的共振谱线产生较大的旋转边带。所以为了窄化谱线、增加灵敏度，得到高分辨率的固体13C-NMR图谱时通常联合使CP、MAS和TOSS等几种技术，这已成为当今研究煤分子结构的普遍方法。
80年代固体核磁技术在常规固体高分辨核磁共振谱的基础上又发展了偶极相移技术，可以区分质子化碳和非质子化碳，提供芳碳率、芳氢率及脂碳率等新的结构信息。到了90年代，利用常规固体技术和偶极相移技术结合谱图分段积分方法得到更为详细的碳结构参数，但是偶极相移技术操作较复杂，需要多次实验，耗时甚多。1996年Koh Kidena等人运用CP和SPE 13C-NMR测试PM煤碳结构，通过分峰拟合(拟合软件为MacAlice)的方法将碳信号分为11类含碳官能团信号，如表1所示。
表1 13C NMR中不同类型碳对应的化学位移
如今基于不同类型碳的不同化学位移归属，结合计算机辅助技术—分峰拟合技术能够直观、精细和快速的得到多种不同类型碳的含量，得到不同碳材料的结构参数。
由于13C CP/TOSS/MAS NMR中CP技术将丰核(1H)较大的自旋状态极化转移给较弱的稀核(13C)，使稀核(13C)极化而迅速恢复平衡，缩短了测试时间，但在对氢去耦过程中增强了碳原子能量，使得碳谱谱线增强。简而言之，当分子内两个磁核之间空间位置相近时，对氢核去耦时达到饱和的氢核会将能量转移到碳核上，从而使得碳谱谱线增强，该现象称为碳核Overhause效应(NOE)。因此13C CP/TOSS/MAS NMR谱图中碳原子谱线的强度并不能定量的反映分子内不同化学环境下碳原子的相对数量，交叉极化实验中，接触时间的不足、射频场的不均匀性、NOE效应的存在都使得固体核磁定量不准确，与理论碳结构参数存在误差，不能准确进行碳材料的定量研究。液体核磁中运用门控去耦技术已消除了核Overhause效应，可以很好的进行碳结构定量。而固体核磁定量大多是通过对谱仪硬件的提升以及脉冲序列的巧妙设计，以达到定量效果，但还未见到快速、有效方便的定量方法。90年代Robert 等在研究中就表明CP技术的运用主要使季碳芳香碳的磁化比例比质子化碳低，所测得的芳香度要偏低。所以对于大量不带质子碳原子的高成熟煤样，如无烟煤测出的误差要相对小一些，而对于大量带质子碳原子的低阶煤中误差就比较大。所以煤结构分析中煤固体核磁碳结构参数定量分析就显得尤为重要。
煤的组成结构模型一直是煤化学研究的核心问题之一。在煤结构方面，中国专利CN 104091504A蔺华林等人通过对煤样固体核磁表征以及对煤液化油气质联用分析构建了煤大分子模型。通过固体核磁碳谱测试表征煤的详细碳结构参数，能够为煤结构模型准确构建奠定坚实的基础，所以获得固体核磁碳结构参数的准确合理性就显得尤为重要。由于核Overhause效应等因素的存在，运用13C CP/TOSS/MAS NMR测试结果对碳材料直接分析，表征碳结构参数不够准确，测定的参数存在一定的误差。
技术实现要素：
本发明的目的在于修正煤中固体核磁碳谱测定碳结构参数的误差，得到相对准确的碳结构参数，提供了一种利用固体核磁碳谱检测煤结构参数的定量分析方法。
所述方法包括如下步骤：
S1)选取模型化合物；
所述模型化合物包括一系列带脂肪侧链和/或含杂原子官能团的固体芳香化合物，各所述模型化合物的芳香度不同，所述芳香度为不饱和碳原子数与总碳原子数之比；
S2)测定各模型化合物的固体核磁碳谱；
S3)建立校正固体核磁碳谱测试误差的回归曲线方程；
根据不同类型碳原子位移归属和步骤S2测定的固体核磁碳谱，运用分峰拟合方法拟合得到各模型化合物的不同类型碳原子含量拟合值，求和分别计算出各模型化合物的饱和碳原子含量拟合值X％和不饱和碳原子含量拟合值Y％；
再将各模型化合物的饱和碳原子含量拟合值X％分别与各模型化合物的饱和碳原子含量理论值进行回归分析，获得饱和碳校正固体核磁测试误差的回归曲线方程(Ⅰ)，
X’＝f(X) (Ⅰ)；
将各模型化合物的不饱和碳原子含量拟合值Y％分别与各模型化合物的不饱和碳原子含量理论值进行回归分析，获得不饱和碳校正固体核磁测试误差的回归曲线方程(Ⅱ)，
Y’＝f(Y) (Ⅱ)；
其中X’、Y’分别为与X和Y对应的修正值；
S4)验证回归曲线方程准确性；
将已知结构的验证化合物按照步骤S2相同的测试条件测定固体核磁碳谱，所述验证化合物也为带脂肪侧链和/或含杂原子官能团的固体芳香化合物；同样通过分峰拟合得到验证化合物的不同类型碳原子含量拟合值，求和分别计算出验证化合物的饱和碳原子含量拟合值X％和不饱和碳原子含量拟合值Y％，然后分别代入回归曲线方程(Ⅰ)和(Ⅱ)得到对应的修正值X’和Y’，再将修正值与验证化合物的理论值比较，验证回归曲线方程的准确性；若验证化合物的饱和碳原子含量和不饱和碳原子含量的修正值与理论值相对误差大于10％，说明准确性不高，重新调整模型化合物的种类和数量，重复步骤S1～S3，直到验证化合物的饱和碳原子含量和不饱和碳原子含量的修正值与理论值相对误差小于10％；
S5)待测煤样碳结构参数的测定及修正；
将待测煤样按照步骤S2中相同的测试条件进行固体核磁碳谱测试，同样通过分峰拟合得到待测煤样的不同类型碳原子含量拟合值，求和分别计算出待测煤样的饱和碳原子含量拟合值X％和不饱和碳原子含量拟合值Y％，然后分别代入回归方程(Ⅰ)和(Ⅱ)得到待测煤样对应的修正值X’和Y’，再根据X’和待测煤样的各个类型的饱和碳原子含量拟合值等比例计算出各个类型的饱和碳原子含量的修正值，根据Y’和待测煤样的各个类型的不饱和碳原子含量拟合值等比例计算出各个类型的不饱和碳原子含量的修正值。上述修正值即为修正后的待测煤样碳结构参数。
所述饱和碳原子含量指饱和碳原子(本文中又称脂肪碳)在总的碳原子中的占比，不饱和碳原子含量指不饱和碳原子(本文中又称芳香碳)在总的碳原子中的占比，下同。
优选的，所述模型化合物选自苯系、萘系和蒽菲系化合物中的至少三种化合物，各化合物纯度大于98％，其中芳香度最低的为30～40％，最高的为90～95％。
优选的，所述模型化合物包括：3,4-二甲基苯甲酸、十二烷基苯磺酸钠、2-萘乙酸、2-甲基萘和9-甲基蒽。
优选的，所述验证化合物也选自苯系、萘系和蒽菲系化合物。
优选的，所述验证化合物为9,10-二甲基蒽。
优选的，步骤S2、S4和S5中，模型化合物、验证化合物及待测煤样在测定固体核磁碳谱前，粉碎研磨至80目以下并在65℃下真空干燥24h。
优选的，步骤S2、S4和S5中，固体核磁碳谱测试条件为：脉冲序列为CP/TOSS，13C共振频率与仪器相匹配，交叉极化接触时间为1～5ms，循环延迟时间为1～10s，魔角转速为3～7k Hz，转子外径为4～7mm。
优选的，步骤S3中，选用Origin软件进行模型化合物非性回归分析，曲线的相关系数R2大于后得到相应的回归曲线方程。
本发明的一些较佳实施例中，回归曲线方程(Ⅰ)和(Ⅱ)均为非线性二次函数，通式如下：
X’＝a1+b1X+c1X2
Y’＝a2+b2Y+c2Y2
式中：a1，b1，c1，a2，b2，c2为曲线回归系数。
本发明具有以下优点和有益效果：
本发明的所述方法以一系列带脂肪侧链和/或含杂原子官能团的苯系、萘系和蒽菲系化合物作为模型化合物，通过测定模型化合物的固体核磁碳谱，确定不同模型化合物碳结构参数误差，将模型化合物碳谱分峰拟合的脂肪碳和芳香碳拟合值与样品碳结构的理论值进行回归分析，得到脂肪碳和芳香碳的校正固体核磁碳谱测试误差回归曲线方程，同时再运用已知结构的模型化合物验证回归方程的准确性；通过对不同模型化合物的固体核磁测定及回归分析，利用回归曲线方程对待测煤样的拟合参数进行修正，可有效解决固体核磁碳谱测试中碳结构参数的误差，实现固体核磁碳谱定量分析。本发明的所述方法为13C CP/TOSS/MAS NMR技术与非线性回归方程相结合，能够快速方便的获得相对准确的不同类型碳结构参数，为煤中碳结构分析提供了新的技术保障，提供了一种简便易行的结构参数修正方法。应用所述方法能够相对准确的测定煤结构参数，从而可以从有机碳角度更好的了解煤的结构和性质，为煤结构的解析提供新的技术支撑，对煤的高效转化和利用起指导作用。
所述的方法不仅适用于煤中碳结构的分析，同样适用于油页岩矿产类含碳固体物质及生物质类含碳固体物质中的固体核磁碳谱的分析。
附图说明
图1为不同模型化合物脂肪碳拟合值与理论值回归曲线图；
图2为不同模型化合物芳香碳拟合值与理论值回归曲线图；
图3为淖毛湖褐煤的分峰拟合图；
图4为小龙潭褐煤的分峰拟合图；
图5为黑山次烟煤的分峰拟合图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1新疆淖毛湖褐煤(NMH)碳结构参数的分析
S1)样品及预处理
待测煤样：新疆淖毛湖褐煤。
模型化合物：3,4-二甲基苯甲酸、十二烷基苯磺酸钠、2-萘乙酸、2-甲基萘、9-甲基蒽；如表2所示，其中十二烷基苯磺酸钠的芳香度最低为％，9-甲基蒽的芳香度最高为％，其余的间于两者之间。
验证化合物：9,10-二甲基蒽，芳香度为％。
预处理：将上述待测煤样、模型化合物和验证化合物分别粉碎研磨至80目以下，煤样在65℃下真空干燥24h，干燥、均匀稳定的样品能保证样品在高速旋转或受到强电磁辐射时不爆炸。
S2)测定各模型化合物的固体核磁碳谱
分别将约150mg研磨均匀后的3,4-二甲基苯甲酸、十二烷基苯磺酸钠、2-萘乙酸、2-甲基萘、9-甲基蒽分别装入4mm ZrO2转子中，在BrukerAVANCEIII500型核磁共振波谱仪上选用脉冲序列为CP/TOSS进行固体核磁碳谱测试，选用4mm固体高分辨率魔角旋转探头。测试条件为：13C共振频率，交叉极化接触时间为1ms，循环延迟时间为3s，魔角转速为 Hz，转速为5600r/s。
S3)建立校正固体核磁碳谱测试误差的回归曲线方程
根据表1所示的不同类型碳位移归属和步骤S2测定的固体核磁碳谱，运用分峰拟合方法拟合得到各模型化合物的各个类型碳原子含量的拟合值(X3％，Xa％，X2％，X1+X*％，XO％，YH％，YB％，YS％，YO％，YCC1％，YCC2％)，求和分别计算出各模型化合物的脂肪碳含量拟合值X％和芳香碳含量拟合值Y％，
X＝X3+Xa+X2+X1+X*+XO，Y＝YH+YB+YS+YO+YCC1+YCC2。
将各模型化合物的芳香碳和脂肪碳的拟合值与其理论值进行误差比较，结果见表2所示。
表2不同模型化合物碳结构理论值与实测值误差
由表2可知，通过上述常规的测定固定核磁碳谱以及分峰拟合的方法测得的碳结构拟合值与理论值误差较大，原因就是由于核Overhause效应等因素使得芳香碳和脂肪碳谱线强度增量不一致。
将步骤S2)中分峰拟合得到的各模型化合物的脂肪碳和芳香碳含量拟合值与各模型化合物的脂肪碳和芳香碳含量理论值进行回归分析，分析结果见图1和图2，相应的，得到脂肪碳校正固体核磁碳谱测试误差非线性回归曲线方程：
X’＝(R2＝，n＝2) (Ⅰa)
以及芳香碳校正固体核磁碳谱测试误差非线性回归曲线方程：
Y’＝(R2＝，n＝2) (Ⅱa)
式中X’、Y’分别为与X和Y对应的修正值。
脂肪碳的理论值与拟合值以及芳香碳的理论值和拟合值有良好的相关性，相关系数R2＝；换言之固体核磁碳谱测试误差可以用响应非线性二次函数进行修正。。
S4)回归曲线方程准确性验证
将9,10-二甲基蒽按照步骤S2中相同的测试条件测定固体核磁碳谱，分峰拟合得到9,10-二甲基蒽的不同类型碳原子含量拟合值，求和分别计算出9,10-二甲基蒽的饱和碳原子含量和饱和不碳原子含量的拟合值X和Y，然后分别代入回归曲线方程(Ⅰa)和(Ⅱa)得到的X’和Y’为修正值，将9,10-二甲基蒽的饱和碳原子含量和不饱和碳原子含量修正前后的拟合值与理论值比较，结果见表3，修正后脂肪碳和芳香碳与其理论值相对误差均在10％以内，故运用非线性回归方法可以很好的修正固体核磁碳谱测试中的脂肪碳和芳香碳含量误差，可以得到较为准确的结构参数。
表3 9,10-二甲基蒽中碳结构实测值和理论值误差
S5)淖毛湖褐煤(NMH)结构参数的测定及修正
将淖毛湖褐煤煤样按照步骤S2中相同的测试条件进行固体核磁碳谱测试，同样通过分峰拟合得到淖毛湖褐煤煤样的不同类型碳原子含量拟合值，求和分别计算出淖毛湖褐煤煤样的饱和碳原子含量拟合值X％和不饱和碳原子含量拟合值Y％，然后分别代入回归方程(Ⅰa)和(Ⅱa)得到淖毛湖褐煤煤样对应的修正值X’和Y’，再根据X’和淖毛湖褐煤煤样的各个类型的饱和碳原子含量拟合值等比例计算出各个类型的饱和碳原子含量的修正值，结果见表4，根据Y’和待测煤样的各个类型的不饱和碳原子含量拟合值等比例计算出各个类型的不饱和碳原子含量的修正值，结果见表5。
表4修正前后淖毛湖褐煤不同类型脂肪碳分布
表5修正前后淖毛湖褐煤不同类型芳香碳分布
同时对煤样作元素分析，元素分析结果如表6所示。
以H/C作为对比参数，煤结构中氢原子以脂肪氢和芳香氢的形式存在，其中脂肪氢部分包括甲基、次甲基以及亚甲基形式，而芳香氢中则主要以质子化氢以及羧基中的氢存在，不考虑酚类，则煤的H/C原子比可根据公式估算：H/C＝(YH+(1-Y)×)/100。修正前后淖毛湖褐煤H/C原子比及芳香度(芳香碳含量)见表6。
表6修正前后淖毛湖褐煤H/C及芳香度
由表6可知，运用非线性回归曲线方程对NMH煤修正后的不同结构参数估算的H/C原子比与元素分析结果具有一致性。对NMH煤的不同类型碳结构参数修正可靠，非线性回归曲线方程修正后能够得到相对准确的碳结构参数。
实施例2小龙潭褐煤(XLT)碳结构参数的分析
按照实施例1的分析步骤对小龙潭褐煤进行分析
步骤S5中，将小龙潭褐煤煤样按照步骤S2中相同的测试条件进行固体核磁碳谱测试，同样通过分峰拟合得到小龙潭褐煤煤样的不同类型碳原子含量拟合值，求和分别计算出小龙潭褐煤煤样的饱和碳原子含量拟合值X％和不饱和碳原子含量拟合值Y％，然后分别代入回归方程(Ⅰa)和(Ⅱa)得到小龙潭褐煤煤样对应的修正值X’和Y’，再根据X’和小龙潭褐煤煤样的各个类型的饱和碳原子含量拟合值等比例计算出各个类型的饱和碳原子含量的修正值，结果见表7，根据Y’和小龙潭褐煤煤样的各个类型的不饱和碳原子含量拟合值等比例计算出各个类型的不饱和碳原子含量的修正值，结果见表8。
表7修正前后小龙潭煤不同类型脂肪碳分布
表8修正前后小龙潭煤不同类型芳香碳分布
同样对小龙潭褐煤进行元素分析，元素分析结果以及修正前后小龙潭煤的H/C原子比及芳香度(芳香碳含量)见表9。
表9修正前后小龙潭煤H/C及芳香度
由表9可知，运用非线性回归曲线方程对XLT煤修正后的不同结构参数估算的H/C原子比与元素分析结果具有一致性。对XLT煤的不同类型碳结构参数修正可靠，非线性回归曲线方程修正后能够得到相对准确的碳结构参数。
实施例3黑山次烟煤(HS)碳结构参数的分析
按照实施例1的分析步骤对黑山次烟煤进行分析
步骤S5中，将黑山次烟煤煤样按照步骤S2中相同的测试条件进行固体核磁碳谱测试，同样通过分峰拟合得到黑山次烟煤煤样的不同类型碳原子含量拟合值，求和分别计算出黑山次烟煤煤样的饱和碳原子含量拟合值X％和不饱和碳原子含量拟合值Y％，然后分别代入回归方程(Ⅰa)和(Ⅱa)得到黑山次烟煤煤样对应的修正值X’和Y’，再根据X’和黑山次烟煤煤样的各个类型的饱和碳原子含量拟合值等比例计算出各个类型的饱和碳原子含量的修正值，结果见表10，根据Y’和黑山次烟煤煤样的各个类型的不饱和碳原子含量拟合值等比例计算出各个类型的不饱和碳原子含量的修正值，结果见表11。
表10修正前后黑山次烟煤不同类型脂肪碳分布
表11修正前后黑山次烟煤不同类型芳香碳分布
同样对黑山次烟煤煤进行元素分析，元素分析结果以及修正前后黑山次烟煤的H/C原子比及芳香度(芳香碳含量)见表12。
表12修正前后黑山次烟煤H/C及芳香度
由表12可知，运用非线性回归曲线方程对HS煤修正后的不同结构参数估算的H/C原子比与元素分析结果具有一致性。对HS煤的不同类型碳结构参数修正可靠，非线性回归曲线方程修正后能够得到相对准确的碳结构参数。
综上所述，本发明通过测定不同模型化合物固体核磁碳谱测试误差，将不同模型化合物碳谱分峰拟合的脂肪碳和芳香碳测试值与样品碳结构的理论值进行回归分析，得到脂肪碳和芳香碳的校正固体核磁碳谱测试误差的回归曲线方程，同时再运用已知结构的模型化合物验证回归方程的准确性；通过对不同模型化合物的固体核磁测定及回归分析，解决了由于核Overhause效应等因素引起的碳结构参数的误差，13C CP/TOSS/MAS NMR技术与回归曲线方程相结合能够快速方便的获得相对准确的不同类型碳结构参数，为煤碳结构分析提供了新的技术保障，提供了一种简便易行的结构参数修正方法。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
更正，应是二甲氧基苯甲酸，昨天查了资料，用硫酸二甲酯故今天决定放弃。多谢大家。
2-甲基苯甲酸无臭。2-甲基苯甲酸大多为白色颗粒，无臭或微带安息香气味，味微甜，有收敛性，易溶于水，白色结晶粉未，熔点173-177℃，医药中间体。邻甲基苯甲酸是一种化学品，分子式是C8H8O2，用于农药、医药及有机化工原料的合成，是生产除草剂稻无草的主要原料。
衔接上一篇数据比对后的结果，使用R包DSS进行处理。
我们先来复习一下上一节课得到的数据结果： *. 文件
这里我们使用的R包为DSS，使用 Bioconductor 进行安装。 这个包可以对甲基化数据做两件事：
DSS包对差异甲基化的检测基于β负二项分布的严格沃尔德检验。
输入数据的格式如下:
DML是甲基化差异位点，DMR为甲基化差异区域。 使用DSS包自带的数据进行演示
1. 载入两个包DSS和bsseq（需要该包构建obj对象）
2. 利用DMLtest函数call DML，分为一下几个步骤：
根据甲基化水平进行loci的差异分析
3. 根据dmlTest来call DML
当然，用户也可以指定差异的阈值，只有差异大于阈值的才会被call出来。
4. 根据dmlTest Call DMR
我们可以发现，smoothing前后得到的结果差异还是很大，所以针对不同的实验类型我们需要注意是否使用smoothing。 同理，也可以使用的delta参数以及调整得到合适的结果。
5. 可视化 DSS包提供了一个不是很美观的可视化函数，用户其实可以使用coverage结果在R里面作图。
分析到此就告一段落了，随后就是自行对差异甲基化区域的注释以及可视化文献作图。
后续在处理数据的时候，发现有一个情况，多核跑DMLtest会报错，详情解决方案可见 以下为简单解决方案
近年来，中枢神经系统(CNS)肿瘤的分类变得更加客观、更依托生物学认知。虽然过去的分子诊断包括特定突变、拷贝数变化或基因融合，但DNA甲基化测序的发展显著提高了诊断精度，增加了可靠性，并为发现新的肿瘤类型提供了思路。在大多情况下，基因突变/融合与DNA甲基化间存在着密切关系。在这篇综述中，作者强调了DNA甲基化图谱在中枢神经系统肿瘤分类中的作用，重点介绍了几种肿瘤类型，以及DNA甲基化图谱对目前肿瘤分类的贡献。 CpG 甲基化测定 有多种方法可以量化DNA甲基化，每种方法在临床肿瘤学中都有不同的应用。限制性内切酶酶切、亲和富集方法，如甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)和电化学检测都是用于测定全基因组甲基化的方法。基因组DNA的重亚硫酸盐测序是最常用的方法，重亚硫酸氢钠可以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，除此之外还有全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS)技术。图1概述了目前DNA甲基化图谱的诊断应用及其在外科神经病理学中的作用。生物信息分析 为了将甲基化阵列数据转化为实际应用，需要执行各种分析和计算步骤。用甲基化数据描述肿瘤类型的一个比较常见和实用的方法是降维。类似于主成分分析(PCA)，这些算法将高维数据(例如，数千个脑瘤样本，每个样本具有约20-30k数据)降至低维(2或3)以便于可视化(图2)。 值得一提的是，甲基化阵列数据中还可以获得其他对诊断有帮助信息。人们很早就认识到甲基化和非甲基化信号强度的总和可以用来推断全基因组的拷贝数，分段的拷贝数数据以及拷贝数断裂点的分析也会对诊断和基因融合的判断起到帮助作用。诊断准确性及其对临床结果的影响 截止到目前，甲基化图谱已经识别出多个新的中枢神经系统肿瘤类型和亚型，其中许多都与临床病程和临床结果有着重要的关联。在临床中，甲基化数据分析在很多病例诊断结果的确定上起到了重要的辅助作用。 基于的临床检测出的差异甲基化数据，从前被归类为原始神经外胚层肿瘤现在被分类成多个不同的肿瘤类型，这些肿瘤包括具有高频率C19MC改变的多层菊形团胚胎性肿瘤(ETMR)，具有 FOXR2 激活的中枢神经母细胞瘤(CNS-NB-FOXR2)，BCOR串联重复的CNS肿瘤(CNS-BCOR-ITD)。总体而言，基于DNA甲基化数据的非监督分析对于CNS-PNET亚型间的区别具有重要的临床意义。 新型和罕见的肿瘤类型 除了在识别常见的中枢神经系统肿瘤类型方面的优势外，甲基化特征分析的一个新的优势是它能够发现新的肿瘤类型，并提供现有类型的确认/改进。例如， IDH1/2 突变定义了一个广泛的弥漫性胶质瘤亚型，这些亚型在临床和分子上与异柠檬酸脱氢酶(IDH)野生型弥漫性胶质瘤不同，这种遗传差异通过DNA甲基化图谱得到证实。甲基化图谱针对对于许多新的肿瘤类型在很大程度上已经成为了一种发现工具。 胶质瘤（Gliomas） 毛细胞型星形细胞瘤(HGAP)包括一个独特的甲基化群，包括 ATRX、TERT 启动子突变； CDKN2A/B 缺失/突变、 CDK4 扩增； NF1 缺失/突变、 BRAF 融合等。组织学表现与其他胶质瘤有很大重叠，HGAP多见于年轻人(中位年龄40岁)，主要见于颅后窝。值得注意的是，HGAP在儿童(0-16岁)中发病是比较罕见的，这个年龄段的大多数形态学诊断的“毛细胞型星形细胞瘤伴间变”与其他甲基化类别聚集在一起，包括毛细胞型星形细胞瘤和IDH-野生型GBM。 目前，甲基化图谱是诊断这种肿瘤类型的唯一方法。在HGAP中发现的基因改变(如 CDKN2A/B 纯合缺失、 ATRX 突变、 BRAF 融合)是非特异性的，可见于其他中枢神经系统肿瘤类型。然而，检测到这些基因改变，就应该引起对HGAP的怀疑。临床上，HGAP与其他高级别胶质瘤的区别很重要，因为HGAP的预后比PA和PXA更具侵袭性，但总体存活率明显高于IDH-野生型GBM。HGAP被误诊为GBM的情况并不少见，精准诊断在临床上具有十分重要的意义，因此将组织学相似的肿瘤分解为生物学和临床相关的类型是DNA甲基化分类的显著优势之一(图3)。神经胶质瘤（Glioneuronal Tumors） 弥漫性胶质神经元瘤具有少突胶质瘤样特征和核簇(DGONC)是最近提出的一种通过甲基化定义的肿瘤类型，它是通过对>25000个中枢神经系统肿瘤的非监督聚类而发现的。DGONC的组织学表型可能与其他肿瘤类型有显著重叠，包括少突胶质细胞瘤和CNS-PNET。在低级别胶质细胞或神经胶质细胞肿瘤中常见的遗传学改变，如FGFR1和BRAF，尚未在测序病例中发现。由于这种肿瘤类型的遗传驱动因素尚未阐明，DNA甲基化图谱仍然是检测其的唯一方法。在低级别胶质细胞或神经胶质细胞肿瘤中，典型的遗传学改变，如 FGFR1 和 BRAF ，尚未在测序病例中被发现。由于这种肿瘤的遗传驱动因素尚未明确，DNA甲基化图谱仍是其检测的唯一方法。 胚胎肿瘤（Embryonal Tumors） 多层菊形团胚胎性肿瘤(ETMR)是一种高度分级(WHO 4级)的原始中枢神经系统肿瘤，具有明显的组织学特征。ETMR甲基化图谱显示与其他中枢神经系统肿瘤类型明显分离，并形成一个相对同质的群体，无论是C19MC扩增还是 DICER1 突变状态。绝大多数病例存在多层菊形团和神经纤维团混合区域的特征性组织学特征。结合LIN28A免疫组织化学，在显微镜下即可作出诊断。尽管LIN28A具有很高的敏感性，但它的表达不是ETMR所特有的，在AT/RT、生殖细胞肿瘤和HGG中已有报道。因此，DNA甲基化分析是诊断ETMR的一种特异性方法，与潜在的组织病理学或基因突变无关，同时基于甲基化的拷贝数评估也可以作为识别潜在亚型的有用特征。 这些肿瘤类型之间的区别在临床上十分重要，通常可以通过组织病理学和影像学来解决。然而，非典型病例可能会造成诊断困难。AT/RT和PDC(脊椎)的平均OS分别为个月和51个月(AT/RT不同亚型的生存期不同）。CRINET和DMT的生存数据有限，但已报道的平均OS分别为125个月(AT/RT-TYR为37个月)和36个月。尽管有共同的基因改变，AT/RT、PDC和DMT的DNA甲基化特征还是具有明显特异性的(图2)。到目前为止的数据表明，DNA甲基化图谱可以区分可能会构成诊断问题的大多数 SMARCB1 失活的中枢神经系统肿瘤。 间充质肿瘤（Mesenchymal Tumors） 伴有 CIC 基因重排的肉瘤是一种罕见的高级别间叶性肿瘤，同时发生于中枢和中枢神经系统外。在组织学上，伴有 CIC 基因重排肉瘤的特点是肿瘤细胞形态呈梭形或圆形，高度恶性(增殖、坏死)，并有数量不等的粘液基质。特征性的基因改变是 CIC 与各种配对基因的易位，导致作为显性癌基因的融合。在中枢神经系统中，最常见的是 CIC-NUTM1 融合，由t(15；19)易位。在 CIC 融合阳性的病例中，有14%的 CIC 裂解FISH呈假阴性。此外，在融合阴性的病例中也发现了 CIC 突变。最近的一份报告还指出，出现了涉及 ATXN1 和 DUX4 的非 CIC 融合基因。在甲基化图谱上根据 CIC 基因将肉瘤重新分成不同的组，与潜在的融合基因/突变或解剖部位无关(图2)。 DICER1 突变的原发性颅内肉瘤是一种新发现的高度恶性肉瘤，由染色体上 DICER1 基因的体细胞或胚系突变所定义。发生在胚系 DICER1 突变背景下的肿瘤可能代表遗传性或综合征性关联(即 DICER1 综合征)。胚胎型横纹肌肉瘤的组织学特征常见于肌源性分化、形态学和免疫表型重叠。因此，初步命名为“具有横纹肌肉瘤样特征的梭形细胞肉瘤， DICER1 突变体”。 DICER1 突变的颅内肉瘤的组织学表现没有特异性，可能与其他肉瘤如滑膜肉瘤、纤维肉瘤和胶质肉瘤重叠。而DNA甲基化分析可以很容易地将 DICER1 突变的原发性颅内肉瘤与其它肿瘤类型区分开来。然而，还需要进一步的研究来评估DNA甲基化分析是否能将其与转移性 DICER1 突变肿瘤区分。已建立的中枢神经系统肿瘤的表观遗传学亚型 作者在这篇文章中还提供了DNA甲基化图谱对已建立的世卫组织中枢神经系统肿瘤亚型的贡献的例子。世界卫生组织对中枢神经系统肿瘤的第5版分类预计将包括更多分子定义的亚型。甲基化阵列分析已被证明能有效地识别并在某些情况下定义这些亚型。 易基因小结 将DNA甲基化分析整合到中枢神经系统肿瘤的常规检查中，可以提高诊断的准确性以及实现明确肿瘤类型的临床意义。捕捉原发性中枢神经系统肿瘤的遗传异质性是DNA甲基化图谱最大的优势。尤其在组织学上不明确的肿瘤类型中具有重要价值，这些肿瘤类型可能含有靶向改变(例如，IHG)。DNA甲基化在确认组织学诊断方面的可靠性已经得到证实。 在骨骼和软组织病理学中实施的基于DNA甲基化阵列的分类可能预示着其他疾病领域得检测也会发生类似的转变。在通过TCGA分析的33种癌症中，全基因分子图谱显示了基于DNA甲基化数据的无监督聚类的所有类型中具有生物学或预后意义的亚群，进一步强调了DNA甲基化在其他癌症中的潜在临床应用价值。鉴于中枢神经系统肿瘤诊断对甲基化特征的日益依赖及其在临床分类标准中的应用，在诊断神经病理学的实践中，特别是对于罕见的中枢神经系统肿瘤，有必要进一步研究和利用DNA甲基化检测这一对临床诊断有巨大帮助作用的技术。
WGBS全称Whole Genome Bisulfite Seuqneicng： 即全基因组重亚硫酸盐测序。该方法通过Bisulfite处理，将原基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U的同时，保留所有甲基化C的碱基不发生转变，从而帮助科研人员识别发生甲基化的CpG位点。该种测序技术适用于绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。 RRBS全称Reduced Representation Bisulfite Sequencing： 即简化代表性重亚硫酸盐测序。该方法在Bisulfite处理前，使用MspI（该酶的酶切位点为CCGG）酶切对样本进行处理， 去除低CG含量DNA片段 ，从而使用较小的数据量富集到尽可能多的包含CpG位点的DNA片段。 相比于WGBS技术，RRBS是一种准确、高效且经济的DNA甲基化研究方法，通过酶切，并进行Bisulfite测序，该方法在保证DNA甲基化状态检测的高分辨率的同时提升测序数据的高利用率。 甲基化数据处理流程：
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学位论文是作者为获得某种学位而撰写的研究报告或科学论文。一般分为学士论文、硕士论文、博士论文三个级别。
不可以。依据《中华人民共和国学位条例》第十一条规定：学位授予单位，在学位评定委员会作出授予学位的决议后，发给学位获得者相应的学位证书。发学位证书后，不得以任何理由进行退回，除冒名顶替、伪造证件、论文抄袭者这样的严重舞弊情况才可能会被撤销或收回学位和毕业证。
查重是一种常见的技术，它可以帮助学者检查自己的论文是否存在重复的内容。查重的方法有很多，最常用的是语料库查重，它可以检查文章中是否存在相似的文本，以及论文中与其他论文的相似程度。除此之外，还可以使用抄袭检测软件，通过对文本进行比较，判断是否存在抄袭行为。此外，还可以使用网络查重工具，通过搜索网络上的文章，来检测文章是否存在相似的内容。总之，查重是一种有用的技术，能够帮助作者检测其论文是否存在重复的内容，可以防止学术不端行为的发生。
1 会查重2 因为学术界对于抄袭和剽窃的惩罚非常严厉，所有的论文都需要经过查重来保证学术诚信3 即使是未发表的论文也需要进行查重，因为未来可能会有机会发表，而且即使不发表，也需要保证自己的论文没有抄袭和剽窃现象。因此，自己的论文也需要进行查重。