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Synthesis of optically pure ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoateby Escherichia coli transformant cells coexpressingthe carbonyl reductase and glucose dehydrogenase genes由共表达碳酰还原酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌转化细胞合成纯光学（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯Abstract The asymmetric reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate (COBE) to ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate((S)-CHBE) was investigated. Escherichia coli cells expressing both the carbonyl reductase (S1) gene from Candida magnoliae and the glucose dehydrogenase (GDH) gene from Bacillus megaterium were used as thecatalyst. In an organic-solvent-water two-phase system,(S)-CHBE formed in the organic phase amounted to M (430 g/l), the molar yield being 85%. E. coli transformant cells coproducing S1 and GDH accumulated M (208 g/l) (S)-CHBE in an aqueous monophase system by continuously feeding on COBE, which is unstable in an aqueous solution. In this case, the calculated turnover of NADP+ (the oxidized form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) to CHBE was 21,600 mol/mol. The optical purity of the (S)-CHBE formed was 100% enantiomeric excess in both systems. The aqueous system used for the reduction reaction involving E. coli HB101 cells carrying a plasmid containing the S1 and GDH genes as a catalyst is simple. Furthermore, the system does not require the addition of commercially available GDH or an organic solvent. Therefore this system is highly advantageous for the practical synthesis of optically pure (S)-CHBE.本本篇文献研究了利用COBE不对称合成（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯（CHBE）。大肠杆菌细胞作为催化剂同时表达了来自念珠菌属magnoliae的碳酰还原酶和来自巨大芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因。在水/有机溶剂两相体系中，(S)-CHBE在有机相中的浓度可以达到（430g/l），摩尔产率达到85%。大肠杆菌的副产物S1和GDH也达到了（208g/l），COBE在水相中不稳定，所以(S)-CHBE可以在水单相中不停的生成。在这种情况下，适当的从NADP+到CHBE的转变达到了21,600 mol/mol。所形成的CHBE的旋光度在这种体系中100%对映体过量。在水相中用携带含有S1和GDH基因质粒的E. coli HB101作为催化剂不对称还原是比较简单的。并且，这种体系并不额外需要商业GDH或者有机溶剂。因此，这种体系对于实际合成纯光学活性的(S)-CHBE是非常方便的。Optically active 4-chloro-3-hydroxybutanoic acid esters are useful chiral building blocks for the synthesis of pharmaceuticals. The (R)-enantiomer is a precursor of L-carnitine (Zhou et al. 1983), and (S)-enantiomer is an important starting material for hydroxymethylglutaryl- CoA (HMG-CoA) reductase inhibitors (Karanewsky et al. 1990). Many studies have described the microbial or enzymatic asymmetric reduction of 4-chloro-3-oxobutanoic acid esters (Aragozzini and Valenti 1992; Bare et ; Hallinan et al. 1995; Patel et al. 1992; Shimizu et al. 1990; Wong et al. 1985) based on the reduction by baker’s yeast (Zhou et al. 1983).We have previously showed that Candida magnoliae AKU4643 cells reduced ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate (COBE) to (S)-CHBE with an optical purity of 96% enantiomeric excess (.) (Yasohara et al. 1999). As this yeast has at least three different stereoselective reductases (Wada et al. 1998, 1999a, b), the (S)-CHBE produced by this yeast was not optically pure. From among these three enzymes, an NADPH-dependent carbonyl reductase, designated as S1, was purified and characterized in some detail (Wada et al. 1998). We cloned and sequenced the gene encoding S1 and overexpressed it in Escherichia coli cells. This E. coli transformant reduced COBE to optically pure (S)-CHBE in the presence of glucose, NADP+, and commercially available glucose dehydrogenase (GDH) as a cofactor generator (Yasoharaet al. 2000). Here, we describe the construction of three E. coli transformants coexpressing the S1 from C. magnoliae and GDH from Bacillus megaterium genes and analyze the reduction of COBE catalyzed by these strains. Previous reports on the enzymatic reduction of COBE to (R)-CHBE with an optical purity of 92% . (Kataoka et al. 1999; Shimizu et al. 1990) recommended an organic- solvent two-phase system reaction for an enzymatic or microbial reduction, because the substrate (COBE) is unstable in an aqueous solvent and inactivates enzymes. We examined the reduction of COBE to optically pure (S)-CHBE by E. coli transformants in a water monophase system reaction and discuss the possible use of this type of reaction system in industrial applications。具有旋光性的（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯在药物制剂的合成中是重要的手性化合物。其右旋体是L-卡尼汀的前体，其左旋体是羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂的起始材料。许多研究描述了以面包酵母为基础微生物或者酶的COBE的不对称还原。我们先前已经知道利用来自念珠菌属magnoliae AKU4643 细胞催化COBE生成光学纯度96%的CHBE。这种酵母至少有三种立体选择性的还原酶，这种酵母产生的CHBE并非纯光学的，在这三种酶之中，NADPH-依赖碳酰还原酶，我们克隆并测序编码S1的基因，并在大肠杆菌中过表达。大肠杆菌转化细胞在葡萄糖，NADP+和商业化的葡萄糖脱氢酶作为辅酶因子的启动子催化COBE生成纯光学的CHBE。我们构建这三种大肠杆菌转化细胞共表达来自的S1和来自巨大芽孢杆菌的GDH，并分析COBE被这几种菌株催化还原的反应机理。先前的报道表明，利用酶催化还原COBE生成CHBE光学纯度可达92%，也提到了因为底物（COBE）在水相中不稳定，并且酶容易钝化，所以利用酶或者微生物在有机溶剂/水两相体系中催化反应。我们研究了在水单相体系中由COBE还原生成纯光学的CHBE，还讨论了这种反应体系在工业应用中可能的用途。Materials and methodsBacterial strain and plasmids The E. coli strains used in this study were JM109 and pGDA2, in which the GDH gene from B. megaterium is inserted into pKK223-3, was kindly provided by Professor I. Urabe, Osaka University (Makino et al. 1989). Plasmids pSL301 and pTrc99A were purchased from Invitrogen (USA), and Amersham Pharmacia Biotech (UK), respectively. Plasmids pUC19 and pSTV28 (Homma et al. 1995; Takahashi et al. 1995) were purchased from Takara Shuzo (Japan).材料和方法菌株和质粒本次实验中使用的大肠杆菌是JM109 and HB101。来自B. megaterium的GDH基因插入到Pkk233-3质粒中，而带有GDH基因片段的pGDA2质粒由到由大阪大学的urabe教授提供。质粒pSL301和 pTrc99A是由美国的Invitrogen公司和英国的公司分别购买的。质粒pUC19和pST28是由日本takara公司购买的。The recombinant plasmid used in this study was constructed as follows (Fig. 1): Plasmid pGDA2 was double-digested with EcoRI and PstI to isolate a DNA fragment of about kilobase pairs (kb) including the GDH gene. This fragment was inserted into the EcoRI-PstI site of plasmid pSL301 to construct plasmid pSLG. Plasmid pSLG was double-digested with EcoRI and XhoI to isolate a DNA fragment of about kb including the GDH gene.这次实验使用的重组质粒构建如下：质粒pGDA2 被EcoRI 和 PstI双酶切从而分离出一个大小约为的包含有GDH基因的DNA片段。这个片段被插入到质粒Psl301的EcoRI-PstI酶切位点从而构建出质粒pSLG。质粒pSLG被EcoRI和XhoI To construct plasmid pNTS1G, this fragment was inserted into the EcoRI-SalI site of pNTS1, which was constructed to overproduce S1 as described previously (Yasohara et al. 2000). To construct plasmid pNTGS1, plasmid pNTG was first generated. Two synthetic primers (primer 1, TAGTCCATATGTATAAAGATTTAG,and primer 2 TCTGAGAATTCTTATCCGCGTCCT) were prepared for polymerase chain reaction (PCR) using pGDA2 as the template. The PCR-generated fragment was double- digested with NdeI and EcoRI and then inserted into the NdeI EcoRI site of plasmid pUCNT, which was constructed from pUC19 and pTrc99A, as reported (Nanba et al. 1999), to obtain pNTG. To construct plasmid pNTGS1, two synthetic primers (primer 3, GCCGAATTCTAAGGAGGTTAATAATGGCTAAGAACTTCTCCAACG, and primer 4, GCGGTCGACTTAGGGAAGCGTGTAGCCACCGTC) were prepared using pUCHE, which contains the S1 gene as the template. The PCR-generated fragment was double-digested with EcoRI and SalI and then inserted into the EcoRI-SalI site of pNTG to obtain pNTGS1. Plasmid pNTS1G, pNTGS1 or pNTG was transformed into E. coli HB101.构建pNTS1是为了过表达前文所提到的S1，这个大小的片段被插入到pNTS1的EcoRI-SalI酶切位点从而构建pNTS1G。为了构建质粒pNTGS1，首先需要构建pNTG。两个合成引物（引物1，TAGTCCATATGTATAAAGATTTAG和引物2，TCTGAGAATTCTTATCCGCGTCCT）和作为模板的pGDA2是PCR反应需要的。PCR得到的片段是由NdeI 和EcoRI双酶切和并插入到质粒pUCNT的NdeI EcoRI酶切位点来得到pNTG。根据报道，pUCNT是由pUC19和 pTrc99A构建而来。为了构建质粒pNTGS1，两个合成引物(引物 3, GCCGAATTCTAAGGAGGTTAATAATGGCTAAGAACTTCTCCAACG, and 引物 4, GCGGTCGACTTAGGGAAGCGTGTAGCCACCGTC)，包括了S1基因作为模板。Pcr产物片段被EcoRI和SalI双酶切然后被插入到pntg的EcoRI-SalI酶切位点得到pntg1.质粒pNTS1G, pNTGS1或者 pNTG都是导入大肠杆菌 pGDA2 was double-digested with EcoRI and PstI to isolate a DNA fragment of about kb including the GDH gene. To construct plasmid pSTVG, this fragment was inserted into the EcoRI-PstI site of plasmid pSTV28. Plasmid pSTVG was transformed into E. coli HB101. 质粒pGDA2被EcoRI 和 PstI双酶切得到包含GDH基因的大小的DNA片段。为了构建pSTVG质粒，这个片段被插入到pSTV28质粒的EcoRI-PstI的酶切位点。pSTVG质粒被导入到E. coli HB101。Medium and cultivationThe 2×YT medium comprised Bacto-tryptone, yeastextract, and NaCl, pH . E. coli HB 101 carrying pNTS1,pNTG, pNTS1G, or pNTGS1 was inoculated into a test tube containing2 ml 2×YT medium supplemented with mg/ml ampicillin,followed by incubation at 37 °C for 15 h with reciprocal preculture ( ml) was transferred to a 500-ml shakingflask containing 100 ml 2×YT medium. The cells were cultivatedat 37 °C for 13 h with reciprocal shaking. E. coli HB101 carryingpNTS1 and pSTVG was similarly cultivated in 2×YT mediumsupplemented with mg/ml ampicillin and mg/ml chloramphenicol.培养基和培菌2*YT培养基 包含有细菌用胰蛋白胨，酵母提取物， NaCl，.携带有pNTS1,pNTG, pNTS1G, 或 pNTGS1的大肠杆菌HB101被接种到有氨苄青霉素的2ml的2*YT培养基，37°C摇床15小时。将菌液接种到100ml2*YT培养基的500ml烧瓶中。在37°C摇床培养13小时。携带有pNTS1 和 pSTVG质粒的大肠杆菌HB101在2*YT培养基中培养方法相似，只是培养基中要加入 mg/ml的氨苄青霉素和 mg/ml的氯霉素。Preparation of cell-free extracts and the enzyme assay Cells were harvested from 100 ml of culture broth by centrifugation, suspended in 50 ml of 100 mM potassium phosphate buffer (pH ), and then disrupted by ultrasonication. The cell debris was removed by centrifugation; the supernatant was recovered as the cell-free extract. Carbonyl reductase S1 activity (COBE-reducing activity) was determined spectrophotometically as follows: The assay mixture consisted of 100 mM potassium phosphate buffer (pH ), mM NADPH, and 1 mM COBE. The reactions were incubated at 30 °C and monitored for the decrease in absorbance at 340 nm. The assay mixture for GDH activity consisted of 1 M Tris-HCl buffer (pH ), 100 mM glucose, and 2 mM NADP+. The reactions were incubated at 25 °C and monitored for the increase in absorbance at 340 nm. One unit of S1 or GDH was defined as the amount catalyzing the reduction of 1 μmol NADP+ or oxidation of 1 μmol NADPH per minute, respectively. Protein concentrations were measured with a proteinassay kit containing Coomassie brilliant blue (Nacalai Tesque, Japan),using bovine serum albumin as the standard (Bradford 1976).无细胞抽提液和酶鉴定将100ml培养液离心收获菌体，用为的磷酸缓冲液悬浮，然后超声粉碎。细胞碎片通过离心可以去除，收集上层清液就是无细胞抽提物。碳酰还原酶S1的活性由分光光度计测量如下：测定的混合物包括：的磷酸二氢钾缓冲液，和1mMCOBE。反应在30°C条件下反应，并且随时监测其在340nm处的吸光值。测GDH混合物包括：1M pH 的Tris-HCl的缓冲液，100mM的葡萄糖，2mM的NADP+。反应在25°C下进行，监测其在340nm处的吸光值。一个单位S1或GDH被定义为每分钟催化还原1μmol NADP+或氧化1 μmol NADPH的量。蛋白质的测定通过含有考马斯亮蓝的蛋白质测定试剂利用牛血清白蛋白作为标准进行测定。Study of enzyme stabilityOne milliliter of 100 mM potassium phosphate buffer (pH ) containing the cell-free extracts of E. coli HB101 carrying pNTS1 (S1: 20 U/ml) was mixed with an equal volume of each test organic solvent in a closed vessel. After the mixture was shaken at 30 °C for 48 h, the remaining enzyme activities in an aqueous phase were assayed as described above. The mixture, containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH ), S1 (20 U/ml), and various concentrations of CHBE, was incubated at 30 °C for 24 h in order to study the enzyme’s stability in the presence of remaining enzyme activities were assayed as described above.酶稳定性的研究一毫升含有含有pNTS1质粒的E. coli HB101的无细胞抽提液的100mM磷酸氢二钾缓冲液（）与等体积的有机溶剂混合。混合物在30 °C震摇48小时后，水相中残留的酶活力即是上述的酶活力。COBE reduction with E. coli cells expressing the S1 gene and E. coli cells expressing GDH genes in a two-phase system reaction The reaction mixture comprised 15 ml culture broth of E. coli HB101 carrying pNTG, 17 ml culture broth of E. coli HB101 carrying pNTS1, mg NADP+, 4 g glucose, g COBE, 25 ml n-butyl acetate, and about 25 mg Triton X-100. The pH of the reaction mixture was controlled at with 5 M sodium hydroxide. At 2 h, g COBE and g glucose were added to the reaction mixture. To compare the reaction by E. coli transformant coexpressing the GDH and S1 genes, 30 ml culture broth of E. coliHB101 carrying pNTS1G was used instead of culture broth of E. coli HB101 carrying pNTG and E. coli HB101 carrying pNTS1. Other components and the procedure were the same as described above.表达S1基因和GDH基因的大肠杆菌细胞在两相反应体系中的还原反应混合物包含有带有pNTG质粒的大肠杆菌HB101的菌液15ml，pNTS1质粒的大肠杆菌HB101的菌液17ml， mg NADP+，4 g葡萄糖，的COBE，25ml的n-butyl acetate丁酰醋酸盐和大约25mg的聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100。用5M的NaOH溶液将pH控制在。在反应两小时后，加入和葡萄糖到该混合物中。比较大肠杆菌转化细胞共表达GDH和S1基因，携带有pNTS1G质粒的大肠杆菌HB10130ml菌液取代了携带有pNTG和pNTS1质粒的大肠杆菌HB101菌液。其他的成分和步骤和上述的方法相似。 COBE reduction to (S)-CHBE in a two-phase system reaction The reaction mixture contained 50 ml of culture broth of an E. coli HB101 transformant, mg NADP+, 11 g glucose, 10 g COBE, 50 ml n-butyl acetate, and about 50 mg Triton X-100. The reaction mixture was stirred at 30 °C, and the pH was controlled at with 5 M sodium hydroxide. Five grams of COBE/ g glucose and 10 g COBE/11 g glucose were added to the reaction mixture at 3 h and 7 h, respectively; mg NADP+ was added at 26 在两相系统中还原生成（S）-CHBE反应混合物包含50ml E. coli HB101转化细胞的培养液，葡萄糖，10gCOBE，50ml丁酰醋酸，和大概50mg聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100.在30°C温度下将其混合均匀，并用5M的NaOH溶液将pH控制在。在第3小时加入5gCOBE和葡萄糖或者在第7小时加入10gCOBE和11g葡萄糖，分别在第26小时加入。 COBE reduction to (S)-CHBE in an aqueous system reaction The reaction mixture was made up of 50 ml of culture broth of an E. coli HB101 transformant, mg NADP+, 11 g glucose, and about 50 mg Triton X-100. The reaction mixture was stirred at 30 °C. Fifteen grams of COBE was fed continuously by means of a micro-feeding machine at a rate of about g/min for about 12 h. The pH of the reaction mixture was controlled at with 5 M sodium hydroxide. The reaction mixture was extracted with 100 ml ethyl acetate. The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and then evaporated in vacuo. COBE在水相中还原成(S)-CHBE的反应反应的体系是由50ml大肠杆菌HB101转化细胞的菌液，，11g葡萄糖和大约50mg聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100。反应混合物在30°C15mg的COBE通过微量添加机器以 g/min的速率连续12小时恒定的加入到体系中。用5M的NaOH溶液将pH控制在。反应混合物用100ml乙酸乙酯萃取。有机层用无水硫酸钠吸干，并在真空中脱水。Analysis The organic layer was obtained on centrifugation of the reaction mixture and was assayed for CHBE and COBE by gas chromatography. Optical purity of CHBE was analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC), as described previously (Yasohara et al. 1999).Enzymes and chemicals Restriction enzymes and DNA polymerase were purchased fromTakara Shuzo (Japan). COBE (molecular weight: ) was purchasedfrom Tokyo Kasei Kogyo (Japan). Racemic CHBE (molecularweight: ) was synthesized by reduction of COBE withNaBH4. All other chemicals used were of analytical grade andcommercially available.分析离心反应混合物得到的有机层通过气相色谱法测定其CHBE和COBE。COBE的光学纯度如前所述通过高效液相色谱法进行分析。酶和化学试剂限制性内切酶和DNA聚合酶由takara公司购得，COBE（分子量：）由东京Tokyo Kasei Kogyo公司购得，消旋体CHBE（分子量）通过COBE及NaBH4合成。所有其他化学试剂都是分析等级和商业化的试剂。Construction of E. coli transformants overproducing S1 and GDHTo express the carbonyl reductase S1 and GDH genes in the same E. coli cells, four expression vectors were constructed (Fig. 1). Plasmids pNTS1G and pNTGS1 contain the S1 gene from C. magnoliae, the GDH gene from B. megaterium, the lac promoter derived from pUC19, and the terminator derived from pTrc99A. Plasmid pNTS1 contains the S1 gene, the lac promoter derived from pUC19, and the terminator derived from pTrc99A. The enzyme activities in cell-free extracts of the E. coli transformants are shown in Table 1. E. coli HB101 cells carrying the vector plasmid pUCNT had no detectable S1 or GDH activity. E. coli HB101 carrying either pNTS1G or pNTGS1 showed S1 and GDH activity without isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) induction. The S1 activities of these two transformants were lower than the GDH activities. To obtain a transformant whose S1 activity was equal to or greater than the level of GDH activity, we used a lower copy vector, pSTV28 (Homma et al. 1995; Takahashi et al. 1995), to express the GDH gene. It may be possible to raise the S1 activity by lowering the GDH activity. Plasmid pSTVG contains the GDH gene, the lac promoter, the chloramphenicol resistance gene, and the replicative origin derived from pACYC184 for compatibility with the plasmid pNTS1. In E. coli HB101 carrying pNTS1 and pSTVG, the S1 activity was higher than the GDH activity, but this GDHlevel may be too low to regenerate in a COBE reduction reaction as described below.过产生S1和GDH的大肠杆菌转化细胞的构建为了在同一大肠杆菌细胞中表达碳酰还原酶S1和GDH基因，要构建四个表达型载体。质粒pNTS1G 和 pNTGS1包含有来自C. magnoliae的S1基因，来自B. megaterium的GDH基因，来自pUC19的LAC启动子，从pTrc99A的来的终止子，质粒pNTS1包含有S1基因，来自pUC19的LAC启动子，从pTrc99A的来的终止子。在大肠杆菌转化细胞的无细胞抽提物的酶活力如表一所示。携带有运输质粒pUCNT的大肠杆菌细胞无法检测到其S1和GDH活性。携带有pNTS1G 或 pNTGS1质粒在没有IPTG的诱导下有S1和GDH的活性。在这两个转化菌种中，S1的活力小于GDH的活力。为了得到S1活性等于或者大于GDH的大肠杆菌转化菌株，我们使用低拷贝的载体pSTV28，来表达GDH基因。它可能可以通过降低GDH的活性从而提高S1的活性。质粒pSTVG包含有GDH基因，lac启动子，和氯霉素抗性基因，以及与pNTS1具有相容性的从pACYC184得来的复制起始位点。在携带有pNTS1和pSTVG的大肠杆菌转化细胞中，S1的活性要高于GDH的活性，但是GDH的活性可能会太低而在COBE还原反应中不能再生。 太长了，字数有限制，所以不能发完。分数我无所谓啦，我很少登录的。这应该算是基因工程的吧，是我以前自己翻的，不是很好。如果你要的话可以联系我的邮箱。
这章是跟着上一章讲的，如有不适应请点击 上一章 服务器里的路由是一个非常重要的角色，它控制了路径与视图函数的关联。 url的是统一资源定位符，对可以从 互联网 上得到的资源的位置和访问方法的一种简洁的表示，是互联网上标准资源的地址。互联网上的每个文件都有一个唯一的URL，它包含的信息指出文件的位置以及浏览器应该怎么处理它。 常见的url是： 可以分成：
通俗的讲
Werkzeug 库的routing模块的主要功能在于URL解析。对于WSGI应用来讲，不同的URL对应不同的视图函数，routing模块则会对请求信息的URL进行解析并匹配，触发URL对应的视图函数，以此生成一个响应信息。routing模块的解析和匹配功能主要体现在三个类上：Rule、Map和MapAdapter。
Rule类继承自RuleFactory类。一个Rule的实例代表一个URL模式，一个WSGI应用可以处理很多不同的URL模式，这也就是说可以产生很多不同的Rule实例。这些Rule实例最终会作为参数传递给Map类，形成一个包含所有URL模式的对象，通过这个对象可以解析并匹配请求对应的视图函数。
关于Rule类有一些常用的方法：
rule实例化时至少接受一个参数，其他的都是默认参数。这个类实现了match,build等方法。主要的方法有get_url方法，这个方法重写了父类RuleFactory的方法，返回的是自身的生成器。这个方法与submain等其他的类的实现方法不同，在submain类中，这个类本身包含了rule类，故调用get_urls方法首先获得rule实例，再一次调用get_url得到一个生成器。 另外一个方法是bind方法，这个方法将rule实例绑定到map实例上,绑定后的rule能够使用map属性的方法。
通过Map类构造的实例可以存储所有的URL规则，这些规则是Rule类的实例。Map实例可以 通过后续的调用和给定的URL进行匹配。
关于Map类有一些常用的方法：
map类相当于一个存放Rule类的容器，实现的方法能对rule进行操作，也是url进入特定视图函数的中介。
MapAdapter主要是获取请求的url参数，将参数传递至相关视图函数中，进行处理。
是个“半夏”又何妨人参虽名贵，也有其局限。半夏虽普通，却也有其独特价值。出众不等于伟大，普通不代表平庸。是个“半夏”又何妨?有人说，能到达金字塔顶的只有两种动物，一个是老鹰，一个是蜗牛。老鹰有能力，它能一飞冲天，平凡的蜗牛虽然没有翅膀，却有自己独特的价值——坚持。平凡的蜗牛利用自己的优势，最终不也和老鹰一样站到了塔顶吗？东晋时人陶渊明，一生平淡无奇。对于当时的世人来说，他也只是一个“采菊东篱下，悠然见南山”的平凡人。他不求名利，不入仕途，只愿做他自己。这样的陶渊明不也成了青史留名的诗人，被后人敬仰吗？对于陶渊明来说，权贵就如同那名贵的“人参”，而他正是那普通的“半夏”，他也有自己独特的价值。是个“半夏”又何妨？古希腊哲学家柏拉图，是苏格拉底的学生。在他的一生中，他并没有看到自己的价值，只出于对苏格拉底的畏惧和敬仰，一味地想要做第二个苏格拉底。正因为这样，柏拉图虽然也很有名望，却永远也无法超越苏格拉底。因为他只是第二个苏格拉底，而没有成为无法超越的柏拉图。苏格拉底就如同那名贵的“人参”，他受人敬仰和爱戴，柏拉图就如同那普通的“半夏”，而遗憾的是，这个“半夏”只想成为“人参”。其实换个角度想想，是个“半夏”又何妨？香港大学的扫地老太袁苏妹被授予香港大学“荣誉院士”称号。这个老人一生只会写五个字。但平凡的袁苏妹却有其自身独特的价值，她对学生关心备至，勤勤恳恳地干了44年。平凡的她并不想追求任何名利，她只想做好自己。朴素的袁苏妹就如同那“半夏”，充分发挥着自身的价值，却成为了香港大学宿舍的灵魂人物。可见，是个“半夏”也无妨！如果你是鱼，不要迷恋天空；如果你是鸟，不要痴情海洋；如果你是半夏，不要嫉妒人参。是个“半夏”又何妨？！
人参被誉为百草之王，历经4000多年光阴沉淀，其根酷似人形，与东方医学文化紧密契合，自古以来就被人们赋予许多神秘而传奇的色彩。 早在2000多年前，从中国第一部药学专著起，关于人参的功效记载便历历在目： 【神农本草经】： “人参，味甘微寒。主补五脏、安精神、定魂魄、止惊悸、除邪气、明目、开心、益智，久服轻身健体”。 【本草纲目】 “治男女一切虚证，发热、自汗、眩晕、吐血、嗽血、下血、血淋、 血崩、胎前产后诸病。” 【中药大辞典】 “大补元气，固脱生津，安神。治劳伤虚损，食少，倦怠，反胃吐食，大便滑泄，虚咳喘促，自汗暴脱，惊悸，健忘，眩晕头痛，阳痿，尿频，消渴，妇女崩漏，小儿慢惊，及久虚不复，一切气血津液不足之症。” 【本草新编】 人参，味甘，气温、微寒、气味俱轻，可升可降，阳中有阴，无毒。乃补气之圣药，活人之灵苗也。能入五脏六腑，无经不到，非仅入脾、肺、心而不入肝、肾也。 【现代医学研究】 人参的养发作用：人参可扩充头部毛细血管，改善头发的营养状况;人参的功效成分被头发吸收，可提高头发的抗拉强度和延伸性，使头发更加柔顺。Kim 等［1］发现人参皂苷在1%( 质量分数) 时的表面张力为38. 1 mN·m －1， 3%的人参皂苷对于头发抗张强度与延伸率具有增强作用，增加了头发的韧性，因而增加了易于梳理的性能，超过此浓度则作用不大。 人参的防脱作用：人参具有防止与减少脱发，促进头发生长发育的作用，并且效果显著。向照瑞等［2］采用人参组方外用治疗脱发162 例，治疗组斑秃、脂秃与对照组的疗效比 较均有显著性差异( P＜0. 001) ，一般在用药半月后开 始出现毳毛或短发，对脂秃能较快减少脱发，在使用过程中未发现不良反应。［3］ 人参育发防脱的机理为: 1) 人参内含有与雌激素有关的植物激素，这些物 质有些以多肽的形式存在，可改善头部皮肤血液循环和调节免疫力，同时可轻而易举的透过皮肤屏障直接进入人的毛母细胞内，激活、营养毛母细胞，提高和促进毛母细胞的活性，达到促进毛发生长的作用。 2) 减少生长期毛囊角质形成细胞凋亡和退行性变。有研究表明人参及其组方中人参皂苷对毛囊间充质干细胞具有促增殖作用，促进毛囊生长，延长小鼠毛发生长期［4 －7］。 参考文献： ［1］KIM C K，洪绍元． 人参皂素用在头发上的功效［ J］ ． 日用化学品科学， 1981( 1) :48 －51． ［ 2］向照瑞，单一君，薛春华．菊美人参生发露治疗脱发临床疗效观察 ［ J］ ． 中西医结合杂志， 1989， 9( 1) :39． ［3］张瑞，闫梅霞等，人参美容护发功效研究现状，《日 用 化 学 工 业》第44 卷第3 期 ［4］MAT SUDA H， YAMAZAKI M， ASANUMA Y， et al．Promotion of hair growth by ginseng radix on cultured mouse vibrissal hair follicles［J］ ． Phyt Other Res， 2003， 17( 7) :797 －800． ［5］赵玉磊． 黄芪、女贞子、人参等中药促毛发生长的在体研究及其对化疗后脱发的影响［D］ ． 南京:南京医科大学， 2003． ［6］刘菲，赵文杰，刘南，等．人参茎叶皂苷对毛囊间充质干细胞增殖 的影响［ J］ ． 黑龙江医药，2012， 25( 2) :232 －234． ［7］周敏，沈敏，顾宜，等． 人参提取物对 C57BL/6J 鼠毛囊生长的影响 ［ J］ ． 解放军药学学报， 2005， 21( 6) :418 －420．繁华草本三千株 独秀云发五千年！ 繁花独秀-御用汉方草本护发品牌。 三千年的中草药智慧与现代创新科技的结合，孕育了“繁花独秀”品牌。 十年来，我们将中草药的智慧应用于头皮保养，专注于开发改善头皮问题、调理头皮到健康生态环境的产品。
合金是由金属与其它一种以上的金属或非金属所组成的具有金属通性的物质。我国是世界上最早研究和生产合金的国家之一，在商朝(距今3000多年前)青铜(铜锡合金)工艺就已非常发达；公元前6世纪左右(春秋晚期)已锻打(还进行过热处理)出锋利的剑(钢制品)。铝是分布较广的元素，在地壳中含量仅次于氧和硅，是金属中含量最高的。纯铝密度较低，为 g/cm3，有良好的导热、导电性(仅次于Au、Ag、Cu)，延展性好、塑性高，可进行各种机械加工。铝的化学性质活泼，在空气中迅速氧化形成一层致密、牢固的氧化膜，因而具有良好的耐蚀性。但纯铝的强度低，只有通过合金化才能得到可作结构材料使用者选用根据铝合金的成分和生产工艺特点,通常分为形变与铸造铝合金两大类.工业上应用的主要有铝-锰,铝-镁,铝-镁-铜,铝-镁-硅-铜,铝-锌-镁-铜等合金.变形铝合金也叫熟铝合金,据其成分和性能特点又分为防锈铝,硬铝,超硬铝,锻铝和特殊铝等五种.。铝合金的突出特点是密度小、强度高。铝中加入Mn、Mg形成的Al-Mn、Al-Mg合金具有很好的耐蚀性，良好的塑性和较高的强度，称为防锈铝合金，用于制造油箱、容器、管道、铆钉等。硬铝合金的强度较防锈铝合金高，但防蚀性能有所下降，这类合金有Al-Cu-Mg系和Al-Cu-Mg-Zn系。新近开发的高强度硬铝，强度进一步提高，而密度比普通硬铝减小15%，且能挤压成型，可用作摩托车骨架和轮圈等构件。Al-Li合金可制作飞机零件和承受载重的高级运动器材。 各种飞机都以铝合金作为主要结构材料。飞机上的蒙皮、梁、肋、桁条、隔框和起落架都可以用铝合金制造。飞机依用途的不同，铝的用量也不一样。着重于经济效益的民用机因铝合金价格便宜而大量采用，如波音767客机采用的铝合金约占机体结构重量 81％。军用飞机因要求有良好的作战性能而相对地减少铝的用量，如最大飞行速度为马赫数 的F-15高性能战斗机仅使用％铝合金有些铝合金有良好的低温性能,在-183～-253[2oc]下不冷脆，可在液氢和液氧环境下工作，它与浓硝酸和偏二甲肼不起化学反应,具有良好的焊接性能,因而是制造液体火箭的好材料。发射“阿波罗”号飞船的“土星” 5号运载火箭各级的燃料箱、氧化剂箱、箱间段、级间段、尾段和仪器舱都用铝合金制造。 航天飞机的乘员舱、前机身、中机身、后机身、垂尾、襟翼、升降副翼和水平尾翼都是用铝合金制做的。各种人造地球卫星和空间探测器的主要结构材料也都是铝合
各学校可能不同吧~~我们学校是这样的，参考文献的书写格式应符合BG7714-87《文后参考文献著录规则》。常用参考文献编写项目和顺序规定如下：著作图书文献序号□作者.（注意：应为小点，并空一格，以下同）书名.（应为小点，并空一格）出版社，（应为逗号，并空一格）出版年：引用部分起止页例子：[1]冯端.金属物理学第三卷金属力学性质.科学出版社，1999：132－144翻译图书文献序号□作者.书名.译者.出版社.出版年：引用部分起止页例子：约翰逊著.钛合金熔炼.张成军，马臣等译.科学出版社.2000年：112－121学术刊物文献序号□作者.文章名.学术刊物名，年，卷（期）：引用部分起止页例子：［1］张二林，金云学，曾松岩等.原位自生TiCP／Ti复合材料组织与铝含量的影响.材料研究学报，2001，4(3)：25－28学术会议论文序号□作者.文章名.编者名.会议名称，会议地址，年份.出版地，出版社，出版年：引用部分起止页例子：严爱民.我国铸造行业现状及发展对策.福建省机械工程学会铸造学会编.第四届20省市铸造学术会议论文集，武夷山.2002年：1－8学位论文类参考文献序号□研究生名.学位论文题目.学校及学位论文级别.答辩年份：引用部分起止页学术会议若出版论文集者，可在会议名称后加“论文集”字样。未出版论文集者省去“出版社”、“出版年”两项。会议地址与出版地相同者省略“出版地”。会议年份与出版年相同者省略“出版年”。例子：马明臻.TiC/2024复合材料的组织及阻尼性能的研究.哈尔滨工业大学博士学位论文.1999年：25－31
中国期刊全文数据库 共找到 89 条[1]帅晓艳,陈尚钘,范国荣,邱业先. 不同浓度铁素营养液对苦荞芽菜品质的影响[J]. 安徽农业科学, 2008,(17) . [2]王秀敏,谢令琴,刘艳苏,胡珍荣. 原子吸收光谱法测定小麦品种子粒中钾钠钙镁的含量[J]. 河北农业大学学报, 2003,(04) . [3]杨勤,刘汉丽,常海军,刘长英. 高效液相色谱法快速测定甘加藏羊肉中V_A含量的研究[J]. 中国草食动物, 2006,(04) . [4]潘静文,吴宗成,唐永秀. 高效液相色谱法测定龙口粉丝中过氧化苯甲酰[J]. 公共卫生与预防医学, 2004,(06) . [5]王永红,周磊. 火焰原子吸收光谱法测定金银花茶中铅、铜[J]. 淮北煤炭师范学院学报(自然科学版), 2004,(04) . [6]王秀敏,陈彦昌,谷俊涛,岳艳玲,刘丽娟. 火焰原子发射光谱法测定枣汁饮料中钾和钠[J]. 分析试验室, 2004,(08) . [7]苟锡斌. 气相色谱法测定面粉中过氧化苯甲酰[J]. 光谱实验室, 2003,(03) . [8]徐宁. HPLC测定糕点类食品中的苯甲酸[J]. 光谱实验室, 2005,(05) . [9]王霞,刘静,张冲,魏丰华,李景超,李赛钰,徐清忠. 电感耦合等离子体-原子发射光谱法快速测定粉条中的7种金属元素[J]. 光谱实验室, 2008,(04) . [10]刘艺力. 流动注射氢化物原子吸收光谱法测定食品中的痕量汞[J]. 光谱学与光谱分析, 2003,(05) . ＞＞更多 中国博士学位论文全文数据库 共找到 7 条[1]余群力. 白牦牛环境—饲草—肉奶产品食物链危害分析与安全体系研究[D]. 甘肃农业大学, 2004 . [2]蔡为荣. 米邦塔仙人掌多糖结构和功能性质的研究[D]. 江南大学, 2008 . [3]汪学荣. 猪血多肽铁螯合盐的制备技术及性质研究[D]. 西南大学, 2008 . [4]王笑丹. 畜肉品质评定方法及综合评定系统研究[D]. 吉林大学, 2008 . [5]曹荣. 对虾生物保鲜与其熟制品保藏技术的研究[D]. 中国海洋大学, 2009 . [6]张艳荣. 姬松茸综合利用关键技术研究与应用[D]. 吉林农业大学, 2008 . [7]尹春丽. 昌黎原产地葡萄酒三维荧光光谱及电子舌特征研究[D]. 西北农林科技大学, 2008 . 中国优秀硕士学位论文全文数据库 共找到 36 条[1]周鸣谦. 南瓜汁乳酸发酵工艺条件及营养成分变化研究[D]. 湖南农业大学, 2002 . [2]汤务霞. 提高酵母抽提物得率和品质的研究[D]. 西南农业大学, 2003 . [3]赵玉艳. 转Bt基因抗虫棉棉籽毒理学安全性评价[D]. 新疆农业大学, 2003 . [4]黄玉安. 稀散元素的分离富集行为及其原子吸收光谱法测定的研究[D]. 湘潭大学, 2003 . [5]蔡瑞玲. 植物蛋白咖啡饮料的研制与风味特征分析[D]. 天津科技大学, 2004 . [6]王笑丹. 吉林省优质猪肉品质评定方法[D]. 吉林大学, 2004 . [7]吴向华. 沼泽红假单胞菌（NS-04）的分离、鉴定及其在暗纹东方鲀养殖上的应用[D]. 南京师范大学, 2004 . [8]常伟. 南瓜（Cucurbitaspp） 成分分析及加工技术的研究[D]. 西北农林科技大学, 2004 . [9]施辉阳. 酶法提取生猪皮胶原的研究[D]. 北京化工大学, 2004 . [10]窦珺. 腐乳基本滋味及其呈味物质的研究[D]. 中国农业大学, 2005 . [1] 张书文,张燕,李燕,王开宇,冯韶辉. 对食品中铝含量国标测定方法的改进[J]. 化学分析计量, 2009,(02) . [2] 马红军. 分光光度法测定食品中的铝含量[J]. 粮油食品科技, 2009,(04) . [3] 金世梅,施文蓉,朱慧. 面制食品中铝测定的改进[J]. 食品科技, 2009,(05) . [4] 杨红兵,蔡丽. 面制食品中铝测定方法的改进[J]. 职业卫生与病伤, 2009,(04) . [5] 白洁龄,阮振,金建军. 面制品中铝测定结果不确定度的评定[J]. 现代测量与实验室管理, 2008,(05) . [6] 付钰洁,郝雪菲,张晓凤,项锦欣,夏爽. 对食品中铝含量国标测定方法的改进[J]. 食品科学, 2007,(08) . [7] 温焕平,谭倩,欧天成. 铬天青S分光光度法测定饮用水中铝的改进[J]. 中国热带医学, 2007,(09) . [8] 吴明亮,徐海祥. 两种不同方法对膨化食品中铝含量的检测对比[J]. 农产品加工(学刊), 2008,(04) . [9] 尹素娟,潘艺,杨文杰. 分光光度法和ICP-AES法对面制食品中铝含量的测定效果比较[J]. 广东农业科学, 2008,(12) . [10] 路宝珍,于洪荣. 铬天青S分光光度计法检测面食中的铝[J]. 中国质量技术监督, 2009,(03) . [1] 樊桂红. 对国标2003中面制品中铝含量测定方法的改进[J]. 科技信息, 2008,(26) [2] 刘燕, 郝新宇, 王赟, 周晓光, 闫永胜. 固相萃取分离/富集技术与分光光度法联用(固相光度法)研究进展[J]. 吉林师范大学学报(自然科学版), 2004,(04) [3] 刘学武. 香飘四海 独秀天下——记广东霸王花米面制品厂[J]. 科技潮, 2000,(04) [4] 张淑芳, 傅佑丽. 催化动力学光度法测定痕量铁[J]. 曲阜师范大学学报(自然科学版), 2005,(01) [5] 翟声明, 许琨, 朱琴. 原子吸收光度法测定铜精矿中的银[J]. 中国西部科技, 2005,(10) [6] 耿立威，杨文琴，郑洪江. 水中微量氟的分光光度法测定[J]. 松辽学刊(自然科学版), 1995,(01) [7] 郝庆秀. 多波长分光光度法同时测定铝和镓[J]. 郑州纺织工学院学报, 1994,(04) [8] 李志良，余般梅，刘亚风，酒井诚，石乐明，李梦龙. 神经网络显色光度法用于镧系稀土的同时测定[J]. 应用科学学报, 1996,(03) [9] 陈桂鸾, 黄一帆, 林文业. ICP-AES法测定膨化食品中铝的含量[J]. 大众科技, 2009,(10) [10] 吴丽, 秦克旋, 孙健, 王荣荣, 李绍元, 李芥春. 激光热透镜效应法测定痕量高氯酸根[J]. 中国科学院研究生院学报, 1992,(03)
可以从斯嘉丽的女性意识变化写起。战前和战后她性格的变化尤为明显，从女性主义入手分析，探讨新旧南方对她的性格影响。
给你推荐一本书，切库的《福》，这本书是对《鲁滨逊漂流记》的大胆颠覆，尤其是在对星期五的处理上，相信能给你不少灵感。
那个年轻，美丽的女人用她那双如鹰般的眸子，搜寻这离她远去的爱人。纵使倩影被湮没于黑夜中，她却极力穿透黑夜，翘首光明。尖锐的眸光折射除不灭的冀望，然而又掩饰不住几许的绝望. 《飘》，淋漓尽致的描绘出了思嘉丽颠沛流离的青春历程也流露出她独到的魅力。 她长的并不美丽，但是男人一旦未她的魅力迷住往往就理会不到这一点。 瞧！艾希礼的订婚宴上，思嘉丽迷倒了几乎全场的绅士们。不过她的目的不在此，而在于得到宴会上男主角的心。孪生兄弟为你闹翻脸；对你一见钟情的说要娶你。这些还不够吗？何必执著于一个艾希礼呢？看似相貌堂堂，器宇轩昂，却是白人渣滓。 思嘉丽你知道吗？为了艾希礼，你的可贵青春，你的终身幸福，你的纯洁灵魂都如家园塔拉一样随风飘逝了，即时你嫁给再多的弗兰克也是徒然。为报复，屈身嫁给媚兰妹妹的情人；为金钱；使计勾引亲妹妹的恋人。到头来，还是一场空。一切的一切都仅仅为了艾希礼，你确实爱他吗？不！你不懂事，你不懂他。在绅士群集的宴会上，你注视到了那个始终爱你，在你结婚来结婚去之间放逐希望的瑞德吗？ 瑞德从容，练达，睿智。只有你才配的起他，也只有他才会爱你这样可爱的人。可惜，你没有珍惜他。瑞德的离开时对你的最大惩罚。然而人总是在失去了才懂得拥有的可贵。‘‘众里寻他千百度，蓦然回首，那人却在灯火阑珊处’’转瞬间，已无踪可觅了。 这天夜里，我背倚着床，沉思…… 蓦地看见思嘉丽端坐在我的窗沿。她憔悴了，脸上不再容光焕发，颊畔的两行泪痕尚未风干；头发凌乱，不再金丝闪闪。纤纤素手已不复存在，战争的残酷让双手又粗又大。倒是那条17英寸的柳腰依然尚存，我想瑞德一定会喜欢的。 她的双手倚在墙上，脸上是异常的懊丧，悒郁。她是在追悔那3段不完美的婚姻，抑或是瑞德无情的离开？ 我奢望帮思嘉丽找回瑞德，我轻声说： “其实，瑞德一定在哪里想着你的！” 她潸然泪下，用最绝望的语气说道： “不会的，他肯定恨死我了。他不会原谅我的” 我真懊恼自己说了不该说的话，勾起了思嘉丽心地最脆弱的弦，断了。刹那间，崩溃了。狠狠的撕破了夜的宁静，那声音，叫天不应叫地不闻…… 月光流淌在她身上，沿着那柔软的弧线倾斜，无法言说…… 瑞德走了，只留下痛苦，寂寞。如果我见到瑞德，我会劝他回到思嘉丽身边，至少不要让两个相爱的人苦苦思恋。 思嘉丽垂泪斜睨扣在书桌上的《飘》，始终不敢正眼细看。也许是不敢面对自己。对于思嘉丽，我既是恨又是怜悯，这两种感情在我心中不断挣扎着。 我，彻夜无眠。 第二天醒来，思嘉丽已不见了。也许是找她的瑞德去了吧！夜里也不见她的倩影，我还有好多问题想问她呢。窗沿上空空荡荡，只剩窗幔与风低声调着情。桌上的《飘》被一页一页的掀开了。 一个女人再坏，也总又令人可敬的一面； 一个女人再强，始终需要爱情的包庇； 一个人，撑不了一片天。 思嘉丽，如果你愿意，我愿带着你，携着书中情节去寻找你的瑞德……
可以从斯嘉丽的女性意识变化写起。战前和战后她性格的变化尤为明显，从女性主义入手分析，探讨新旧南方对她的性格影响。
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到中国知网上去看。背景到GOOGLE 上去查。我记得有个网站上对每一小节都有分析。至于哪个网站，我已经不知道了。过去3年了。反正到处搜啊！我那时还搜到人家哈佛的图书馆去了咧。俺的论文基本上我是写成中文后来自己翻译的，用了很厚一个笔记本。因为我查不到对我有用的英文资料。还是多到图书馆多看看吧。