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发表论文注意事项（1）合理选刊是发表论文的关键，一般核心期刊最难发表，国家级期刊次之，省级最简单。根据中高级职称论文的发表要求，小编建议大家评中级职称选省级期刊，评高级职称选国家级期刊，评行业内最高职称发核心期刊。（2）我们投稿的论文不一定会完全符合杂志社的审核要求，如果文章被退回，但附有修改建议，可以按照要求修改以后继续投稿。如果直接被拒绝，可以重新写文章投稿，或者去别的期刊投稿。（3）无论是什么专业的论文，除了专业性以外，论文主题一定更要符合社会主义价值观，不能写负能量的文章。（4）要想顺利发表一篇论文，必须遵循三个原则：专业性强，且和工作岗位相关；写作能力达到一定水平；严格按照投稿期刊的格式。建议大家在写作之前多读一些专业文献和范文，了解更多的专业术语和写作要求。（5）投稿之前，一定要咨询好论文发表周期。大部分期刊的发表周期为2-3个月，但有的期刊比较热门，投稿人多，可能排到4个月以后，如果时间充裕还好说，如果错过了评职称时间就悔之晚矣。（6）在发表论文时，可能会遇到一些特殊期刊，例如增刊、电子期刊、内部期刊等，这些期刊是不能用于职称评审的。此外，还有一些假刊也要注意。大家在投稿之前可以去国家新闻总署的官网上查询真伪。发表论文有两种方式，一种是自己买本杂志根据杂志版权页上的投稿方式去自己投稿，一种是自己找个靠谱的代理机构去代理投稿，下面介绍一下这两种方式的利弊，你根据自己的需求选择一下合适的投稿方式，自己投稿的利弊：好处就是省钱，只需要给杂志社出版面费就可以，需要出版面费就说明文章要发表了，不用担心投出去的钱白费了。但是弊端也是有的，第一，杂志社的审稿时间很长而且都是来稿不退，使作者的等待时间也很长，也不知道稿件是否被录用，很可能就错过了评职称交材料的时间。第二，杂志社的审稿比较严格，一般都是三次审核，文章质量要保证好才能通过审稿。第三，杂志社的编辑审稿量很大，有时候可能会看不到某些稿件，如果自己的稿件没有被看到，写的再好也无济于事。第四，投稿要自己选择期刊，但是就自己对杂志的了解来说，可供自己选择的期刊并不多，所以自己投的稿件很可能不符合杂志社的办刊宗旨，这样的稿件也不会通过的。找代理投稿的好处：第一，就是快速，最快的一个月左右，比自己投稿要省时间多了。选定了刊物就可以向客服咨询什么时候能发表，看能不能赶在自己交评职称的材料之前发表。这样心里就有底了。第二，网站会根据作者的文章给作者推荐合适的期刊，这样就不会投稿无路了。第三，网站和杂志社都是有合作的，可能有些杂志只在网站征稿不对外征稿，这样的话只能通过网站在这个期刊上发表文章了。第四，文章能通过网站的审核也就能通过杂志社的审核，就能顺利发表了，如果能发表，网站人员会及时通知作者发表的时间，这样作者心里就不再茫然了。发表行业鱼龙混杂，必须得保证自己发的杂志是正刊，也不能是增刊）。找代理机构认准以下几点；一、首先选择国家新闻出版广电局能查到的正规杂志二、其次是某宝担保交易，更有保障三、最后录用通知下来后，亲自打版权页或者收录网站（知网、维普、万方、龙源）上查稿电话查稿确认录用后，再付款。
毕业论文需要发表相关的论文就是写论文的时候查询资料的文章。 发表的论文的研究内容与你的毕设（学位论文）内容是相关的，一般是其中的一部分。比如你的毕设是研究一个完整的雷达系统，你的小论文可能只是介绍这个雷达系统的接收机部分，这可以叫内容相关。
要选择新闻出版部署可以查到的杂志期刊，论文不同用途要求会不一样。而且要求论文要在 中国知网，万方数据等检索网站上检索到。大学生发论文更要慎重，重复率不能超过规定的指标，否则会涉及学术不端。评职称发论文，也要看相关评审文件的要求。
论文发表时要怎样选择期刊？论文发表时选择期刊非常重要，需要掌握相关的期刊选择技巧，增加论文发表成功率。论文发表刊物分为多个级别，有sci国际核心，北大核心，南大核心，国内国家级期刊和省级期刊，高校学报创办刊物等，大家发表论文尽量选择适合自己的期刊。发表论文选择期刊除了要注意刊物级别外，还需要注意“增刊、特刊、专刊、综合版、专辑”类型。想要投稿正规期刊最好到相关的官方网站查看投稿要求。发表论文还需要相关的证明文件。参加国际学术会议，且论文作者之一做会议发言，收入正式出版的论文集(有书刊号)的论文，确定为第四级(C 类)，未发言的确定为第五级(D 类)。参加全国性学术组织举办的全国学术会议，且论文作者之一做会议发言，收入正式出版的论文集(有书刊号)的论文，确定为第五级(D 类)，未发言的确定为第六级(E 类)。论文发表需要投稿核心刊物，最好先在网站查询最新版核心期刊目录，发表论文选择核心期刊都是按照作者所在单位(学院、学校)的要求，如果你所在的单位承认扩展版可以加分，否则扩展版就不能设为来源刊。论文发表这样选择期刊可以帮助你快速见刊，增加通过率和成功率。那么如何在自己能力范围内挑选合适的刊物都需要讲究技巧。
发表论文注意事项（1）合理选刊是发表论文的关键，一般核心期刊最难发表，国家级期刊次之，省级最简单。根据中高级职称论文的发表要求，小编建议大家评中级职称选省级期刊，评高级职称选国家级期刊，评行业内最高职称发核心期刊。（2）我们投稿的论文不一定会完全符合杂志社的审核要求，如果文章被退回，但附有修改建议，可以按照要求修改以后继续投稿。如果直接被拒绝，可以重新写文章投稿，或者去别的期刊投稿。（3）无论是什么专业的论文，除了专业性以外，论文主题一定更要符合社会主义价值观，不能写负能量的文章。（4）要想顺利发表一篇论文，必须遵循三个原则：专业性强，且和工作岗位相关；写作能力达到一定水平；严格按照投稿期刊的格式。建议大家在写作之前多读一些专业文献和范文，了解更多的专业术语和写作要求。（5）投稿之前，一定要咨询好论文发表周期。大部分期刊的发表周期为2-3个月，但有的期刊比较热门，投稿人多，可能排到4个月以后，如果时间充裕还好说，如果错过了评职称时间就悔之晚矣。（6）在发表论文时，可能会遇到一些特殊期刊，例如增刊、电子期刊、内部期刊等，这些期刊是不能用于职称评审的。此外，还有一些假刊也要注意。大家在投稿之前可以去国家新闻总署的官网上查询真伪。发表论文有两种方式，一种是自己买本杂志根据杂志版权页上的投稿方式去自己投稿，一种是自己找个靠谱的代理机构去代理投稿，下面介绍一下这两种方式的利弊，你根据自己的需求选择一下合适的投稿方式，自己投稿的利弊：好处就是省钱，只需要给杂志社出版面费就可以，需要出版面费就说明文章要发表了，不用担心投出去的钱白费了。但是弊端也是有的，第一，杂志社的审稿时间很长而且都是来稿不退，使作者的等待时间也很长，也不知道稿件是否被录用，很可能就错过了评职称交材料的时间。第二，杂志社的审稿比较严格，一般都是三次审核，文章质量要保证好才能通过审稿。第三，杂志社的编辑审稿量很大，有时候可能会看不到某些稿件，如果自己的稿件没有被看到，写的再好也无济于事。第四，投稿要自己选择期刊，但是就自己对杂志的了解来说，可供自己选择的期刊并不多，所以自己投的稿件很可能不符合杂志社的办刊宗旨，这样的稿件也不会通过的。找代理投稿的好处：第一，就是快速，最快的一个月左右，比自己投稿要省时间多了。选定了刊物就可以向客服咨询什么时候能发表，看能不能赶在自己交评职称的材料之前发表。这样心里就有底了。第二，网站会根据作者的文章给作者推荐合适的期刊，这样就不会投稿无路了。第三，网站和杂志社都是有合作的，可能有些杂志只在网站征稿不对外征稿，这样的话只能通过网站在这个期刊上发表文章了。第四，文章能通过网站的审核也就能通过杂志社的审核，就能顺利发表了，如果能发表，网站人员会及时通知作者发表的时间，这样作者心里就不再茫然了。发表行业鱼龙混杂，必须得保证自己发的杂志是正刊，也不能是增刊）。找代理机构认准以下几点；一、首先选择国家新闻出版广电局能查到的正规杂志二、其次是某宝担保交易，更有保障三、最后录用通知下来后，亲自打版权页或者收录网站（知网、维普、万方、龙源）上查稿电话查稿确认录用后，再付款。
毕业论文需要发表相关的论文就是写论文的时候查询资料的文章。 发表的论文的研究内容与你的毕设（学位论文）内容是相关的，一般是其中的一部分。比如你的毕设是研究一个完整的雷达系统，你的小论文可能只是介绍这个雷达系统的接收机部分，这可以叫内容相关。
1.您如果有时间的话建议您自己写文章，投稿的时候杂志社会给您修改意见。您如果没时间的话就可以让杂志社代写。需要找到社内编辑给您安排，代理的话价位会比较高。2.您可以看您评职文件上的要求，对期刊和收录网站有什么要求，需要核心期刊还是国家级或者是省级期刊。在收录网站找到对应期刊，打社内的查稿电话。查稿老师会让社内编辑加您。这样您就不会加到代理。希望对你有帮助，不懂的可以再问我。
论文发表时要怎样选择期刊？论文发表时选择期刊非常重要，需要掌握相关的期刊选择技巧，增加论文发表成功率。论文发表刊物分为多个级别，有sci国际核心，北大核心，南大核心，国内国家级期刊和省级期刊，高校学报创办刊物等，大家发表论文尽量选择适合自己的期刊。发表论文选择期刊除了要注意刊物级别外，还需要注意“增刊、特刊、专刊、综合版、专辑”类型。想要投稿正规期刊最好到相关的官方网站查看投稿要求。发表论文还需要相关的证明文件。参加国际学术会议，且论文作者之一做会议发言，收入正式出版的论文集(有书刊号)的论文，确定为第四级(C 类)，未发言的确定为第五级(D 类)。参加全国性学术组织举办的全国学术会议，且论文作者之一做会议发言，收入正式出版的论文集(有书刊号)的论文，确定为第五级(D 类)，未发言的确定为第六级(E 类)。论文发表需要投稿核心刊物，最好先在网站查询最新版核心期刊目录，发表论文选择核心期刊都是按照作者所在单位(学院、学校)的要求，如果你所在的单位承认扩展版可以加分，否则扩展版就不能设为来源刊。论文发表这样选择期刊可以帮助你快速见刊，增加通过率和成功率。那么如何在自己能力范围内挑选合适的刊物都需要讲究技巧。
收录论文的杂志也有三六九等之分，你的首篇一旦发表，二篇三篇就会想着往更高级别的杂志投，对自己是一种挑战；如果得到高一级别杂志编辑的认可，又能极大增强自己的自信，同时树立自己在圈子里的威望。有什么需要我给你给你参谋一下。这个看你是刚什么用发表的是普通的散文还是学术性质的论文了，一般普通的散文只要投稿杂志3-10天内就会给你打电话是否录用了，然后把稿费给你邮过来，但是学术期刊可以没有什么稿费了，还要你自己付版面费用。而且对文章要求很严。不能要抄袭，格式不能错，什么什么的，我投了好几次都被打回来了。郁闷死，最后在一朋友知道了说我傻不傻现在论文都是在网上找代理的，他给我介绍了“小柯毕业论文”，咨询了一段时间觉得那个客服为人还比较真诚，就试着发了一篇。书都收到了，我还把我的几个朋友介绍过去，都说不错。如果您是要发表职称方面的论文，你也可以去试试。
对于刚进大学的大学生来说，可能对于发表论文的事情，感觉离他比较遥远，但是你可以再自己在低年级的时候就对论文发表进行一定的了解，这样就可以根据自己的经验发表出比较好的学术论文。现在学术型论文还是相对于其他论文比较有优势，对于学术性论文是关于相关的，或者是同一个事物的，这种长远考虑是比较有优势的。想要顺利的发表一篇学术性的论文，就要敢想敢做，如果你连想都不敢想，那么你的同学对于发表论文这件事更加不会讲关于一个自己的思维能力，那么机会来临的时候，你就可以突破思维的局限，解除自己的限制，然后取得最后的成功。俗话说，成功是留给有准备的人的，所以想要发表论文，第一个就是要做到有思想上的准备，那就是我要发表学术性的论文。做到敢想之后，还有另一个比较重要的就是发现大学生活中写论文的机会，并且牢牢把握住它，关于论文撰写你要了解报告文献综述和初稿等问题，都可以和导师以及任课老师进行一定交流，导师是你对论文的一个关键性了解。最重要的就是要抓住机会，这个方面有三点比较重要，那就是要主动积极的和导师沟通，一定要坚持到底，并且热情地去做每件事情，还要对论文的总体结构有一个现状分析问题，问题分析和相对应的对策分析。当然还要切记在和导师进行沟通的时候，要礼貌和主动做是作为一个学生应该做到的。导师对你的指导和一些问题的纠正要虚心求教，再改完之后发给老师修改之后也要给老师查看，自己要对自己的事情有一定的全局把握及时的进行处理。再进行经验的累积之后，对于学术论文的发表是比较重要的，导师在选择的时候会喜欢那种积极向上主动好学的学生，就算没有机会出现，他们也会主动的去问一些有关于做论文的一些东西
在日常生活中,无论是评职称还是大学生毕业都离不开发表论文.在公开发行的学术期刊上发表论文,成为职称评选硬性条件之一,可以说发表论文,在职称评审中占据非常重要的作用.下面学术堂就来简单的说一下如何凭借个人经验发表论文.发表论文首先需要写一篇好的论文,论文不光主题鲜明,论点创新,还应该结构严谨,层次分明.与此同时,还应该注意论文标准格式、文句通顺,确保论文通过审核.发表论文流程主要包括以下几方面.根据杂志办刊盘方向以及办刊宗旨,确定要发表的刊物.然后投稿到杂志社邮箱,杂志社审稿录用排版印刷,到最后出版发行.如果稿件有问题会出现两种情况出现退稿与返修.返修的稿件要求整理好发回杂志社.觉得注意的是杂志社审稿在一周到一年不等根据杂志社实际情况来定排班时间在一周左右交稿三天左右印刷七到十天左右发行时间为一周左右.在进行发表期刊论文的过程中,要根据自己的实际情况选择合理的时间进行发表.个人如何发表论文.1、发表论文的重要性.不同的人发表论文的作用也不同:(1)评职称(晋升职称):研究生 毕业需要;教师 、医护人员 、科研院所的人员、企业员工 等 晋升高一级的职称时,发表期刊论文是作为一项必须的参考指标.(2)申报基金、课题 :教育、科技、卫生系统 每年申报的国家自然科学基金项目、其它各种基金项目、各种研究课题时,发表论文 是作为 基金或课题 完成的一种研究成果的结论性展示.(3)世界性基础领域的研究,比如在医学、数字、物理、化学、生命科学 等领域开展的基础性研究,公开发表论文 是对最新科技 科学研究成果、研究方法的一种展示和报道.以推动整个社会的科技进步等.(4)提升自身竞争力:本科生和研究生在校期间发表具有一定水准的论文,有助于提升个人学术素养,进入社会,也可能会有更高的起点.2、发布论文的流程.(1)确定自己的研究课题,验证其写作价值,如果具有一定价值,就着手开始筹备论文,第一次发表论文,可以多向前辈请教,多查阅一些资料文献,在前人的基础上寻找突破口,选题立意要新颖实用,不要为了写论文而写论文.(2)论文经过多次修改完善以后,接下来我们就可以准备发表论文,发表论文第一步就是要选择对应的期刊,如果稿件投向不合适的期刊可能会遭遇退稿和不公正评判.如何选择合适的期刊?在知网或其他数据库中检索本篇论文相关领域的期刊,查看期刊级别以及刊物号等,确保其为正规期刊,然后阅读其刊登发表过的论文,看自己的论文是否适合在这些期刊上发表,从中挑出2-3个期刊作为备选,进一步了解这些刊物的审稿周期、投稿费用、投稿要求等,从中选出将要投稿的1个期刊,联系期刊编辑将自己的稿件投递过去,然后等待审稿人员的回复.
一、个人发表论文的程序：1.有了自己的学术成果后，按其研究方向在中国知网等论文收录网站上查找和你所研究领域相关的文献。确认你的核心内容前人没有研究发表后，选择该领域的相关杂志；2.按照所选杂志的格式要求，将自己的研究内容撰写成论文，通过该杂志的制定投稿渠道进行投稿，之后进行耐心等待；3.编辑审阅后如果不感兴趣会直接退稿，如果感兴趣会给你提出修改意见，从投稿到第一次审回一般要2个月以上，按照编辑提出的修改意见逐条改正，并在给编辑回复时对其提出的每一条意见进行逐条回复，之后继续耐心等待；4.二审后，基本就离发表不远了，一般会再给你提一些格式类的细节修改问题，解决后回复，等待发表就好。二、发表论文对个人的影响：1.学术论文的创作一定是基于现有工作的提高和改进，目的是使工作更高效，结构更合理。因此，长期写作论文呃人，一定会养成对事情深究的习惯，在科技研究领域，这个习惯是十分宝贵的；2.为了让你的论文有着十足的可信度，你必须对论文的全部内容进行极其严谨的审核，对个人思维的严密性和科学性也是很好的锻炼。3.创作论文的必备条件就是浏览大量的学术期刊，对个人知识储备有着很大的帮助4.在你有了一定数量的论文后，你会引起别人的重视，在你通过自己的努力得到别人的认可后，无论别人向你请教问题也好，探讨新技术也好，都是结交人脉、扩大人际影响的重要渠道，因为即使是自由职业者，要把工作做得更好也离不开朋友的支持，所以在人脉这种无形财富上，对你的帮助也很大；5.这一点是我自己思考的结果，和你分享一下：论文创作避免不了要接触到各类学术会议，并且往往是在其他城市举的。对于这种会议，有些是借机圈钱，有些则会实在的做些探讨研究。但无论是哪一种，我的看法是：写论文，是心在旅途上；参加学术会议，是身在旅途上。身与心总有一者在路上，这就是进步的生活。三、对发表论文的建议：1.能养成自己遇事深究思考的习惯，让自己成为一个有思想的人，而绝不人云亦云；2.经常写论文后，思维会变得缜密，遇到事情或发现问题后，会对其进行全面分析并擅长将想法写下来，写成可行性分析或报告和别人探讨。3.收录论文的杂志也有三六九等之分，你的首篇一旦发表，二篇三篇就会想着往更高级别的杂志投，对自己是一种挑战；如果得到高一级别杂志编辑的认可，又能极大增强自己的自信，同时树立自己在圈子里的威望。4.考虑到你是自由职业者，现在全国90%的杂志要收取版面费，一篇400—3000不等，肯定没地方给你报销，长期发的话对经济也会造成一定的冲击。而各领域最高等级的几本杂志一般都不收版面费，因此，从经济角度考虑，保证自己论文的持续高水准，也能为自己创收不少呢。希望我的回答对你有所帮助。
1.论文内容的准备
想要发表的话对于论文的质量也是有要求的，出于精益求精的要求，论文提前一段时间准备。所以如果想要发核心期刊的话，建议最好大二下开始，因为这时候专业基础知识有了一些，另外核心周期在年至一年，这之前还要联系指导老师（本科生没有指导老师几乎不可能发上核心），准备素材、查找资料等。如果是为了保研发普刊，大三下的二三月份是高峰期，平时普刊周期两到三个月，这段时间就要延长半个月左右。
2.弄清楚发表的要求发期刊论文有很多用途，可以平时加分、保研加分、评奖学金、结项以及考研复试等，总的来看还是跟学校、单位要求相关，所以就要先搞清楚相关政策才能保证发出去了有用。
3.注意需要各种时间期刊论文得在规定时间内提交才有用，所以要注意各种时间节点。审稿时间审核通过后才有录用证明。如果是自己投稿的话，一般审稿要半个月以上。期刊质量越高，审核时间越久，拿到录用后就知道该期刊的出刊时间了，最快也要一到两个月才能出版，慢的话要等半年以上。质量高的期刊一般都会出现超前收稿的现象，而出版也是有规定时间的，所以如果想发论文用来加分之类的，就需要提前做准备。上网时间还有的要看到在网上检索证明才能认定，一般非知网的普刊在出刊后1-3个月上网，知网的普刊在出刊后2-3个月上网。
4.投稿渠道的选择首先需要确定的是发在哪个期刊上，如果是自己投稿，那可以去知网、维普、万方等数据库找期刊。先搜研究方向，然后确定想要发的期刊，一般会有投稿联系方式，根据这个联系编辑就可以了。还可以认真去各个期刊官网寻找编辑老师或者征稿电话联系方式，听从编辑老师的格式要求或修改建议，然后耐心等待。在这里学姐建议去数据库查找期刊信息，这里的才是最可信的，很多百度页的期刊官网都是假网站。
最后，不管你是自己投稿还是找的渠道或者机构代投，拿到录用证明后都可以去打该期刊的查稿电话去核实自己的文章有没有被录用，能查到就是可信的哦。
1.首先搞清楚为什么发论文, 一般都是为了保研,学位, 评奖，评职称加分等等, 然后就要了解对应事项对论文方向和所发的杂志(有的会给出一个目录)的要求, 以免发非所要做无用功2.确定的论文方向, 自己应该要有充分的了解, 可以多看看知网上相关文章, 也可以找老师指导一下, 尽量能写出比较独到的逻辑完整的观点, 还要有充分的论据和比较丰富的论证方法3.确定目标杂志, 可以先大致圈定几个意向进行详细了解, 包括杂志的周期(有些杂志出刊太慢排队太久等不起), 杂志对作者的偏好(有些较好的杂志只接受一定级别的作者, 本科生不在考虑范围), 投稿审稿或版面费用(一般越好的杂志可能不收费但上稿难度很大), 有可能的话可以在官网或杂志上找到编辑部联系方式, 直接咨询, 不要轻易相信网络上的中介4.投稿要注意符合杂志社的投稿格式规范, 要检查好文字不要出现低级错误, 那样会严重影响编辑对稿件的印象, 投稿投到官方的邮箱, 然后可以打个电话提醒一下编辑查收, 需要付费的一般是杂志出了用稿通知后才付费, 如果是上来就要钱说包发的十有八九是
首先，你需要写出像样的论文，文章肯定不能是炒冷饭的那种，需要有自己的创新点。所以在写文章之前，需要查阅大量的文献，以确保此前没人发过类似的文章。多看一些好文章，从中能够学到很多东西，比如一些观点或者写作方法。文章撰写完成之后，一定要反复修改，避免出现口语化的句子。如果是英文，还要注意语法，一定要按照英文惯用的表达方式来撰写文章。当文章经过反复修改之后，可以开始找期刊投稿。为了提高文章的接收率，找一个合适的期刊非常关键。所以一定要多看文章，这样才能知道自己写的文章大概在什么样的水平，然后选择相应档次的期刊进行投稿。中文期刊包括中文核心期刊、非核心期刊、学报，英文期刊包括SCI收录期刊、EI收录期刊，其中中文核心期刊和SCI收录期刊在中文和英文中是档次较高的期刊，也是很多人的投稿目标。此外，中科院把SCI收录期刊分为四区：一区、二区、三区和四区，档次和难度依次降低。在确定要投哪个期刊之后，按照该期刊的要求把论文的格式改好。然后，通过电子邮件把文章投出去。切忌，不要一稿多投！这样的做法只会降低你的信用，不利于以后的投稿，毕竟这个圈子不大。文章投出去之后，就是等待同行评审的结果。一般至少有两个审稿人评审同一篇文章，如果审稿人给出的意见都是修改（可能是大修或者小修），那么，只要按照要求修改好文章，最终一般都会被接收。如果其中有个审稿人给出的审稿意见是拒稿，那么文章就不会被接收。但你也可以根据审稿人的意见修改文章，然后再找一个更合适的期刊进行投稿。
发表一篇学术论文（特别是SCI、SSCI）不是一件很简单的事情，往往需要经历一个相对漫长的过程。对于科研新手而言，可能比较好奇发表一篇学术论文需要经过哪些步骤，今天就以理工科生发表SCI为例来谈一谈。第一步，数据收集要想发论文，首先得有拿得出手的东西，对理工科生来说，就必须有值得发表的数据，因此收集数据是发表一篇学术论文的第一步（此处忽略选题、文献调研等前期工作）。一般来说，理论性的论文可以将一些理论计算、仿真分析等结果作为数据，构成一篇论文；工程性的论文，往往需要实验数据，如果再结合一些理论分析（增加实验结果的可信度），会给文章加分不少。看过这么多文献，我发现比较牛逼的文章往往有深厚的理论分析。收集数据是第一步，也是最难、最耗时间的一步，因为你的数据是否漂亮一定程度决定了论文的创新性和价值。为了获得好的数据，好课题的重要性不言而喻，但更需要的是潜心钻研、经得住磨炼的精神。实验往往是残酷的，可能10次实验里前9次都是失败的，只有最后一次成功了，可能干脆全崩了，这时我们的心态也有可能跟着崩了。因此，不能害怕失败，就算失败了也要稳住心态，分析失败的原因，从而找出解决办法，一步一步完善实验。理论计算和仿真分析，有时比做实验更有挑战，因为往往只有具备深厚的数学和专业基础才能做好这一块，这不是一日之功就能完成的，往往需要长期的知识积累和很强的学习能力。当接触了一个新的方向时，我们对其理论背景往往不是非常熟悉，这时大量阅读文献，特别是英文书籍就很有必要，这个过程是痛苦且漫长的。第二步，数据处理/科研绘图数据很重要，数据分析也不能轻视。运用适当的数据分析方法有助于我们掌握数据的特点和内在规律，引发我们新的思考。因为论文的讨论（discussion）部分都是围绕数据展开的，数据的特点更丰富，值得说的点就更多，写起文章来也更容易。论文中的图（Figure）除了数据图还有示意图，炫酷的示意图能给论文增加不少印象分，相信审稿人看到一篇作图水平非常高的论文心情都会好很多吧。像CNS这种级别的论文的作图那叫一个赏心悦目，据说有个学者为了将一颗白菜的三维图做的更漂亮，买了一车的白菜来研究！因此掌握一定的数据处理/科研绘图能力非常重要，平时可以学一下相关的软件，知乎上有个相关的帖子打击可以点击“阅读原文”看一下。第三步，论文撰写数据处理好了，下一步自然就是撰写论文了。有了好东西，得把它说得漂亮才行，就像你开发了个好产品，但是卖得不好也没用。学术论文的结构总是差不多，相信文献看多了之后就发现，总是少不了摘要（abstract）、前言（introduction）、结果（results）、讨论（discussion）、总结（conclusion）等几个部分。在写论文初稿时，不要想着论文的排版，只管把该写的内容写下来就好（word单栏即可，或者LaTeX）。初稿完成后，再根据想要投稿的期刊的格式要求对论文进行排版，一般来说期刊会在官网提供投稿模板（template），按照要求修改格式即可。其实，投稿论文（manuscript）的格式要求和最后发表的格式往往并不一样，涉及到的都是一些比较简单的排版（字体大小、论文结构、图表等 ），因此完全不用为排版担心。因为发表前，期刊编辑会按照发表格式的要求对论文进行重新排版的。总之记住一点，写论文时把重点放在内容上，而不是格式上。论文撰写过程中，英文的表达非常重要，因此平时在文献阅读过程中，要养成积累优秀句型的习惯，做好笔记，拿来即用。前面有几期介绍过一些有助于论文写作的网站，如《论文写作时，堪称神器的网站！》。如果对自己的英文写作不够自信，最好请外国人或者相关的机构润色一下。论文写作过程中，还有一个非常重要的环节就是参考文献格式的书写。我发现身边很多人都会受这个困扰，花很多时间去琢磨如何排版参考文献。其实，有很多优秀的工具可以帮助我们做到这些，比如前面介绍的软件Zotero，后期我会专门讲解如何排版参考文献。
就SCI论文本身来说，我国科研工作者大多面临英语能力匮乏的缺陷，尤其对于年龄大和专业性强的科技工作者来说，内容不是问题，英语往往成为了制约的瓶颈。医荟园是专业科研与英语母语学术编辑服务平台，主要为非英语国家科研工作者提供SCI论文编译I﹑留学文书编辑和各类科研相关服务，现就针对毫无SCI论文写作经验情况下如何发表SCI论文进行指导。一、确认研究方向对于很多研究人员而言，选择研究方向是个很头疼的事情，但研究方向对研究的成败却起着决定性的作用。研究什么样的问题，在很大程度上就能决定了发表怎样水平的文章。同时论文的研究对象在很大程度上也决定着研究的成果，如果没有开拓研究对象，便只能一直固步自封直到落后挨打，所以研究对象必须对社会发展有重大意义、必须不断开拓新的研究对象。一般情况下，研究生的研究对象和方向基本由导师决定，自己可选的余地不大。对于博士毕业后仍然从事科研的年轻人来说，一般来说应该以自己擅长的方法、技巧、领域为基础，逐渐扩展。如果自己特别喜欢某一个领域，需要多向熟悉该领域的学者请教、学习，如果能跟着熟悉该领域的成功者干一段时间更好。在医荟园看来，不管如何，对于一篇论文的撰写，首要确定的便是论文的研究方向，在确定了研究方向之后，才能根据自己该研究领域的了解和知识继续后续的科研内容。二、英文写作需循序渐进英语写作是发表SCI论文必须过的一关，因为国内的中文期刊一般最多EI收录，想发表SCI论文很难。多读一些科技论文写作技巧的书是很有必要的。而写英文论文也是一个反复修改的过程，只要自己有耐心，多看几遍、多检查，总能有所改进。三、不断调研与研究写论文离不开查阅文献，无论是只想发表几篇论文尽快毕业，还是想发表一些有影响的论文为自己的学术道路奠定基础，大量文献的查阅都是必须的。查阅文献既可以了解别人在做些什么，这些事情有何价值，还可以了解别人是怎么做的，自己可以做些什么，也可以学习别人的方法，尝试提出自己的方法等。写论文往往是一个调研与研究不断反复的过程，我们在研究过程中遇到新问题需要调研，解决了这个问题继续前进会遇到新问题，继续调研，如此不断反复直至取得成功。最后写论文的时候还需要看文献，检查一下别人是否有人做过类似的研究，确信自己的论文是有新意、有价值的，然后再发表到合适的期刊上。四、撰写好的引言通常情况下，引言需要包括：研究对象的意义和价值、回顾相关研究工作、该研究领域目前存在的问题以及自己做该项研究目的、自己解决了什么问题以及有何意义。切忌只引用很老的参考文献，这会被编辑或评阅人认为这个领域现在已经没人研究，一方面这给编辑找审稿人带来困难，另外一方面很容易被拒稿。一般情况下，评阅人先看看摘要和结论，看完引言基本就能决定是否接受论文。写引言的过程中会读不少文献的引言，这是了解相关研究的一个过程，如果自己不打算结束这个方向的研究，写完一篇论文的引言基本上就考虑好了下一篇论文写什么。总之，一个好的引言既是对自己所研究领域的简要概括，也是对自己所做的研究的概述。五、参考文献的选择和撰写不少期刊的编辑一般通过作者的参考文献找审稿人，所以引用一些近几年的文献可以给编辑提供方便，自然可以加快自己论文的发表速度。关键的参考文献一定要引用，在引言中对参考文献的评述一定要中肯、恰当。参考文献是论文的最后一部分，建议把参考文献写好，这样有利于读者查阅相关文献，从而更快的接受你的研究成果，这对增加你的论文的引用率是有意义的。
从审稿人的角度出发，去思考研究这个问题。1、一定要有吸引力的题目，思路清晰的摘要，和漂亮的图。这三者是决定文章命运的关键。实际上大部分reviewer，审稿的方法是快速看一下文章题目，摘要和图，如果这三者不满意，这篇文章基本就Over了。2、标题尽量不要出现novel, new等字眼，也不要太长，简洁明确，有力。从逻辑的角度讲，写科技文章的目的就是报道新的进展，如果不新的话那也没有发表的必要了。3、Abstract里不要充斥大量数字。我们知道，人对数字是最不敏感的，abstract需要的是清晰的逻辑思路，引着编辑思路。切记，做实验的一些朋友有时候可能非常得意自己测出的某些最新数据，于是乎恨不得都塞到Abstract中以示强调，殊不知在审稿人眼中这些仅仅是一串串毫无意义的阿拉伯数字而已。4、图与表的选择，能用图尽量用图表示，包括各种统计图。图更直观一些，表都是数字，很难理解的。如果一篇文章让reviewer看起来“难受”的话，结果不言而喻了。另外，近年来主张图尽量组合在一起，这样也容易理解一些。5、参考文献和引用一定要规范，最好用文献管理软件来编辑，不要手工制作，费力且不讨好。软件来做，这样不会出错。我们医刊汇，对于所有的投稿文章，参考文献全部重新查找，并用软件生成，确保不犯各种小错误。6、节标题的拼写一定要准确，另外小节，不建议用一个单词，而建议用一个短语或句子。经常看见的错误就是Conclusions，Acknowledgments不带s。这两个标题估计99％的人都要用到，而且孤零零就那么一个词，字号比一般的字还要大那么几倍，写错了话还真是着实扎眼。如实验结果一段，如westernblot，有人在小标题就用western blot，让人不知道什么意思，这不是方法学一段。在结果中应该是XXX expression by westernblot。这样会更清晰。7、切忌超长段落。一般一个段落以3到5个句子为宜，千万不要追求一气呵成的感觉而堆在一起，那种动辄一页纸的大段落任谁看了都眼晕。如果要表达的内容确实多，可以适当的使用enumerate和itemize，可以让文章看起来简洁清爽。8、图表切忌模糊不清。在审稿阶段图表和正文一般是分开的，图和表都是一页一个，图还会被放大到A4纸的大小。这就要求图的质量要高，如果是矢量图那问题还不大，如果不是的话那分辨率一定要高，最好自己先放大打印出来看看。9、科技写作常识要知道。科技写作是有着自己的一套规则的，不讲规则只能是让审稿人觉得你是个新手或者杂牌军，这样拒起稿来几乎毫无心理负担。因此大家在写作的时候还是要稍微注意一下，比如名词缩写第一次出现注明，阿拉伯数字1到12出现在文中的时候要用text，数字不能做为一个句子的开头，等等。10、文章的格式要符合规则。一般来讲通篇双倍行距，段落之间留出空行，正文跟参考文献字体要区分开。（论文提供更多论文知识）
从简单地剪切致病基因，到开发出不再传播疾病的工程动物，基因编辑技术已经释放出巨大的潜力。随着研究的深入，科学界还发现，除了编辑具有遗传讯息的DNA片段，编辑RNA可以在不改变基因组的情况下，帮助调整基因表达方式，此外，RNA的寿命是相对短暂的，这也意味着它的变化是可以逆转的，从而避免基因工程中的巨大风险。
2017年10月，来自Broad研究所的张锋研究团队在《自然》期刊上发表了题为“RNA targeting with CRISPR-Cas13”的文章，首次将CRISPR-Cas13系统公之于众，证实了CRISPR-Cas13可以靶向哺乳动物细胞中的RNA。仅仅时隔三周，又一篇名为“RNA editing with CRISPR-Cas13”的力作发表于《科学》期刊。在该研究中，张锋研究团队再次展示了这一RNA编辑系统，能有效地对RNA中的腺嘌呤进行编辑。
在CRISPR出现之前，RNAi是调节基因表达的理想方法。但是Cas13a酶一大优势在于更强的特异性，而且这种本身来自细菌的系统对哺乳动物细胞来说，并不是内源性的，因此不太可能干扰细胞中天然的转录。相反，RNAi利用内源性机制进行基因敲除，对本身的影响较大。但CRISPR-Cas13系统还有一个重要的问题，Cas13a酶本质上是一种相对较大的蛋白质，因此很难被包装到靶组织中，这也可能成为RNA编辑技术临床应用的一大障碍。
2018年3月16日，一项发表在《细胞》期刊的重磅成果为RNA编辑技术带来一大步飞跃，来自美国Salk研究所的科学家利用全新的CRISPR家族酶扩展了RNA编辑能力，并将这个新系统命名为“CasRx”。
CasRx（品红色）在人类细胞核中靶向RNA（灰色），Salk研究所
“生物工程师就像自然界的侦探一样，在DNA模式中寻找线索来帮助解决遗传疾病。CRISPR彻底改变了基因工程，我们希望将编辑工具从DNA扩展到RNA。”研究领导者Patrick Hsu博士表示，“RNA信息是许多生物过程的关键介质。在许多疾病中，这些RNA信息失去了平衡，因此直接靶向RNA的技术将成为DNA编辑的重要补充。”
除了高效性且无明显脱靶效应，新系统的一个关键特征是其依赖于一种比以前研究中物理尺寸更小的酶。 这对RNA编辑技术至关重要，这使得该编辑工具能够更容易被包装到病毒载体，并进入细胞进行RNA编辑。来自东京大学的科学家Hiroshi Nishimasu并未参与这项研究，他表示：“在这项研究中，研究人员发现了一种较Cas13d更加‘紧凑’的酶CasRx。从基础研究到治疗应用，我认为CasRx将成为非常有用的工具。”
此外，在这项研究中，研究人员还展示了利用这种新型RNA编辑系统来纠正RNA过程的能力。他们将CasRx包装到病毒载体中，并将其递送到利用额颞叶痴呆（FTD）患者干细胞中培养的神经细胞，最终使tau蛋白水平恢复到健康水平上，有效率达到80%。
Patrick Hsu博士最后说道：“基因编辑技术通过对DNA的切割带来基因序列的改变。在经过基因编辑的细胞中，其效果是永久的。虽然基因编辑技术能够很好地将基因完全关闭，但对调节基因的表达上并不那么优秀。展望未来，这一最新工具将在RNA生物学研究中发挥重要作用，并有望在未来凭借该技术对RNA相关疾病进行治疗。”
该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默。
3月18日，《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文，该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默，证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性，通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时，利用AAV递送CasRx和靶向Pscsk9的sgRNA到小鼠肝脏，有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，以及小鼠血液中的胆固醇水平。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。
同时，杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作，也探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性，研究人员发现在体内使用CasRx敲低Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积，验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。
近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势，因而成为近年来的研究热点。2018年，加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比，Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％，shRNA达到65％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比，Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。
此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性，杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性，为临床提供了可能性。为证明CasRx在动物体内的活性，研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选，然后采用尾静脉注射敲低Pten的质粒、尾静脉注射敲低Pcsk9的AAV8病毒、眼部注射敲低Vegfa的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析，分别得到Pten基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调，Pcsk9下调造成血清胆固醇下调；Vegfa下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积。
2020年3月18日，《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文，该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向 Pten 基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了 Pten 的高效沉默， 证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性， 通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时，利用AAV递送CasRx和靶向 Pscsk9 的sgRNA到小鼠肝脏， 有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，以及小鼠血液中的胆固醇水平 。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。
同时，杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作，也 探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性，研究人员发现在体内使用CasRx敲低 Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积**，验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。
近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势，因而成为近年来的研究热点。2018年，加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比， Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％ ，shRNA达到65％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比， Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的 ，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。
此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性，杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性，为临床提供了可能性 。为证明CasRx在动物体内的活性，研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选，然后采用尾静脉注射敲低 Pten 的质粒、尾静脉注射敲低 Pcsk9 的AAV8病毒、眼部注射敲低 Vegfa 的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析，分别得到 Pten 基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调， Pcsk9 下调造成血清胆固醇下调； Vegfa 下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积。
图1 CasRx介导的 Pten 体内体外的下调（ Protein & Cell ）
A.质粒示意图；B.N2a细胞中 Pten 的下调；C.Western检测PTEN及AKT的表达； D.CasRx与shRNA脱靶比较；E.尾静脉注射质粒示意图；F.G.H.免疫荧光，qPCR，western分别检测 Pten 及p-AKT的表达
图2 血清胆固醇的调节以及 Pcsk9 的可逆调控（ Protein & Cell ）
A.针对 Pcsk9 的AAV8病毒注射示意图；B.肝组织中 Pcsk9 的表达量；C.血清 PCSK9 的表达量；D.血清胆固醇水平；E.F.血清ALT和AST的测定；G.可逆调节注射示意图； H. Pcsk9 的动态调控。
图3 AAV介导CasRx减少了AMD小鼠模型中CNV的面积（National Science Review）
A.小鼠和人序列比较以及sgRNA示意图；B.C.在293T和N2a细胞中敲低 Vegfa ；D.VEGFA蛋白的表达；E.AAV病毒质粒示意图；F.实验流程图；G.CasRx的mRNA表达水平；H.I.激光烧伤之前或之后7天的 Vegfa mRNA水平；J.CNV诱导3天后的VEGFA蛋白水平；K.激光烧伤7天后，用PBS或AAV-CasRx- Vegfa 注射的代表性CNV图像；L.M.CNV面积统计。
2020 年 4 月 8 日， Cell 期刊在线发表了题为 《Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice》 的研究论文，该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室 杨辉 研究组完成。
该项研究通过运用最新开发的 RNA 靶向 CRISPR 系统 CasRx 特异性地在视网膜穆勒胶质细胞中敲低 Ptbp1 基因的表达，首次在成体中实现了视神经节细胞的再生，并且恢复了永久性视力损伤模型小鼠的视力。同时，该研究还证明了这项技术可以非常高效且特异地将纹状体内的星形胶质细胞转分化成多巴胺神经元，并且基本消除了帕金森疾病的症状。该研究将为未来众多神经退行性疾病的治疗提供一个新的途径。
人类的神经系统包含成百上千种不同类型的神经元细胞。在成熟的神经系统中，神经元一般不会再生，一旦死亡，就是永久性的。神经元的死亡会导致不同的神经退行性疾病，常见的有阿尔兹海默症和帕金森症。此类疾病的病因尚不明确且没有根治的方法，因此对人类的健康造成巨大威胁。据统计，目前全球大约有 1 亿多的人患有神经退行性疾病，而且随着老龄化的加剧，神经退行性疾病患者数量也将逐渐增多。
在常见的神经性疾病中，视神经节细胞死亡导致的永久性失明和多巴胺神经元死亡导致的帕金森疾病是尤为特殊的两类，它们都是由于特殊类型的神经元死亡导致。我们之所以能看到外界绚烂多彩的世界，是因为我们的眼睛和大脑中存在一套完整的视觉通路，而连接眼睛和大脑的神经元就是视神经节细胞。
作为眼睛和大脑的唯一一座桥梁，视神经节细胞对外界的不良刺激非常敏感。研究发现很多眼疾都可以导致视神经节细胞的死亡，急性的如缺血性视网膜病，慢性的如青光眼。视神经节细胞一旦死亡就会导致永久性失明。据统计，仅青光眼致盲的人数在全球就超过一千万人。
帕金森疾病是一种常见的老年神经退行性疾病。它的发生是由于脑内黑质区域中一种叫做多巴胺神经元的死亡，从而导致黑质多巴胺神经元不能通过黑质-纹状体通路将多巴胺运输到大脑的另一个区域纹状体。目前，全球有将近一千万人患有此病，我国尤为严重，占了大约一半的病人。 如何在成体中再生出以上两种特异类型的神经元，一直是全世界众多科学家努力的方向。
该研究中，研究人员首先在体外细胞系中筛选了高效抑制 Ptbp1 表达的 gRNA，设计了特异性标记穆勒胶质细胞和在穆勒胶质细胞中表达 CasRx 的系统。所有元件以双质粒系统的形式被包装在 AAV 中并且通过视网膜下注射，特异性地在成年小鼠的穆勒胶质细胞中下调 Ptbp1 基因的表达。
大约一个月后，研究人员在视网膜视神经节细胞层发现了由穆勒胶质细胞转分化而来的视神经节细胞，并且转分化而来的视神经节细胞可以像正常的细胞那样对光刺激产生相应的电信号。
研究人员进一步发现，转分化而来的视神经节细胞可以通过视神经和大脑中正确的脑区建立功能性的联系，并且将视觉信号传输到大脑。在视神经节细胞损伤的小鼠模型中，研究人员发现转分化的视神经细胞可以让永久性视力损伤的小鼠重新建立对光的敏感性。
为进一步发掘 Ptbp1 介导的胶质细胞向神经元转分化的治疗潜能，研究人员证明了该策略还能特异性地将纹状体中的星形胶质细胞非常高效的转分化为多巴胺神经元，并且证明了转分化而来的多巴胺神经元能够展现出和黑质中多巴胺神经元相似的特性。
在行为学测试中，研究人员发现这些转分化而来的多巴胺神经元可以弥补黑质中缺失的多巴胺神经元的功能，从而将帕金森模型小鼠的运动障碍逆转到接近正常小鼠的水平。
需要指出的是，虽然科学家们在实验室里取得了重要进展，但是要将研究成果真正应用于人类疾病的治疗，还有很多工作要做：人类的视神经节细胞能否再生？帕金森患者是否能通过该方法被治愈？这些问题有待全世界的科研工作者共同努力去寻找答案。
（上）CasRx 通过靶向的降解 Ptbp1 mRNA 从而实现 Ptbp1 基因表达的下调。
（中）视网膜下注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将视网膜穆勒胶质细胞转分化为视神经节细胞，转分化而来视神经节细胞可以和正确的脑区建立功能性的联系，并且提高永久性视力损伤模型小鼠的视力。
（下）在纹状体中注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将星形胶质细胞转分化为多巴胺神经元，从而基本消除了帕金森疾病模型小鼠的运动症状。
RNA-editing Cas13 enzymes have taken the CRISPR world by storm. Like RNA interference, these enzymes can knock down RNA without altering the genome , but Cas13s have higher on-target specificity. New work from Konermann et al. and Yan et al. describes new Cas13d enzymes that average only 2.8 kb in size and are easy to package in low-capacity vectors! These small, but mighty type VI-D enzymes are the latest tools in the transcriptome engineering toolbox.
Microbial CRISPR diversity is impressive, and researchers are just beginning to tap the wealth of CRISPR possibilities. To identify Cas13d, both groups used very general bioinformatic screens that looked for a CRISPR repeat array near a putative effector nuclease. The Cas13d proteins they identified have little sequence similarity to previously identified Cas13a-c orthologs, but they do include HEPN nuclease domains characteristic of the Cas13 superfamily. Yan et al. proceeded to study orthologs from Eubacterium siraeum (EsCas13d) and Ruminococcus sp. (RspCas13d), while Konermann et al. characterized orthologs from “Anaerobic digester metagenome” (AdmCas13d) and Ruminococcus flavefaciens (nicknamed CasRx), as well as EsCas13d.
Like other Cas13 enzymes, the Cas13d orthologs described in these papers can independently process their own CRISPR arrays into guide RNAs. crRNA cleavage is retained in dCas13d and is thus HEPN-independent. These enzymes also do not require a protospacer flanking sequence, so you can target virtually any RNA sequence ! In bacteria, Cas13d-mediated cleavage promotes collateral cleavage of other RNAs. As with other Cas13s, this collateral cleavage does not occur when Cas13d is expressed in a mammalian system.
Since Cas13d is functionally similar to previously discovered Cas13 enzymes - what makes these orthologs so special? The first property is size - Cas13d enzymes have a median length of ~930aa - making them 17-26% smaller than other Cas13s and a whopping 33% smaller than Cas9! Their small size makes then easy to package in low-capacity vectors like AAV, a popular vector due to its low immunogenicity. But these studies also identified other advantages, including Cas13d-specific regulatory proteins and high targeting efficiency, both of which are described below.
The majority of Type VI-D loci contain accessory proteins with WYL domains (named for the three conserved amino acids in the domain). Yan et al. from Arbor Biotechnologies found that RspCas13d accessory protein RspWYL1 increases both targeted and collateral RNA degradation by RspCas13d. RspWYL1 also increased EsCas13d activity, indicating that WYL domain-containing proteins may be broader regulators of Cas13d activity. This property makes WYL proteins an intriguing counterpart to anti-CRISPR proteins that negatively modulate the activity of Cas enzymes, some of which are also functional in multiple species (read Arbor Biotechnologies' press release about their Cas13d deposit here ).
Not all Cas13d proteins are functional in mammalian cells, but Konermann et al. saw great results with CasRx and AdmCas13d fused to a nuclear localization signal (NLS). In a HEK293 mCherry reporter assay, CasRx and AdmCas13d produced 92% and 87% mCherry protein knockdown measured by flow cytometry, respectively. Cas13d CRISPR array processing is robust, with CasRx and either an unprocessed or processed gRNA array (22 nt spacer with 30 nt direct repeat) mediating potent knockdown. Multiplexing from the CRISPR array yielded >90% knockdown by CasRx for each of four targets, including two mRNAs and two nuclear long non-coding RNAs.
One interesting twist to Cas13d enzymes is their cleavage pattern: EsCas13d produced very similar cleavage products even when guides were tiled across a target RNA, indicating that this enzyme does not cleave at a predictable distance from the targeted region. Konermann et al. show that EsCas13d favors cleavage at uracils, but a more detailed exploration of this cleavage pattern is necessary.
Konermann et al. compared CasRx to multiple RNA regulating methods: small hairpin RNA interference, dCas9-mediated transcriptional inhibition (CRISPRi), and Cas13a/Cas13b RNA knockdown. CasRx was the clear winner with median knockdown of 96% compared to 65% for shRNA, 53% for CRISPRi, and 66-80% for other Cas13a and Cas13b effectors. Like previously characterized Cas13 enzymes, CasRx also displays very high on-target efficiency; where shRNA treatment produced 500-900 significant off-targets, CasRx displayed zero. Unlike Cas9, for which efficiency varies widely across guide RNAs, each guide tested with CasRx yielded >80% knockdown. It seems that CasRx may make it possible to target essentially any RNA in a cell.
Since catalytically dead dCasRx maintains its RNA-binding properties, Konermann et al. tested its ability to manipulate RNA species through exon skipping. Previous CRISPR exon-skipping approaches used two guide RNAs to remove a given exon from the genome, and showed success in models of muscular dystrophy . In this case, Konermann et al. targeted MAPT , the gene encoding dementia-associated tau, delivering dCasRx and a 3-spacer array targeting the MAPT exon 10 splice acceptor and two putative splice enhancers. After AAV-mediated delivery to iPS-derived cortical neurons, dCasRx-mediated exon skipping improved the ratio of pathogenic to non-pathogenic tau by nearly 50%, showing proof-of-concept for pre-clinical and clinical applications of dCasRx.
The identification of Type VI Cas13d enzymes is another win for bioinformatic data mining. As we continue to harness the natural diversity of CRISPR systems, only time will tell how large the genome and transcriptome engineering toolbox will be. It is, however, certain that the impact of CRISPR scientific sharing will continue to grow, and we at Addgene appreciate our depositors for making their tools available to the broader community.
References
Konermann, Silvana, et al. “Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.” Cell (2018) pii: S0092-8674(18)30207-1. PubMed PMID: 29551272
Yan, Winston X., et al. “Cas13d Is a Compact RNA-Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein.” Mol Cell. (2018) pii: S1097-2765(18)30173-4. PubMed PMID: 29551514
\1. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors
\2. CRISPR genetic editing takes another big step forward, targeting RNA
\3. How Editing RNA—Not DNA—Could Cure Disease in the Future
[ https://www.obiosh.com/kyfw/zl/aav/209.html](