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体内药物分析是由药物分析学派生出来的一门学科。
它是通过分析人或动物体液及各组织器官中药物及其代谢物浓度，了解药物在体内数量和质量的变化，获得药物代谢动力学的各种参数和转变，以及代谢的方式、途径等信息，从而有助于药物的研究、临床合理应用等。
体内药物浓度，尤其是血浆（或血清）药物浓度直接与药效相关，并受多种因素影响。例如，不同给药途径（如口服、吸人、静脉注射、肌肉注射、透皮等）可直接影响药物的吸收、分布、代谢和排泄，从而影响体内药物的浓度以及经时行为，并最终影响疗效。
患者的生理因素（性别、年龄等），病理状态（疾病的类型和程度），基因类型，吸收、代谢及分泌排泄功能，都影响药物在体内的经时行为。许多药物需经肝脏代谢或经肾脏排泄，所以对于肝或肾病患者，由于他们的肝脏生物转化及代谢功能降低、或肾脏的分泌排泄功能降低，往往会造成药物在体内蓄积，进而发生药物毒性反应。
常用方法：
体内样品的预处理方法的选择需要综合考虑多种因素，包括体内样品的种类、被测药物的性质和浓度、以及所采用的测定方法等三方面。
如血浆或血清需除蛋白，使药物从蛋白结合物中释出；尿液样品则常采用酸或酶水解使药物从缀合物中释出；唾液样品主要采用离心去除黏蛋白沉淀。
被测定药物的结构、性质、存在形式与浓度范围等，均直接影响到样品前处理方法的选择与应用。例如，药物的酸碱性（pKa）与溶解性影响到药物的萃取分离条件的选择，药物的极性、稳定性、官能团性质和光谱特性影响到其色谱测定条件的优化选择。不同药物在样品中的浓度相差悬殊，浓度大的样品对前处理要求稍低，浓度越低则样品前处理要求越高。
体内样品前处理的方法以及分离纯化的程度，均取决于测定要求和所采用的测定方法。测定方法的耐受污染程度和抗干扰能力越强、专属性越好、灵敏度越高，则对前处理的要求越低。
通常，免疫测定法由于具有较高的灵敏度和抗干扰能力，体内样品只需经离心分离即可直接用于测定。而高效液相色谱和色谱-质谱联用等方法，为防止蛋白质等在色谱柱上沉积、内源性干扰、或基质效应影响，色谱分析前均需对体内样品进行去除蛋白、溶剂萃取、甚至制备衍生物等前处理。
药物进入体内会在一系列酶的作用下被催化为极性分子，发挥药效或者被正常代谢体系排除天外的过程就是药物代谢，这是机体的一种自我保护方式。药物代谢已经成为药理研究的重要部分。研究药物在体内的代谢过程及其化学变化，对于阐述药理作用、毒性研究、结构修饰等都具有重要意义，而药物代谢的过程最重要的角色便是参与其中的各种酶，包括细胞色素酶P450、还原酶、过氧化物酶、单加氧酶和水解酶。细胞色素 CYP450抑制分析是药物发现过程的重要组成部分，因为药物之间的不利相互作用将导致药物开发计划终止、药物撤市或限制治疗用途。由于需要在药物发现过程的早期淘汰表现不佳的候选药物，使得体外 ADME 分析也需尽早开展。今天我们来讨论下细胞色素酶P450的各个亚型，以及计算机方法在预测药物上的运用。 细胞色素酶P450 细胞色素酶P450（cytochrome P450 enzyme system, CYP450）主要存在于肝脏和其他组织的内质网中，是一类血红蛋白偶联单加氧酶，其发挥作用需要辅酶NADPH和分子氧的共同参与，主要参与药物的生物转化中氧化反应，包括失去电子、脱氢反应和氧化反应，CYP450是主要的药物代谢酶系。CPY450通过活化分子氧，使得其中一个氧与有机分子结合，同时将另一个氧原子还原为水，通过这种方式在药物分子中引入氧。CYP450催化的反应类型有烷烃和芳香化合物的氧化反应；烯烃、多核芳烃以及卤代笨的环氧化反应；仲胺、叔胺及醚的脱烷基反应；胺类的脱氨反应；将胺转化为N-氧化物、羟胺及亚硝基化合物以及卤代烃的脱卤反应等。具体参与代谢类型如下： CYP450是一组酶的总称，有许多同工酶和亚型组成，命名时用CPY代表CYP450,其后加阿拉伯数字表示CPY450的家族成员，例如CYP1、CPY2、CPY3等，在数字后加字母，则代表亚家族，如CYP1A、CYP2C、CYP2D、CYP2E等。CPY450最早发现与20世纪60年代，目前已经报道的CPY基因至少有57个，被分为18个家族和43个亚家族。虽然肝微粒体中有多个CPY450亚型，但参与药物代谢的酶只有少数几个，其中参与度最高的是CPY3A4。下图为CYP3A4与血红素和酮康唑结合结构图：下表展示了人不同亚型的CYP在药物代谢中的作用 其中，CYP3A4含量在肠道中占CPY总量的70%，在肝脏中占总量CYP的30%，抑制CPY3A4会导致药物在血液浓度的增加可能引起毒副作用，激活CPY3A4则会增强其对药物的代谢，有可能降低药效。有研究表明一些药物是CPY3A4底物的同时，也是P-糖蛋白（P-gp）的底物，一些药物通过被动转运进入肠道上皮细胞，会被CYP3A4代谢，同时又被P-gp外排至肠腔，是的药物在肠道细胞核肠腔之间形成一个连续的反复循环，导致药物减少吸收，限制了药物进入循环系统的量。许多阿片类镇痛药都被 CYP3A4 代谢, 同时又是 P-gp 的底物、抑制剂或诱导剂。在与抗逆转录病毒药物合用时通常会发生由 P-gp 和 CYP3A4 介导的 DDI。美沙酮的血药浓度会受利托那韦影响而明显减少, 因为利托那韦诱导 CYP3A4 使美沙酮的代谢增加, 同时抑制了 P-gp 对它的外排。 计算机预测方法药物代谢 在药物发现早期利用计算机模型预测药物可能参与的代谢，将极大节省药物研发的成本和提高药物发现的成功率。包括预测CPY450底物、抑制剂、代谢位点和代谢产物的预测，下面介绍几种CPY450药物代谢预测的计算机工具： 总结 由于该主题对药物发现的重要性，预计代谢预测软件的势头将在可预见的将来保持下去，但缺乏高质量的数据将不可避免地阻碍其进展，同时算法的精度也有进一步提升的空间。当前，由于CYP代谢与I期药物代谢密切有关，因此重点一直放在CYP代谢上，但其他清除途径有关的酶同样需要倾注更多的注意力，例如谷胱甘肽转移酶和磺基转移酶等。 参考文献 Tyzack J D, Kirchmair J. Computational methods and tools to predict cytochrome P450 metabolism for drug discovery[J]. Chemical biology & drug design, 2019, 93(4): 377-386.
N-脱脘基化反应氧化脱胺反应N-氧化反应
药物进入体内会在一系列酶的作用下被催化为极性分子，发挥药效或者被正常代谢体系排除天外的过程就是药物代谢，这是机体的一种自我保护方式。药物代谢已经成为药理研究的重要部分。研究药物在体内的代谢过程及其化学变化，对于阐述药理作用、毒性研究、结构修饰等都具有重要意义，而药物代谢的过程最重要的角色便是参与其中的各种酶，包括细胞色素酶P450、还原酶、过氧化物酶、单加氧酶和水解酶。细胞色素 CYP450抑制分析是药物发现过程的重要组成部分，因为药物之间的不利相互作用将导致药物开发计划终止、药物撤市或限制治疗用途。由于需要在药物发现过程的早期淘汰表现不佳的候选药物，使得体外 ADME 分析也需尽早开展。今天我们来讨论下细胞色素酶P450的各个亚型，以及计算机方法在预测药物上的运用。 细胞色素酶P450 细胞色素酶P450（cytochrome P450 enzyme system, CYP450）主要存在于肝脏和其他组织的内质网中，是一类血红蛋白偶联单加氧酶，其发挥作用需要辅酶NADPH和分子氧的共同参与，主要参与药物的生物转化中氧化反应，包括失去电子、脱氢反应和氧化反应，CYP450是主要的药物代谢酶系。CPY450通过活化分子氧，使得其中一个氧与有机分子结合，同时将另一个氧原子还原为水，通过这种方式在药物分子中引入氧。CYP450催化的反应类型有烷烃和芳香化合物的氧化反应；烯烃、多核芳烃以及卤代笨的环氧化反应；仲胺、叔胺及醚的脱烷基反应；胺类的脱氨反应；将胺转化为N-氧化物、羟胺及亚硝基化合物以及卤代烃的脱卤反应等。具体参与代谢类型如下： CYP450是一组酶的总称，有许多同工酶和亚型组成，命名时用CPY代表CYP450,其后加阿拉伯数字表示CPY450的家族成员，例如CYP1、CPY2、CPY3等，在数字后加字母，则代表亚家族，如CYP1A、CYP2C、CYP2D、CYP2E等。CPY450最早发现与20世纪60年代，目前已经报道的CPY基因至少有57个，被分为18个家族和43个亚家族。虽然肝微粒体中有多个CPY450亚型，但参与药物代谢的酶只有少数几个，其中参与度最高的是CPY3A4。下图为CYP3A4与血红素和酮康唑结合结构图：下表展示了人不同亚型的CYP在药物代谢中的作用 其中，CYP3A4含量在肠道中占CPY总量的70%，在肝脏中占总量CYP的30%，抑制CPY3A4会导致药物在血液浓度的增加可能引起毒副作用，激活CPY3A4则会增强其对药物的代谢，有可能降低药效。有研究表明一些药物是CPY3A4底物的同时，也是P-糖蛋白（P-gp）的底物，一些药物通过被动转运进入肠道上皮细胞，会被CYP3A4代谢，同时又被P-gp外排至肠腔，是的药物在肠道细胞核肠腔之间形成一个连续的反复循环，导致药物减少吸收，限制了药物进入循环系统的量。许多阿片类镇痛药都被 CYP3A4 代谢, 同时又是 P-gp 的底物、抑制剂或诱导剂。在与抗逆转录病毒药物合用时通常会发生由 P-gp 和 CYP3A4 介导的 DDI。美沙酮的血药浓度会受利托那韦影响而明显减少, 因为利托那韦诱导 CYP3A4 使美沙酮的代谢增加, 同时抑制了 P-gp 对它的外排。 计算机预测方法药物代谢 在药物发现早期利用计算机模型预测药物可能参与的代谢，将极大节省药物研发的成本和提高药物发现的成功率。包括预测CPY450底物、抑制剂、代谢位点和代谢产物的预测，下面介绍几种CPY450药物代谢预测的计算机工具： 总结 由于该主题对药物发现的重要性，预计代谢预测软件的势头将在可预见的将来保持下去，但缺乏高质量的数据将不可避免地阻碍其进展，同时算法的精度也有进一步提升的空间。当前，由于CYP代谢与I期药物代谢密切有关，因此重点一直放在CYP代谢上，但其他清除途径有关的酶同样需要倾注更多的注意力，例如谷胱甘肽转移酶和磺基转移酶等。 参考文献 Tyzack J D, Kirchmair J. Computational methods and tools to predict cytochrome P450 metabolism for drug discovery[J]. Chemical biology & drug design, 2019, 93(4): 377-386.
药物从体内消除(elimination)主要有两种方式，即代谢(metabolism)和排泄(excretion)。代谢是大部分药物从体内消除的主要方式。药物的代谢反应大致可以分为氧化(oxidation)、还原(reduction)、水解(hydrolysis)和结合(conjugation)四种类型，氧化、还原和水解为Ⅰ相代谢，结合反应为Ⅱ相代谢。有些药物可以同时通过几种反应类型进行代谢。 (Intestinal Metabolism, Gut Metabolism)近年来研究发现许多药物在小肠吸收后通过肠壁时被代谢，从而导致药物的生物利用度降低，这种肠道的首过效应已引起相当重视。肠道内壁的上皮细胞从绒毛(villi)的低端移动到顶端后脱落，这个过程中上皮细胞逐渐成熟，整个过程大约需要两三天时间（图3）。肠壁中药物代谢酶主要分布于成熟的上皮细胞内，其中绒毛尖端活性最强。目前已经在肠壁中发现许多种类的代谢酶，如CYP26、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4、CYP3A5等, 其中以CYP3A4的含量最高(ref1)。许多临床常用的药物为CYP3A的底物，可以在肠壁内代谢。肠壁代谢是造成许多药物口服生物利用度偏低的重要原因之一。
中药是中华民族的伟大瑰宝，有着丰富的资源和悠久的传承历史，历经了千百年的临床实践，虽然积累了丰富的临床经验，为中华民族的健康事业作出巨大的贡献。但是中药的研发仍然充满了挑战，如药材来源变异大、有效成分不明、质量控制困难、缺乏清晰准确的安全性评价、药理作用机制不明等等。因此，至今还没有一种中药通过美国FDA的新药审批；而且，欧盟已经颁发了(欧盟传统药品法案)，也直接影响了中药的出口。为了扭转目前这种尴尬的境地，实现真正与国际接轨。发展祖国中医药事业，必须对中药的安全性、作用机理及其药理活性成分有明确的认识，并深入剖析。近十多年来。在西方药物发现和开发阶段利用体外和计算机辅助研究技术进行化合物的吸收、分布、代谢、排泄和毒性(ADME／T)特性研究，大大提高了新药研发的成功率【1]。所以借鉴西方新药研发的成功经验，将ADME／T评价体系引入到中药的研究中。特别是药物代谢研究，不仅有利于揭示中药的真正有效成分和作用机理，而且有利于研究中药复方的配伍规律等。本文将综述药物代谢(Dmg Metabolism)在中药研究中的应用概况及其进展。1 药物的代谢药物在机体内的消除方式主要有两种：一种是药物不经任何代谢而直接以原型随粪便和尿液排出体外；另一种是部分药物在体内经代谢后，再以原型和代谢物的形式随粪便和尿液排出体外。药物的代谢(drug metabolism)也称为药物生物转化(biotransformation)，是药物从体内消除的主要方式之一【2J。药物在体内的代谢主要分为两个步骤【3j，第一步称为I相代谢反应。药物在I相反应中被氧化、还原或水解，催化I相代谢反应的酶主要为肝微粒体中的细胞色素P450酶。第二步称为Ⅱ相结合反应。药物在Ⅱ相结合反应中与一些内源性的物质(如葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽等)结合或经甲基化、乙酰化后排出体外。催化Ⅱ相结合反应的酶主要有葡萄糖醛酸转移酶、谷胱甘肽一s一转移酶、磺基转移酶和乙酰基转移酶等【4 】。其中P450酶在众多外来化合物的生物转化过程中扮演了重要角色，被P450酶催化的底物相当广泛，90％以上药物的氧化是由P450酶催化的。是人体内最重要的代谢酶，其催化的I相代谢反应是化合物在体内代谢的关键步骤。因为这一步反应通常是药物从体内清除的限速步骤，可影响化合物的半衰期、清除率等动力学特性，且P450酶活性常常随遗传因素、年龄、疾病状态或其他药物相互作用的影响而发生改变L7J。一般来说，药物在体内经过代谢转化后其药理活性发生了较为复杂的变化，大致分为四种情况：第一，代谢物活性或毒性降低；第二，形成活性代谢物；第三，形成毒性代谢物；第四，前药的代谢激活。总之，药物代谢转化的最终结果是使药物极性增加。有利于药物的排出体外【2．3】。2 药物代谢研究的方法药物代谢的研究方法分为体内法和体外法，两者各有优缺点，所以通常两者相结合进行药物的评价研究。体外研究可以通过高通量筛选对大量化合物进行筛选，对大量候选化合物的药动学特性作出初步的评价。缩小体内筛选的范围，一般应用于药物发现和开发的初期。体内代谢研究是体外研究的良好的衔接点，因为有时候应用体外模型预测体内参数不理想，必须借助体内筛选。当然在药物开发的后期，也要进行动物和人体体内药物代谢研究，总之，两者相辅相成【3J。2．1 体内法药物的体内代谢研究主要是在整体水平上进行的。给予一定剂量的药物后，于不同的时间段分别收集胆汁、尿液和粪便，然后用高效液相色谱法(HPLC)或液质联用技术(LC-MS／MS)等方法在胆汁、尿液和粪便样品中寻找药物的代谢物(包括I相和Ⅱ相代谢物)。并对代谢产物进行初步的分析和鉴定，最终确定药物在体内的代谢途径。2．2 体外法肝脏是药物代谢的主要和重要器官之一，是药物生物转化的主要场所，因为富含有丰富的肝药酶，所以大部分的药物在肝脏被代谢。故药物的体外代谢模型多以肝脏为基础。常见的有：肝微粒体体外温孵法、肝细胞体外温孵法、离体肝灌流法、肝切片法和重组I)450酶体外温孵法等。药物体外代谢研究中应用到的方法除了高效液相色谱法(HPLC)或液质联用技术(LCMS／Ms)，还有分子生物学的方法，如we．ston bloting等。体外法因有其独特的快速简便和节约成本等优势和特点。所以在药物代谢研究中得到了广泛的应用。除了肝脏以外，口服药物还必须经过胃肠道消化吸收后才能进入血液发挥疗效(如人参皂苷的体内代谢[8 )，因此药物在胃肠内菌群的代谢越来越受到人们的重视，而且已经有人把药物在肠内菌代谢的研究引入到药物代谢的研究范畴。其常见的研究方法也有整体肠内菌代谢实验和离体实验两种，前者是对人或动物服药后的消化道各部分及其内容物进行分析，后者有粪便温孵法和消化道内容物温孵法，随着微生物技术的发展，也可用肠内菌纯菌株、混合菌或粗酶进行代谢研究。3 药物代谢在中药研究中的应用3．1 中药代谢产物谱的定性研究要了解中药在体内的代谢转化规律，首先应该明白其在体内转化成什么产物，而且这些产物有可能是活性增强的产物或活性减弱的产物。也有可能是毒性成分。因此对代谢产物谱的研究显得特别重要，它不仅可以阐明其在体内的代谢途径和机制，也可以进行代谢产物的有效性和安全性评价。国内对这一方面的研究报道较多，一般是将中药代谢后的各种生物样品采用各种手段分离后进行分析鉴定。如阿基业等人给予大鼠一定剂量的盐酸关附甲素后，在不同时间间隔收集大鼠尿液，应用液质联用法进行分析鉴定。结果表明关附甲素在大鼠体内可以转化成为关附壬索、关附醇胺、关附甲素葡萄糖醛酸和硫酸结合物、关附壬索葡萄糖醛酸和硫酸结合物，经过生物转化，代谢产物的极性增加，药效下降【9j。李晓海等人采用大鼠肝微粒体体外温孵法和大鼠体内法对左旋一叶蔌碱的代谢转化进行了研究，代谢产物分别鉴定为6一位羟基、6．位羰基及5一位a及B羟基取代的左旋一叶蔌碱，还证实了体内6一位羟基代谢物进一步形成了Ⅱ相结合物。最终基本阐明左旋一叶蔌碱在大鼠体内外代谢转化的途径Cio】。徐文等人将待测淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ与新鲜配制的大鼠肠内溶物悬液在37℃孵化，采用高效液相色谱同时测定孵化前后溶液中淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ的浓度，结果表明淫羊藿苷被肠道菌群迅速代谢成淫羊藿次苷Ⅱ，而淫羊藿次苷Ⅱ不被代谢[11]。3．2 中药代谢酶谱的研究鉴定参与中药代谢的代谢酶种类及其贡献，对中药现代化的研究同样重要。因为遗传因索和环境因素造成人体对药物代谢的存在差异，这种差异表现为代谢酶的表达差异，其根本原因是代谢酶的基因多态性决定的，依此可将人群分为强、中和弱代谢型等表型C12J。强代谢者和弱代谢者之间药代动力学性质存在显著差异[13J，因此给予不同代谢表型人群相同的剂量，药物产生的疗效会完全不一样。甚至会中毒现象的发生【l 。所以鉴定参与中药代谢的代谢酶种类及其贡献有利于指导临床合理用药，保证用药安全有效。此外中药代谢酶谱的研究还有利于研究中药的配伍规律、中药毒性研究等。高凯等人采用大鼠肝微粒体体外温孵法和高效液相色谱技术，通过运用不同的CYP同工酶选择性抑制剂和底物进行抑制实验，初步选出介导甘草次酸单羟化所涉及的CYP同工酶为CYP 3A1／2和CYP 2C9／10 cis}，研究结果提示当甘草次酸在CYP 3A1／2和CYP 2C9／lO弱表达的代谢者人群中使用时，应该注意剂量的控制，否则可能会出现中药的安全性问题。3．3 中药对代谢酶的诱导或抑制以及药物间相互作用研究中药的化学成分非常复杂。许多中药有效成分对CYP450酶表现出明显的诱导或抑制。如中药白芷中富含呋哺香豆素化合物，研究发现白芷提取物可以抑制大鼠肝微粒体CYP 3A、CYP 2C和CYP 2D1的活性，所以会抑制甲苯磺丁脲、地西泮、硝苯地平等在体内的代谢[16]。中药黄芩的主要有效成分黄芩苷。对 1Al、CYP 2B1和CYP 2Cll这3种同工酶有明显的诱导作用【l 。中药在lJ笛床上常复方用药或与化合物合并用药。这就有可能发生药物间的相互作用，引起药效、药动学、毒性等的变化。药物间的相互作用主要表现为药物代谢酶的诱导或抑制。如人参的有效成分人参皂苷Rd，它对CYP3A4有抑制作用；而人参再造丸、通心络等中成药组方中又含有人参，因此如果患者在服用通心络、人参再造丸等中成药时，同时服用经CYP3A4代谢的化学药硝苯地平、胺碘酮等，就可能会导致低血压等不良反应[18]。高月等人考察中药丹参、苦参、人参及其与藜芦合用对大鼠肝P450酶活力及mRNA表达的影响，结果显示这3种中药与藜芦配伍合用后均不同程度的抑制了P450酶含量和主要的药物代谢酶CYP3A及CYP2E1的酶活力。提示可能正是由于3种中药与藜芦配伍后对药物代谢酶的抑制作用减缓了剧毒中药藜芦中相关物质的代谢．致毒性增加，产生了不期望的中药毒性【l 。4 展望随着科学技术的发展，中药代谢的研究除了深入研究单一成分的代谢外。首先应加强有效部位、单味药材和中药复方的代谢研究，这样才能更准确更全面的阐明中药的药效作用机制；其次，应该深入开展中药基于代谢酶的配伍规律的研究，阐明中药复方中各单味药材之间的相互关系以及中药复方的解毒机制。总之，随着中药代谢的深入研究，以及其他学科和技术的合作。必将揭示中药的代谢规律、中药的配伍规律和解毒机制等，为中药新药的研制、创新药物的发现以及指导临床用药作出贡献。
在撰写药学 毕业 论文过程中，一个好的论文题目除了给整篇 文章 画龙点睛外，还直接决定着论文的内容、范围、框架结构以及选用的参考资料。下面我将为你推荐药学毕业论文题目，希望能够帮到你! 药学毕业论文题目(一) 1. 抗生素滥用举例 2. 抗菌药合理使用 3. 处方药和非处方药管理现状研究 4. 药品的 广告 管理 5. 药品销售中存在的问题 6. 药物不良反应 7. 药物相互作用 8. 中西药合用的优缺点 9. 给药时间与人体生物节律 10. 药物依赖性 11. 药物代谢酶在药物合用中的作用 12. 给药方式与药物疗效 13. 影响药物作用的因素 14. 谈谈你对中药毒性的认识 15. 药代动力学参数及其意义 16. 解热镇痛抗炎药的不良反应调查 17. 抗高血压药物的合理应用 18. 糖皮质激素类药物的合理应用 19. 细菌对抗菌药物的耐药性 药学毕业论文题目(二) 1. GAP在中药发展中的应用。 2. 中药的质量控制(可以具体到某个药材或者某一种中药制剂) 3. 中药临床不良反应监控及分析(可以具体到某个药材或者某一种中药制剂) 4. 中药新药研究与开发的现状及思考 5. 请结合临床实践谈谈你对中药现代化的理解 6. 中药新制剂研制工艺研究(可以针对某一医院制剂) 7. 我国制药工业的研究现状和发展趋势 8. 制药工艺学教学模式及 学习 方法 的探讨 9. 药物(写一具体名字)的工艺优化方法的探讨 10. 药物(写一具体名字)的合成研究 11. 相转移催化剂的研究进展 12. 酶催化剂的研究进展 13. 新药研发中药品质量控制的探讨 14. 新药研发中对溶剂的选择原则 15. 药厂“三废”处理方法的探讨 16. 药厂污水处理方法的现状和发展趋势。 17. 高效液相色谱应用新进展 18. 固相萃取技术在药物分析中的应用 19. “设计性”实验在药物分析实验教学中的应用探讨 20. 高效液相色谱整体柱在药物分离分析中的应用进展 药学毕业论文题目(三) 1. 常用抗肿瘤药物的不良反应 2. 急性脑卒中患者凝血、抗凝和纤溶指标的测定及临床意义 3. 抗血小板治疗药物的临床应用 4. 溶栓药物的临床应用进展 5. 脑血管病治疗药物进展 6. 血栓形成机制及其治疗进展 7. 缺血性脑卒中单元规范化溶栓绿色通道的应用与管理 8. 支气管哮喘治疗药物研究进展 9. 肺结核的药物治疗进展 10. 糖尿病治疗药物研究进展 11. 降血脂药物研究进展 12. 抗艾滋病药物研究进展 13. 帕金森病的药物治疗进展 14. 恶性肿瘤防治现状 15. 原发性高血压病的药物治疗 16. 慢性阻塞性肺病的药物治疗 17. 国内植物药研究的新进展。 18. 国外植物药研究的新进展。 19. 2010年版药典(一部)在中药质量监控中的变化。 20. 植物资源在中药研究中的应用。 药学毕业论文题目(四) 1. ****药品的 市场营销 策划方案 2. ****药品 市场调查 报告 3. ****医药企业营销实务中的4PS组合运用 4. ****医药企业产品策略分析 5. ****医药企业价格策略分析 6. ****医药企业 渠道 策略分析 7. ****医药企业广告策略分析 8. ****医药企业公共关系营销策略分析 9. ******医药新产品市场定位分析 10. ******公司医药代表的管理 11. ****新医改背景下医药市场的特点及营销策略 12. ****农村医药市场的特点及营销策略 13. ****传统医药保健品企业的直销分析 14. ******医药商品的“绿色营销”。 15. ****医药企业物流运行中存在的问题分析 16. ****药品零售连锁企业探析 17. ****平价药店的价格策略分析 18. ****药品品牌管理 19. ****地区医药企业营销人员现状调查 20. ****医药企业的营销战略选择 猜你喜欢： 1. 药学专业毕业论文 2. 药学论文题目大全 3. 药学类毕业论文题目 4. 药学毕业论文选题 5. 药学系毕业论文题目
中药是中华民族的伟大瑰宝，有着丰富的资源和悠久的传承历史，历经了千百年的临床实践，虽然积累了丰富的临床经验，为中华民族的健康事业作出巨大的贡献。但是中药的研发仍然充满了挑战，如药材来源变异大、有效成分不明、质量控制困难、缺乏清晰准确的安全性评价、药理作用机制不明等等。因此，至今还没有一种中药通过美国FDA的新药审批；而且，欧盟已经颁发了(欧盟传统药品法案)，也直接影响了中药的出口。为了扭转目前这种尴尬的境地，实现真正与国际接轨。发展祖国中医药事业，必须对中药的安全性、作用机理及其药理活性成分有明确的认识，并深入剖析。近十多年来。在西方药物发现和开发阶段利用体外和计算机辅助研究技术进行化合物的吸收、分布、代谢、排泄和毒性(ADME／T)特性研究，大大提高了新药研发的成功率【1]。所以借鉴西方新药研发的成功经验，将ADME／T评价体系引入到中药的研究中。特别是药物代谢研究，不仅有利于揭示中药的真正有效成分和作用机理，而且有利于研究中药复方的配伍规律等。本文将综述药物代谢(Dmg Metabolism)在中药研究中的应用概况及其进展。1 药物的代谢药物在机体内的消除方式主要有两种：一种是药物不经任何代谢而直接以原型随粪便和尿液排出体外；另一种是部分药物在体内经代谢后，再以原型和代谢物的形式随粪便和尿液排出体外。药物的代谢(drug metabolism)也称为药物生物转化(biotransformation)，是药物从体内消除的主要方式之一【2J。药物在体内的代谢主要分为两个步骤【3j，第一步称为I相代谢反应。药物在I相反应中被氧化、还原或水解，催化I相代谢反应的酶主要为肝微粒体中的细胞色素P450酶。第二步称为Ⅱ相结合反应。药物在Ⅱ相结合反应中与一些内源性的物质(如葡萄糖醛酸、硫酸、甘氨酸、谷胱甘肽等)结合或经甲基化、乙酰化后排出体外。催化Ⅱ相结合反应的酶主要有葡萄糖醛酸转移酶、谷胱甘肽一s一转移酶、磺基转移酶和乙酰基转移酶等【4 】。其中P450酶在众多外来化合物的生物转化过程中扮演了重要角色，被P450酶催化的底物相当广泛，90％以上药物的氧化是由P450酶催化的。是人体内最重要的代谢酶，其催化的I相代谢反应是化合物在体内代谢的关键步骤。因为这一步反应通常是药物从体内清除的限速步骤，可影响化合物的半衰期、清除率等动力学特性，且P450酶活性常常随遗传因素、年龄、疾病状态或其他药物相互作用的影响而发生改变L7J。一般来说，药物在体内经过代谢转化后其药理活性发生了较为复杂的变化，大致分为四种情况：第一，代谢物活性或毒性降低；第二，形成活性代谢物；第三，形成毒性代谢物；第四，前药的代谢激活。总之，药物代谢转化的最终结果是使药物极性增加。有利于药物的排出体外【2．3】。2 药物代谢研究的方法药物代谢的研究方法分为体内法和体外法，两者各有优缺点，所以通常两者相结合进行药物的评价研究。体外研究可以通过高通量筛选对大量化合物进行筛选，对大量候选化合物的药动学特性作出初步的评价。缩小体内筛选的范围，一般应用于药物发现和开发的初期。体内代谢研究是体外研究的良好的衔接点，因为有时候应用体外模型预测体内参数不理想，必须借助体内筛选。当然在药物开发的后期，也要进行动物和人体体内药物代谢研究，总之，两者相辅相成【3J。2．1 体内法药物的体内代谢研究主要是在整体水平上进行的。给予一定剂量的药物后，于不同的时间段分别收集胆汁、尿液和粪便，然后用高效液相色谱法(HPLC)或液质联用技术(LC-MS／MS)等方法在胆汁、尿液和粪便样品中寻找药物的代谢物(包括I相和Ⅱ相代谢物)。并对代谢产物进行初步的分析和鉴定，最终确定药物在体内的代谢途径。2．2 体外法肝脏是药物代谢的主要和重要器官之一，是药物生物转化的主要场所，因为富含有丰富的肝药酶，所以大部分的药物在肝脏被代谢。故药物的体外代谢模型多以肝脏为基础。常见的有：肝微粒体体外温孵法、肝细胞体外温孵法、离体肝灌流法、肝切片法和重组I)450酶体外温孵法等。药物体外代谢研究中应用到的方法除了高效液相色谱法(HPLC)或液质联用技术(LCMS／Ms)，还有分子生物学的方法，如we．ston bloting等。体外法因有其独特的快速简便和节约成本等优势和特点。所以在药物代谢研究中得到了广泛的应用。除了肝脏以外，口服药物还必须经过胃肠道消化吸收后才能进入血液发挥疗效(如人参皂苷的体内代谢[8 )，因此药物在胃肠内菌群的代谢越来越受到人们的重视，而且已经有人把药物在肠内菌代谢的研究引入到药物代谢的研究范畴。其常见的研究方法也有整体肠内菌代谢实验和离体实验两种，前者是对人或动物服药后的消化道各部分及其内容物进行分析，后者有粪便温孵法和消化道内容物温孵法，随着微生物技术的发展，也可用肠内菌纯菌株、混合菌或粗酶进行代谢研究。3 药物代谢在中药研究中的应用3．1 中药代谢产物谱的定性研究要了解中药在体内的代谢转化规律，首先应该明白其在体内转化成什么产物，而且这些产物有可能是活性增强的产物或活性减弱的产物。也有可能是毒性成分。因此对代谢产物谱的研究显得特别重要，它不仅可以阐明其在体内的代谢途径和机制，也可以进行代谢产物的有效性和安全性评价。国内对这一方面的研究报道较多，一般是将中药代谢后的各种生物样品采用各种手段分离后进行分析鉴定。如阿基业等人给予大鼠一定剂量的盐酸关附甲素后，在不同时间间隔收集大鼠尿液，应用液质联用法进行分析鉴定。结果表明关附甲素在大鼠体内可以转化成为关附壬索、关附醇胺、关附甲素葡萄糖醛酸和硫酸结合物、关附壬索葡萄糖醛酸和硫酸结合物，经过生物转化，代谢产物的极性增加，药效下降【9j。李晓海等人采用大鼠肝微粒体体外温孵法和大鼠体内法对左旋一叶蔌碱的代谢转化进行了研究，代谢产物分别鉴定为6一位羟基、6．位羰基及5一位a及B羟基取代的左旋一叶蔌碱，还证实了体内6一位羟基代谢物进一步形成了Ⅱ相结合物。最终基本阐明左旋一叶蔌碱在大鼠体内外代谢转化的途径Cio】。徐文等人将待测淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ与新鲜配制的大鼠肠内溶物悬液在37℃孵化，采用高效液相色谱同时测定孵化前后溶液中淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ的浓度，结果表明淫羊藿苷被肠道菌群迅速代谢成淫羊藿次苷Ⅱ，而淫羊藿次苷Ⅱ不被代谢[11]。3．2 中药代谢酶谱的研究鉴定参与中药代谢的代谢酶种类及其贡献，对中药现代化的研究同样重要。因为遗传因索和环境因素造成人体对药物代谢的存在差异，这种差异表现为代谢酶的表达差异，其根本原因是代谢酶的基因多态性决定的，依此可将人群分为强、中和弱代谢型等表型C12J。强代谢者和弱代谢者之间药代动力学性质存在显著差异[13J，因此给予不同代谢表型人群相同的剂量，药物产生的疗效会完全不一样。甚至会中毒现象的发生【l 。所以鉴定参与中药代谢的代谢酶种类及其贡献有利于指导临床合理用药，保证用药安全有效。此外中药代谢酶谱的研究还有利于研究中药的配伍规律、中药毒性研究等。高凯等人采用大鼠肝微粒体体外温孵法和高效液相色谱技术，通过运用不同的CYP同工酶选择性抑制剂和底物进行抑制实验，初步选出介导甘草次酸单羟化所涉及的CYP同工酶为CYP 3A1／2和CYP 2C9／10 cis}，研究结果提示当甘草次酸在CYP 3A1／2和CYP 2C9／lO弱表达的代谢者人群中使用时，应该注意剂量的控制，否则可能会出现中药的安全性问题。3．3 中药对代谢酶的诱导或抑制以及药物间相互作用研究中药的化学成分非常复杂。许多中药有效成分对CYP450酶表现出明显的诱导或抑制。如中药白芷中富含呋哺香豆素化合物，研究发现白芷提取物可以抑制大鼠肝微粒体CYP 3A、CYP 2C和CYP 2D1的活性，所以会抑制甲苯磺丁脲、地西泮、硝苯地平等在体内的代谢[16]。中药黄芩的主要有效成分黄芩苷。对 1Al、CYP 2B1和CYP 2Cll这3种同工酶有明显的诱导作用【l 。中药在lJ笛床上常复方用药或与化合物合并用药。这就有可能发生药物间的相互作用，引起药效、药动学、毒性等的变化。药物间的相互作用主要表现为药物代谢酶的诱导或抑制。如人参的有效成分人参皂苷Rd，它对CYP3A4有抑制作用；而人参再造丸、通心络等中成药组方中又含有人参，因此如果患者在服用通心络、人参再造丸等中成药时，同时服用经CYP3A4代谢的化学药硝苯地平、胺碘酮等，就可能会导致低血压等不良反应[18]。高月等人考察中药丹参、苦参、人参及其与藜芦合用对大鼠肝P450酶活力及mRNA表达的影响，结果显示这3种中药与藜芦配伍合用后均不同程度的抑制了P450酶含量和主要的药物代谢酶CYP3A及CYP2E1的酶活力。提示可能正是由于3种中药与藜芦配伍后对药物代谢酶的抑制作用减缓了剧毒中药藜芦中相关物质的代谢．致毒性增加，产生了不期望的中药毒性【l 。4 展望随着科学技术的发展，中药代谢的研究除了深入研究单一成分的代谢外。首先应加强有效部位、单味药材和中药复方的代谢研究，这样才能更准确更全面的阐明中药的药效作用机制；其次，应该深入开展中药基于代谢酶的配伍规律的研究，阐明中药复方中各单味药材之间的相互关系以及中药复方的解毒机制。总之，随着中药代谢的深入研究，以及其他学科和技术的合作。必将揭示中药的代谢规律、中药的配伍规律和解毒机制等，为中药新药的研制、创新药物的发现以及指导临床用药作出贡献。
【关键词】 靶向给药；药剂学；药物载体0引言常规剂型的药物经静脉、口服或局部注射后，药物分布于全身，真正到达治疗靶区的药物量仅为给药量的小部分，而大部分药物在非靶区的分布不仅无治疗作用，还会带来毒副作用. 因此，药物新剂型的开发已成为现代药剂学发展的一个方向，其中靶向给药系统（Targeted drug delivery system, TDDS）的研究已经成为药剂学研究热点〔1〕. TDDS指一类能使药物浓集定位于病变组织、器官、细胞或细胞内的新型给药系统. 靶向制剂具有疗效高、药物用量少. 毒副作用小等优点. 理想的TDDS应在靶器官或作用部位释药，同时全身摄取很少，这样，既可提高疗效，又可降低药物的毒副作用. TDDS要求药物能到达靶器官、靶细胞，甚至细胞内的结构，并要求有一定浓度的药物停留相当长的时间，以便发挥药效. 成功的TDDS应具备3个要素：定位蓄积、控制释药、无毒可生物降解. 靶向制剂包括被动靶向制剂、主动靶向制剂和物理化学靶向制剂3大类. 目前，实现靶向给药的主要方法有载体介导、受体介导、前药、化学传递系统等. 现就靶向给药方法研究进展作一介绍.1载体介导的靶向给药常用的靶向给药载体是各种微粒. 微粒给药系统具有被动靶向的性能. 有机药物经微粒化可提高其生物利用度及制剂的均匀性、分散性和吸收性，改变其体内分布. 微粒给药系统包括脂质体(LS)，纳米粒(NP)或纳米囊(NC)，微球(MS)或微囊(MC)，细胞和乳剂等. 微粒靶向于各器官的机制在于网状内皮系统(RES)具有丰富的吞噬细胞，可将一定大小的微粒( μm)作为异物摄取于肝、脾；较大的微粒(7~30 μm)不能滤过毛细血管床，被机械截留于肺部；而小于50 nm的微粒可通过毛细血管末梢进入骨髓.肝癌、肝炎等肝脏疾病是常见病和多发病，但目前药物治疗效果很不理想，其原因除药物本身药理作用尚不够理想外，不能将药物有效地输送至肝脏的病变部位也是一重要原因. 将一些抗肿瘤、抗肝炎药物制备成微粒，给药后可增加药物的肝靶向性. 米托蒽醌白蛋白微球（DHAQ BSA MS）的体内分布研究发现，给药20 min时，DHAQ BSA MS和米托蒽醌（DHAQ）在小鼠体内分布有显著差异，DHAQ BSA MS约有80%的药物集中在肝脏，而以上的DHAQ存在于血液中〔2〕. 张莉等〔3〕考察去甲斑蝥素（NCTD）微乳的形态、粒径分布及生物安全性，研究NCTD微乳及其注射液在小鼠体内的组织分布，结果表明，NCTD微乳较NCTD注射液增强了药物的肝靶向性，降低了肾脏分布，在一定程度上延长药物在小鼠体内的循环时间. 纳米粒和纳米囊肝靶向制剂的研究报道较多，如氟尿嘧啶、阿霉素、羟基喜树碱、狼毒乙素、环孢素等抗癌药物都被制成了纳米靶向制剂〔4〕. 王剑红等〔5〕采用二步法制备米托蒽醌明胶微球，粒径在 μm范围的占总数，体外释药与原药相比延长了4倍. 经小鼠体内分布试验表明具有明显的肺靶向性，靶向效率增加了3~35倍，肺中药代动力学行为可用一室开放模型描述，平均滞留时间延长10 h. 在纳米粒表面上包封亲水性表面活性剂，或通过化学方法连接上聚乙二醇或其衍生物，可以减少与网状内皮细胞膜的亲和性，从而避免网状内皮细胞的吞噬，提高毫微粒对脑组织的靶向性. Gulyaev等〔6〕以生物降解材料聚氰基丙烯酸丁酯为载体，以吐温80为包封材料制备了阿霉素毫微粒，研究结果表明脑中阿霉素浓度是对照组的60倍. 一些易于分解的多肽或不能通过血脑屏障的药物（如达拉根、洛哌丁胺、筒箭毒碱）通过制成包有吐温80的生物降解毫微粒在动物身上已取得一定的靶向治疗效果〔7〕. 研究表明粒径是影响微粒进入骨髓的关键因素，粒径越小越容易进入骨髓. 彭应旭等〔8〕制得不同粒径的柔红霉素聚氰基丙烯酸正丁酯毫微粒，小鼠尾静脉给药，小粒径组（70±24） nm骨髓内柔红霉素浓度是大粒径组（425±75） nm的倍. 骨髓会因肿瘤浸润、化疗药物或严重感染受到抑制. 研究表明，多种生长因子，如人粒细胞集落刺激因子（GCSF），粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）可促使骨髓细胞自我更新、分裂增殖，并提高其活性. 利用骨髓靶向载体可提高药物在骨髓内分布，并避免血象中的不良反应. Gibaud等〔9〕以聚氰基丙烯酸异丁酯、异己酯毫微粒为载体携带GCSF，提高了其在骨髓内的分布.基因治疗是一种专一性的靶向治疗. 基因治疗就是利用基因转移技术将外源重组基因或核酸导入人体靶细胞内，以纠正基因缺陷或其表达异常. 纳米颗粒作为基因载体具有一些显著的优点. 纳米颗粒能包裹、浓缩、保护核苷酸，使其免遭核酸酶的降解；比表面积大，具有生物亲和性，易于在其表面耦联特异性的靶向分子，实现基因治疗的特异性；在循环系统中的循环时间较普通颗粒明显延长，在一定时间内不会像普通颗粒那样迅速地被吞噬细胞清除；让核苷酸缓慢释放，有效地延长作用时间，并维持有效的产物浓度，提高转染效率和转染产物的生物利用度；代谢产物少，副作用小，无免疫排斥反应等.2受体介导的靶向给药利用细胞表面的受体设计靶向给药系统是最常见的主动靶向给药系统. 去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）是一种跨膜糖蛋白，它存在于哺乳动物的肝实质细胞上. 其主要功能是去除唾液酸糖蛋白和凋亡细胞、清除脂蛋白. 研究发现，ASGPR能特异性地识别N乙酰氨基半乳糖、半乳糖和乳糖，利用这些特性可以将一些外源的功能性物质经过半乳糖等修饰后，定向地转入到肝细胞中发挥作用. Lee等合成了三分枝N乙酰氨基半乳糖糖簇YEE，它与肝细胞的结合能力为乙酰氨基半乳糖单糖的1万倍. 我们考察了半乳糖苷修饰的十六酸拉米夫定酯固体脂质纳米粒（LAPGSLN）的肝靶向性，其靶向效率为，比未修饰纳米粒的靶向效率高倍〔10〕. 药物通过与大分子载体连接，再对载体进行半乳糖化，可以产生较好的肝靶向效果. 若能使药物直接半乳糖化，则可以简化耦联环节，提高靶向效率. 这一思路对蛋白类药物而言，较易实现. 蛋白质或多肽(分子质量在一定范围)在连接上半乳糖后，都有可能成为受体结合的肝靶向性物质. 小分子物质经类似途径能否靶向于肝，取决于糖和药物密度、分子质量、摄取屏障等多方面因素. 小分子药物共价连接乳糖或半乳糖，初步揭示其靶向性并不好，有关机制和可行性尚待进一步探讨.半乳糖基化壳聚糖（GC）与质粒pEGFPN1混和制备成纳米微囊复合物，体外转染SMMC7721细胞. 将含1 mg质粒的纳米微囊经肝动脉和门静脉注射入犬体内，实验结果表明半乳糖基化壳聚糖在体外有较高的转染率，在犬体内有肝靶向性，可用作肝靶向基因治疗的载体〔11〕. 大多数肿瘤细胞表面的叶酸受体数目和活性明显高于正常细胞. 以叶酸作为导向淋巴系统或肿瘤细胞的放射性核素的载体，同时将叶酸作为靶向肿瘤细胞的抗肿瘤药物的载体已做了广泛的研究〔12〕.表皮生长因子受体（EGFR）是一种跨膜糖蛋白，由原癌基因cerbB1所编码，是erbB受体家族之一，在多种肿瘤中观察到EGFR高水平的表达，如神经胶质细胞瘤、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌和胸腺上皮癌等. 针对富集EGFR的恶性肿瘤，方华圣等〔13〕成功地建立了EGFR富集的恶性肿瘤的靶向基因治疗方法.3抗体介导的靶向给药mAb是药物良好的靶向性载体， 将其通过共价交联或吸附到药物载体(如脂质体、毫微粒、微球、磁性载体等)或药物具有自身抗体(如红细胞)或抗体与细胞毒分子形成结合物，避免其对正常组织毒性，选择性发挥抗肿瘤作用. 徐凤华等〔14〕利用己二酰肼制备腙键连接的聚谷氨酸表阿霉素，然后使其与单抗交联制得偶合物. 偶合物较好地保留了抗体活性，体外细胞毒性较游离药物略有下降，但表现出单抗介导的靶细胞选择性杀伤作用，为其进一步制备细胞靶向的肿瘤化疗药物奠定了基础.用于治疗白血病的CMA676是由一种人源化的mAb hp 与新型的抗肿瘤抗生素calicheamicin的N乙酰γ衍生物偶联而成的〔15〕，当CMA676与CD33抗原相结合，抗原抗体复合物迅速内在化，进入胞内后，calicheamicin衍生物被水解释放，通过序列特异性方式与DNA双螺旋的小沟结合，使脱氧核糖环中的氢原子发生转移，从而使DNA双链断裂，诱导细胞死亡〔16〕. EGFR mAb可直接作用于EGFR的细胞外配体结合区，阻滞配体的结合，如IMCC225, ABXEGFR和EMD55900等，能抑制细胞生长和存活率，诱导细胞凋亡和抑制血管生成，曲妥珠单抗(Trasruzumab)作用于erbB2的细胞外区域，该药已获美国FDA批准用于转移性的乳腺癌的治疗〔17〕. IMCC225具有增强细胞毒性药物和放射治疗效应的作用，IMCC225与拓扑特肯(TPT)的联合用于荷有人类结肠癌移植体的裸鼠，能提高其生存率〔18〕. 由第四军医大学和成都华神集团股份有限公司联合研制的治疗肝癌新药碘〔13lI〕美妥昔单抗注射液，日前获得国家食品药品监督管理局颁发的生产文号，即将上市. 这是全球第一个专门用于治疗原发性肝癌的单抗导向同位素药物.4制成前体药物一些药物与适当的载体反应制备成前体药物，给药后药物就会在特定部位释放，达到靶向给药的目的. 脑是人高级神经活动的指挥中枢，也是神经系统最复杂的部分. 但由于血脑屏障（bloodbrain barrier, BBB）的存在，使得大部分治疗药物不能有效透过BBB. 含OH, NH2, COOH结构的脂溶性差的药物可通过酯化、酰胺化、氨甲基化、醚化、环化等化学反应制成脂溶性大的前体药物，进入CNS后，其亲脂性基团通过生物转化而释放出活性药物. 张志荣等〔19〕合成了3′, 5′二辛酰基氟苷，并制备了其药质体，给小鼠静脉注射后用HPLC法测定药物在体内各组织的分布，结果表明，氟苷酯化后的前体药物的药质体有良好的脑靶向性.结肠内有大量的细菌，能产生许多独特的酶系，许多高分子材料在结肠被这些酶所降解，而这些高分子材料作为药物载体在胃、小肠由于相应酶的缺乏不能被降解，这就保证药物在胃和小肠不释放. 如多糖、果胶、瓜耳胶、偶氮类聚合物和α, β, γ环糊精均可成为结肠给药体系的载体材料. 常利用结肠内厌氧环境，使偶氮键还原的特点制成偶氮前体药物. 柳氮磺胺吡啶是由5氨基水杨酸（5ASA）与磺胺吡啶用偶氮键连接而成. 口服后在结肠释药，发挥5ASA治疗溃疡性结肠炎的作用,减少其胃肠吸收产生的全身不良反应. 5ASA也与非生理活性的高分子聚合物通过偶氮双键制成前体药物〔20〕. 糖皮质激素共价连接于多糖〔21〕，环糊精〔22〕制成的前药，口服后在结肠部位可释放出药物，可用于结肠炎的治疗. 我们〔23，24〕合成了果胶酮洛芬（PTKP）前药，进行了体内外评价. 结果表明，此前药在不同pH环境下结构稳定，只能被结肠果胶酶特异性降解，释放出KP，发挥治疗作用. 也可以利用结肠pH差异和时滞效应设计结肠靶向给药系统〔25〕.5化学传递系统化学传递系统（chemical delivery system, CDS）是一种输送药物透过生理屏障到达靶部位，再经生物转化释放药物的药物传递系统. CDS通常是将含OH, NH2, COOH结构的药物共价连接于二氢吡啶载体（Q），药物（D）与靶向剂二氢吡啶结合为DQ结合物，建立了二氢吡啶―二氢吡啶钅翁盐氧化还原脑内定向转释递药系统. Chen等〔26〕设计了Tyr Lys的脑靶向CDS，并评价它的药效. Lys的C末端接亲脂性胆甾烯酯，N末端通过一种L氨基酸桥接靶向剂1，4二氢葫芦巴碱（含吡啶结构）制成Tyr Lys CDS，全身给药后，通过被动扩散机制透过BBB，且经酶催化1，4二氢葫芦巴碱变为季铵盐型使其存留于脑内. 通过小鼠甩尾间隔期实验证明，Tyr Lys CDS作用时间明显延长. Mahmoud等〔27〕将吸电子羧甲基连接到氮原子构建了一种新的二氢吡啶载体介导的脑定向转释系统(N羧甲基1,4二氢吡啶3,5二酰胺),该载体稳定,具有良好的脑定向转释能力.靶向给药的研究还面临许多实质性的挑战. 提高药物在靶组织的生物利用度；提高TDDS对靶组织、靶细胞作用的特异性；使生物大分子更有效地在作用靶点释放，并进入靶细胞内；体内代谢动力学模型；质量评价项目和标准，体内生理作用等问题都是研究的重点. 随着靶向给药系统研究的深入，新的靶向给药途径、新的载药方法将会不断出现，遇到的问题会逐步解决. 靶向给药的研究不仅具有理论意义，而且会产生明显的经济和社会效益.【参考文献】〔1〕 Theresa MA, Pieter RC. Drug delivery systems: Entering the mainstream 〔J〕. Science, 2004；303（5665）：1818-1822.〔2〕 张志荣，钱文. 肝靶向米托蒽醌白蛋白微球的研究〔J〕. 药学学报，1997；32（1）： ZR, Qian WJ. Study on mitoxantrone albumin microspheres for liver targeting 〔J〕. Acta Pharm Sin, 1997；32（1）：72-78.〔3〕 张莉，向东，洪诤，等. 肝靶向去甲斑蝥素微乳的研究〔J〕. 药学学报，2004；39（8）： L, Xiang D, Hong Z, et al. Studies on the liver targeting of norcantharindin microemulsion 〔J〕. 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ERAD简介 内质网相关降解（ERAD）△ 内质网应激想必大家都是很熟悉这个概念了。 它由三个主要的通路构成 ：(i) 通过PERK-诱导的eIF2α磷酸化来减弱翻译从而调节ER蛋白的合成；(ii) 基因表达诱导ER腔分子伴侣(luminal chaperones)，例如BiP/GRP78和GRP94，以及其他促进蛋白折叠的组分；(iii) 通过内质网相关降解（ ERAD ）从内质网中清除未折叠蛋白。 通常，细胞通过多种控制蛋白质质量的信号通路来维持蛋白质组的健康状态，这个过程叫 蛋白质内稳态 。细胞糖蛋白的分泌并维持稳定的糖蛋白稳态主要通过ERQC（内质网糖蛋白折叠质量控制）和ERAD来实现。ERAD作用的底物的范围是相当广泛的，从ER定位的错误组装蛋白到错折叠的膜和（管）腔蛋白。错误折叠的ERAD-L和ERAD-C蛋白的递送，泛素化和降解的ERAD机制△ 在ERAD过程中，待降解的底物（分三种：ERAD-L (lumen)、ERAD-M (membrane)和ERAD-C (cytosol)）通过E3连接酶标记上泛素，之后，通过特定的运输机制运回到细胞质中，然后，被细胞质 26S蛋白酶体 所降解。ERAD中最有意思的一个特征便是需要将底物从ER常驻位置移动到它们在细胞质中的最终目的地以实现蛋白酶体降解，即 受Cdc48/p97 AAA-ATP酶（也叫VCP）驱动的逆向转位 的过程。 ERAD过程示意图△ ERAD相关蛋白 1. 菱形假蛋白酶 Derlins是酵母和哺乳动物中最初被发现的介导ERQC的蛋白。基于序列和结构的同源性，derlins蛋白与菱形样蛋白超家族具有类似的结构特征。具体来说，它们是ER常驻性完整膜蛋白，拒预测可跨磷脂双分子层6次。 维持蛋白稳态，尤其是在内质网中，是极具挑战性的，因为内质网中蛋白合成的高需求不断的产生错误折叠应激。为了抵消伴随着缺陷蛋白累积产生的灾难性效应，错误折叠的ER蛋白会通过ERAD靶向降解。 Derlin-1是一种ER常驻的多次跨膜蛋白，与酵母Der1具有同源性，参与了ERAD。尽管许多研究证明了derlins协助了一些底物的ERAD，它们在逆向转位中的直接的功能仍然不清楚。 其他的一些蛋白及其生理和病理功能详见文献： The role of rhomboid superfamily members in protein homeostasis: Mechanistic insight and physiological implications. 2. 菱形蛋白酶 RHBDL4（RHBDD1）是一种参与ERAD的ER常驻菱形蛋白酶。与Derlins相比，Derlins主要参与从ER中逆转运全长缺陷蛋白，而 RHBDL4将特异性膜基质裂解为片段，随后逆向转运到细胞质中被蛋白酶体降解 。RHBDL4发挥其在ERAD中作用的两个重要特征是泛素化互作模体（motif，motif定义： 蛋白质的超二级结bai构，由2个或2个以上具有二级结构的的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，并发挥专一的功能 ）UIM和缬酪肽结合模体VBM，此模体可招募AAA-ATPase p97。有研究表明，特异性抑制p97会引起多聚泛素化蛋白的聚集、 ERAD底物的滞留和无法解决的蛋白毒性应激 ，导致未折叠蛋白响应的凋亡通路的激活，最终发挥治疗癌症的作用（ Targeting the AAA ATPase p97 as an approach to treat cancer through disruption of protein homeostasis ）。 Lember课题组最初报道了RHBDL4具有裂解膜蛋白，并靶向它们使其发生ERAD的作用。在这个极具创造力的研究中，他们发现 RHBDL4在逆向转运和降解之前，能裂解若干膜蛋白 ，而且裂解不仅发生在它们的膜内段，在跨膜段也可发生。该团队更近的研究也证实了RHBDL4具有介导错误折叠的 腔蛋白 （luminal protein）的周转（turnover）的作用。RHBDL4与ERAD组分 Erlin1和Erlin2形成一种底物适配器性质的复合物靶向腔蛋白。RHBDL4在具有腔聚集倾向性的蛋白的ERAD通路中发挥作用，这些蛋白会首先被裂解为片段，随后被蛋白酶体清除和降解，而不是以全长的形式逆向转运。癌症中的ERAD 高生长速率、ATP生成受损、低氧、低血糖以及特定的突变会扰乱内质网蛋白稳态，可能会引起UPR（unfolded protein response, 未折叠蛋白反应），继而可导致细胞死亡。ERAD会在不经意间（unwittingly，这个词有点意思）赋予癌细胞耐受糖蛋白毒性应激的能力，从而帮助癌细胞。慢性内质网应激下的细胞生存是侵略性癌症的一个特征，肿瘤细胞会试图通过劫持ERAD来维持生存。（老编插一句：下划线的两句中，描述的ERAD作用是矛盾的：前者是ERAD促癌，后者是ERAD抑癌。这其实跟自噬比较相似，过头了，反而对细胞的生存是不利的。后一句作者 引用的文献 讲的是，急性的ER应激会引起细胞凋亡。）基于这些理由，有人提出 用终末端的ERAD组分的抑制剂来特异性靶向破坏癌细胞的生存 。阻断ERAD同样能激发细胞凋亡。 在ERAD通路中 早期 发挥作用的组分是内质网降解增强性甘露糖苷酶（endoplasmic reticulum degradation-enhancing mannosidases, EDEM），它会将错误折叠的糖基化蛋白呈递进入降解过程中。一旦EDEM引发的去甘露糖苷化（demannosylated）发生，内质网腔中和内质网膜上的错误折叠的糖蛋白会被OS-9（osteosarcoma 9）和XTP3B ERAD凝集素招募至内质网膜连接的复合物，该复合物是围绕着E3泛素连接酶组装起来的。OS-9和XTP3B定位于内质网腔中，可特异性识别N-连接聚糖的经处理的C臂上Man α(1,6)-Man α(1,6)-Man残基。XTP3B也会抑制非糖基化蛋白的降解。然而，不同研究发现不同癌症中ERAD凝集素的作用可以是相反的。例如，OS-9在骨肉瘤中上调，XTP3B对于人肺癌细胞的转移特征至关重要，而lncRNA可通过增加OS-9的mRNA和蛋白水平来抑制胰腺癌的侵袭。 如前所述，p97 AAA-ATP酶是ERAD的关键分子。通过抑制p97很可能会导致不可逆的蛋白毒性应激，这些通路为我们提供了一个潜在可靶向的癌细胞的弱点。目前，有很多p97抑制剂在癌症治疗中的研究，如NMS-873和CB-5083，在实体瘤中，有的甚至比蛋白酶体抑制剂更加有效（ Targeting the AAA ATPase p97 as an approach to treat cancer through disruption of protein homeostasis ）。这种积极的结果可能预示着，靶向ERAD的治疗可能成为治疗癌症的一种新思路。更多资料 Structural view of ERQC/ERAD△ 与不同组成的聚糖结合的糖蛋白折叠阶段的ER轨迹是通过其与ER腔或与ER膜相关的ERQC/ERAD组分的相互作用来进行的。 剩下的就看图说话吧！ 文献来源 1. Kandel, R. R., & Neal, S. E. (2020). The role of rhomboid superfamily members in protein homeostasis: Mechanistic insight and physiological implications. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research, 118793. 2. Anderson, D. J., Le Moigne, R., Djakovic, S., Kumar, B., Rice, J., Wong, S., ... & Madriaga, A. (2015). Targeting the AAA ATPase p97 as an approach to treat cancer through disruption of protein homeostasis. Cancer cell, 28(5), 653-665. 3. Tax, G., Lia, A., Santino, A., & Roversi, P. (2019). Modulation of ERQC and ERAD: A Broad-Spectrum Spanner in the Works of Cancer Cells?. Journal of oncology, 2019.
从简单地剪切致病基因，到开发出不再传播疾病的工程动物，基因编辑技术已经释放出巨大的潜力。随着研究的深入，科学界还发现，除了编辑具有遗传讯息的DNA片段，编辑RNA可以在不改变基因组的情况下，帮助调整基因表达方式，此外，RNA的寿命是相对短暂的，这也意味着它的变化是可以逆转的，从而避免基因工程中的巨大风险。
2017年10月，来自Broad研究所的张锋研究团队在《自然》期刊上发表了题为“RNA targeting with CRISPR-Cas13”的文章，首次将CRISPR-Cas13系统公之于众，证实了CRISPR-Cas13可以靶向哺乳动物细胞中的RNA。仅仅时隔三周，又一篇名为“RNA editing with CRISPR-Cas13”的力作发表于《科学》期刊。在该研究中，张锋研究团队再次展示了这一RNA编辑系统，能有效地对RNA中的腺嘌呤进行编辑。
在CRISPR出现之前，RNAi是调节基因表达的理想方法。但是Cas13a酶一大优势在于更强的特异性，而且这种本身来自细菌的系统对哺乳动物细胞来说，并不是内源性的，因此不太可能干扰细胞中天然的转录。相反，RNAi利用内源性机制进行基因敲除，对本身的影响较大。但CRISPR-Cas13系统还有一个重要的问题，Cas13a酶本质上是一种相对较大的蛋白质，因此很难被包装到靶组织中，这也可能成为RNA编辑技术临床应用的一大障碍。
2018年3月16日，一项发表在《细胞》期刊的重磅成果为RNA编辑技术带来一大步飞跃，来自美国Salk研究所的科学家利用全新的CRISPR家族酶扩展了RNA编辑能力，并将这个新系统命名为“CasRx”。
CasRx（品红色）在人类细胞核中靶向RNA（灰色），Salk研究所
“生物工程师就像自然界的侦探一样，在DNA模式中寻找线索来帮助解决遗传疾病。CRISPR彻底改变了基因工程，我们希望将编辑工具从DNA扩展到RNA。”研究领导者Patrick Hsu博士表示，“RNA信息是许多生物过程的关键介质。在许多疾病中，这些RNA信息失去了平衡，因此直接靶向RNA的技术将成为DNA编辑的重要补充。”
除了高效性且无明显脱靶效应，新系统的一个关键特征是其依赖于一种比以前研究中物理尺寸更小的酶。 这对RNA编辑技术至关重要，这使得该编辑工具能够更容易被包装到病毒载体，并进入细胞进行RNA编辑。来自东京大学的科学家Hiroshi Nishimasu并未参与这项研究，他表示：“在这项研究中，研究人员发现了一种较Cas13d更加‘紧凑’的酶CasRx。从基础研究到治疗应用，我认为CasRx将成为非常有用的工具。”
此外，在这项研究中，研究人员还展示了利用这种新型RNA编辑系统来纠正RNA过程的能力。他们将CasRx包装到病毒载体中，并将其递送到利用额颞叶痴呆（FTD）患者干细胞中培养的神经细胞，最终使tau蛋白水平恢复到健康水平上，有效率达到80%。
Patrick Hsu博士最后说道：“基因编辑技术通过对DNA的切割带来基因序列的改变。在经过基因编辑的细胞中，其效果是永久的。虽然基因编辑技术能够很好地将基因完全关闭，但对调节基因的表达上并不那么优秀。展望未来，这一最新工具将在RNA生物学研究中发挥重要作用，并有望在未来凭借该技术对RNA相关疾病进行治疗。”
该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默。
3月18日，《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文，该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默，证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性，通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时，利用AAV递送CasRx和靶向Pscsk9的sgRNA到小鼠肝脏，有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，以及小鼠血液中的胆固醇水平。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。
同时，杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作，也探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性，研究人员发现在体内使用CasRx敲低Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积，验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。
近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势，因而成为近年来的研究热点。2018年，加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比，Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％，shRNA达到65％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比，Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。
此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性，杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性，为临床提供了可能性。为证明CasRx在动物体内的活性，研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选，然后采用尾静脉注射敲低Pten的质粒、尾静脉注射敲低Pcsk9的AAV8病毒、眼部注射敲低Vegfa的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析，分别得到Pten基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调，Pcsk9下调造成血清胆固醇下调；Vegfa下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积。
2020年3月18日，《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文，该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向 Pten 基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了 Pten 的高效沉默， 证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性， 通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时，利用AAV递送CasRx和靶向 Pscsk9 的sgRNA到小鼠肝脏， 有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，以及小鼠血液中的胆固醇水平 。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。
同时，杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作，也 探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性，研究人员发现在体内使用CasRx敲低 Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积**，验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。
近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势，因而成为近年来的研究热点。2018年，加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比， Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％ ，shRNA达到65％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比， Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的 ，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。
此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性，杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性，为临床提供了可能性 。为证明CasRx在动物体内的活性，研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选，然后采用尾静脉注射敲低 Pten 的质粒、尾静脉注射敲低 Pcsk9 的AAV8病毒、眼部注射敲低 Vegfa 的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析，分别得到 Pten 基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调， Pcsk9 下调造成血清胆固醇下调； Vegfa 下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积。
图1 CasRx介导的 Pten 体内体外的下调（ Protein & Cell ）
A.质粒示意图；细胞中 Pten 的下调；检测PTEN及AKT的表达； 与shRNA脱靶比较；E.尾静脉注射质粒示意图；.免疫荧光，qPCR，western分别检测 Pten 及p-AKT的表达
图2 血清胆固醇的调节以及 Pcsk9 的可逆调控（ Protein & Cell ）
A.针对 Pcsk9 的AAV8病毒注射示意图；B.肝组织中 Pcsk9 的表达量；C.血清 PCSK9 的表达量；D.血清胆固醇水平；.血清ALT和AST的测定；G.可逆调节注射示意图； H. Pcsk9 的动态调控。
图3 AAV介导CasRx减少了AMD小鼠模型中CNV的面积（National Science Review）
A.小鼠和人序列比较以及sgRNA示意图；.在293T和N2a细胞中敲低 Vegfa ；蛋白的表达；病毒质粒示意图；F.实验流程图；的mRNA表达水平；.激光烧伤之前或之后7天的 Vegfa mRNA水平；诱导3天后的VEGFA蛋白水平；K.激光烧伤7天后，用PBS或AAV-CasRx- Vegfa 注射的代表性CNV图像；面积统计。
2020 年 4 月 8 日， Cell 期刊在线发表了题为 《Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice》 的研究论文，该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室 杨辉 研究组完成。
该项研究通过运用最新开发的 RNA 靶向 CRISPR 系统 CasRx 特异性地在视网膜穆勒胶质细胞中敲低 Ptbp1 基因的表达，首次在成体中实现了视神经节细胞的再生，并且恢复了永久性视力损伤模型小鼠的视力。同时，该研究还证明了这项技术可以非常高效且特异地将纹状体内的星形胶质细胞转分化成多巴胺神经元，并且基本消除了帕金森疾病的症状。该研究将为未来众多神经退行性疾病的治疗提供一个新的途径。
人类的神经系统包含成百上千种不同类型的神经元细胞。在成熟的神经系统中，神经元一般不会再生，一旦死亡，就是永久性的。神经元的死亡会导致不同的神经退行性疾病，常见的有阿尔兹海默症和帕金森症。此类疾病的病因尚不明确且没有根治的方法，因此对人类的健康造成巨大威胁。据统计，目前全球大约有 1 亿多的人患有神经退行性疾病，而且随着老龄化的加剧，神经退行性疾病患者数量也将逐渐增多。
在常见的神经性疾病中，视神经节细胞死亡导致的永久性失明和多巴胺神经元死亡导致的帕金森疾病是尤为特殊的两类，它们都是由于特殊类型的神经元死亡导致。我们之所以能看到外界绚烂多彩的世界，是因为我们的眼睛和大脑中存在一套完整的视觉通路，而连接眼睛和大脑的神经元就是视神经节细胞。
作为眼睛和大脑的唯一一座桥梁，视神经节细胞对外界的不良刺激非常敏感。研究发现很多眼疾都可以导致视神经节细胞的死亡，急性的如缺血性视网膜病，慢性的如青光眼。视神经节细胞一旦死亡就会导致永久性失明。据统计，仅青光眼致盲的人数在全球就超过一千万人。
帕金森疾病是一种常见的老年神经退行性疾病。它的发生是由于脑内黑质区域中一种叫做多巴胺神经元的死亡，从而导致黑质多巴胺神经元不能通过黑质-纹状体通路将多巴胺运输到大脑的另一个区域纹状体。目前，全球有将近一千万人患有此病，我国尤为严重，占了大约一半的病人。 如何在成体中再生出以上两种特异类型的神经元，一直是全世界众多科学家努力的方向。
该研究中，研究人员首先在体外细胞系中筛选了高效抑制 Ptbp1 表达的 gRNA，设计了特异性标记穆勒胶质细胞和在穆勒胶质细胞中表达 CasRx 的系统。所有元件以双质粒系统的形式被包装在 AAV 中并且通过视网膜下注射，特异性地在成年小鼠的穆勒胶质细胞中下调 Ptbp1 基因的表达。
大约一个月后，研究人员在视网膜视神经节细胞层发现了由穆勒胶质细胞转分化而来的视神经节细胞，并且转分化而来的视神经节细胞可以像正常的细胞那样对光刺激产生相应的电信号。
研究人员进一步发现，转分化而来的视神经节细胞可以通过视神经和大脑中正确的脑区建立功能性的联系，并且将视觉信号传输到大脑。在视神经节细胞损伤的小鼠模型中，研究人员发现转分化的视神经细胞可以让永久性视力损伤的小鼠重新建立对光的敏感性。
为进一步发掘 Ptbp1 介导的胶质细胞向神经元转分化的治疗潜能，研究人员证明了该策略还能特异性地将纹状体中的星形胶质细胞非常高效的转分化为多巴胺神经元，并且证明了转分化而来的多巴胺神经元能够展现出和黑质中多巴胺神经元相似的特性。
在行为学测试中，研究人员发现这些转分化而来的多巴胺神经元可以弥补黑质中缺失的多巴胺神经元的功能，从而将帕金森模型小鼠的运动障碍逆转到接近正常小鼠的水平。
需要指出的是，虽然科学家们在实验室里取得了重要进展，但是要将研究成果真正应用于人类疾病的治疗，还有很多工作要做：人类的视神经节细胞能否再生？帕金森患者是否能通过该方法被治愈？这些问题有待全世界的科研工作者共同努力去寻找答案。
（上）CasRx 通过靶向的降解 Ptbp1 mRNA 从而实现 Ptbp1 基因表达的下调。
（中）视网膜下注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将视网膜穆勒胶质细胞转分化为视神经节细胞，转分化而来视神经节细胞可以和正确的脑区建立功能性的联系，并且提高永久性视力损伤模型小鼠的视力。
（下）在纹状体中注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将星形胶质细胞转分化为多巴胺神经元，从而基本消除了帕金森疾病模型小鼠的运动症状。
RNA-editing Cas13 enzymes have taken the CRISPR world by storm. Like RNA interference, these enzymes can knock down RNA without altering the genome , but Cas13s have higher on-target specificity. New work from Konermann et al. and Yan et al. describes new Cas13d enzymes that average only kb in size and are easy to package in low-capacity vectors! These small, but mighty type VI-D enzymes are the latest tools in the transcriptome engineering toolbox.
Microbial CRISPR diversity is impressive, and researchers are just beginning to tap the wealth of CRISPR possibilities. To identify Cas13d, both groups used very general bioinformatic screens that looked for a CRISPR repeat array near a putative effector nuclease. The Cas13d proteins they identified have little sequence similarity to previously identified Cas13a-c orthologs, but they do include HEPN nuclease domains characteristic of the Cas13 superfamily. Yan et al. proceeded to study orthologs from Eubacterium siraeum (EsCas13d) and Ruminococcus sp. (RspCas13d), while Konermann et al. characterized orthologs from “Anaerobic digester metagenome” (AdmCas13d) and Ruminococcus flavefaciens (nicknamed CasRx), as well as EsCas13d.
Like other Cas13 enzymes, the Cas13d orthologs described in these papers can independently process their own CRISPR arrays into guide RNAs. crRNA cleavage is retained in dCas13d and is thus HEPN-independent. These enzymes also do not require a protospacer flanking sequence, so you can target virtually any RNA sequence ! In bacteria, Cas13d-mediated cleavage promotes collateral cleavage of other RNAs. As with other Cas13s, this collateral cleavage does not occur when Cas13d is expressed in a mammalian system.
Since Cas13d is functionally similar to previously discovered Cas13 enzymes - what makes these orthologs so special? The first property is size - Cas13d enzymes have a median length of ~930aa - making them 17-26% smaller than other Cas13s and a whopping 33% smaller than Cas9! Their small size makes then easy to package in low-capacity vectors like AAV, a popular vector due to its low immunogenicity. But these studies also identified other advantages, including Cas13d-specific regulatory proteins and high targeting efficiency, both of which are described below.
The majority of Type VI-D loci contain accessory proteins with WYL domains (named for the three conserved amino acids in the domain). Yan et al. from Arbor Biotechnologies found that RspCas13d accessory protein RspWYL1 increases both targeted and collateral RNA degradation by RspCas13d. RspWYL1 also increased EsCas13d activity, indicating that WYL domain-containing proteins may be broader regulators of Cas13d activity. This property makes WYL proteins an intriguing counterpart to anti-CRISPR proteins that negatively modulate the activity of Cas enzymes, some of which are also functional in multiple species (read Arbor Biotechnologies' press release about their Cas13d deposit here ).
Not all Cas13d proteins are functional in mammalian cells, but Konermann et al. saw great results with CasRx and AdmCas13d fused to a nuclear localization signal (NLS). In a HEK293 mCherry reporter assay, CasRx and AdmCas13d produced 92% and 87% mCherry protein knockdown measured by flow cytometry, respectively. Cas13d CRISPR array processing is robust, with CasRx and either an unprocessed or processed gRNA array (22 nt spacer with 30 nt direct repeat) mediating potent knockdown. Multiplexing from the CRISPR array yielded >90% knockdown by CasRx for each of four targets, including two mRNAs and two nuclear long non-coding RNAs.
One interesting twist to Cas13d enzymes is their cleavage pattern: EsCas13d produced very similar cleavage products even when guides were tiled across a target RNA, indicating that this enzyme does not cleave at a predictable distance from the targeted region. Konermann et al. show that EsCas13d favors cleavage at uracils, but a more detailed exploration of this cleavage pattern is necessary.
Konermann et al. compared CasRx to multiple RNA regulating methods: small hairpin RNA interference, dCas9-mediated transcriptional inhibition (CRISPRi), and Cas13a/Cas13b RNA knockdown. CasRx was the clear winner with median knockdown of 96% compared to 65% for shRNA, 53% for CRISPRi, and 66-80% for other Cas13a and Cas13b effectors. Like previously characterized Cas13 enzymes, CasRx also displays very high on-target efficiency; where shRNA treatment produced 500-900 significant off-targets, CasRx displayed zero. Unlike Cas9, for which efficiency varies widely across guide RNAs, each guide tested with CasRx yielded >80% knockdown. It seems that CasRx may make it possible to target essentially any RNA in a cell.
Since catalytically dead dCasRx maintains its RNA-binding properties, Konermann et al. tested its ability to manipulate RNA species through exon skipping. Previous CRISPR exon-skipping approaches used two guide RNAs to remove a given exon from the genome, and showed success in models of muscular dystrophy . In this case, Konermann et al. targeted MAPT , the gene encoding dementia-associated tau, delivering dCasRx and a 3-spacer array targeting the MAPT exon 10 splice acceptor and two putative splice enhancers. After AAV-mediated delivery to iPS-derived cortical neurons, dCasRx-mediated exon skipping improved the ratio of pathogenic to non-pathogenic tau by nearly 50%, showing proof-of-concept for pre-clinical and clinical applications of dCasRx.
The identification of Type VI Cas13d enzymes is another win for bioinformatic data mining. As we continue to harness the natural diversity of CRISPR systems, only time will tell how large the genome and transcriptome engineering toolbox will be. It is, however, certain that the impact of CRISPR scientific sharing will continue to grow, and we at Addgene appreciate our depositors for making their tools available to the broader community.
References
Konermann, Silvana, et al. “Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.” Cell (2018) pii: S0092-8674(18)30207-1. PubMed PMID: 29551272
Yan, Winston X., et al. “Cas13d Is a Compact RNA-Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein.” Mol Cell. (2018) pii: S1097-2765(18)30173-4. PubMed PMID: 29551514
\1. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors
\2. CRISPR genetic editing takes another big step forward, targeting RNA
\3. How Editing RNA—Not DNA—Could Cure Disease in the Future
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论文关键词： 结核病;化学治疗;药物
抗结核药物是结核病化学治疗(简称化疗)的基础，而结核病的化学治疗是人类控制结核病的主要手段。结核病化疗的出现使结核病的控制有了划时代的改变，全球结核病疫情由此得以迅速下降。最早出现的有效抗结核药物当数链霉素(SM)。它发现于20世纪40年代，当时单用SM治疗肺结核2～3个月后就可使临床症状和X线影像得以改善，并可暂获痰菌阴转。对氨水杨酸(PAS)被应用于临床后发现，SM加PAS的治疗效果优于单一用药，而且可以防止结核分支杆菌产生耐药性[1]。发明异烟 肼 (INH)后，有人单用INH和联用INH PAS或SM进行对比治疗试验，再一次证明了联合用药的优势[2]。于是在此基础上产生了著名的结核病“标准”化疗方案，即SM INH PAS，疗程18个月～2年，并可根据药源和患者的耐受性将PAS替换为乙胺丁醇(EMB)或氨硫 脲 (TB1)，俗称“老三化”[3]。70年代随着利福平(RFP)在临床上的应用以及对吡 嗪 酰胺(PZA)的重新认识，在经过大量的实验后，短程化疗成为结核病治疗的最大热点，并取得了令人瞩目的成就[4，5]。当人类迈入2000年的今天，抗结核药物的研究已经获得了更进一步的发展，其中最引人注目的主要是利福霉素和氟 喹 诺酮这两大类药物，尤以后者更为突出。
一、利福霉素类
在结核病的化疗史上，利福霉素类药物的研究一直十分活跃。随着RFP的发现，世界各国出现了研制本类新衍生物的浪潮，相继产生了数个具有抗结核活性的利福霉素衍生物，但杀菌效果都不如RFP，RFP仍是利福霉素类药物中最经典的抗结核药物。
1.利福布丁(rifabutin，RFB，RBU)：RBU对RFP敏感菌的最低抑菌浓度(MIC)是低的(< μg/ml)，而对RFP耐药菌株的MIC明显增高(～ μg/ml)。此结果显示RFP与RBU存在交叉耐药;这么宽的MIC范围，又提示RFP耐药菌株对RBU有不同程度的敏感性，敏感比例高达31%。在MIC< μg/ml的结核分支杆菌株，或许可把RBU考虑为中度敏感[6]。RBU的亲脂性、透过细胞壁和干扰DNA生物合成的能力高于RFP，使之能够集中分布在巨噬细胞内而具有较强的活性。
RBU也有其不足之处。如RBU的早期杀菌作用不如RFP[7]，可能与其血浆浓度低有关。有研究结果表明，RBU口服剂量300 mg 4 h后的峰值浓度仅为 μg/ml，比同剂量RFP的峰值约低10倍。究其原因，可能与RBU的口服生物利用度和血清蛋白结合率均低有关，前者只有12%～20%，后者仅为RFP的25%。
临床上已将RBU试用于不同类型的结核病人。香港胸腔协会的研究结果表明，在治疗同时耐INH、SM和RFP的结核病患者中，RBU和RFP的效果几乎相等[8]。但已有研究表明，RBU对鸟分支杆菌复合群有明显的作用。
2.苯并恶 嗪 利福霉素-1648(KRM-1648)：苯并恶 嗪 利福霉素-1648属于3-羟-5-4-烷基 哌 嗪 ，为苯并恶 嗪 利福霉素5种衍化物之一。本品比RFP的MIC强16～32倍。小鼠实验结核病治疗结果显示：单剂KRM-1648 3 mg/kg的疗效明显优于RFP 10 mg/kg，与HE联用亦比RFP HE疗效佳。KRM-1648和其它利福霉素类的交叉耐药也必然是一问题，但纲谷良一[9]认为：由于KRM-1648比RFP有更强的杀菌作用，即使结核分支杆菌对RFP具耐药性，本药也能发挥一定的杀菌作用。
最近芝加哥的一份动物实验研究结果表明，KRM-1648、RBU和RFP这三种相类似的药物均对耐多药结核病(MDR-TB)无效[10]。
3. 利福喷丁(rifapentine， DL473， RPE， RPT)：RPT又名环戊基 哌 嗪 利福霉素，于1976年由意大利Leptit公司首先报道，我国紧跟其后于1977年就已着手研制，并在1984年应用于临床。该药为RFP的环戊衍生物，据Arioli等[11]报告，其试管中的抗菌活力比RFP高2～10倍。本品口服后，胃肠道吸收良好，并迅速分布到全身组织中，以肝脏为最高，其次为肾、脾、肺及心脏，在脑组织中也有分布。人口服后4 h即达血浓度高峰。RPT的蛋白结合率可达98%～99%，因此组织停留时间长，消除半衰期时间亦较RFP延长4～5倍，是一种高效、长效抗结核药物。
我国使用该药替代RFP对初、复治肺结核进行了对比研究，每周顿服或每周2次服用RPT 500～600 mg，疗程结束时痰菌阴转率、病变有效率和空洞关闭率与每日服用RFP组相比，疗效一致，未见有严重的药物毒副反应。本药不仅有满意的近期效果，而且有可靠的远期疗效[12]。由于RPT可以每周只给药1～2次，全疗程总药量减少，便于督导，也易为病家所接受。
二、氟 喹 诺酮类(FQ)
第三代氟 喹 诺酮类药物中有不少具有较强的抗结核分支杆菌活性，对非结核分支杆菌(鸟胞分支杆菌复合群除外)亦有作用，为临床治疗开拓了更为广阔的前景。由于结核分支杆菌对氟 喹 诺酮产生自发突变率很低，为1/106～107，与其他抗结核药之间无交叉耐药性，目前这类药物已成为耐药结核病的主要选用对象。
氟 喹 诺酮类药物的主要优点是胃肠道易吸收，消除半衰期较长，组织穿透性好，分布容积大，毒副作用相对较小，适合于长程给药。这类化合物抗菌机制独特，通过抑制结核分支杆菌旋转酶而使其DNA复制受阻，导致DNA降解及细菌死亡。氟 喹 诺酮在肺组织、呼吸道粘膜组织中有蓄积性，浓度均超过结核分支杆菌的MIC。感染部位的组织浓度对血药浓度的比值较正常组织中高，在痰、支气管粘膜、肺等组织的药浓度/血清浓度为2或更高，显示了对肺结核的强大治疗作用。
1.氧氟沙星(ofloxacin， OFLX)：OFLX对结核分支杆菌的MIC约～2 μg/ml，最低杀菌浓度(MBC)为1～2 μg/ml，在下呼吸道的组织浓度远高于血清浓度。OFLX有在巨噬细胞内聚积的趋势，在巨噬细胞中具有与细胞外十分相近的MIC，与PZA在巨噬细胞中产生协同作用。OFLX与其他抗结核药之间既无协同作用也无 拮 抗作用，可能为相加作用[13]。
OFLX的临床应用已有若干报道，尽管人体耐受量仅有中等程度抗结核作用，但不论对鼠实验结核或人结核病治疗均有肯定疗效。现在香港将OFLX与其它可供使用的配伍药一起，常规用于少数耐多药的慢性肺结核病人[8]。
我院采用含有OFLX的化疗方案治疗耐多药肺结核，获得了痰菌培养2个月阴转率50%、3个月62%以及6个月75%的可观效果。厂家推荐的用于治疗严重呼吸道感染的剂量为400 mg 2次/日。有人对22例单用OFLX 300 mg/d或800 mg/d治疗，持续9个月到1年，所有病人耐受良好，并显示较大的剂量效果较好[6]。多次用药后，血清或各种体液中无临床上明显的蓄积作用，有利于肺结核的长程治疗。人体对OFLX的最大耐受量为800 mg/d，我院选择的经验剂量为300 mg 2次/日。
2.环丙沙星(ciprofloxacin，CPLX， CIP)：CIP对结核分支杆菌的MIC和MBC与OFLX相似，具有很好的抗菌活性，但由于有人认为该药在试管内和RFP一起应用有 拮 抗作用，所以临床应用的报道也还不多。CIP因胃肠吸收差，生物利用度只有50%～70%，体内抗结核活性弱于OFLX。基于上述因素，OFLX被更多地用于耐药结核病。
3.左氟沙星(levofloxacin， DR-3355， S-OFLX， LVFX)：1986年开发的LVFX为OFLX的光学活性L型异构体，抗菌活性要比D型异构体大8～128倍。在7H11培养基中，LVFX抗结核分支杆菌的MIC50、MIC90均为 μg/ml。在7H12培养基中对敏感菌及耐药菌的MIC为～1 μg/ml(MBC1 μg/ml，)，比OFLX强1倍。与OFLX一样，LVFX亦好聚集于巨噬细胞内，其MIC为 μg/ml(MBC是2 μg/ml)，抗结核分支杆菌的活性也是OFLX的2倍。两者之间之所以产生这样的差异，可能与它们抗DNA旋转酶的活性不同有关[14]。
LVFX口服吸收迅速，服药后1 h血药浓度达 μg/ml，达峰时间(±) h。服用LVFX 4 h后痰中药物浓度平均 μg/ml，高于同期平均血液药物浓度 μg/ml，证明本品在体内吸收后渗透入支气管-肺屏障的浓度极高。而且，该药的副反应发生率只有。LVFX良好的抗菌活性、优良的药物动力学和较高的安全性以及与其他抗结核药间的协同作用[15]，使LVFX正逐步替代OFLX而成为MDR-TB的主要治疗药物。
4.司氟沙星 (sparfloxacin， AT-4140， SPFX) 与洛美沙星(lomefloxacin， LMLX)：SPFX是现行氟 喹 诺酮类中抗结核分支杆菌活性较高的品种。SPFX的MIC为 μg/ml，MBC μg/ml，较OFLX和CIP强2～4倍，亦优于LVFX。采用SPFX 50 mg/kg(仅相当于OFLX的1/6)就完全能够控制鼠结核病，临床上为达到最佳治疗结核的效果，宜采用400 mg/d。但SPFX对脑脊液的渗透有限，单次口服200 mg后脑脊液中的药物浓度分别低于或 mg/L。
LMLX对结核分支杆菌亦具有活性，但弱于对其它革兰阴性菌和阳性菌的活性。用于抗结核的剂量为400 mg 2次/日，如治疗超过一个月的患者可改为400 mg 1次/日。Primak等对43例初治肺结核用本药或RFP联用其它抗结核药进行疗效对比，3个月的痰菌阴转率不逊于RFP组。
SPFX与LMLX和氟罗沙星(fleroxacin)一样，因光毒性，使其在临床上的应用受到一定限制。
5. 莫西沙星(moxifloxacin， MXFX， Bay12-8039)：MXFX因附加的甲基侧链可增加抗菌活性，属第三代 喹 诺酮药物。对结核分支杆菌的MIC为 mg/L，虽体外活性大致与SPFX和克林沙星(clinafloxacin)相当;体内如在鼠实验结核中，克林沙星无活性，而MXFX的杀菌力较SPFX更高[16]。MXFX对治疗结核具有一定的开发潜力。
尽管上述氟 喹 诺酮类药物具有较好的抗结核作用，但无论如何也不能和RFP相提并论[17]。由于氟 喹 诺酮类药物影响年幼动物的软骨发育，对儿童和孕妇的安全性至今尚无定论，原则上暂不考虑用于这二类人群。
三、吡 嗪 酰胺
PZA是一种传统的抗结核药物，后来对它的杀菌作用又有了新的认识。根据Mitchison[18]的新推论，虽治疗开始时病灶内大多数细菌存在于细胞外，但当其中某些菌引起炎症反应使pH下降，部分细菌生长受抑制，此时PZA较INH更具杀菌作用。所以在短程化疗开始的2个月中加用PZA是必需的，可以达到很高、几乎无复发的治愈率。目前国外正在研制新的吡 嗪 酸类衍化物[20]。
四、氨基糖苷类
1.阿米卡星(amikacin，AMK)：卡那霉素由于它的毒性不适合于长期抗结核治疗，已逐渐被AMK所替代。AMK在试管中对结核分支杆菌是一种高效杀菌药，对大多数结核分支杆菌的MIC约为4～8 μg/ml。肌注 mg/kg(相当于 g/50 kg)，1 h后平均血的峰浓度(Cmax)为21 μg/ml。美国胸科学会(ATS)介绍的肌注和静脉滴注的剂量均为15 mg/kg[6] ，并将AMK列入治疗MDR-TB的主要药物中。
尽管AMK的耳毒性低于卡那霉素，但在条件许可的情况下，应监测该药的血浓度以确保剂量足够但不过高。具体做法可考虑每月测定一次高峰血液药物浓度，推荐峰浓度(静脉注射30 min后，肌肉注射60 min后)为35～45 μg/ml，可据此进行剂量调节。如果患者年龄在60岁或以上时，需慎用，因为AMK对年老患者的肾脏和第八对听神经的毒性较大。
2.巴龙霉素(paromomycin)：巴龙霉素是从链霉菌(streptomyces rimosus)的培养液中获得的一种氨基糖苷类药物，有研究认为它具有抗结核作用[19]。Bates[20]则将其作为一种新的抗结核药物，并用于MDR-TB。
五、多肽类，结核放线菌素-N(tuberactinomycin-N，TUM-N;enviomycin，EVM)
结核放线菌素-N的'抗结核作用相当于卡那霉素的1/2，它的优点是对肾脏和听力损害比紫霉素和卡那霉素低。鉴于此药对耐SM或KM菌株有效，可用于复治方案。常用剂量为1 g/d，肌肉注射，疗程不超过3个月。上海市肺科医院临床应用的结果表明，密切观察下肌肉注射结核放线菌素-N 1 g/d 14个月，未观察到明显的药物副反应。
六、氨硫 脲 衍生物
较引人注目的是2-乙酰 喹 啉 N4吡咯烷氨硫 脲 ，MIC为 μg/ml，优于TB1。国内单菊生等报告的15种氨硫 脲 衍生物有4种具体外抗结核分支杆菌作用，MIC范围在～ μg/ml之间，其中以乙 烯 基甲基甲酮缩TB1对小鼠实验性结核病的疗效为著。
七、吩 嗪 类
这是一类用于麻风病的药物，近年来也开始试用于耐药结核病，其中对氯法齐明(氯苯吩 嗪 ， clofazimine， CFM， B663)的研究最多[21]。CFM是一种吩 嗪 染料，通过与分支杆菌的DNA结合抑制转录而产生抑制分支杆菌生长的效果，对结核分支杆菌和牛分支杆菌的MIC为～ μg/ml。一般起始剂量为200～300 mg/d，当组织饱和(皮肤染色)时减为100 mg/d。它的另外一个重要作用是与β干扰素合用，可以恢复由结核分支杆菌25片段引起的细胞吞噬和杀菌活性的抑制作用，从而成为吞噬细胞的激发剂，属于免疫治疗的一部分，已经超出了单纯化疗的范畴[22]。CFM可引起严重威胁生命的腹痛和器官损害，应予以高度重视[23]。
有人报道，在11个吩 嗪 类似物中有5个体外抗结核分支杆菌活性等于或优于CFM(MIC90≤ μg/ml)，其中以B4157最强(MIC90为 μg/ml)，但仍在进一步研究之中[21]。
八、β内酰胺酶抗生素和β内酰胺酶抑制剂
结核分支杆菌也产生β内酰胺酶，但β内酰胺酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦在单用时并不能抑制结核分支杆菌的生长，而是通过抑制β内酰胺，使β内酰胺酶类抗生素免遭破坏[24]。当β内酰胺酶抑制剂与不耐酶的广谱半合成青霉素联合使用时，能大大增强这类青霉素的抗结核分支杆菌作用。其中的最佳联用当数氨 苄 西林或阿莫西林与克拉维酸的等摩尔复合剂[25]。一项27株结核分支杆菌的试管实验结果显示，阿莫西林单用时的MIC>32 mg/L，而与克拉维酸联用时MIC下降至4～11 mg/L，效果增加了2～7倍。这类代表性的复合剂有阿莫西林-克拉维酸(奥格孟汀，augmentin)，氨 苄 西林-克拉维酸和替卡西林-克拉维酸(特美汀，timentin)[26]。值得注意的是，氨 苄 西林加丙磺舒远远高于氨 苄 西林与克拉维酸联用时对结核分支杆菌的MIC90。如单用氨 苄 西林口服 g后的血清峰值为18～22 mg/L，加用1 g丙磺舒后可上升至25～35 mg/L。
由于β内酰胺酶类抗生素很难穿透 哺 乳动物的细胞膜而进入细胞内，有可能限制这类药物抗结核治疗的效果[27]。目前，这类药物的抗结核研究还限于实验阶段。
九、新大环内酯类
本类抗结核分支杆菌作用最强的是罗红霉素(roxithromycin， RXM， RU-28965)，与INH或RFP合用时有协同作用。其它还有甲红霉素(克拉霉素，clarithromycin， CAM， A-56268)和阿齐霉素(azithromycin， AZM， CP-62933)，主要用于非结核分支杆菌病的治疗[28]。
十、硝基咪 唑 类
近年来的研究认为，5-硝基咪 唑 衍生物作为新的抗结核药物具有相当好的开发前景。此类药物中的CGI-17341最具代表性，体外抗结核分支杆菌活性优于SM，可与INH和RFP相比拟，对结核分支杆菌的敏感菌株的MIC为～ μg/ml。实验动物中该药对感染结核分支杆菌小鼠的半数有效量(ED50)为 mg/kg，而INH和RFP的半数有效量分别为(～)和(～) mg/kg。其疗效与剂量显著相关，20、40、80 mg/kg的生存时间分别为(±) d、(±) d和(±) d。但是，5-硝基咪 唑 衍生物的抗结核研究尚未应用于临床。
十一、吩噻 嗪 类
吩噻 嗪 类中的氯丙 嗪 在早期的文献中报告能改善临床结核病，其浓度为～ μg/ml时能抑制巨噬细胞内结核分支杆菌，并增强SM、INH、PZA、RFP和RBU对抗细胞内结核分支杆菌的作用，该类药物中的 哌 嗪 衍生物三氟拉 嗪 (triluoperazine)，也有与之相类似的效果。
十二、复合制剂
抗结核药物复合制剂的研制主要是为了提高病人的依从性和增加药物的杀菌效果。复合制剂有杀菌剂与抑菌剂、杀菌剂与增效剂等多种形式，一般是两药复合，也有三药复合的情况。部分复合制剂的药效仅仅是单药累加效应，目的是提高病人的依从性;另一部分则不仅提高了依从性，也起到了增进药物疗效的作用。
在众多复合剂中，力排肺疾(Dipasic)是最为成功的一个品种，它以特殊方法将INH与PAS分子化学结合。动物实验结果显示，力排肺疾较同剂量INH的效果高5倍，亦明显高于以物理方式混合的INH加PAS，而且毒性低、耐受性良好、容易服用、耐药发生率低。近年来，国内已开始自行生产这类制剂，如结核清、百生 肼 、力康结核片和力克肺疾等。
力排肺疾的临床应用有两大趋势，一是用于耐药结核病，二是用于轻型儿童结核病。用于耐药结核病的理论依据是：自从短程化疗问世以来，临床上已很少使用PAS，可望结核分支杆菌对PAS有较好的敏感性;再就是二药分子化学结合而产生的增效结果。力排肺疾服用方便，毒副反应少，更适合于儿童结核病患者。
其它复合剂型还有卫肺特(Rifater，HRZ)和卫肺宁(Rifinah，HR)，这些复合剂只是物理性混合药物，本质上和组合药型类似。
已有的研究结果表明：使用复合剂的头8周痰菌阴转率为87%，高于单剂联合的78%;副作用前者为，低于后者的，但也有副作用以前者为高的报道;使用上复合剂较单剂联合更方便，有助于提高病人的可接受性[29]。
以上虽罗列了数大类药物在抗结核研究方面的进展，但应该认识到这些只不过是抗结核药物研究重新开始的序幕。因开发一种新的抗结核药物既需要财力和时间，还要评估其在试管和临床试用的效果，并非易事。从前一段时间看，由于发达国家的结核病疫情已经下降，而且认为已经有了有效的抗结核药物，而发展中国家无能力购置昂贵的药物，这些都是为什么尚无治疗结核病新药问世的一些理由。由于目前伴有HIV感染的结核病发病率增加和耐多药结核分支杆菌的出现，以及预料今后耐RFP菌株的发生率将会增高，所以导致急需迅速开发新的抗结核药物。抗结核新药的研究，在美国、欧洲和亚洲的实验室，已经从过去10年基本静止状态发展到一个活力相当大的时期。虽然Hansen疾病研究实验室筛选了可能用于抗结核的近5 000种化合物，但还没有发现高质量的化合物，而且该项目的因素评估工作还需要数年之久。何况即使在实验室初步证实有效的药物，用于人体是否有效和足够安全，尚待揭示，可谓任重道远。抗结核药物研究除直接开发新药外，还要认识到随着靶向释药系统的发展，利用脂质体或单克隆抗体作载体，使药物选择作用于靶位，增加药物在病变局部或细胞内的浓度，以改进疗效。文献早已报道了脂质体包埋的INH和RFP对鼠实验结核病的治疗取得良好效果。有人以携有吞噬刺激素(tuftsin)的RFP脂质体治疗实验鼠结核病，每周2次，共2周，使小鼠肺脏活菌数下降的效果比游离RFP至少强2 000倍，其疗效非同一般。目前脂质体虽尚无制剂上市供临床应用，但为今后提高难治性结核病的疗效、降低副反应，提供了令人鼓舞的前景。由此来看，未来结核病化疗的研究重点将仍在于寻找更为高效的杀菌剂或(和)灭菌剂，进而减少服药数量和服药次数、缩短化疗疗程、提高病人的依从性。