酶工程复习小结
第一章 绪论
1.酶的发展史
1773年，意大利斯帕兰扎尼发现了鹰的胃液消化肉块。
19世纪欧洲发现酶的反应属于化学反应，与生命活动无关。
巴斯德发现发酵与活细胞有关，起发酵作用的是酵母细胞。
库恩将其命名为酶。
毕希纳发现是一种生物反应催化剂。
酶的本质研究：最初认为酶是酿酒酵母，后来发现是一种具有生物催化活性的物质，在后来发现酶是一种蛋白质，在后来发现有些酶是RNA。
生物催化剂（Biocatalytics）：通常把来源于生物并且具有催化活性的酶制剂统称为生物催化剂。生物催化剂除了从生物体分离出来的酶之外，还包括富含酶制剂的细胞碎片、细胞器、丧失生命活性的完整细胞器以及可以增值的活细胞。
酶工程是利用酶催化的作用，在一定的生物反应器当中将原料转化为所需要产品，是酶学理论与微生物技术的结合而产生的一门新技术，是酶的生产与应用过程技术。
酶的生产：通过各种方法获得人们所需要的酶的技术过程。
酶的应用：通过酶的催化作用获得人们所需要的物质或者除去不需要的物质的技术过程。在酶的应用过程当中，出现了天然酶的缺陷包括：稳定性差（对热强酸强碱）、酶的分离纯化技术复杂、只能使用一次。
酶的改良：通过各种技术和方法改良酶的催化特征的技术过程。包括酶的分子修饰、酶的固定化、酶的非水相催化体系的建立以及酶的定向进化。
酶工程的三个阶段：
酶的提取分离阶段（日本的高峰让吉用米曲霉制备淀粉酶、Rohm动物一张中提取出胃蛋白酶用于皮革洗涤和软化、木瓜蛋白酶用于啤酒澄清、细菌淀粉酶用于纺织品退浆。
酶的发酵生产阶段：微生物液体深层发酵进行淀粉—淀粉酶的改良。
工程全面化发展：易错PCR、DNA重排、基因家族重排、高通量筛选、酶的定向进化。
第二章 酶学知识
1.酶的分类与命名
酶的分类：可以分为蛋白酶和核酸类酶。其中蛋白类酶包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶六种，核酸酶包括分子内核酸酶（自我剪切和酶、自我剪接核酶）和分子间核酸酶（DNA、RNA、多肽、氨基酸）。羊转水裂一脸
酶的命名：习惯命名法：底物加反应特性（蛋白酶、淀粉酶）、催化反应特征（水解酶）、加来源或特征（木瓜蛋白酶、碱性磷酸酶）
系统命名法：E.C.a.b.c.d
a表示大类即分类当中的六类。
2.酶的组成和特点
单纯酶是指简单酶，只有一种催化成分，单纯蛋白质，比如：脲酶、淀粉酶、脂肪酶。蛋白质的性质决定了他的催化活性。
结合酶或全酶：是指由酶蛋白和辅助因子构成的，辅助因子包括金属离子和小分子物质，其中小分子物质又包括辅酶和辅基。辅酶结合比较松弛，辅基结合比较紧密。一般来说，全酶的酶蛋白决定了底物的专一性，辅助因子决定了反应的专一性。
辅助因子的作用：
金属离子
金属离子的作用：催化作用，参与三元络合物E-M-S的形成，稳定蛋白构象。根据金属离子与酶蛋白的结合程度可以分为两种：金属酶和金属激活酶。酶蛋白与金属离子结合紧密，比如说铁离子/亚铁离子、铜离子/亚铜离子。金属激酶：酶蛋白与金属离子结合比较松散，在溶液中酶蛋白与这类离子结合而被激活。
辅酶和辅基：
辅酶：是指与酶蛋白结合比较松散那的小分子有机物质，通过透析方法可以除去。
辅基：以共价键与酶蛋白结合，不能用透析方法除去，必须使用一定的化学处理才能够将共价键打开。
酶的组成形式：单体酶、寡聚酶、多酶复合体、多酶融合体。
单体酶：有一条肽链组成或者多条肽链通过二硫键链接形成的酶。
寡聚酶：由两个或两个以上的与亚基组成的酶。
多酶复合体：由几种酶通过共价链接形成的复合体。其中每一个酶催化一种反应所有反应依次进行。
多聚融合体：一条多肽链上链接有多种催化活性的酶，通常是由基因改造形成的。
酶的结构：包括必需基团、结构维持和活性部位（包括结合基因和催化基因）
3.酶催化
酶催化的特点：催化效率高、高特异性、酶活可调节（不同反应条件下酶活不同）
催化反应的机制：广义的酸碱催化、共价催化
4.酶反应动力学：研究酶促反应的速率以及其影响因素的科学。
5.酶活力测定：反应条件设计酶浓度、底物浓度、反应体系、条件、样品、空白和对照。
第三章 酶的蛋白合成
1.中心法则
2.蛋白表达的调控：
2.1胞内蛋白和胞外蛋白的差异：
胞内蛋白由细胞质内游离的核糖体形成，一般来说，不含信号肽，不经过内质网、高尔基体的加工。胞外蛋白是存在于细胞外的基质当中，由细胞合成之后分泌到胞外的蛋白质，绝大多数含有信号肽。
2.2操纵子、调控子、信号肽、前肽。其中操纵子和信号肽位于目的基因上游。
操纵子：操纵子包括启动基因、操纵基因以及结构基因，三者紧密相连，操纵子是三者的总称。很多功能相关的基因前后链接成串，由一个共同的控制区进行调控。常见的操纵子包括：乳糖操纵子、色氨酸操纵子等信号肽：蛋白质中由特定氨基酸组成的连续序列，决定蛋白质在细胞中的最终定位。在胞外蛋白分泌的过程中至关重要。
2.3密码子：mRNA每三个相邻碱基排列成为一个密码子，密码子决定氨基酸的种类，密码子的排列顺序决定氨基酸的排列顺序，进而决定蛋白质的一级结构。在翻译过程中会与反密码子相结合。免疫原性：指可以引起免疫应答的性能。即抗原刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞发生活化、增殖、分化，最终产生特定的免疫细胞的能力。
抗原性：抗原性是指抗原与其诱导的看抗体或致敏淋巴细胞他特异性结合的能力大小。
蛋白结构包括一级结构、二级结构。
第四章 微生物产酶
1.微生物产酶的流程
1）菌种分离筛选：土样采集、过滤、辅基、菌落培养、筛选
2）菌种优化培育
3）发酵培养基/发酵条件的优化
4）发酵产物的分离纯化
5）酶制剂的包装保存
2.微生物产酶的生化机制
1）酶的生物合成的基本过程：转录和翻译
2）生物合成的调节：
分解代谢物的阻遏作用
酶生物合成的诱导作用
酶生物合成的反馈阻遏作用
3）合成模式：同步合成型、延续合成型、中期合成型、滞后合成型。（合成模式并不是固定不变的，同一菌种在不同条件下的合成模式可能会不同。）
同步合成型：酶的合成与细胞的生长同步进行，在细胞进入平衡期之后，酶的合成停止。
延续合成型：酶的合成与细菌的生长同步进行，但是在细菌生长进入平衡期之后，酶还可以继续合成一段时间。
中期合成型：酶在细菌生长一段时间之后才开始，在细胞生长达到平衡期之后，酶的合成停止。
滞后合成型：酶合成在细胞生长开始一段时间后，在细胞生长达到平衡期之后，酶的合成还可以继续合成一段时间。
3.微生物产酶的影响因素：
优化菌株、优化培养基、优化分离技术、设备及条件、控制工艺、其他（添加诱导物、控制阻遏物浓度、添加表面活性剂、添加促进剂）。
诱导物：能够调节启动子开关的物质称为诱导物，诱导物可以与调控蛋白结合，改变调控蛋白的空间结构，从而能改变基因转录翻译。
阻遏物：一种可以与DNA或者RNA结合来阻遏转录翻译的一种蛋白质，与操纵基因结合之后影响操纵子的蛋白结构，进而影响蛋白质合成。
表面活性剂：指具有一定的亲水疏水基因，在溶液表面横向排列，并且可以使表面张力下降的物质。促进剂：可以促进产酶，但是并不清楚其原理。
因此，发酵方式的选择、了解发酵特点、培养基的选择、优化工艺、优化发酵条件非常重要。
培养基：培养基的C/N，碳源、氮源有什么物质提供、无机盐、生长因子
发酵条件包括pH条件（缓冲体系、培养基中、流体）、温度（培养温度、发酵罐温度）、溶解氧（氧分压、通气量、气液接触时间、接触面积、改变培养液的性质）。
4.微生物发酵的优点：
1
）微生物产酶产量高。
2）微生物产酶稳定下好。
3）利于培养和管理
4）利于酶的分离纯化
5）安全可靠，无毒性。
第五章 微生物菌种改造
1.育种的分子生物学基础——突变
突变的分子机制：基因突变（碱基替换、移码突变、易位突变），染色体畸变和染色体组变（缺失和重复、倒位和易位、多倍体三倍体）
遗传性状改变：同义和无义突变、错义突变、移码突变
突变类型：形态突变型、生化突变型、条件致死突变型、致死突变型、抗性突变型。
基因突变：基因组DNA发生突然变化的，可以遗传的，变异现象。从分子水平来看，就是发生在碱基序列上的变化。
碱基替换：在DNA分子中，一个碱基被另一个碱基替换的现象。
移码突变：在正常的DNA分子中，碱基改变非3的倍数，导致在这个位置后面的所有碱基序列发生改变，导致碱基编码移位错误的现象就做移码突变。
易位突变：染色体片段发生位置改变叫做易位，其中在同一条染色体上的改变叫做移位或者染色体内易位，在不同染色体之间发生叫做染色体间易位。
染色体畸变：染色体畸变包括染色体数目的畸变和染色体形态的畸变。
同义突变：又叫沉默突变，是指DNA中的碱基改变导致mRNA的密码子发生改变，但是由于密码子并没有发挥作用，氨基酸并没有发生改变的突变。
无义突变：DNA的突变导致mRNA中的密码子改变为另一种终止密码子。
错义突变：DNA中的碱基改变导致mRNA中的密码子发生改变，编码成另一种氨基酸的突变。
形态突变型：指肉眼可见的突变型，比如说性状、大小、颜色的突变型。
2.育种前的准备——诱导细胞的选择
1）单倍体细胞
2）单核或者细胞核尽可能少。
3）诱变剂作用机理选择细胞状态
4）分离纯化
注意1）爱固定条件下培养细胞，2）利用成分固定的细胞进行实验，3）细胞充分分散，4）诱变之后表型延迟
3.育种的一般流程
1）选择出发菌株
2）出发菌株纯化
3）制备单孢子
4）诱变剂或者诱变方式的选择性
5）诱变条件的优化
4.菌种筛选
1）筛选流程的确认
2）筛选方法的确定和优化
3）筛选培养基
4）产物测定
5）突变菌株的分纯
6）突变菌株的工业化
5.育种的常见方法及原理
1）自然选育：小概率突变
2）经典诱变：物理诱变、化学诱变（烷化剂、核酸碱基类似物、抗生素）、复合诱变
产TG酶的菌种紫外诱变（制备孢子处理液、紫外处理、涂布暗箱培养、高通量初筛、摇瓶复筛、工业发酵罐放大）
亚硝基胍诱变：原理：烷化剂，是DNA上的碱基和磷酸部分被烷化，DNA复制时导致配对错误而引起突变。诱变条件：不同pH的诱变机理不同。
常温常压等离子体（ARTPA）常温常压等离子体突变，在其中含有多种化学活性成分粒子。
3）基于PCR技术的突变
随机突变、定点突变、易错PCR、基因重排、定向进化（建库）。
易错PCR：在采用DNA聚合酶进行PCR时，通过调整反应条件，比如说加入镁离子、加入锰离子、改变体系中的dNTP、低保真的酶等，来改变基因频率，以此达到基因突变的效果。
基因重排：将含有不同大小的基因库切成DNA小片段，小片段之间互为引物进行PCR扩增，扩增含有多个突变位点的基因，转化筛选。
定向进化：突变文库构建（基于易错PCR以及基因文库的建立），定向筛选（按照定向有目的筛选），基因鉴定（扩增目标基因，进行鉴定）
PCR对基因的改造缺点：只能对单基因进行改造，一般的酶分子不要过大，只能针对酶本身进行改造，往往适应性不好，效果有限。
4）有性选育：杂交育种、原生质体融合、基因组重排。
杂交育种：是将父母本杂交之后得到子代，对子代进行选育。
原生质体融合：采用人工的方法，将两个有一定性状的原生质体进行融合从而达到育种目的。
基因组重排：基因组重排需要一个基因库，然后通过原生质体融合的方式将目的基因进行随即重排。
第六章 酶的分离纯化
1.分离纯化的概要
1）酶蛋白纯化的一般过程：合适的方法选取、蛋白质来源及释放、初步分离、纯化、脱盐浓缩、检测保存
2）纯化常规需要考虑
量：科研级别（微克）；医药上和工业上（公斤级），
纯度：临床治疗99.9%，食品级安全
破碎条件：温和，去除杂志、脂质、核酸、毒素等物质。
纯化条件：缓冲体系，蛋白酶，稳定性
2.蛋白质的初步纯化——分离
1）细胞破碎：机械破碎法、化学破碎法、物理破碎法（压力差、温度差、超声）、酶促破碎法。
2）提取：
盐溶液提取：麸曲中的淀粉酶、蛋白酶等胞外酶。
酶溶液提取：胰蛋白酶的提取
碱溶液提取：细菌L—天冬酰胺酶
有机溶剂萃取：有机相、水相，多用于与脂质可以牢固结合或者有较多极性基团的酶提取。
3）沉淀分离：
盐析：利用不同蛋白质在不同溶液当中的溶解度不同进行分离，通过在酶溶液中加入一定浓度的盐使酶或者杂质析出沉淀，从而达到沉淀分离的作用。
等点点沉淀：利用两性电解质在等电点的溶解度最低，以及不同的良性电解质有不同的等电点这个特征，通过调节溶液的pH，是没或者杂质析出。
有机溶剂沉淀法：利用酶或者其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的有机溶剂，是没或者杂志析出。
复合沉淀：在酶中加入某种物质，使之与酶形成复合物，而沉淀下来。
选择性变性沉淀：选择一定条件使酶液中存在杂质，并且不会影响酶的作用效果。
4）离心分离
差速离心：根据粒子大小、沉降系数等进行离心。
密度梯度离心：在密度梯度离心介质（蔗糖、甘油）进行离心。
等密梯度离心：将介质与样品混合，由于各自的浮力上浮或者下沉。
5）膜分离：粗滤、微滤、超滤
3.蛋白质的精细纯化
1）色谱层析：吸附层析和分配层析（纸上层析和簿层层析）
2）不同层析的原理
3）分子排阻
4）离子交换层析
5）层析聚焦
6）疏水层析
4.高效液相色谱法
第七章 酶的性质
1.酶的基本性质
1）检测
SED-PAGE
WB：是否为特异性蛋白
LC-MS/GC-MS：含量以及分子量
CD：研究蛋白质的二级结构
紫外扫描/分光光度法：浓度
DSC：通过吸放热的特殊点发生蛋白质溶解点进行蛋白质分子连接点的研究。
晶体结构：冷冻电镜
2）酶的基本性质
酶活：是指在一定条件下酶催化反应的能力
酶活力大小：一定条件下酶催化反应的速率
酶单位：一定条件下一定时间内将一定量的底物转化为产物所需要的酶量。
酶转换数（Kcat）：一定条件下每秒钟每个酶分子转换的底物分子数来表示酶的反应速率。
抑制剂：分子直接作用于酶，导致其催化效率较低的物质叫做酶抑制剂。
3）酶学特征检测
2.酶的稳定性
金属离子、底物、辅因子、其他相对低分子的分子质量陪提的结合作用。
盐桥、二硫键、氢键、
3.酶的变性机制
1）化学变性因素：
表面活性剂、去污剂：阴离子>阳离子>无离子
变性剂：脲和盐酸胍
高浓度盐：硫酸铵、酶稳定剂
氰化钠（紊乱剂）
有机溶剂
螯合
重金属离子和巯基试剂
2）物理变性因素：热、机械力、冷冻脱水、辐射作用
3）蛋白复性：不在完全不可逆失活的条件下，大多数蛋白质可以复性。也就是重新具有酶的功能。
4）不可逆失活：
蛋白质水解酶和自溶作用：微生物或者外源蛋白水解酶的作用。
聚合作用：热变性、二硫键重组
极端pH：启动改变、交联破坏氨基酸残基
氧化作用：芳香族的侧链氨基酸、蛋氨酸、半胱氨酸，胱氨酸残基
4.酶的保存：保存条件状态、温度、水分、氧气、保护剂。固定化、酶分子修饰
第八章 酶的保存
1.酶抑制剂
1）抑制剂：直接作用于酶使其翠花效率降低的分子。
2）酶抑制剂的应用：治疗或者有毒
抑制作用类型：分为可逆抑制和不可逆抑制，可逆抑制又可以分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。
可逆抑制：可逆抑制是说对反应的一直是可逆的，以酶促反应来说，可逆性抑制剂与酶形成复合物，抑制酶与底物的作用。但是在相同条件下，复合物又可以分解成酶和抑制剂，分解后的酶仍然可以催化反应的发生。
竞争性抑制：抑制剂与底物共同竞争美的同一个活性位点，从而干扰了底物与酶的结合。
非竞争性抑制：抑制剂可与酶的其他活性部位结合，但不会和底物竞争同一个活性部位。
反竞争性抑制：抑制剂不能与游离酶发生结合，但是可以与底物—酶的复合物发生结合，从而抑制酶促反应。
不可逆抑制：共价修饰改变酶的结果，不可逆转。大豆胰蛋白酶抑制剂只不可逆作用于多肽，青霉素亚砜只不可逆作用于内酰胺酶。
3）酶抑制剂的应用
神经毒气 乙酰胆碱酯酶
达菲竞争性抑制流感
第九章 动植物及其细胞产酶
1.动物细胞及动物细胞产酶
1）概述
动物组织中有些酶的含量很高，可以直接提取，利用动物细胞额方法也可以产生大量的酶
2）动物细胞产酶的特点：易获取、动物来源、病毒、含量、纯度不高、可持续性不长。
3）动物产酶举例
蜗牛酶的提取：蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中植被的混合酶，含有纤维须眉，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等多种酶。
破壳，摘嗦囊，2-3倍缓冲液，过滤取滤液，冻干极为成品。
胰蛋白酶提取和精细纯化。
豚鼠肝脏中 TG酶
4）动物细胞产酶特点：
用于功能蛋白的生产
生产缓慢
需要添加抗生素
对剪切力面干、培养条件苛刻
有些只能贴壁培养。
培养基复杂，需要血清或替代品，价格昂贵。
5）动物细胞培养工艺
悬浮培养、贴壁培养、固定化细胞培养
培养基：氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、生长因子、激素
温度：36.5
6）重组蛋白表达
构建表达载体
选择合适的宿主细胞
有话培养基
优化纯化工艺
2.植物细胞产酶
1）概述半贴壁单层细胞室温可以生长，表达的重组蛋白可溶，折叠正确有翻译后修饰，有生物活性，比较容易分离，易于表达异源蛋白，安全
2）产酶方式
植物组织直接提取
愈伤组织培养
转基因植物
植物细胞培养
原生质体培养
3）植物细胞培养
细胞体积大，营养条件相对简单，产率提高，所短周期，易于管理、需要的条件较多（外界条件，修剪等）
4）植物组织培养
选择和处理外植体，分离细胞，愈伤组织诱导培养、细胞培养、原生质体再生培养
5）示例：蒜素和蒜酶超氧化物歧化酶、木瓜蛋白酶（提取炼乳，凝固，陈江，干燥、麦芽糖酶。
药学毕业论文开题报告篇3
题 目 名 称： 番泻叶对小鼠尿量的影响
研究现状：
一、普鲁兰酶
普鲁兰酶(Pullulanase，EC.3. 2. 1. 41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1.6糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉的脱支酶。普鲁兰酶还可以分解普鲁兰多糖，普鲁兰酶来源于微生物，R-酶则来源于植物。普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气气杆菌Aerobacter. aerogenes}(典型菌为肺炎克雷伯氏杆Klebsiella.pneumoniae)发酵获得，他们报道了该酶良好的酶学性能。之后，各国的科研人员经过广泛深入研究，从不同的地区、微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。
在淀粉加工工业中，α淀粉酶最为常用，它的功能是水解淀粉的α-1,4糖苷键，单独用它时，产物中含有大量分支结构的糊精，其中就含有大量的α-1,6糖苷键。假如不把淀粉的α-1,6糖苷键彻底分解的话，势必会造成很大的浪费。自然界中，存在有能分解淀粉的α-1,6糖苷键的酶，通称为解支酶。如寡α-1,6葡萄糖苷酶( E.C3.2.1.68, Oligo-l,6-glucosidase )，普鲁兰酶(E.C3.2.1.41Pullulanase )，异淀粉酶( E.C3.2.1.68, Isoamylose )，支链淀粉一6-葡聚糖酶( E.C3.2.1.69,Amylopectin-6-gluanohydrase )，其中普鲁兰酶要求的底物分子结构最小，故而可以将最小单位的支链分解，导致可以最大限度的利用淀粉，所以在淀粉加工工业中有着重要的用途和良好的市场前景。故而许多国家都争相开发，但是到现在为止，只有丹麦的NOVO公司具有普鲁兰酶的生产能力。我国只有向其进口，但是其价格昂贵，限制了普鲁兰酶在我国的应用。其实，我国早在七十年代就开发普鲁兰酶的产生菌，但是该菌的酶学性质不适合生产，至今我国在普鲁兰酶的国产化方面还没有报道。
在淀粉的加工行业上，对普鲁兰酶的酶学性质的要求是耐酸耐热，其原因是因为通常使用外加酶化法，由于所用酶类的限制，普鲁兰酶的添加可以在两步反应的任何一步，但必须满足上述的反应的条件。因此所开发的普鲁兰酶的酶学性质必须满足现有的酶法水解制糖的条件，也就是耐酸耐热。
二、普鲁兰酶的研究现状
1.产普鲁兰酶的微生物
普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气杆菌(Aerobacter
aerogenes)发酵获得。他们报道了该酶的良好性能之后，各国的科研人员经过广泛深入的研究，从不同的地区的微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。但是迄今为止，尽管发现许多微生物能够产普鲁兰酶，但是由于当今工业生产条件(酸性，温度)，大多数微生物所产的普鲁兰酶并无商业价值。以下便介绍一下普鲁兰酶的生产菌种。
1.1蜡状芽抱杆菌覃状变种(Bacillus cereus Var.mycodes)
由日本的ToshiyukiTakasaki于1975年发现。该菌同时产生两种淀粉酶:β-淀粉酶和普鲁兰酶。最佳作用条件为pH6～6.5，温度50℃，最大转化率(淀粉水解产生麦芽糖)大约为95%.酶学研究中发现，此酶在pH5，温度60℃依然保持大部分活性，该菌的营养细胞呈棒杆状，聚集成长短不等紊乱链状，无运动性，格兰氏阳性，产芽抱时细胞无明显膨胀。该菌最适生长温度30℃～37℃ ,最高生长温度在41℃～45℃，可以利用葡萄糖，甘露糖，麦芽糖，海藻糖，淀粉和糖原。
1.2嗜酸性分解普鲁兰多糖芽抱杆菌(BaciIluS.Acidopullulyticus)
上世纪八十年代初，丹麦Novo公司获得此菌，此菌所生产的普鲁兰酶耐热
(60℃)，耐酸(pH4.5)。该公司经过投入巨资开发研究，1983年Nov。公司在日本和欧洲市场同时商业化销售，商品名Prornozyme。如今，它是应用最广，产量最大的普鲁兰酶。Bacillus.Acidopullrrlyticus呈棒状，深层发酵几小时后，可观察到类原生质体的膨胀细胞，较稳定，饱子呈圆柱体或椭圆体。格兰氏反应阳性，37℃生长良好，45℃以上和pI-1高于6.5以上不长，在以普鲁兰糖为碳源的培养基((pH4.8 ～5.2)上生长良好。
1.3枯草芽饱杆菌(Bacillus subtilis)
1986年，日本的Yushiyuki Takasaki报道了一株能产生耐热耐酸普鲁兰酶的菌种，被命名为Bacillus subtilis TU。此菌种所产生的酶为普鲁兰酶和淀粉酶的混合物，可水解淀粉为麦芽三糖和麦芽搪.水解普鲁兰糖为麦芽三糖，其中普鲁兰酶最佳作用pH为7.0～7.5，但在pH5.0时亦有约50%的酶活，此普鲁兰酶最佳作用温度60℃。
1.4耐热产硫梭菌(Clostridum Themosulfurogenes)
1987年.德国的E.madi等报道了一株能同时产a淀粉酶、普鲁兰酶和葡萄糖淀粉酶的菌种:耐热产硫梭菌。该菌种所产普鲁兰酶有较广的温度适应范围(40℃～85℃)，在pH4.5～6.0有较高的活性，在如此广的范围内都有较强活力无疑将扩大该普鲁兰酶的应用领域.
1.5 Bacillusnaganoensis,Bacillus deramificans,Bacillus.Acidopullulyticus
上世纪九十年代，Deweer发现了普鲁兰酶产生菌Bacillus naganoensis;Tomimura筛选出Bacillus deramifrcans。这两株菌所产的普鲁兰酶的酶学性质与Bacillus. Acidopullulyticus的酶学性质相似。这两株菌都是中度嗜酸菌，在pH6.5以上就不生长，温度超过45℃以上同样也不生长。这两株普鲁兰酶产生菌的发现，进一步拓宽了普鲁兰酶的应用。
1.6产普鲁兰酶的高温菌菌种
自上世纪八十年代以来，人们逐渐意识到在通常的自然条件下，很难筛选得到极端耐热的普鲁兰酶生产菌种，于是各国的科学家便把目光转移到温泉嗜高温细菌的筛选，而且现在已经取得较多的成果。Bacillus如vorcaldarius所产普鲁兰酶的最适温度和pH分别是75～85℃, pH6.3, Thermotoga maritime的最适温度和pH分别是90℃, pH6.0, Thermurs caldopHilus的最适温度和pH分别是75℃,pH5.5, Fenidobacterion pernnavoran最适温度和pH分别是80～85℃, pH6.0o
2.普鲁兰酶的分子结构
至今为止，许多普鲁兰酶的基因己经被克隆，但是还没有见到任何有关普鲁兰酶结构的报道，但是在根据序列相似性对糖普键水解酶的分类，普鲁兰酶属于第13家族，α淀粉酶家族，这个家族中包含了30多种酶，可以分为水解酶，转移酶。异构酶三大类。这些酶能够水解和合成α～1.4,α～1.6,α～1.2,α～1.3,α～1.5,α～1.1糖苷键。其中很多酶的结构已经被报道，它们都采取了(β/α)8的结构，通过生物信息学的研究，这个家族的蛋白都有一个共同的结构，酶的活性中心都是(β/α)8折叠筒的结构，命名为结构域A。第13家族的大多数酶还具有结构域B，它是位于(β/α)8折叠筒中，第三个β片层与第三个α螺旋之间的一段序列，其特点是结构和长度差异较大，推测其功能是与底物的结合有关。在紧接着(β/α)8折叠筒后，还有C结构域，紧接C结构域，部分家族成员还有结构域D。
3.普鲁兰酶的应用
普鲁兰酶，在食品工业中是一种用途广泛的酶制剂和加工助剂。它能专一性分解淀粉中的支链淀粉和糖原分子及其衍生的低聚糖分支中的α～l, 6糖苷键，使分支结构断裂，形成长短不一的直链淀粉。因此，将该酶与 其它 淀粉酶配合使用时，可使淀粉糖化完全。近年来，普鲁兰酶己作为淀粉酶类中的一个新酶种，应用于淀粉为原料的食品等工业部门，在食品工业中有如下几方面的作用:
3.1单独使用普鲁兰酶，使支链淀粉变为直链淀粉
直链淀粉具有凝结成块，易形成结构稳定的凝胶的特性，因此，可作为强韧的食品包装薄膜。这种薄膜对氧和油脂有良好的隔绝性，又因涂布开展性好，故适合于作为食品的保护层。它还适合于淀粉软糖制造，也可用作果酱增稠剂，用于装油脂含量高的食品，以防止油的渗出以及肉食品加工。近年来在食品工业中提倡使用可被生物降解的薄膜，直链淀粉在这些方面具有较大的发展前途。豆类直链淀粉含量较高，因此绿豆淀粉制成的粉丝韧性比其它淀粉好，如果用普鲁兰酶处理谷物淀粉，再制成直链淀粉后，可以制成高质量的粉丝。一般谷物淀粉中，直链淀粉含量仅占20%，支链淀粉含量约为80%。工业上每生产1吨直链淀粉就有4吨副产品的支链淀粉。美国虽然通过遗传育种的方法.得到含直链淀粉60%玉米新品种，但不大适于大量生产。国外已采用普鲁兰酶改变淀粉结构，可使支链淀粉变为直链淀粉。据报道，采用此法收率可达100%.制造直链淀粉的方法为，先采用普鲁兰酶分解经液化的分支部分，使其转变为直链淀粉，并以丁醇或缓慢冷却法沉淀淀粉。再回收含少量水分的晶型沉淀物，最后通过低温喷雾干燥法制成粉状的直链淀粉。
3.2普鲁兰酶与β～淀粉酶配合使用生产麦芽搪
饴糖是我国传统的淀粉糖产品，其中所含部分麦芽糖，广泛用于糖果、糕点等食品工业。目前生产方法是以α～淀粉酶进行液化，再用β～淀粉酶水解支链淀粉，这样只能水解侧链部分。接近交叉地位的α～1.6糖苷键时，水解反应停止。但如果使用普鲁兰酶共同水解，便能使分支断裂，提高淀粉酶水解程度，降低了β极限糊精的含量，大大提高了麦芽糖的产率，有利于生产麦芽搪浆。目前对加普鲁兰酶进行糖化己作了较大规模的试验。
试验条件为。每批投料量约为900公斤碎米，粉浆浓度为15～16Be°数皮用量1.5%(对碎米计)，β～淀粉酶活性2,000单位/克以上，pH5.8;普鲁兰酶活性45,000～55,0 00单位/克，系由产气气杆菌生产，每批用量为1公斤。试验结果表明，加入普鲁兰酶糖化的试验糖与对照糖品相比，还原糖平均增加14.8，麦芽糖含量平均增加了45.6，糊精含量平均减少了26.7高浓度麦芽糖浆较之高浓度葡萄搪浆，具有不易结晶，吸湿性小的特点，所以高浓度麦芽糖浆在食品工业中有着广泛的用途。采用普鲁兰酶与p一淀粉酶配合使用，成本低廉，麦芽糖收率达到70%左右，其至更高。
3.3用于啤酒外加酶法糖化
啤酒生产中麦芽，既是酿造啤酒的主要原料，也为酿造过程提供了丰富的酶源。在啤酒酿造的糖化过程中，麦芽中分解淀粉的主要酶是α～淀粉酶、β～淀粉酶和分解淀粉α～1. 6糖瞥键的R一酶(植物普鲁兰酶或植物茁霉多糖酶)。β～淀粉酶与另两种淀粉酶协同作用，可使淀粉分解成麦芽糖(也包括少量的麦芽三糖和极少量的葡萄糖)和低分子糊精。使麦芽汁有比较理想的糖类组成。在工业生产中为了节约麦芽用量，采用所谓外加酶法糖化，即在减少麦芽用量的前提下，增加淀粉质辅助原料的比率，并加入适当种类的酶制剂进行搪化。要使大麦及其它辅助原料糖化完全，需要外加a一淀粉酶和分解α～1.6糖苷键的普鲁兰酶制剂等。单独使用a一淀粉酶时产生麦芽糖和麦芽三搪是很不完全的。假如分解淀粉α～1.6糖苷键的酶活性不足，淀粉分解就不完全，其结果是可发酵性糖含量低，制成的啤酒发酵度达不到要求。若采用能分解α～1.4和α～1.6糖苷键的糖化型淀粉酶，则其反应产物为葡萄糖，容易使酒味淡薄。采用普鲁兰酶与α～淀粉酶协同，效果良好，其分解产物主要是麦芽糖和少量的麦芽多糖。采用外加酶法糖化时，加入酶制剂的用量为:淀粉酶6～7单位/克大麦及大米:蛋白酶，60-80单位/克，并配合以菠萝蛋白酶10ppm，普鲁兰酶50单位/克大麦。以上三种酶制剂均添加于糖化或酒化开始。
总之，普鲁兰酶无论作为酶制剂和食品工业的加工助剂均有广阔的发展前途。
研究目的和意义：
酶制剂工业是上世纪七十年代就己经形成的一个重要的产业，目前世界酶制剂总产值达100亿美元，我国的产值约为100亿人民币，并且随着其应用领域的不断扩大以及新酶种的开发，这一市场正在迅猛发展。但是全球酶制剂产业几乎被几家外国公司所垄断，其中丹麦的NOVO公司几乎占全球总销售额的一半。本研究对普鲁兰酶的开发，对酶制剂产业的发展有重要的意义。
其次我国自从七十年代开始便对普鲁兰酶进行研究开发，但是所开发得到的普鲁兰酶，既不耐热也不耐酸，这就使其在工业化应用中受到了局限。为了改变我国对进口产品的依赖，填补我国这一领域的空白，寻找一条国产化的道路，本研究的目的是利用自然微生物资源，普鲁兰酶，提高我国淀粉原料的利用率，从而提高整个淀粉加工行业的生产率，这对我国淀粉加工产业的意义是不言而喻的。
研究内容(内容、结构框架以及重点、难点)：
一.普鲁兰酶产生菌的筛选
(1)样品的采集;
(2)菌种初筛;
(3)菌种复筛;
(4)菌种保藏方法;
(5)酶活力测定方法的建立。
二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究
(1)碳源，氮源对发酵产酶的影响;
(2)初始PH对发酵产酶的影响;
(3)接种量对发酵产酶的影响;
(4)发酵温度对产酶的影响;
(5)金属离子对产酶的影响。
重点或关键技术：
(1)纯菌株的分离;
(2)菌株的鉴定方法的选择。
研究方法、手段：
一.普鲁兰酶产生菌的筛选
(1)样品的采集：选择适合产生的地点(面粉厂.菜地.果园等)采集土样
(2)菌种初筛：在采集的土样用无菌水稀释后，在含有淀粉类的培养基中做平板涂步， 37℃培养48h后，用碘液进行显色反应，将有淀粉酶产生的菌落接于斜面中保存。
(3)菌种复筛：将前期分离的能产生淀粉酶的菌株涂步于普鲁兰糖平板上，37℃培养48h后用95%乙醇进行透明圈实验。有透明圈产生说明菌株产生普鲁兰酶，将产生透明圈的菌落挑于斜面培养基培养。
(4)菌种保藏方法： 采用4℃低温保藏。
(5)酶活力测定方法的建立：采用发酵培养液经过离心后利用DNS显色法 520nm测定吸光值，测定标准葡萄糖标准曲线，利用标准曲线计算普鲁兰酶酶活大小。
二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究
(1)碳源，氮源对发酵产酶的影响：采用不同碳源，氮源培养基培养一段时间，测定酶活力。(其他条件相同：接种量，装瓶量，初始PH值，转速，培养时间。)
(2)初始PH对发酵产酶的影响：采用相同发酵培养基，在不同初始PH下接种等量种子液。在相同条件下培养，测定发酵液的酶活。(其他条件相同：接种量，装瓶量，转速，最佳培养温度，最佳培养时间。)
(3)接种量对发酵产酶的影响：在发酵培养基中分别接入2%，4%，6%，8%，
10%，14%，18%的种子培养液于最佳碳源，氮源，最佳初始PH的培养基中，在相同条件下培养，分别检测酶活。(采用以上确定的最佳碳源，氮源，最佳初始PH。)
(4)发酵温度对产酶的影响：采用相同培养基，在不同温度下(25℃，30℃，35℃，40℃，45℃)培养一定时间，测定酶活力。
(5)金属离子对产酶的影响：在基础培养基中加入少量不同金属离子，发酵后测酶活。(金属离子有： 锰离子，钙离子，锌离子，镁离子，铁离子，铜离子。)
研究进度
：完成项目总体进度30%，样品土样的采集及前期的准备工作,菌株的初筛，包括(样品土样原液的涂步培养及摇床培养，产支链淀粉酶菌株的挑选及斜面培养)。
：完成项目总体进度50%,菌株的复筛，包括(产普鲁兰酶菌株的筛选及斜面培养),葡萄糖标准曲线的测定,酶活测定方法的建立,并以酶活大小对菌株进行再次筛选。
：完成项目总体进度80%,产酶条件的研究。包括：碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。并通过各中单因素试验确定发酵培养基的最佳碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。
2009、4—2009、5 ：完成项目总体进度100%,课题总结，撰写论文。
文献综述(包括：国内外研究理论、研究方法、进展情况、存在问题、参考依据等)
自从1961年Bender H.等人在研究一株产气气杆菌Aerobacter aerogenes(典型菌为肺炎克雷伯氏杆菌Klebsiella.pneumoniae)时首次发现普鲁兰酶后，国际上对产生这种酶的微生物进行了广泛研究，发现许多微生物可以产生此酶，并筛选出一些适用于工业化生产的优良菌株。随着该酶的应用发展，对耐热性普鲁兰酶的研究也逐渐增多，已成功克隆并表达了该酶的基因。国内1976年开始对一株产气气杆菌(Aerobacteraerogenes 10016)的普鲁兰酶进行研究，对该菌株的产酶条件、酶的分离提取及酶学性质作了报道，并研究了该酶的食品级提取技术。此外，陈朝银、刘涛等人从云南温泉水样中筛选到一株产普鲁兰酶高温栖热菌菌株，通过诱导等实验将该酶的酶活从0.069u/mL提高到170u/mL，酶产量提高了近2500倍左右，酶的最适作用温度及pH分别是75℃和4.5，具有一定的耐热和耐酸特性。
陈金全等从温泉水样中筛选到一株产耐热耐酸普鲁兰酶的野生菌株，并根据形态、生理生化特征、细胞化学组分分析及16SrDNA序列比对、基因组DNA的G+C摩尔百分含量、同源性比对等实验，鉴定其为脂环酸芽抱杆菌属(Alicyclobacillus)的一个新种，所产酶最适作用温度为60℃，最适pH值4.0，具有较好的耐热耐酸特性。杨云娟等利用毕赤酵母成功构建了普鲁兰酶表达量较高的基因工程菌，摇瓶发酵酶活可达350.8U/mL，最佳发酵条件下产量可达504.5-510.1U/mL .酶的最适作用温度为600C，最适pH值4.5，具有较好的耐热耐酸性。目前我国仍没有具备独立生产普鲁兰酶能力的厂商，要实现低成本、国产化的生产，还有很长的路要走。
技术应用于耐热脱支酶的研究，使耐热异淀粉酶的研究有了很大发展。Coleman等人将嗜热厌氧菌T. brockii普鲁兰酶基因克隆到B.subtilis中得到的克隆子分泌的普鲁兰酶数量高于出发菌株，Okada等人将Bacillus Steanther, onhiu:中编码热稳定异淀粉酶的基因克隆到B.subtilu:中，得到的转化菌株其异淀粉酶能在60 ℃稳定15分钟。Burchadf将。ostridium thermosulf urogenes DSM38%的嗜热异淀粉酶基因克隆并在E.coli中表达，所得酶的最适pH和最适温度与出发菌相同，而且在高温下仍能保持活性.Antranikiam等人将Pyrococcus舟riousous的异淀粉酶基因克隆到E.coli中并分离得到了酶蛋白。尽管如此，目前尚未有已将转基因的耐热性异淀粉酶工程菌应用到工业生产中的报道。众所周知，利用物理和化学诱变剂单独或复合处理微生物细胞是选育高产变种菌株行之有效的经典方法，它在为培育多种抗生素、氨基酸、核苷酸激酶(尤其是蛋白酶和淀粉酶)的高产变种菌株方面曾经起过极为重要的作用，至今仍然是方便易行和行之有效的方法之一。
主要参考文献：
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酸性蛋白酶是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类，其最适作用pH值为2.5-5.0。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。 目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为3.0左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定，从而限制了酸性蛋白酶的应用范围。 因此，本研究以开发耐温偏酸性蛋白酶为目标，进行了以下几方面的研究： (1)偏酸性蛋白酶产生菌的分离筛选。 (2)偏酸性蛋白酶粗酶酶学性质的研究。 (3)偏酸性蛋白酶固体发酵条件的优化。 (4)偏酸性蛋白酶产生菌P-1007的初步鉴定。 (5)偏酸性蛋白酶在啤酒澄清中的应用。 本论文主要研究结果和结论如下： (1)用常规土壤分离方法，从土壤样品中筛选到一株产偏酸性蛋白酶的菌株，命名为P-1007。 (2)通过单因素发酵条件实验和正交实验的方法得到最佳固体发酵条件为：麦麸15g，黄豆粉8％，葡萄糖3％，NaH2PO41％，CuSO40.2％，水35ml，最佳起始pH7.0，最适发酵温度为40℃。在此条件下所产酶活可达3700u/g，比原始菌株发酵酶活提高了将近2倍，且产酶稳定性较好。 (3)菌株P-1007所产的偏酸性蛋白酶的最适作用pH值为5.5，最适作用温度为50℃。酶的pH稳定性和耐温性较好，50℃、pH5.5条件下保温8h后剩余酶活可达83％以上，pH5.5、50℃条件下保温2h后剩余酶活仍在70％以上。Mn2+、Cu2+对偏酸性蛋白酶有明显的激活作用，其它金属离子则对该酶有不同程度的抑制作用。与目前所得到的酸性蛋白酶相比较，偏酸性蛋白酶具有较高的作用pH值和较好的耐温性。 (3)从菌株P-1007菌落形态、显微观察以及5.8SrDNA-ITS区序列分析可以看出菌株P-1007可能属于烟曲霉。 (4)从酶学性质上可以看出，菌株P-1007所产的偏酸性蛋白酶的作用条件满足于啤酒澄清工艺的要求，因此本实验进行了偏酸性蛋白酶在啤酒澄清中的应用研究以及该酶与酿造复合酶和啤酒用中性蛋白酶作用效果的比较。研究结果表明：经偏酸性蛋白酶作用后，麦汁和发酵液中酪氨酸含量、透光率、总氮量、可凝固性氮含量都有了明显的提高。麦汁中a-氨基氮含量也增加了，说明偏酸性蛋白酶将凝固性蛋白质水解成了分子量较小的a-氨基氮，为啤酒酵母的生长繁殖提供了氮源。同时发酵液中的a-氨基氮含量却降低了，分析原因为发酵阶段中酵母利用a-氨基氮的速度比偏酸性蛋白酶降解蛋白质的速度快。麦汁和发酵液的pH值都无太大变化，因此不会影响啤酒酵母的生长和繁殖。在与酿造复合酶和啤酒用中性蛋白酶作用效果的比较中发现，三种酶的作用效果大致相同，但从最适作用条件来看，偏酸性蛋白酶比另两种蛋白酶更适合于啤酒澄清工艺。 以上研究结果表明，本课题筛选到的菌株P-1007所产偏酸性蛋白酶的作用条件特别适合于啤酒澄清工艺，因此在啤酒工业中有较好的应用前景。 关键字:烟曲霉,偏酸性蛋白酶,发酵条件优化,酶学性质,rDNA-ITS区序列分析,啤酒澄清
