王晓梅，杨坚泰，许改霞，林晓潭，周消清，屈军乐，陈思平，牛憨笨，“CdSe/CdS/ZnS量子点对体外培养成熟卵母细胞的浸入性研究”，中国激光，2010,37（11）：2730-2734.李恒，邵永红，王岩，屈军乐，安莹，牛憨笨，“基于微透镜阵列和振镜扫描的光谱分辨多焦点多光子显微技术”，中国激光，2010，37(5):1240-1244.于凌尧，尹君，万辉，刘星，屈军乐，牛憨笨，林子扬，“基于超连续光谱激发的时间分辨相干反斯托克斯拉曼散射方法与实验研究”，物理学报，2010,59（8）：5406-5411尹君，于凌尧，屈军乐，牛憨笨，林子扬，“获取生物分子完整拉曼谱的时间分辨相干反斯托克斯拉曼散射方法的理论研究”，光学学报，2010，30（7）：2136-2141刘夏，陈丹妮，屈军乐，杨坚泰，罗永祥，Roy Indrajit , 王晓梅，林晓潭，钟磊，Prasad N. Paras , 许改霞，牛憨笨，“生物相容性量子点的表征及其在细胞标记中的应用”，光谱学与光谱分析，2010，30（5）：1290-1294.于斌，陈丹妮，孙强，屈军乐，牛憨笨，“新型衍射光学成像光谱仪的设计和分析”，光学学报，2009,29（5）：1260-1263.邵永红，李恒，王岩，屈军乐，牛憨笨，“基于同步扫描相机的荧光寿命测量系统研究”，深圳大学学报理工版，2009,26（4）：331-336.尹君，林子扬，屈军乐，于灵尧，刘星，万辉，牛憨笨，“相干反斯托克斯拉曼散射显微成像技术”，中国激光，2009，36（10）：2477-2484.许改霞，杨坚泰，Roy Indrajit,屈军乐，陈丹妮，王晓梅，Paras N. Prasad，牛憨笨，“纳米颗粒在穿透血脑屏障研究中的应用”，深圳大学学报理工版，2009,26（1），1-8.孙怡雯，屈军乐，赵伶羚，许改霞等. 眼底RPE细胞脂褐素及氧化黑色素自体荧光寿命成像研究. 物理学报，2008，57（2）：772-777.屈军乐，潘文良，赵羚伶，孙磊，王小平，陈同生，“蟾酥灵诱导细胞内caspase-3活化特性荧光分析”，深圳大学学报理工版，25（3），244-247（2008）.陈同生，卢盈颖，王龙祥，屈军乐，“基于FRET效率分析细胞内caspase-3活化特性研究”，深圳大学学报理工版，25（3），233-237（2008）.林浩铭，邵永红，屈军乐，“散斑照明宽场荧光层析显微成像技术研究”，物理学报，57（12），227-235（2008）., ,牛憨笨，袁小聪，屈军乐，许改霞，刘立新，彭翔，“细胞生命现象分析和研究的光学方法与手段”，中国科学，G辑：物理学 力学 天文学，37，21-29(2007).刘立新，王磊，屈军乐，林子扬，刘文清，牛憨笨，“两维荧光光谱技术及最佳光谱分辨率设计”，深圳大学学理工版，24(3)，252－256（2007）.刘立新，屈军乐，林子扬，陈丹妮，许改霞，胡涛，郭宝平，牛憨笨. 双光子激发时间分辨荧光光谱测量技术. 物理学报，2006, 55(12): 6281-6286.林子扬，付哲，刘立新，胡涛，屈军乐，郭宝平，牛憨笨. 双光子阵列点激发同时多维荧光信息的处理, 物理学报，2006, 55(12):6701-6707.刘立新, 屈军乐, 林子扬，陈丹妮，胡涛，郭宝平，牛憨笨. 用于双光子激发荧光寿命显微成像的高重复频率皮秒扫描相机, 光学学报，2006，26（3）：373-378.
论文提纲：硅基超连续谱的研究进展
1. 引言
超连续谱(Supercontinuum，SC)是指当一束高强度的短脉冲通过非线性材料时，经过一系列非线性效应与线性色散的共同作用，使得出射光中产生许多新的频率成分，从而使频谱得到极大展宽的一种现象。超连续谱光源在光子学集成回路中有着重要作用，特别是在波分复用系统中扮演着重要角色。使用展宽的激光光源，筛选出所需的波长信道，比使用独立的光源更节省能源，也更利于集成。另外，超连续谱光源在光源检测、生物医学、高精密光学频率测量等方面有着重要应用。产生超连续谱的介质需具有非常高的非线性系数以及可调的色散系数，可用于超连续谱产生的介质很多，例如，单模光纤，光子晶体光纤（Photonic CrystalFiber，PCF），硅波导，泥酸锂等。目前以光纤为介质产生超连续谱的技术已经较为成熟，实现了大范围的光谱展宽。通过大量的实验研究证实，在非线性效应强、色散可调的介质中，可在低功率、短距离上实现超连续谱的产生。例如Kumar 等人用75 cm 的SF6 保偏光纤已得到了展宽从350 nm 到2200 nm 的超连续[1]；B. A. Cumberland 使用50 W 的掺Yb 光纤激光器泵浦一段20 m 长的高非线性光子晶体光纤，最终得到输出功率为29 W 的超连续谱[2]。
然而光纤中非线性效应较弱，即使使用经过特殊设计的光子晶体光纤也要有几十厘米的长度才能得到有效展宽，不利于集成化设计。
近几年，具有低损耗、低功率、小体积等特性的硅波导受到人们的广泛重视。对硅波导中各种现象机理的研究也日趋成熟。拉曼放大、四波混频、自相位调制等非线性效应已成功运用于硅波导器件中。硅的三阶非线性效应比普通光纤高许多，例如，硅的Kerr 系数比普通单模光纤大100 倍，拉曼增益系数比普通单模光纤高三个数量级。并且，硅具有高折射率，能够将光很好地限制在一个很小的范围。通过对硅波导尺寸、几何结构的合理设计，可以实现对其色散系数的可控性。硅波导所具有特殊的色散和非线性特性，使其比普通光纤更易产生超连续谱。随着CMOS 技术的发展成熟，在硅波导中产生超连续谱将有利于超连续谱的应用向集成化、小型化发展。与光纤相比，硅波导具有无可替代的优势，可望在通信领域获得全新的应用，硅材料中实现超连续谱将为全光通讯翻开崭新的一页。
2．超连续谱的产生机制
超连续谱的产生是多种非线性效应与色散共同作用的结果。脉冲光在硅波导中传播，各种非线性效应，诸如，自相位调制（Self-Phase Modulation，SPM），交叉相位调制（Cross-PhaseModulation，XPM），参量过程，拉曼散射都会起作用。当高强度的短脉冲通过非线性介质时，入射光的瞬时高光强会引起自身的相位调制，即自相位调制。自相位调制会产生新的波长，这是出射光谱展宽的重要来源。随着光谱成分的增加，交叉相位调制，参量过程以及内拉曼散射作用逐渐增强，使得频谱进一步展宽。
然而，硅是一种半导体材料，具有一些特殊的非线性性质，如双光子吸收（Two-photoabsorption ，TPA）以及由双光子吸收产生的自由载流子（Free-carrier absorption，FCA）对入射光的影响，而这种影响可以分为相位调制和吸收两部分，因此硅中超连续谱的产生机制比普通光纤更为复杂。双光子吸收是指在强激光作用下,介质分子同时吸收两个光子通过一个虚中间态跃迁到高能态的过程。双光子吸收带来大量能量损失，降低光脉冲的峰值功率，从而限制了脉冲展宽。同时，双光子吸收过程中会产生大量的自由载流子，高浓度的自由载流子对光脉冲产生相位调制作用而使其蓝移，且调制作用与自由载流子浓度成正比。而脉冲后沿会积累大量的载流子，因此脉冲后沿的出射频谱展宽蓝移。于此同时，自由载流子对脉冲后沿产生吸收，使脉冲在时域上整体前移。另外，硅中拉曼散射与光纤中也有很大不同，硅基波导中的拉曼散射增益谱很窄只有105 GHz，并且响应时间约为10 ps，若使用飞秒脉冲入射，拉曼效应可以忽略。
激光脉冲在硅波导中传播，可以用广义非线性薛定谔方程描述如下式。
其中，右边第一项描述了硅波导中的色散效应，βm 表示m 阶色散系数，第二项描述了自由载流子产生的相移以及自由载流子吸收项，σn 表示自由载流子产生的相移大小，σα 表示自由载流子吸收大小，第三项描述了非线性Kerr 效应以及双光子吸收项，n2 为Kerr 效应系数，βT 为双光子吸收系数，ā 为波导有效截面积。
在超连续谱的产生过程中，哪种效应起决定作用主要取决于初始入射脉冲的参数和介质的线性色散特性。若用皮秒脉冲入射，色散效应较弱，光脉冲主要在非线性效应，特别是自相位调制作用下发生展宽，一般范围有限。若用飞秒脉冲入射，在波导的反常色散区，波导的色散效应和自相位调制效应会相互平衡,出现孤子传播态。光谱展宽初期以自相位调制为主，之后发生高阶孤子分裂，并伴随孤子辐射，随着光谱成分的增加四波混频效应逐渐增强。
在反常色散区，相位匹配条件很易满足，故能得到较宽的超连续谱。
3．自相位调制（SPM）诱导的频谱展宽
随着硅器件在通信系统的广泛应用，人们对硅波导中产生超连续谱作了大量工作，同时也取得了许多重大的成果。理论研究表明，对于一般的短脉冲，脉冲传播的色散长度远大于所用的波导长度，此时色散效应可以忽略，自相位调制效应起主要地位，从而导致出射频谱的展宽。
2004 年，Jalali 研究小组首次通过实验在硅波导中获得超连续谱，得到了2 倍展宽的出射光谱[3]。他们使用被动锁模光纤激光器产生脉宽为1 ps 的短脉冲，通过3 dB 带通滤波器对光谱整形后经由掺铒光纤放大器放大得到脉宽为4 ps，峰值功率为110 W（相当于光功率密度为2.2 GW/cm2）的入射脉冲光。脊型硅波导的有效面积为5 μm2，总长度2 cm。实验结果所示。
从图中可清楚地看到出射光谱的宽度大约是入射光谱宽度的2 倍。光谱展宽主要是由自相位调制效应造成的。在考虑双光子吸收效应的情况下，通过理论模拟，将入射峰值功率增加10 倍可以得到5 倍展宽的出射光谱。此实验证实了利用硅波导可以产生超连续谱，同时揭开了在较低泵光功率下产生超连续谱的新篇章。
之后，Jalali 研究小组又讨论了硅波导中自由载流子对超连续谱产生的影响[4]。众所周知，Kerr 效应、自由载流子效应均对频谱的相移有贡献。Kerr 效应使得脉冲前沿红移、后沿蓝移。而自由载流子效应使得脉冲整体蓝移。由此可知脉冲后沿得到很大的蓝移展宽。但是，脉冲后沿积累了更多的自由载流子，光脉冲衰减更为严重。他们通过理论模拟分析了自由载流子对出射光谱展宽的作用，如图2 所示,只考虑Kerr 效应带来的相移时，展宽因子大约为8，考虑自由载流子对相移的影响后，展宽因子迅速增大大约为28，最后考虑自由载流子吸收后，展宽因子下降到12。由此可知，自由载流子对频谱展宽（尤其使得频谱蓝移）有着重要作用，但其浓度的增加导致的吸收也会削弱光谱展宽。
2006 年，E.dulkeith 等人研究了入射光波长以及峰值功率对光谱展宽的影响[5]。硅波导截面为470×226 nm、长4 mm。入射脉冲脉宽1.8 ps、周期1 kHz、中心波长1550 nm。改变入射光功率可以看到，在功率较低时，波导工作在线性区域，出射光谱的形状和位置几乎没有变化，随着功率的增加，出射光谱的展宽随之增大。实验结果如图3 所示。实验中使用皮秒脉冲作为入射光，色散作用在脉冲传播过程中并不显著，脉冲展宽主要来自自相位调制的作用。从图中可以清楚地看到，脉冲展宽并不对称，这主要是因为在脉冲后沿比前沿积累更多的自由载流子，因此后沿的相移更大，导致脉冲展宽的不对称性。
4．孤子分裂与超连续谱的产生
从上面的实验结论可以看到，由于存在双光子吸收对脉冲功率的损耗，利用SPM 并不能得到较大的展宽。为了克服这一缺点，必须在TPA 带来大的损失前实现频谱展宽。此时，可以借鉴光纤中孤子分裂以及超连续谱产生的方法，利用高阶孤子在波导入射端的孤子分裂现象来得到频谱的展宽。
2007 年，Richard M. Osgood. Jr 等人观察到展宽350 nm 的超连续谱[6]。硅波导横截面积520×220 nm2，长4.7 mm，入射脉冲脉宽100 fs，周期250 kHz。中心波长在1300 nm 到1600nm 之间变化，此波长范围正处于波导的反常色散区，能够得到更有效的超连续谱。实验结果如图4 所示，随着入射峰值功率的增加展宽也逐渐增加。在λ<1700 nm 时，双光子吸收对最大功率有限制作用，但仍能得到较大展宽。
此外他们还观察了超连续谱对波长的依赖性。从图5 中可以看到，中心波长越靠近零色散区（ZGVD),出射光谱展宽越大。这是由于在零色散区线性色散小，非线性作用在脉冲传播过程中占据主要地位。在短波方向有突起的平滑的峰，由于短波方向的光学损耗大，随着中心波长向短波方向移动，峰值越来越小，因此短波方向频谱展宽受到限制。三阶色散微扰导致的孤子分裂以及孤子辐射的影响，在长波方向突起的峰，随着中心波长向长波方向移动，峰值越来越大，这对超连续谱的产生有着决定性作用。
同年，Lianghong Yin 等人通过数值模拟利用入射飞秒脉冲作为高阶孤子得到展宽达400nm 的超连续谱[7]。模拟用直波导截面宽0.8 μm，高0.7 μm，长1.2 cm，入射脉冲带宽50 fs、峰值功率25 W。此时，入射光脉宽远小于自由载流子寿命，而脉冲周期大于自由载流子寿命，故自由载流子吸收在超连续谱的产生过程中不起重要作用。同时从理论上得出双光子吸收只对输入的最大功率有衔制作用，而不影响超连续谱的产生。并且由于Si 的晶格结构，使得受激拉曼散射依赖于硅波导的结构以及入射光的偏振特性，故合理选择硅波导的结构以及入射光的偏振特性，可以忽略受激拉曼散射的.影响。模拟中使用N=3 的三阶孤子脉冲，在三阶色散的微扰下分裂成为低阶孤子并伴有色散波，此时出射脉冲得到较大展宽，结果如图6 所示。这是自硅波导超连续谱研究以来在硅波导中能产生的最宽的光谱。
5．硅基超连续谱的应用
随着波分复用技术的广泛应用，为了寻找更好的光源，掀起对超连续谱光源的研究热潮。
硅波导中产生超连续谱将使全光网络向小型化发展，前景诱人，将硅基波导中产生的超连续谱应用到实际，将为全光网络翻开崭新的一页。
波分复用技术是光通信系统的一大优势，要实现能够高速传递信号的片上光通讯系统，波分复用技术是必不可少的，而超连续谱这是一种有效的解决方案。2007 年，Jalali 研究小组成功实现超连续谱的硅基集成化并将展示了其在波分复用系统中的应用潜力[8]。实验中，他们将微盘共振器与硅波导共同集成在一个三维芯片上，使用未集成在芯片上的脉宽为3 ps的激光脉冲作为入射光，脉冲沿着硅波导传播，利用自相位调制效应得到展宽的光谱，然后以微盘共振器作为光滤波器将超连续谱中不同的光谱成分有硅波导中分别导出，从而实现多个波长信道。实验中硅波导与微盘共振器的集成和工作原理如图7 所示。该装置得到的最远信道离入射脉冲中心波长3.1 nm，使硅基超连续谱应用于片上集成的波分复用技术成为可能。
另外，硅基超连续谱还可以在拉曼泵浦方面产生应用。硅波导中的高拉曼增益系数使拉曼散射成为在硅波导中实现激光振荡和放大的有效途径，然而，硅的拉曼增益带宽非常窄，限制了拉曼放大的带宽，从而制约了其在实际应用中的范围。随着硅波导中超连续谱的研究逐渐深入，利用超连续谱的产生机制，在硅波导中产生超连续谱的同时实现拉曼散射效应，由此来增大拉曼增益带宽成为一种可能的解决方法。2008 年，Jalali 研究小组成功实现这一构想，获得展宽的拉曼增益谱[9]。实验中使用中心波长1550 nm 的皮秒脉冲作为泵浦光源，激光脉冲在硅波导中受到Kerr 效应和自由载流子效应的共同作用而发生展宽，从而使拉曼增益谱获得扩展。实验在中心波长为1638 nm 处获得了宽度超过10 nm 的拉曼增益谱。为了观察入射脉宽对拉曼增益展宽的影响，实验中使用两个脉宽不同的入射脉冲，分别为3 ps、42 ps，得到的拉曼增益谱如图8 所示，对于3 ps 的入射脉冲，拉曼展宽频谱起伏不定，并且由于自由载流子的作用频谱明显蓝移。对于42 ps 的入射脉冲，拉曼展宽频谱同样蓝移，但频谱变化相对平滑。另外，在入射功率较大时，能过得到较大的拉曼展宽。实验证明，通过改变脉冲的性质，例如，脉冲功率、脉宽、脉冲 啁 啾，可以实现对增益范围和形状的调节，从而应用于实现集成化的光信号传输以及可调硅基激光器的研制。
6．结论
硅在电子器件的发展过程中起着举足轻重的作用，目前大部分的器件使用硅作为芯片材料，在硅波导中产生超连续谱将有利于硅基光子器件的实现，并向集成化、小型化发展。目前，实验中能得到的硅基超连续谱宽度仅为400 nm，在实际应用的波分复用系统中，还存在各种各样的损耗，使得展宽大大减小，因此还需进一步的研究，合理设计硅波导的色散特性，减小有效面积增大非线性强度，从而进一步增大展宽，使得硅基超连续谱更加实用化。 ;
近日，北京大学物理学院冯旭课题组与康涅迪格大学助理教授靳路昶合作，首次用格点量子色动力学（格点QCD）研究缪氢原子兰姆位移，成功获得双光子交换对兰姆位移的修正。相关成果在线发表于《物理评论快报》(Physical Review Letters)。
质子是构成物质世界的基本粒子之一，它具有复杂的内部结构，由带电的夸克和不带电的胶子组成。质子内部的电荷分布半径，通常也被用来衡量质子大小。
2010年，物理学家通过精确测量缪氢原子（即氢原子中的电子被替换成缪子）兰姆位移(Lamb shift)，捕捉到质子内部电荷分布对缪氢原子能级造成的微小影响，从而确定了电荷分布半径。兰姆位移是物理学家Lamb和Retherford在1947年利用微波技术，测量出氢原子的2S(1/2)和2P(1/2)之间存在的能级差。
尽管缪氢光谱实验的精度远高于其他实验，但从中获得的电荷分布半径较此前全球实验平均值相差了5个标准差，即所谓的质子大小之谜。2019年，最新的电子-质子散射和氢原子光谱实验与缪氢实验结果符合，预示着质子大小之谜正在逐步破解，实验上的分歧也逐渐缩小。
迄今为止，缪氢光谱实验依然是获取质子电荷半径最精确的实验手段。光谱学高精度测量使得QCD的贡献在理论与实验对比中更加重要。事实上，从缪氢兰姆位移中提取电荷分布半径，最主要的理论误差就来源于非微扰QCD主导的双光子交换费曼图。
此次，北京大学物理学院理论物理研究所冯旭研究员课题组与康涅迪格大学靳路昶助理教授合作，解决了双光子图的红外发散问题，发展了全新的长程减除方案来降低统计误差，并依托中国超算天津中心“天河三号”超级计算机，首次实现了双光子图的格点计算。在此基础上，团队拟进一步开展更为系统、精度更高的计算，以期最终解决“质子究竟有多大”这一基本科学问题。
前述研究表明，格点方法还可用于研究超精细光谱等其他重要的光谱学物理量。北大格点团队未来的工作重点之一，是将格点QCD研究拓展至原子光谱学，为夸克和胶子尺度的高能物理研究与极高精度的原子光谱学研究构建起跨学科的桥梁。
论文第一作者为北京大学物理学院博士研究生傅杨，本科生陆辰飞参与部分计算和数据分析。前述研究工作获得国家自然科学基金、国家重点研发计划，及量子物质科学协同创新中心、北京大学高能物理研究中心、国家超级计算天津中心等支持。
校对：张亮亮
近日，《物理评论快报》在线刊发了他们的研究论文。山西大学为论文唯一单位，博士研究生李耀和杨勇刚教授为论文共同第一作者，通讯作者为秦成兵教授和肖连团教授，贾锁堂教授和张国峰教授等共同参与了研究工作。
金纳米粒子因其特有的非线性效应、表面等离子体共振效应、光热效应等，一直是物理、化学、材料等学科的研究热点，在光学传感、能量俘获、高分辨成像和光热治疗等方面具有重要的应用。由于金纳米粒子量子产率低(10-6)，而多光子荧光强度和高阶非线性效应严重依赖于激发光的功率，大功率激光的使用一方面会因光热效应破坏金纳米粒子本身的结构，另一方面也会对纳米系统或有机体 (如细胞、组织) 造成不可修复的损伤，从而极大地限制了金纳米粒子在功能器件、生物成像、癌症治疗等方面的实际应用。
图1金纳米粒子在不同时间尺度下的超快动力学行为。(a) 线性坐标；(b) 对数坐标。(c) 两束等功率飞秒脉冲激发下的对称干涉条纹；(d) 不等功率激发下的非对称干涉条纹。传统多光子激发模拟结果：(e) n=2，(f) n=3.8。
肖连团教授研究团队针对金纳米粒子应用发展存在的瓶颈问题，提出基于中间态物理参数可调的三能级理论模型，提升超快双脉冲激发金纳米粒子的非线性干涉效应。实验发展了相位和振幅精确可调的双脉冲超快光场技术，用于精准地调控飞秒激光与金纳米粒子相互作用，在将激发功率降低2个量级的情况下，实现了金纳米粒子双光子荧光的非线性干涉，相干相长时荧光强度比通常的双光子光致发光方法提高100倍以上，相干相长与相干相消之比达到104。
研究工作同时表明，通过精确调控两束飞秒激光的延迟，可以精准地调控飞秒激光与金纳米粒子相互作用的非线性系数。使用单束飞秒脉冲激发金纳米粒子时，其荧光表现出明显的双光子吸收过程，非线性系数为2；在采用双脉冲激发时，当仅改变其中一束飞秒激光功率时，金纳米粒子的荧光随两束脉冲延迟的增加呈现出从线性过程向双光子过程渐变的奇异行为。在金纳米粒子的实际应用中，线性过程适用于精密测量与传感，而高阶非线性过程对超分辨成像更为有利。
图2 (a) 不同延迟下金纳米粒子荧光强度随激发功率的变化；(b) 金纳米粒子多光子荧光的非线性系数随两束脉冲相对延迟的变化行为。
文中图片由山西大学提供
高分辨率光学显微术在生命科学中的应用
【摘要】 提高光学显微镜分辨率的研究主要集中在两个方面进行，一是利用经典方法提高各种条件下的空间分辨率，如用于厚样品研究的SPIM技术，用于快速测量的SHG技术以及用于活细胞研究的MPM技术等。二是将最新的非线性技术与高数值孔径测量技术（如STED和SSIM技术）相结合。生物科学研究离不开超高分辨率显微术的技术支撑，人们迫切需要更新显微术来适应时代发展的要求。近年来研究表明，光学显微镜的分辨率已经成功突破200nm横向分辨率和400nm轴向分辨率的衍射极限。高分辨率乃至超高分辨率光学显微术的发展不仅在于技术本身的进步，而且它将会极大促进生物样品的研究，为亚细胞级和分子水平的研究提供新的手段。
【关键词】 光学显微镜；高分辨率；非线性技术；纳米水平
在生物学发展的历程中显微镜技术的作用至关重要，尤其是早期显微术领域的某些重要发现，直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展。对固定样品和活体样品的生物结构和过程的观察，使得光学显微镜成为绝大多数生命科学研究的必备仪器。随着生命科学的研究由整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及鉴别精微细节的能力已经成为一个非常关键的技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。在400～760nm的可见光范围内，显微镜的分辨极限大约是光波的半个波长，约为200nm，而最新取得的研究成果所能达到的极限值为20～30nm。本文主要从高分辨率三维显微术和高分辨率表面显微术两个方面，综述高分辨率光学显微镜的各种技术原理以及近年来在突破光的衍射极限方面所取得的研究进展。
1 传统光学显微镜的分辨率
光学显微镜图像的大小主要取决于光线的波长和显微镜物镜的有限尺寸。类似点源的物体在像空间的亮度分布称为光学系统的点扩散函数(point spread function, PSF)。因为光学系统的特点和发射光的性质决定了光学显微镜不是真正意义上的线性移不变系统，所以PSF通常在垂直于光轴的x-y平面上呈径向对称分布，但沿z光轴方向具有明显的扩展。由Rayleigh判据可知，两点间能够分辨的最小间距大约等于PSF的宽度。
根据Rayleigh判据，传统光学显微镜的分辨率极限由以下公式表示[1]：
横向分辨率(x-y平面)：dx，y=■
轴向分辨率(沿z光轴)：dz=■
可见，光学显微镜分辨率的提高受到光波波长λ和显微镜的数值孔径N.A等因素的制约；PSF越窄，光学成像系统的分辨率就越高。为提高分辨率，可通过以下两个途径：（1）选择更短的波长；（2）为提高数值孔径, 用折射率很高的材料。
Rayleigh判据是建立在传播波的假设上的，若能够探测非辐射场，就有可能突破Rayleigh判据关于衍射壁垒的限制。
2 高分辨率三维显微术
在提高光学显微镜分辨率的研究中，显微镜物镜的像差和色差校正具有非常重要的意义。从一般的透镜组合方式到利用光阑限制非近轴光线，从稳定消色差到复消色差再到超消色差，都明显提高了光学显微镜的成像质量。最近Kam等[2]和Booth等[3]应用自适应光学原理，在显微镜像差校正方面进行了相关研究。自适应光学系统由波前传感器、可变形透镜、计算机、控制硬件和特定的软件组成，用于连续测量显微镜系统的像差并进行自动校正。 一般可将现有的高分辨率三维显微术分为3类：共聚焦与去卷积显微术、干涉成像显微术和非线性显微术。
2.1 共聚焦显微术与去卷积显微术 解决厚的生物样品显微成像较为成熟的方法是使用共聚焦显微术(confocal microscopy) [4]和三维去卷积显微术(three-dimensional deconvolution microscopy, 3-DDM) [5]，它们都能在无需制备样品物理切片的前提下，仅利用光学切片就获得样品的三维荧光显微图像。
共聚焦显微术的主要特点是，通过应用探测针孔去除非共焦平面荧光目标产生的荧光来改善图像反差。共聚焦显微镜的PSF与常规显微镜的PSF呈平方关系，分辨率的改善约为■倍。为获得满意的图像，三维共聚焦技术常需使用高强度的激发光，从而导致染料漂白，对活生物样品产生光毒性。加之结构复杂、价格昂贵，从而使应用在一定程度上受到了限制。
3-DDM采用软件方式处理整个光学切片序列，与共聚焦显微镜相比，该技术采用低强度激发光，减少了光漂白和光毒性，适合对活生物样品进行较长时间的研究。利用科学级冷却型CCD传感器同时探测焦平面与邻近离焦平面的光子，具有宽的动态范围和较长的可曝光时间，提高了光学效率和图像信噪比。3-DDM拓展了传统宽场荧光显微镜的应用领域受到生命科学领域的广泛关注[6]。
2.2 选择性平面照明显微术 针对较大的活生物样品对光的吸收和散射特性，Huisken[7]等开发了选择性平面照明显微术(selective plane illumination microscopy，SPIM)。与通常需要将样品切割并固定在载玻片上的方式不同，SPIM能在一种近似自然的状态下观察2～3mm的较大活生物样品。SPIM通过柱面透镜和薄型光学窗口形成超薄层光，移动样品获得超薄层照明下切片图像，还可通过可旋转载物台对样品以不同的观察角度扫描成像，从而实现高质量的三维图像重建。因为使用超薄层光，SPIM降低了光线对活生物样品造成的损伤，使完整的样品可继续存活生长，这是目前其他光学显微术无法实现的。SPIM技术的出现为观察较大活样品的瞬间生物现象提供了合适的显微工具，对于发育生物学研究和观察细胞的三维结构具有特别意义。
2.3 结构照明技术和干涉成像 当荧光显微镜以高数值孔径的物镜对较厚生物样品成像时，采用光学切片是一种获得高分辨3D数据的理想方法，包括共聚焦显微镜、3D去卷积显微镜和Nipkow 盘显微镜等。1997年由Neil等报道的基于结构照明的显微术，是一种利用常规荧光显微镜实现光学切片的新技术，并可获得与共聚焦显微镜一样的轴向分辨率。干涉成像技术在光学显微镜方面的应用1993年最早由Lanni等提出，随着I5M、HELM和4Pi显微镜技术的应用得到了进一步发展。与常规荧光显微镜所观察的荧光相比，干涉成像技术所记录的发射荧光携带了更高分辨率的信息。（1）结构照明技术：结合了特殊设计的硬件系统与软件系统，硬件包括内含栅格结构的滑板及其控制器，软件实现对硬件系统的控制和图像计算。为产生光学切片，利用CCD采集根据栅格线的不同位置所对应的原始投影图像，通过软件计算，获得不含非在焦平面杂散荧光的清晰图像，同时图像的反差和锐利度得到了明显改善。利用结构照明的光学切片技术，解决了2D和3D荧光成像中获得光学切片的非在焦平面杂散荧光的干扰、费时的重建以及长时间的计算等问题。结构照明技术的光学切片厚度可达0.01nm，轴向分辨率较常规荧光显微镜提高2倍，3D成像速度较共聚焦显微镜提高3倍。（2）4Pi 显微镜：基于干涉原理的4Pi显微镜是共聚焦/双光子显微镜技术的扩展。4Pi显微镜在标本的前、后方各设置1个具有公共焦点的物镜，通过3种方式获得高分辨率的成像：①样品由两个波前产生的干涉光照明；②探测器探测2个发射波前产生的干涉光；③照明和探测波前均为干涉光。4Pi显微镜利用激光作为共聚焦模式中的照明光源，可以给出小于100nm的空间横向分辨率，轴向分辨率比共聚焦荧光显微镜技术提高4~7倍。利用4Pi显微镜技术，能够实现活细胞的超高分辨率成像。Egner等[8，9]利用多束平行光束和1个双光子装置，观测活细胞体内的线粒体和高尔基体等细胞器的精微细节。Carl[10]首次应用4Pi显微镜对哺乳动物HEK293细胞的细胞膜上Kir2.1离子通道类别进行了测量。研究表明，4Pi显微镜可用于对细胞膜结构纳米级分辨率的形态学研究。（3）成像干涉显微镜(image interference microscopy, I2M)：使用2个高数值孔径的物镜以及光束分离器，收集相同焦平面上的荧光图像，并使它们在CCD平面上产生干涉。1996年Gustaffson等用这样的双物镜从两个侧面用非相干光源（如汞灯）照明样品，发明了I3M显微镜技术(incoherent, interference, illumination microscopy, I3M），并将它与I2M联合构成了I5M显微镜技术。测量过程中，通过逐层扫描共聚焦平面的样品获得一系列图像，再对数据适当去卷积，即可得到高分辨率的三维信息。I5M的分辨范围在100nm内。
2.4 非线性高分辨率显微术 非线性现象可用于检测极少量的荧光甚至是无标记物的样品。虽有的技术还处在物理实验室阶段，但与现有的三维显微镜技术融合具有极大的发展空间。（1）多光子激发显微术：(multiphoton excitation microscope，MPEM)是一种结合了共聚焦显微镜与多光子激发荧光技术的显微术，不但能够产生样品的高分辨率三维图像，而且基本解决了光漂白和光毒性问题。在多光子激发过程中，吸收几率是非线性的[11]。荧光由同时吸收的两个甚至3个光子产生，荧光强度与激发光强度的平方成比例。对于聚焦光束产生的对角锥形激光分布，只有在标本的中心多光子激发才能进行，具有固有的三维成像能力。通过吸收有害的短波激发能量，明显地降低对周围细胞和组织的损害，这一特点使得MPEM成为厚生物样品成像的有力手段。MPEM轴向分辨率高于共聚焦显微镜和3D去卷积荧光显微镜。（2）受激发射损耗显微术：Westphal[12]最近实现了Hell等在1994年前提出的受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED）成像的有关概念。STED成像利用了荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系。STED技术通过2个脉冲激光以确保样品中发射荧光的体积非常小。第1个激光作为激发光激发荧光分子；第2个激光照明样品，其波长可使发光物质的分子被激发后立即返回到基态，焦点光斑上那些受STED光损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力，而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的光点。Hell等已获得了28nm的横向分辨率和33nm的轴向分辨率[12,13]，且完全分开相距62nm的2个同类的分子。近来将STED和4Pi显微镜互补性地结合，已获得最低为28nm的轴向分辨率,还首次证明了免疫荧光蛋白图像的轴向分辨率可以达到50nm[14]。（3）饱和结构照明显微术：Heintzmann等[15]提出了与STED概念相反的饱和结构照明显微镜的理论设想，最近由Gustafsson等[16]成功地进行了测试。当光强度增加时，这些体积会变得非常小，小于任何PSF的宽度。使用该技术，已经达到小于50nm的分辨率。（4）二次谐波 (second harmonic generation, SHG)成像利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源。SHG一般为非共振过程，光子在生物样品中只发生非线性散射不被吸收，故不会产生伴随的光化学过程，可减小对生物样品的损伤。SHG成像不需要进行染色,可避免使用染料带来的光毒性。因其对活生物样品无损测量或长时间动态观察显示出独特的应用价值，越来越受到生命科学研究领域的重视[17]。
3 表面高分辨率显微术
表面高分辨率显微术是指一些不能用于三维测量只适用于表面二维高分辨率测量的显微技术。主要包括近场扫描光学显微术、全内反射荧光显微术、表面等离子共振显微术等。
3.1 近场扫描光学显微术 近场扫描学光显微术(near-field scanning optical microscope, NSOM)是一种具有亚波长分辨率的光学显微镜。由于光源与样品的间距接近到纳米水平，因此分辨率由光探针口径和探针与样品之间的间距决定，而与光源的波长无关。NSOM的横向分辨率小于100nm，Lewis[18]则通过控制在一定针尖振动频率上采样，获得了小于10nm的分辨率。NSOM具有非常高的图像信噪比，能够进行每秒100帧图像的快速测量[19]，NSOM已经在细胞膜上单个荧光团成像和波谱分析中获得应用。
3.2 全内反射荧光显微术 绿色荧光蛋白及其衍生物被发现后，全内反射荧光(total internal reflection fluorescence，TIRF)技术获得了更多的重视和应用。TIRF采用特有的样品光学照明装置可提供高轴向分辨率。当样品附着在离棱镜很近的盖玻片上，伴随着全内反射现象的出现，避免了光对生物样品的直接照明。但因为波动效应，有小部分的能量仍然会穿过玻片与液体介质的界面而照明样品，这些光线的亮度足以在近玻片约100nm的薄层形成1个光的隐失区，并且激发这一浅层内的荧光分子[20]。激发的荧光由物镜获取从而得到接近100nm的高轴向分辨率。TIRF近来与干涉照明技术结合应用在分子马达步态的动力学研究领域, 分辨率达到8nm，时间分辨率达到100μs[21]。
3.3 表面等离子共振 表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR) [22]是一种物理光学现象。当入射角以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将发生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光被耦合入表面等离子体内可引起电子发生共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面流过的液相的折射率而改变，折射率的改变又与结合在金属表面的生物分子质量成正比。表面折射率的细微变化可以通过测量涂层表面折射光线强度的改变而获得。
1992年Fagerstan等用于生物特异相互作用分析以来，SPR技术在DNA-DNA生物特异相互作用分析检测、微生物细胞的监测、蛋白质折叠机制的研究，以及细菌毒素对糖脂受体亲和力和特异性的定量分析等方面已获得应用[23]。当SPR信息通过纳米级孔道[24]传递而提供一种卓越的光学性能时，将SPR技术与纳米结构设备相结合，该技术的深入研究将有可能发展出一种全新的成像原理显微镜。
【参考文献】
[1] 汤乐民,丁 斐.生物科学图像处理与分析[M].北京:科学出版社,2005：205.
[2] Kam Z, Hanser B, Gustafsson MGL, et al.Computational adaptive optics for live three-dimensional biological imaging[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:3790-3795.
[3] Booth MJ, Neil MAA, Juskaitis R, et al. Adaptive aberration correction in a confocal microscope[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2002, 99:5788-5792.
[4] Goldman RD,Spector DL.Live cell imaging a laboratory manual[J].Gold Spring Harbor Laboratory Press,2005.
[5] Monvel JB,Scarfone E,Calvez SL,et al.Image-adaptive deconvolution for three-dimensional deep biological imaging[J].Biophys,2003,85:3991-4001.
[6] 李栋栋,郭学彬,瞿安连.以三维荧光反卷
