分子生物学技术在国内防制虫媒传染病领域的应用
【摘要】 本文综述了国内近年来,分子生物学技术在虫媒病中蚊媒传染病防制的应用情况,以期为蚊媒传
染病的防制、应对突发公共卫生事件中蚊媒传染病的发生提供参考。
【关键词】 分子生物学技术;虫媒;传染病
虫媒病是由节肢动物携带病原体传播的一组疾病。
1992年在国际虫媒病毒中心登记的已达535种,其中128
种对人有致病性[1]。我国法定报告的传染病中,虫媒病占
13种,蚊虫作为媒介,除了传播病毒性疾病外,还可传播
寄生虫病。这类疾病大都属于自然疫源性疾病,有一定的
地域性和时间性,发病率低、死亡率高,主要通过媒介的
控制进行防制[2]。近年来,随着分子生物学技术的研究和
发展,在医学领域的应用日趋广泛,并取得了重大进展,
作者就近年来分子生物学技术在蚊媒传染病的诊断和防制
等方面的应用综述如下。
1 常用的分子生物学技术[3]
1·1 核酸分子杂交技术
核酸的分子杂交(molecular hybridization)它是利用核
酸分子的碱基互补原则,在特定的条件下,双链解开成两
条单链,与异源的DNA或RNA (单链)复性,若异源
DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列,则在复
性时可形成杂交的核酸分子。杂交的双方是待测核酸序列
及探针。核酸探针可用放射性核素、生物素或其它活性物
质标记。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探
针、寡核苷酸探针、RNA探针等。
分类:根据被测定的对象,分为Southern杂交和
Northern杂交;根据所用的方法,分为斑点(dot)杂交、
狭槽(slot)杂交和菌落原位杂交;根据环境条件:分为液
相杂交和固相杂交。
1·2 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)
是以拟扩增的DNA分子为模板,以一对分别与模板互
补的寡核苷酸片段为引物,在DNA聚合酶的作用下,按照
半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合
成。通过不断重复这一过程,可以使目的DNA片段得到扩
增,同时新合成的DNA片段也可以作为模板,使DNA的
合成量呈指数型增长。
PCR各种应用模式:兼并引物( degenerate primer)
pcr、套式引物(nested primer) pcr、复合pcr (multiplex
pcr)、反向pcr ( inverse pcr或reverse pcr)、不对称pcr
(asymmetric pcr)、标记pcr ( lp-pcr)和彩色pcr、加端
pcr、锚定pcr或固定pcr、玻片pcr、反转录pcr方法检测
rna、定量pcr。
1·3 DNA芯片
基因芯片又称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列
(DNA microarray)。是采用光导原位合成或显微印刷等方
法将大量特定序列的探针分子密集、有序地固定于经过相
应处理的载体上,然后加入标记的待测样品,进行多元杂
交,通过杂交信号的强弱及分布,来分析目的分子的有无、
数量及序列,从而获得受检样品的遗传信。特点:具有通
量大,并行性、微量化与自动化等优点,但在实践中其研
究成本较高;方法标准化不足;配套软件不够完善。
2 分子生物学技术在虫媒病诊断的应用
2·1 疟疾
黄炳成等[4]用pBF2 DNA片断,经标记后作探针,从
多种疟原虫DNA样本中检出恶性疟原虫。基因芯片在疟原
虫的研究内容还有疟原虫新基因发现[5]、转录因子调控网
络[6]、疟原虫适应人体宿主机制[7]、疟原虫比较基因组杂
交分析[8]、恶性疟原虫抗原变异分子机制[9]以及疟原虫攻
击红细胞机制[10]等。
2·2 丝虫病
黄志彪等[11]运用PCR技术检测血液中的班氏丝虫微
丝蚴,可检出lOOul阳性血样中的l条班氏丝虫微丝蚴;用
于检测班氏丝虫监测点540份血液样本结果均为阴性,镜
检血片结果亦为阴性。常规丝虫检测是在夜间采血,有资
料显示[12], SsP/PCR扩增系统可用于检测班氏丝虫病患
者血样中的循环DNA,能用于周期性或夜间周期性丝虫病
的日间血检工作,从根本上改变了丝虫病的诊断、监测和
工作方式。
2·3 登革热病
郑夔等[13]应用多重PCR技术快速鉴定4种血清型登
革病毒,并在同一反应管中进行多重PCR对登革病毒进行
分型鉴定,证实了2004年在广东发生的登革热疫情为I型
登革病毒;也有报道应用寡核苷酸芯片技术能同时确认流
感和登革热病毒[14]。长期受这种疾病困扰的地区将有望通
过这种技术的完善,获得有效的治疗和保护。
给楼主论文：
分子细胞基因组的研究
随着结构分析技术的发展，现在已有几千个蛋白质的化学结构和几百个蛋白质的立体结构得到了阐明。70年代末以来，采用测定互补DNA顺序反推蛋白质化学结构的方法，不仅提高了分析效率，而且使一些氨基酸序列分析条件不易得到满足的蛋白质化学结构分析得以实现。
发现和鉴定具有新功能的蛋白质，仍是蛋白质研究的内容。例如与基因调控和高级神经活动有关的蛋白质的研究现在很受重视。
蛋白质－核酸体系 生物体的遗传特征主要由核酸决定。绝大多数生物的基因都由 DNA构成。简单的病毒，如λ噬菌体的基因组是由 46000个核苷酸按一定顺序组成的一条双股DNA（由于是双股DNA，通常以碱基对计算其长度）。细菌，如大肠杆菌的基因组，含4×106碱基对。人体细胞染色体上所含DNA为3×109碱基对。
遗传信息要在子代的生命活动中表现出来，需要通过复制、转录和转译。复制是以亲代 DNA为模板合成子代 DNA分子。转录是根据DNA的核苷酸序列决定一类RNA分子中的核苷酸序列；后者又进一步决定蛋白质分子中氨基酸的序列，就是转译。因为这一类RNA起着信息传递作用，故称信使核糖核酸(mRNA)。由于构成RNA的核苷酸是4种，而蛋白质中却有20种氨基酸，它们的对应关系是由mRNA分子中以一定顺序相连的 3个核苷酸来决定一种氨基酸，这就是三联体遗传密码。
基因在表达其性状的过程中贯串着核酸与核酸、核酸与蛋白质的相互作用。DNA复制时，双股螺旋在解旋酶的作用下被拆开，然后DNA聚合酶以亲代DNA链为模板，复制出子代 DNA链。转录是在 RNA聚合酶的催化下完成的。转译的场所核糖核蛋白体是核酸和蛋白质的复合体，根据mRNA的编码，在酶的催化下，把氨基酸连接成完整的肽链。基因表达的调节控制也是通过生物大分子的相互作用而实现的。如大肠杆菌乳糖操纵子上的操纵基因通过与阻遏蛋白的相互作用控制基因的开关。真核细胞染色质所含的非组蛋白在转录的调控中具有特殊作用。正常情况下，真核细胞中仅2～15％基因被表达。这种选择性的转录与转译是细胞分化的基础。
蛋白质－脂质体系 生物体内普遍存在的膜结构，统称为生物膜。它包括细胞外周膜和细胞内具有各种特定功能的细胞器膜。从化学组成看，生物膜是由脂质和蛋白质通过非共价键构成的体系。很多膜还含少量糖类，以糖蛋白或糖脂形式存在。
高等植物的性状主要由核基因控制，其遗传遵循孟德尔规律。1900年Coorence和Baut等人就已发现影响质体表型的一些突变不符合孟德尔遗传规律；1962年里斯(Ris)和Plont证明植物叶绿体中存在遗传物质DNA。现已证明，植物细胞质中的叶绿体和线粒体都含有自己的DNA及整套的转录和翻译系统，能够合成蛋白质。高等植物的叶绿体和线粒体基因组，多数在有性杂交过程中表现为母性遗传。其机制有两种解释：一是认为雄配子不含有细胞质，因而没有胞质基因；另一种观点是雄配子含有少量的细胞质，其细胞器在受精前即已解体，失去功能。胞质基因组的母性遗传，大大限制了胞质基因的遗传研究，利用有性杂交方法难以知晓当胞质基因处于杂合状态时的遗传和生理效应及其对表型的影响。近年来发展起来的体细胞杂交技术为胞质基因的研究开辟了一条新途径。本文拟对植物体细胞杂交后代胞质基因重组的多样性，创制胞质杂种的可能途径及胞质基因组的传递等问题加以说明。
1 植物体细胞杂交后代胞质基因组重组的多样性
体细胞杂交时，核基因组、线粒体基因组和叶绿体基因组三者均既可以单亲传递又可以双亲传递，因而可以产生许多有性杂交难以产生的核-质基因组的新组合类型。Kumar等人根据已有的实验结果结合理论推导提出，植物体细胞杂交一代理论上可以产生48种类型，而相应的有性杂交一代只能产生两种类型。48种类型可分为亲型、核杂种和胞质杂种3类。胞质杂种即是具有一个亲本的细胞核和双亲细胞质的植株或愈伤组织，它是研究胞质基因组的好材料。
2 创制胞质杂种的方法
2．1 “供体-受体”原生质体融合技术 这是目前最为可行的方法，由Zelcer等(1987)提出。其原理基于生理代谢互补，利用高于致死剂量的电离辐射处理供体原生质体使其核解或完全失活，细胞质完整无损；再用碘乙酸或碘乙酚胺处理受体原生质体以使其受到暂时抑制而不分裂，这样双亲原生质体融合后，只有融合体能够实现代谢上的补偿，进行持续分裂，形成愈伤组织或再生植株，这些融合体就是各种各样的胞质杂种。此技术的优点是双亲不需任何选择标记，适用范围广，可行性强，缺点是适宜的辐射剂量难以掌握。
2．2 “胞质体-原生质体”融合法 所谓胞质体是指去核后的原生质体。该法由Maliga提出。优点是避免了电离辐射可能产生的不利影响，缺点是制备胞质体尚存在一些技术性的困难。最近Lesney等人提出了一种能够从悬浮系原生质体制备大量胞质体的方法。
2．3 其它的可能途径
(1)根据双亲原生质体形态上的差异或通过荧光染料标记来机械分离融合体，然后进行微培养。(2)利用分别由核基因组和质基因组编码的抗药性状，通过双重抗性选择获得胞质杂种。(3)原生质体直接摄取外缘细胞器。(4)通过显微注射或电激法实现细胞器转移。
3 胞质杂种中双亲胞质基因的传递遗传学
3．1 叶绿体基因组 胞质杂种中，叶绿体基因组的传递分为单亲传递和双亲传递两种。单亲传递是指胞质杂种愈伤组织及由之再生的植株只含有亲本之一的叶绿体基因组。这种分离机制目前尚不清楚。关于叶绿体基因组的分离是否随机的问题，由于研究者们采用的试验材料不同得出两种结论：一种是叶绿体基因组的随机分离，这在品种间、种间及属间原生质体融合中都被观察到；另一种是叶绿体基因组的非随机分离(即亲本之一的叶绿体基因组优先保留)，如弗利克(Flick)和埃文(Evens，1982)在烟草的研究中表明，所有的N．nesophila和N．tabacum体细胞杂种都只具有N．nesophila叶绿体基因组，类似的例子很多。双亲传递是指胞质杂种中，同时含有双亲的叶绿体基因组，其在体细胞杂种以后的有性繁殖过程中能够保持稳定，既然双亲叶绿体能够共存，理论上二者就有可能发生重组。事实上，叶绿体基因组重组现象已被观察到，但频率很低。
3．2 线粒体基因组 胞质杂种中，线粒体基因组的传递方式是双亲传递，且发生活跃的重组，产生丰富的新类型。然而在分析线粒体基因组重组类型时不可忽视由于离体培养而诱发的线粒体基因组分子内重组(突变)的可能性，因为离体培养过程中不仅使核基因组产生大量变异，而且对于某些植物，也可诱发线粒体基因组发生变异。
4 植物胞质基因组控制的重要性状
目前已基本阐明的由叶绿体基因组编码的性状主要是一些抗药性状。如：链霉素抗性、林肯霉素抗性等。在与线粒体基因组有关的性状中，研究最多的是胞质型雄性不育性状。许多学者在不同植物上研究发现，雄性不育系与其同型保持系之间在线粒体DNA内切图谱或其编码的蛋白上存在明显差异。如在玉米上已发现T型雄性不育植株的线粒体基因组发生了多至7次重组，且主要发生于26s rRAN基因附近，产生一个嵌合基因，因此导致转录时阅读框架发生了改变，如果这个嵌合基因发生了缺失或小段插入，则阅读框架恢复正常，育性也随之恢复。
总之，植物体细胞杂交是胞质基因组及其所控制性状研究的有效途径，关于胞质性状的研究对于某些植物已从分子水平上深入到了与雄性不育相关的特异线粒体DNA片段及相应的特殊蛋白，但仍有许多问题有待深入研究。这些问题的阐明将会使得从分子水平上改良雄性不育性状成为可能。
生物科学实验是以认识生命运动的本质和规律为目标的实践。它不是盲目的行为，而是在理性指导下的变 革现实的实践活动。在每一个实验的过程中，从实验意念的产生到实验方案的设计，从实验结果的分析到实验 报告的完成，每一步都有思维活动，每一步都是思维的结果。所以，生物科学实验有利于把学生带入发现问题 的情境，使学生在分析实验问题之中和在解决实验问题中锻炼思维能力。 科学的思维能力是科学素质的重要方面，而科学素质的培养又是全面实现素质教育的重要内容。本文结合 初中生物实验关于培养学生的思维能力问题谈几点看法。 一、启发学生的思维积极性 兴趣是思维活性的触发剂，求知的需要是学习动机的基础。当学生对某个问题发生兴趣时，就会围绕着这 个问题积极地思考起来。但是，单纯由“实验”表面的“魅力”所引起的，只是直接的兴趣，如果没有更深层 次内涵的吸引，维持不了多久。要想保持学生持久的兴趣，就要善于“创造”种种诱因。比如，从生产实际和 学生生活实际引出实验课题，不断明确实验目的意义，不断提出有趣而又有思考性的问题引起学生思考，等等 。通过这些手段，及时地把学生的直接兴趣发展为间接兴趣。 思维总是在观察和解决问题的过程中进行的。当一个人产生必须排除困难的需要，或要了解某一问题时， 思维就活跃起来。实践证明，有意识地创设发现问题的情境是引导学生积极思维的好方法。我们要善于利用实 验中的〔观察与思考〕、〔讨论〕等栏目中的问题，以及在辅导实验的教学中用有启发性的问题巧妙地引导和 调动学生思维的积极性。 二、帮助学生掌握科学研究的基本过程 科学思维方法的首要问题是明确科学研究的基本过程，即解决问题的程序。 例如，〈观察鼠妇活动〉的实验设计思路。 首先，通过观察发现问题。为什么在花盆下、石块下等处容易找到鼠妇？这些地方有什么特点？ 其次，提出假设（对发现的问题大胆提出猜测和解释）。 1.鼠妇的活动可能与光照条件有关。 2.鼠妇的活动还可能和水分，以及其它外界因素有关，等等。 第三步，设计实验，验证假说。在这个阶段，实验的目的任务、方法、材料、装置等等都是根据假设来确 定的。所以，实验的理论依据主要是假设（当然还有赖于学生对有关科学知识的掌握情况）。 1.先检验“光照”对鼠妇活动有无影响。 2.为了消除无关变量的干扰，突出自变量，找出自变量和因变量的因果联系，必须创造一个除“光照”以 外其它条件均相同的、只有明暗两处相通的场所。把一定数量的鼠妇放在其中，观察鼠妇在明暗两处的数量分 布情况。 第四步，分析、讨论实验结果，推导结论验证假设的真伪。 通过“鼠妇实验”，要帮助学生感受和理解科学研究的基本过程：问题→假设→实验→结论。初中所有的 生物实验几乎都体现了这条思路，这里不再重复。 需要说明一点，科学的“假设”绝不是无根据的凭空捏造，而是要有科学根据的。这种根据来源于头脑中 已有的知识，或者来源于别人的研究成果，或者来源于对客观实际的观察。例如，在研究“消化”的实验里所 提出的假设：“细胞膜只能透过小分子物质，食物中的大分子物质必须先变成小分子物质才能透过细胞膜。” 这个假设的理论根据是：①人和动物都是由细胞构成的；②生活的细胞需要从外界吸收营养物质；③营养物质 是通过细胞膜进入细胞里的；④人和动物的营养物质来源于食物；⑤食物营养成分中有大分子物质。通过生物 实验使学生理解科学研究的基本过程，经过反复训练，完全可以把这种思考问题的程序内化为学生的思维习惯 。 三、训练学生的思维操作技能 思维操作技能包括分析、综合、比较、抽象和概括等几个步骤。在生物实验中要实现对某生命现象的本质 和规律的认识，就要对实验中的感性材料进行一系列的思维操作才能实现。 首先，是对要研究的事物进行分析。根据系统论的观点，任何一个生命体或一种生命现象都是由部分、层次、要素组成的开放的有序整体。对于这样一个整体如果囫囵吞枣地研究是无法进行的。只有将其分解，才能 一部分一部分地研究，深入其内部，发现其本质。在头脑中把整体分解为部分而进行逐个研究的过程就是分析 。比如，在研究“影响鼠妇活动的外部条件”时，必须先把“外部条件”分析成光、水、化学物等单个因子， 然后逐一考查和鼠妇活动的关系；在研究“光合作用”时，也是将其分解为原料、条件、产物几部分，而这每 一部分又是由次一级的成分组成。为了便于研究还须进行更深层次的分解。所有的科学实验都离不开分析。 综合，在头脑中把生命体的各部分，把生命现象的各个方面和属性联合起来，形成对生命体和生命现象整 体的认识，这就是综合。比如在了解了细胞膜、细胞质、细胞器、细胞核等构造之后，再把它们联合起来就形 成了一个完整的生活的细胞的概念。分析和综合是相反相成、紧密联系的对立统一的关系。它们是思维活动的 基础。 比较，是把生物各部分构造、功能和某些属性加以对比，并确定它们之间的异同点。这就为进一步认识生 命的本质和规律、进行抽象和概括打下基础。例如，比较各种细胞在形态构造、功能等方面的相同点和不同点 ，比较各种种子的构造，比较淀粉酶在不同条件下对淀粉的作用情况，等等，这些都是比较的过程。 抽象和概括，是找出各种生物体或各种生命现象中共同的本质的属性，或找出各部分构造之间，功能与构 造之间，生物与环境条件之间的因果关系，而抛开次要的、非本质属性和非因果的偶然联系。并且，把抽象出 来的本质属性，必然联系加以综合形成概念和判断，达到对生物现象的本质和规律的认识。比如，在研究了植 物的各种花之后，舍去颜色，形状等次要属性而抽取出都有“花蕊”及担负“有性繁殖”功能这两个最本质的 特征，形成花的一般概念，这就是对花的抽象和概括。 分析、综合、比较、抽象和概括等在同一次思维活动中都是共同参与，紧密结合。一般说来，分析、比较 、综合是抽象和概括的基础，而抽象和概括是思维的核心。只有通过抽象和概括才能认识事物的本质和发展规 律，形成概念和原理，从而达到对事物理性的认识。 四、培养学生思维的逻辑性 思维的逻辑性主要指能正确运用概念、判断、推理的形式进行思维和表达思维的结果。在实验过程中，学 生通过观察获得大量具体的、形象直观的感性材料，对这些材料经过思维，抽象和概括出各种生命现象的本质 属性和必然联系，再以概念、判断、推理的形式表达出来或贮存起来。生物学中的各种基本概念、规律、原理 等都是概念、判断、推理的具体体现。这些就构成了生物学的知识体系。 生物学的基本概念和概念体系是生物科学知识的基础，所以，我们必须重视基本概念的教学。但是，应该 让学生自己通过“劳动”取得这些概念，让学生通过实验、观察、思考形成这些概念，并且能够用科学的语言 把它们表达出来。坚持让学生给概念下定义，让学生推导实验的结论，实际上是训练了学生思维的逻辑能力。 生物实验中经常用到的推理方法主要有归纳推理和演绎推理。这就为培养学生的推理能力创造了有利条件 。 归纳法是从个别事例概括出一般原理的思维形式。它一般又分为完全归纳、简单枚举法和因果归纳。简单 枚举法在中学生物实验中是普遍存在的。比如，一个鼠妇喜暗怕光，二个鼠妇喜暗怕光，……，从多数的鼠妇 喜暗怕光，归纳出所有的鼠妇都喜暗怕光。再比如，花、种子等许多生物学概念均是简单枚举归纳推理的结果 。 因果归纳可有求同法、求异法和剩余法等多种形式。这些方法在设计生物实验时都有所应用。例如在光合 作用实验中就应用了求异法。求异法是研究现象（a）和条件（A）的因果联系。如果当A存在的场合a现象也出 现，当A不存在时a也不出现，则可归纳出a与A有因果联系。光合作用和“光照”条件的关系推理如下表： 处理 光(A) 其它条件(B) 光合作用(a) ①光照 √√√ ②遮光 ×√× 结论 光合作用与光照条件有关 演绎推理，是从一般原理到特殊事例的推理。它有三种类型，其中以“三段论”应用最为广泛。比如，检 验光合作用产物之一——淀粉就应用了“三段论”的思维形式。 大前提 所有遇碘变蓝的物质都是淀粉， 小前提 如果光合作用产物之一遇碘变蓝
