随着对复杂动植物基因组认识的不断深入，越来越多的证据表明，基因组结构变异（SVs）在决定育种和农业重要性状方面发挥着重要作用。全基因组关联分析（GWAS）是性状相关基因定位的强有力工具，已被广泛的用于鉴定影响表型变异的候选基因组位点。但通常GWAS的研究主要依赖于单核苷酸变异（SNPs）的信息与表型相关联，而忽略了具有更大表型效应大小的大片段SVs。现在为大家分享几篇SV-GWAS的经典案例，为各位科研工作者的研究提供更多的思路选择和可能性探索。赶紧来看看吧！
一、PAV-GWAS揭示结构变异对大豆种子光泽的影响[1]
文章名称：Pan-Genome of Wild and Cultivated Soybeans
发表期刊：Cell
发表单位：中国科学院遗传与发育生物学研究所等
影响因子：38.637
发表时间：2020年6月
1. 研究背景
大豆为人类提供了主要的植物油料和蛋白资源，是重要的粮食经济作物。野生大豆和栽培大豆之间以及不同地理区域的栽培大豆之间存在广泛的遗传多样性。由于之前缺乏代表不同大豆种质材料的全新基因组资源，因此结构变异在大豆中重要农艺性状调控中发挥作用尚未被很好的开发。
2. 材料方法
对来自世界大豆主产国的2898个大豆种质材料（包含收集自全球范围的103份野生大豆、1048份地方品种和1747份栽培品种）进行了深度重测序和GWAS分析。
3. 研究结果
将2898份材料的重测序数据比对到图形泛基因组，鉴定了总共55,402个SVs，表明大豆种质含有丰富的结构变异多样性。种子光泽是大豆的一个重要性状，先前的研究表明，大豆疏水蛋白（HPS）的积累与种子光泽的变化有关。然而，相关基因仍不清楚。基于图形结构的基因组分型的SVs对种子光泽进行的全基因组关联研究（GWAS），确定了15号染色体上的一个重要信号，其中一个10 kb的PAV导致了一个HPS编码基因的存在和缺失。研究表明，含有和不含有这10 kb序列的大豆种子分别具有较高比例的光泽和无光泽，这表明PAV可能是控制大豆种子光泽变化的因果遗传变异之一。
本文构建了高质量的基于图形结构的泛基因组，挖掘到大量利用传统基因组不能鉴定到的大片段结构变异。经深入分析发现，一些结构变异在重要农艺性状调控中发挥重要作用，如种皮亮度、种皮颜色的驯化、缺铁失绿等。另外，该结果也为SV-GWAS分析如何推动植物基因组学和功能基因组学研究的发现提供了有力的例证。
二、SV-GWAS发现基于SNP-GWAS未发掘的玉米含油量相关的结构变异[2]
文章名称：Genome assembly of a tropical maize inbred line provides insights into structural variation and crop improvement
发表期刊：Nature Genetics
发表单位：华中农业大学等
影响因子：27.603
发表时间：2019年6月
1. 研究背景
玉米是全球重要的粮食作物之一，它显示出丰富的遗传多样性。之前已发表的玉米基因组材料都来自于温带，研究时无法全面揭示热带玉米的遗传多样性。而热带玉米具有许多温带玉米所不具备的优良性状，如抗病虫、耐旱等。本文构建了高质量热带玉米基因组图谱，并基于结构变异进行分析，为探索玉米基因组的结构变异以及挖掘玉米新的优势农艺性状具有重大意义。
2. 材料方法
基于521份不同玉米自交系品种的深度重测序数据进行SVs检测和群体多态性SV（pSV）分析。
3. 研究结果
共鉴定到80,614个多态性 pSV，其中有21.9%的变异是传统SNP检测方法所不能检测到的，说明部分遗传多样性的来源可能并非是SNPs，而是较大的SVs。为确定新鉴定的SVs在表型形成中的效用，研究者针对含油量和脂肪酸含量性状进行了全基因组关联分析，并对SNP-GWAS和SV-GWAS的分析结果进行比较，基于SV-GWAS结果发现了一个新的位于4号染色体上的显著相关的区域，在这个区域内的位点呈连续分布，推测该区域可能与玉米的含油量性状相关。在这个候选区域内找到一个基因 Zm00015a017119 ，该基因编码烯酰-酰基载体蛋白还原酶（ENR），该酶催化脂肪酸延伸循环中的最后一个酶促步骤。结合转录组数据进行验证，结果发现ENR表达量与含油量呈正相关，统计86个主要SVs类型为B73的个体和7个主要SVs类型为SK的个体，结果表明是SVs造成玉米含油量的显著差异。
该研究基于SV-GWAS发现了新的变异候选位点，结合转录组数据，发现SVs相比于SNPs更容易引起基因表达量的变化。研究表明，结构变异是表型差异的基础，且基于SVs的GWAS分析可以挖掘基于传统SNPs的研究中未发现的重要遗传变异位点。
三、PAV-GWAS挖掘基于SNP-GWAS未发现的油菜荚果长度、种子重量和开花时间相关的结构变异[3]
文章名称：Eight high-quality genomes reveal pan-genome architecture and ecotype differentiation of Brassica napus
发表期刊：Nature Plants
发表单位：华中农业大学等
影响因子：13.256
发表时间：2020年1月
1. 研究背景
甘蓝型油菜是一种具有复杂基因组的异源四倍体作物，在不同的材料和生态型中有广泛的基因组和表型变异。在对季节变化(如春化要求、抗寒性和光周期等)反应的驱动下，甘蓝型油菜已被驯化的具有各种特性，但是其巨大的表型变异背后的遗传多样性还有很多未知。
2. 材料方法
通过全基因组比较分析整合8个甘蓝型油菜材料的PAVs组合，鉴定了16个巢式关联群体(NAM)亲本系的PAV基因型，并根据高密度的遗传连锁图谱将其比对到2141个重组自交系(RILs)上。
3. 研究结果
通过泛基因组比较分析，共鉴定出77.2~149.6 Mb的存在和缺失变异(PAVs)，其中超过9.4%的基因包含大的效应突变或结构变异。为探索SVs对性状变异的贡献，基于油菜NAM群体（共包含27,216个PAVs）进行了PAV-GWAS分析。角果长度及种子重量是产量相关的重要性状，A09染色体上的峰值区域为先前报道的由传统数量性状定位和图位克隆确定的区域，但没有相关的SNP位于靶基因 BnaA9.CYP78A9 的调节区或编码序列中，PAV-GWAS直接检测到了 BnaA9.CYP78A9 启动子区上游3.9 kb的CACTA-like TE插入，被确定为角果长度和种子重量的因果变异。在8个油菜品种中，Gangan和ZS11 在 BnaA9.CYP78A9 的上游有TE插入，这两个品种显示出比其他品种明显更长的角果长度和更大的种子。
开花是植物从营养生长转为生殖生长的关键过程，与产量密切相关。PAV-GWAS分析发现了直接位于开花抑制因子 BnaA02.FLC 和 BnaA10.FLC 内的峰值PAV，A02上的PAV峰值是 BnaA02.FLC 第六外显子的hAT的插入导致，在冬季和春季环境中，具有这种824bp PAV的NAM RILs比没有它的开花更早。A10的PAV峰是 BnaA10.FLC 启动子区的hAT插入导致，该位点在以前的近1000份油菜SNP-GWAS中没有报道。在春季环境中，有这种4421bp hAT插入的NAM RILs比没有的开花晚。
结果表明，PAV-GWAS直接确定了以ZS11为供体的巢式关联作图群体中角果长度、种子重量和开花时间的因果结构变异，而SNP-GWAS没有检测到这些变异，表明PAV-GWAS在确定与性状的关联方面与SNP-GWAS互补。
四、SV-GWAS揭示基因组结构变异对桃果实形状的影响[4]
文章名称：Genome structure variation analyses of peach reveal population dynamics and a 1.67 Mb causal inversion for fruit shape
发表期刊：Genome Biology
发表单位：北京市农林科学院等
影响因子：10.806
发表时间：2021年1月
1. 研究背景
桃树起源于中国，距今已有2百万年，在其8,500年的驯化过程中，其果实大小，形状，颜色，质地和风味的表型差异很大。桃已经被作为多年生果树的模式植物广泛开展遗传研究，然而，其全基因组SVs的表征及其潜在的表型影响仍是一个主要尚未开发的领域。
2. 材料方法
选择主要产区的桃品种（共149份材料，产区包括华北，西北，华南，西南，日本，美洲和欧洲）进行全基因组重测序。
3. 研究结果
研究者构建了高质量的SVs图谱，包含27,734个SVs，总共覆盖RYP1基因组的约16.10％（~38.49 Mb），表明桃基因组含有丰富的结构变异。果实形状是栽培桃中极有价值的农艺性状，使用SNP-GWAS分析得到多个与果形相关的强SNPs信号映射到“S”基因座。然而，最近的群体规模研究表明，基于SNP-GWAS所报道的基因的突变显然不足以解释某些品种的扁平果形性状，该性状的遗传基础值得进一步研究。基于SV-GWAS分析，鉴定出最重要的关联是在“S”基因座处从27,959,880 bp到29,634,101 bp的1.67-Mb杂合倒位，覆盖了主要SNPs，与果实扁表型共分离，所有37个扁平果种均携带该倒位的衍生等位基因，而所有99个圆形果种均携带祖先等位基因。
不可否认，基于SNP-GWAS代表了一种强大的研究策略，可用于识别植物性状的遗传变异。但仅使用SNP-GWAS，则无法鉴定出这种与扁平果相关的1.67-Mb杂合倒位。也就是说，对于已知由大型SVs引起的重组率降低和搭便车效应，SNP-GWAS几乎可以肯定会错过，就像该1.67-Mb杂合倒置的发现可以明显解释主要的农业上重要的水果形状表型。
五、小结
研究表明，尽管SVs在表型形成中作用还需要更多的研究，但是可以肯定的是，当探究表型变异背后的遗传多样性机制时，结构变异是必须要考虑的因素。上述研究也证实了SV-GWAS提供了一种有效的策略来鉴定关键的候选基因，且基于SV-GWAS比SNP-GWAS对某些候选基因的鉴定更加有效，为后续优异基因资源的发掘提供了重要参考。扒一扒近期发表的动植物群体文章，不难发现基于SV-GWAS的研究频现登陆各大高分期刊，可参见下表：
随着测序技术的不断进步，识别基因组中结构变异的程度和影响变得越来越可行，特别是三代测序技术的发展，使全基因组范围内产生准确的长读长数据变得更容易。
上述案例研究提供了利用SVs如何驱动植物科学中基本功能发现的重要方法，对未来分子辅助育种和遗传改良具有重要的指导意义。总而言之，动植物群体SV-GWAS的研究思路已经准备就绪，文章蓄势待发，风口已然来临，还在等什么，赶紧上车哟！
参考文献：
1. Liu Y, Du H, Li P, et al. Pan-Genome of Wild and Cultivated Soybeans[J]. Cell, 2020, 182(1):162-176.
2. Yang N, Liu J, Gao Q, et al. Genome assembly of a tropical maize inbred line provides insights into structural variation and crop improvement[J]. Nature Genetics, 2019, 51(6):1052-1059.
3. Song J M, Guan Z, Hu J, et al. Eight high-quality genomes reveal pan-genome architecture and ecotype differentiation of Brassica napus[J]. Nature Plants, 2020, 6(1): 34-45.
4. Guan J, Xu Y, Yu Y, et al. Genome structure variation analyses of peach reveal population dynamics and a 1.67 Mb causal inversion for fruit shape[J]. Genome Biology, 2021, 22(1): 13.
5. Zhou H, Ma R, Gao L, et al. A 1.7-Mb chromosomal inversion downstream of a PpOFP1 gene is responsible for flat fruit shape in peach[J]. Plant Biotechnology Journal, 2021, 19(1): 192-205.
6. Alseekh S, Scossa F, Fernie A R. Mobile transposable elements shape plant genome diversity[J]. Trends in Plant Science, 2020, 25(11): 1062-1064.
7. Guo J, Cao K, Deng C, et al. An integrated peach genome structural variation map uncovers genes associated with fruit traits[J]. Genome Biology, 2020, 21(1): 258.
8. Li X, Yang J, Shen M, et al. Whole-genome resequencing of wild and domestic sheep identifies genes associated with morphological and agronomic traits[J]. Nature Communications, 2020, 11(1): 2815.
9. Yu Y, Fu J, Xu Y, et al. Genome re-sequencing reveals the evolutionary history of peach fruit edibility[J]. Nature Communications, 2018, 9(1):5404.
根据一篇论文可知，中国石竹的染色体数为30。
该论文为：
《Factors affecting somatic embryogenesis in anther cultures of Chinese pink (Dianthus chinensis L .)》
期刊：In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant
出版社：Springer Berlin / Heidelberg
ISSN：1054-5476 (Print) 1475-2689 (Online)
期：Volume 44, Number 3 / 2008年6月
作者：XiaoPeng Fu, ShuHua Yang and ManZhu Bao
原文引言如下：
Abstract：
In this study, we aimed to maximize the rates of somatic embryogenesis achievable in anther cultures of Chinese pink (Dianthus chinensis L.) (2n=2x=30).
大家好，本周给大家分享的是一篇发表在nature plants上的关于 crispr-cas9技术诱导拟南芥同源染色体易位 的文章。
文章题目： CRISPR–Cas9-mediated induction of heritable chromosomal translocations in Arabidopsis (CRISPR-Cas9 介导的拟南芥遗传染色体易位诱导)
期刊： Nature Plants
影响因子： IF = 15.793;
发文单位： 德国卡尔斯鲁厄技术研究所,德国莱布尼茨植物遗传学和作物植物研究所(IPK)等单位。
摘要： CRISPR–Cas9技术主要应用于植物育种中，用于改善单或多性状的基因。此文献展示了这种技术也可以用于重组植物染色体。利用金黄色葡萄球菌的Cas9核酸酶，本文实验团队诱导了拟南芥异源染色体间Mbp范围内的相互易位，并观察到在没有经典的非同源端连接途径的情况下，易位频率大约提高了5倍。通过分子和细胞学分析，作者证实了拟南芥1号、2号染色体之间，1号、5号染色体之间的染色体臂交换是保守的和互作的。染色体易位的诱导可以模拟基因组的进化或有方向的修改染色体、固定或打破不同染色体性状之间的遗传联系。植物基因组的可控重组具有改变植物育种的潜力。
实验思路：
DSB的修复途径主要为以下两种，在植物中NHEJ是体细胞中普遍存在的修复途径。一次诱导多个DSB可以通过NHEJ连接不相关的断裂末端，导致基因组重排。因此在异源染色体上同时诱导两种DSB可能会导致相互易位的形成。
实验方案：
为了形成易位，实验使用来自金黄色葡萄球菌的Cas9核酸酶(SaCas9)诱导拟南芥1号染色体(Chr1)和Chr2上的两个dsb (TL1-2)。Cas9核酸酶的靶位点被设计为切于Chr1和Chr2长染色体臂末端0.5 Mbp的基因间区域(图1a)。为了确定CRISPR在体细胞中造成的易位频率事件，我们通过农杆菌介导的浸花方法对col0植株中的CRISPR构建物进行了转化，并选择生长两周后的植株为初代转化子。设置了6个生物重复，每个重复收集100株植物用于提取基因组DNA。使用带位点特异性引物的数字滴式PCR(ddPCR)对易位频率进行定量测量，连接位点附近序列的变化作为鉴定到易位的标志。实验检测到TL1-2在两个连接处的易位频率约为0.01%，表明使用CRISPR-Cas9确实可以实现染色体臂的相互交换。为了确定哪些修复途径参与了植物体细胞易位的形成，实验通过下一代测序(NGS)检查了连接位点的序列模式。序列显示在野生型背景下，约60%的事件显示无错连接，其余事件为小规模序列缺失。大多数情况下没有核苷酸丢失，最可能的原因是新连接为嵌合连接，与最初切割位点相反，不能再被Cas酶识别。这说明主要是cNHEJ通路导致了染色体易位的形成。同时还分析了在敲除cNHEJ关键酶KU70后易位的形成。结果显示，敲除KU70使易位频率增加了约5倍，接近0.05%。这说明在没有cNHEJ的情况下，aNHEJ能够有效地形成易位
实验通过遗传转化得到T0代初级转化子，T0代授粉自交得到T1代，T1代进行基因分型挑选出40个含易位事件的植株进行T2代植株种植培养。40个T2植株混样提取DNA进行基因分型筛选，另外同时进行单株的筛选。挑选具有易位事件的单株进行T3代种植培养。单株检测易位事件随后继续分离培养。c-e：半合子状态下的相互易位分离示意图。T2植株的染色体组分别有野生型(1和2)和嵌合型(J1和J2)拷贝(c);因此，它们的配子要么携带野生型单倍体染色体组，要么携带易位染色体组，要么携带缺乏部分遗传信息的两组染色体(用红色十字标记;d);在T3代中，如果所有4个配子都没有偏置转移到下一代，理论上可以产生16种基因型组合(e)。然而，一半(8)的受精事件会导致染色体不平衡(黄色)，两个细胞将失去遗传信息(红色)，只有六个组合(绿色)可以解释一个平衡的二倍体后代。在这六种平衡的基因型中，有四种是杂合子的易位，这意味着它们同时携带原染色体和重组后的染色体。两种基因型来自不平衡的配子组合(浅绿色)，两种来自平衡的配子组合(深绿色)。因此，如果不平衡的配子不能贡献后代，16个合子中只能产生4个存活的合子(1个纯合子野生型，2个杂合子易位和1个纯合子易位)，导致易位染色体的准孟德尔分离(1:2:1)。T2分析中，所有转化株系均检测到两个连接位均为阳性的植株，Col-0和ku70-1的易位频率分别为0.125%和0.5%。在得到的T3代中，每个T3株系筛选到40株，由于没有检测到不平衡的染色体组，观察到向平衡后代的转移。用χ2检验检验易位连接的拟孟德尔分离。
通过使用不同DNA探针，针对Chr1(红色)和Chr2(绿色)易位断点区域进行FISH，观察到了野生型和易位植株有丝分裂和自然延伸的粗线期染色体。遗传易位事件的两个连接位点J1(b)和J2(c)的测序结果显示在野生型背景的4个T4细胞株中，有3个细胞株在两个连结处均无错误连接，另一个细胞株在一个连结处有小的缺失。两者都分析了ku70-1背景下的易位事件在两个连接处的突变特征是aNHeJ修复。
相同的实验流程在Chr1和Chr5之间进行了易位诱导，野生背景下携带易位事件的40个T2株系中有一个单株为易位阳性，T3分析未检测到配子不平衡导致的基因型，10%的子代为纯合子易位。测序分析显示两个连接位点都有小的缺失。使用不同标记的探针对易位区域进行FISH，三次重复结果一致表现易位现象。
a ，四个不同编辑位点上SaCas9的编辑效率 b ，Col-0在连接位点上的缺失多为中小缺失，而ku70突变体在两个连接位点上的缺失量较大。 c ，在野生型中，大多数连接是直接连接的，在连接位点没有任何突变诱导。在显示连接位点突变的reads中，大多数连接不使用MHs，只有少数连接使用MHs。相比之下，在ku70突变背景中几乎没有无错误的连接发生，在连接位点普遍的修复模式显示使用MHs连接。 d, e ，野生型和突变型中两个连接位点在序列水平上最常见的10个reads的详细表示。
为了证明没有序列信息丢失，在易位染色体上每100kb扩增出一个约2.5kb的典型扩增。图a。易位染色体部分PCR扩增产物的凝胶电泳图显示易位染色体每100KB就能检测到一条条带，表明易位形成过程中没有信息丢失。作为PCR对照，将未易位形成的野生型基因组DNA(阳性对照)和水(nTC=无模板对照，阴性对照)同时处理，并加载在不同的凝胶上。表型分析和育性分析(测量5个生物学独立样本的角果长度和种子数)显示易位植株和野生植株并无差别。d,e，育性分析是通过测量5个生物学独立样本(n=5)的角果长度和计数种子数进行的。Barplots显示平均值，errorbars为mean±s.d。对于两个携带TL1-2的分析品系，我们无法检测到任何差异。
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（一）PubMed简介：
PubMed是美国家医学图书馆(NLM)下属的国家生物技术信息中心(NCBI)开发的、基于WWW的查询系统。
PubMed是NCBI Entrez 数个数据库查询系统下中的一个。
PubMed 是提供免费的MEDLINE、PREMEDLINE与其他相关数据库接入服务，MEDLINE是一个拥有1亿字条的巨大数据库。
PubMed也包含着与提供期刊全文的出版商网址的链接，来自第三方的生物 学数据，序列中心的数据等等。
PubMed提供与综合分子生物学数据库的链接与接入服务，这个数据库归NCBI所有，其内容包括：DNA与蛋白质序列，基因图数据、3D蛋白构象，人类孟德尔遗传在线。
（二）页面介绍:（更新很快，但其内容变化一般不大）
在你的浏览器中的URL地址框中健入
并单击回车键后，你将进入Pubmed的主页面。如图：
主页面左侧框的介绍（注：Cubby和tutorial为最新加入的）
MeSh Browser你可以用它来分层流览MesH表
Single Citation Matcher通过填表的形式输入期刊的信息可以找到某单篇的文献或整个期刊的内容。
Batch Citution Matcher用一种特定的形式输入期刊的信息一次搜索多篇文献。
Clinical Queries这一部分为临床医生设置，通过过滤的方式将搜索的文献固定在4个范围：治疗、诊断、病原学与预后。
Old PubMed (使用以前的PubMed查询方式)
关于每一项的具体使用方法, 后面将会有详细介绍。
3) Related Resources
Order Documents提供一种收费性质服务，可以使用户在当地得到文献的全文拷贝（费用与发送方式各不相同）。
Grateful Med是对另一个NLM基于网络的查询系统的链接。Grateful Med也提供MEDLINE的接入，并且还有一些其他的数据库如AIDSLINE、HISTLINE等等。
Consumer Health提供与MEDLINEplus的链接，MEDLINEplus是与消费者健康信息相关的国家医学图书馆的网络节点。
Clinical Alerts此部分的目的是加快NIH资助的临床研究成果的发布。
2. 主页面底部的介绍
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下面将举例说明查询的主体部分，也就是页面上部的使用方法。
假如我们这次的工作是查找与gallstone、pain有关的文献。
在对话框中输入查询词。比如我们这次输入的是gallstone pain，然后单击“go”按钮或按回车键，PubMed将会自动开始检索，并将检索到的相关条目显示在屏幕上。
你可以随时向查询框输入查询词，点击“go”按钮开始新的查询。“clear”按钮可以帮你清除查询框中的内容，然后开始一个新的查询。
在查询框前search提示后有一个下拉式菜单，你可以在这里选择其他的信息资源或NCBI的数据库。
Structure 搜索分子结构数据库(MMDB)The Molecular Modeling Database，这个数据库保存的是由X线晶体成像、NMR分光光度法建立的三维分子结构。
Genome 提供所有基因与染色体纪录与图片的查询服务，这个库中数以百万的基因序列是由庞大的基因排序工作得来的。
PopSet 这个数据库中的内容是由相关种族、人类发展、突变研究得来的人类进化与人种差异的结果。
下面我们将详细介绍查询结果屏幕。
显示选项（Display Option）
在Display后面有一个下拉式菜单，在这里可以选择各种显示选项。
简要格式（Summary）在缺省设置下PubMed采用这种显示格式，他所显示的内容包括以下几项：
作者：纪录中的所有作者都奖杯显示出来。
相关：列出相关内容，如文章、蛋白质、核苷酸等（列出的文章不以摘要格式显示）。
文章题目：英语以外的语种的题目将被翻译成英语，并且加上括号。
来源：提供文献所在期刊名的缩写，出版时间，卷，页数，也包括语种（针对非英语文献），出版类型。没有摘要的文献将显示“No abstract avilaible”
标识数字：提供PubMed标示（PMID）与MEDLINE唯一标识（UI）。
简报格式（ Brief）显示的条目内容包括作者姓名、文献名的前10个字母、PubMed唯一标识。
摘要格式（Abstract）将会显示以下几项内容：文献题目、作者、第一作者单位（地址）、期刊来源（期刊名简写、出版日期、卷、页数）、如果必要加上标注、出版类型、非英语文章加上标注、摘要、备注、PubMed与MEDLINE的唯一标识。
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Nursing：护理学期刊的子集
PubRef：这是一项将搜索词范围扩大的服务，选择此项将会搜索更广范围的科学期刊（如物理、天文等）而不是限定在PubMed中，这个选项也可以帮用户搜索到出版商网址上的文献全文。
Date(日期) PubMed 中包括自1966年来出版的文献，新条目周二到周四加入。在PubMed中有两种日期表示方式：Entrez日期是条目最初被加入PubMed的日期，Publication（出版）日期是文献出版时的日期。PubMed已Entrez日期顺序来显示你的查询结果的，最新被加入的纪录第一个被显示出来。
Limiting by Date（日期限定）使用Entrez下拉式菜单，可以把你的搜索范围设定在30天到10年，出版日期下拉菜单有Publication Date 与Entrez Date两项，以确定使用那种日期记法来设定搜索范围。使用From、To框输入一个时间段；以YYYY/MM/DD的格式输入日期（月和日可不填）
Limit Indicator Limit旁边的复选框如果处于选中状态则表示限定条件生效，如果开始搜索，生效的限定条件将会以黄色框Display按钮的上面。注意再进行其他搜索前将Limit前的复选框去掉，以消除限定条件。
Preview/Index（预览/索引）使用特征栏的Preview/Index可以做到：
在显示条目之前显示所查到的文献数。
随时通过增加查询单词来修改查询方案。
在特定的搜索域中向方案里加入查询词。
从Index中查看并选择词语来修改查询方案。
在你修改查询时查看方案。
下面将详细加以介绍：
Preview(预览)使用此功能可以在显示条目之前显示所查到的文献数。在输入框中键入搜索词，然后单击Preview，PubMed返回的信息是条目的数量。
通过增加一个或多个单词来修改查询方案。向查询框中加入另一个词语点击Preview，你可以继续向框中加入多个词语，点击Preview直到你希望得到的内容,当修改查询时可以看到搜索方案与查询结果的数量。Preview显示的是历史记录中最近的三条记录，使用History可以看到最近100次的查询结果。History中的Clear History按纽也可以清除Preview/Index中的内容。
向下滚动Preview/Index找到“Add to Query or View Index”部分，使用下拉菜单确定一个搜索域，向文本框中加入词语，单击Preview，向查询框中加入词语并且可以看到查询结果。
现在我们向查询框中加入MeSH词Nurse，使用下拉菜单确定一个搜索域，向文本框中填加一个词，单击Preview，你可以一直这样加入单词，单击Preview，直到完成你的搜索方案。Preriew自动使用“AND”运算符来将单词合为一体，即要求同时查询包含两个词的文献。
使用布尔运算符按纽。使用布尔运算符将你要查找的词语连接起来，OR代表的是要查找的文献包括第一个搜索词或第二个词，NOT为“否”，包括第一个搜索词而不包括第二个词的文献。每加入一个搜索词都要点击Preview来列出搜索结果的数量。
查询举例
让我们查找一下有关碳水化合物(Carbohydrate)或大豆(Soybeans)对骨质疏松症影响的文献。
使用下拉菜单确定一个搜索域 ，向文本框中加入一个词语，单击AND按纽，我们可以预览结果或者接续向文本框中填加搜索词，我们想找到有关Soybeans的文献，继续往下作，使用下拉菜单选择一个搜索域，向文本框中加入Soybeans，单击Preview来查看搜索结果
Index（索引）中选择搜索词
使用索引按钮可以从特定域中选择以索引的单词，并把他们加入查询方案之中。
Index（索引）中你可以查看某一个特定搜索域中词语列表。
在这里也可以使用布尔运算符来建立一个查询方案。
举例说明：我们在下拉菜单中选择MeSH Terms作为搜索域，键入搜索词Strikes，点击Index按钮，PubMed以字母序显示所选定搜索域中相关的词语，使用滚动条来上下移动列表。在单词右边的括号里显示的是包括此词语的文献的数量。使用Up、Down按钮按页上下翻动列表。
对话框显示了搜索词与搜索域，Result显示了文献的数量。注意：Preview缺省是AND将查询词语连在一起的。你可以使用布尔运算符按自己的要求将他们结合起来，但你在使用布尔运算符将查询词语输入对话框以后，必须点击Preview才能看到查询结果。
查询举例：
将以Legilation and Jurispradence为副标题的Strikes Employs与以Satistics and numerical为副标题的Strikes Employs点击高亮显示，单击AND按钮将选择的查询词加入对话框，选择缺省的设置是以OR连接起来的。按住Ctrl键，可以在列表中连续选择多个查询词，当你所有需要的查询词都被高亮显示后，单击AND或OR将他们加入对话框，这时在PubMed的对话框中是这样的内容：“Strikes,employee/legislation and jurispredence” OR “Strikes,employee/statistics and numerical data””
让我们使用Index再把这次搜索修改一下，我们想把搜索缩小到有关Nurse与已设内容范围，在输入框中键入Nurse后点击Index，在索引中选择Nurse并单击AND将其加入对话框中。点击Preview按钮查看查询结果的数量，对话框中显示的是搜索词、搜索域与布尔运算符。
History（历史记录）历史记录中保存的是你所有的查询方案与查询结果，只有当你运行了一次查询之后，History中才有内容。History屏幕将会显示：你的查询方案、查询时间、查询到的文献数量。
使用History（历史记录）
你可以在查询方案中使用查询序数（the search Statement Number）,如#1、#2、#3等等。
例子：#1 AND #2、#7 AND #14。
如上个例子显示的，布尔运算符的字母必须大写。
History的一些小知识：
History内所能记录的最大查询数是100
一旦查询数量超过100，PubMed会将最早的查询除去，加进最新的一次查询。
如果两次查询内容相同，PubMed会将头一次的去除。
注意：查询序数不能用在Detail中的保存到URL功能中，这是因为尽管查询方案被保存了，但你的History在你1小时没有动作后将会消失，这时你保存的方案中的查询序号也就会失效。
点击 Clear History可以将History中的所有内容清除。
Clipboard（剪切板）剪切板可以帮助你保存或查看在一个后多个查询中选择的条目，然后就可以打印、保存、订购剪切板中的内容了。将条目左边的复选框选中，单击”Add to clipboard”就可以将其加入剪切板中，一旦某条被加入，剪切板的记录号码将会改变颜色。
剪切板使用的小知识
如果你没有用复选框选择任何条目，而去点击Add to clipboard，PubMed将会向其中加入500个条目。
剪切板中最大的储存数是500条。
剪切板中的内容如果你一小时没有任何操作将会消失。
使用剪切板
点击特征条上的Clipboard来观看剪切板中的内容，如果想删除剪切板中的某些项目，先将其左面的复选框选中，然后点击Remove from clipboard按钮；要想清空剪切板，不选任何条目，单击Remove from clipboard按钮
保存剪切板中的内容，首先选择一种显示方式，选中你想要的条目（如果想保存所有的条目，则哪个也不选），点击Save按钮。
Order（订购）在PubMed中查到的只是有关一篇文献的信息，而真正的文献全文是不提供的。PubMed的Order功能提供的就是通过一些中介机构来获得全文的服务，这项服务通常是收费的。
