细胞学说的建立已有150多年的历史。1838--1839年，德国植物学家施莱登（Schleiden，M.J.1804—1881，和动物学家施旺（Schwann，T.1810--1882，）创立了细胞学说。1855年，德国病理学家微耳和（VirchOW，R.l821一1902，又提出了“细胞来自细胞”的理论，此后便形成了完整的细胞学说。从那时起，生物学界就一直认为细胞是以分裂方式繁殖增生的，而且认为分裂是细胞繁殖增长的唯一途径；细胞分裂理论成为细胞学说的重要内容，生物学界在此基础上发展着细胞学理论。
然而.到了20世纪30年代，我国生物学家贝时璋却以实验研究为依据，提出了新的观点：细胞分裂不是细胞繁殖增生的唯一途径，除了细胞分裂，细胞繁殖增生还有另外一条途径——细胞重建；细胞重建是细胞自组织的过程，是生命世界客观存在的与细胞分裂并存的现象。贝时璋所依据的是开始于1932年并延续至今的一项自主创新研究工作——细胞重建的研究。
1932年，贝时璋到杭州一处叫松木场的地方采集实验用的动物。在稻田里，他发现了一种体长1-2厘米、样子像小虾、腹部朝上仰游的美丽的甲壳动物。据说，这种小动物在稻田、水塘大量出现，也和瑞雪一样。是丰年之兆，所以人们称它为丰年虫。丰年虫有几种，贝时璋看到的这种是南京丰年虫。他不是来采集丰年虫的，也没有要用丰年虫做研究材料的设想。然而。他以科学家的敏感发现，其中一些丰年虫头部形态异常，他断定这种异常具有生物学意义，可能是一种新的发现。
他将其带回实验室进行观察与研究，的确有了新的发现.那些丰年虫在性别上是异常的，非雌非雄，亦雌亦雄，是一种“中间性”。丰年虫常见，但中间性不常见。进一步研究，贝时璋又发现，中间性丰年虫在生活周期的某一时期会进行性的转变，转变成雌性或雄性。
激光扫描共聚焦显微镜系统及其在细胞生物学中的应用》
摘要激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学图象分析仪器，现已广泛应用于荧光定量测量、共焦图象分析、三维图象重建、活细胞动力学参数监测和胞间通讯研究等方面。其性能为普遍光学显微镜质的飞跃，是电子显微镜的一个补充。本文以美国Meridian公司的ACASULTIMA312为例简要介绍了激光扫描共聚显微镜系统的结构，功能和生物学应用前景。
关键词; 激光；共聚焦显微镜；粘附细胞分析与筛选（ACAS）
TheLaserScanningConfocalMicroscopySystemanditsBiologicalApplications
ChenYaowen,LinJielong,LaiXiaoying,MeiPinchao
(ShantouUni.Med.College,CentralLab,ShantouGuangdong515031)
AhstractTheLaserScanningConfocalMicroscopyisanewmedicalimageanalysisinstrument,whichisdevelopedinthelastdecade.Nowitiswidelyappliedinsuchfieldsasfluorescentquantitativemeasurement,conpocalimageandlyusis,3-Dreconstruction,Kineticsignalmonitioringoflivingcell,cellcellcommunicationresearches,etc.Inthispaper,ACSAULTIMA312(MeridianCo,USA)istakenasanexampletointroducetheprincipleofconfocalmicroscopy,itsfunetionsandbiologicalapplications.
KeywordsLaserConfocalMicroscopyAdherentCellAnalysisandsorting(ACSA)
激光扫描共聚焦显微镜（LaserscanningConfocalMicroscopy，简称LSCM）是近代生物医学图象仪器的最重要发展之一，它是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。已广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经生物学等领域[1、2、3]，对生物样品进行定性、定量、定时和定位研究具有很大的优越性，为这些领域新一代强有力的研究工具。
创建于1983年的美国Meridian公司，在90年代推出的“激光扫描共聚焦显微镜”这一项具有划时代的义意的高科技产品，曾获得美国“政府新产品奖”和两次“高科技领先技术奖”，它能达到每秒120幅画面的高速扫描激光共聚焦观察，可提供实时，真彩色的激光共聚焦原色图象。我院最近引起的ACASuLTIMA312是Meridian公司最新的高科技产品，为同类仪器中档次最高、功能最全的精密仪器。现以该仪器为例介绍激光扫描共聚焦显微镜系统及其在细胞生物学中的应用。
1、激光扫描共聚焦显微镜成像原理及组成
有关共聚焦显微镜的某些技术原理，早在1957年就已提出，二十年后由Brandengoff在高数值孔径透镜装置上改装成功具有高清晰度的共聚焦显微镜[5]，1985年WijnaendtsVanResandt发表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生物学中应用的文章，到了1987年，才发展成现在通常意义上的第一代激光扫描共聚焦显微镜。
激光扫描共聚焦显微镜成像原理如图1所示，激光器发出的激光束经过扩束透镜和光束整形镜，变成一束直径较大的平行光束，长通分色反射镜使光束偏转90度，经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品中的荧光物质在激光的激发下发射沿各个方向的荧光，一部分荧光经过物镜、长通分色反射镜、聚焦透镜、会聚在聚焦物镜的焦点处，再通过焦点处的针孔，由检测器接收。
从图1中可以看出，只有在物镜的焦平面上发出的荧光才够到达检测器，其它位置发出的光均不能过针孔。由于物镜和会聚透镜的焦点在同一光轴上，因而称这种方式成像的显微镜为共聚焦显微镜为共聚显微镜。在成像过程中针孔起着关键作用，针孔直径的大小不仅决定是以共聚焦扫描方式成像还是以普遍学显微镜扫描方式成像，而且对图像的对比度和分辨率有重要的影响。
ACASULTIMa312采用快速镜扫描或台阶扫描对样品逐点扫描成像，由于样品中不同的扫描点始终在物镜和会聚透镜的光轴上，因而它以相同的信噪比扫描整个样品，扫描精度达0.1μm，扫描面积最大的为10cm×8cm，当激光逐点扫描样品时，针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，并将之转化为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚聚焦图像。一个微动步进马达控制栽物台的升降，使焦平面依次位于标本的不同层面上，可以逐层获得标本相应的光学横断面的图像。这称为“光学切片”。再利用计算机的图像处理及三维重建软件。可以得到高清晰度来表现标本的外形剖面，十分灵活、直观地进行形态学观察。
2、激光扫描共聚焦显微镜硬件和软件系统
2.1ACASULTIMa312硬件及参数指标 激光光源：氩离子激光（50mW的紫外光、999mW的可见光），能同时/顺序/分别输出紫外光和可见光，激发波长为351-364nm；488nm；514nm。 计算机系统：80586/133MHzPCI/80MBRAM/2000MBSCSI硬盘/150MBBernoulli盘驱动器/17’’大屏幕显示器。 共聚焦系统：计算机自动控制光路准调节；计算机控制孔径校准；计算机调节孔径大小；自动Z轴调节（最小0.1μm）。 光学探测系统：3个测窗式PMT采集荧光；1个CCD系统；12位的高速A/D转换器。 图像分辨率：图像大小1535×1535；像素最小距离：0.1μm；灰度为4096级。 扫描方式：快速镜扫描DualScan台阶扫描；扫描精度0.1μm；扫描面积最大为10cm×8cm；扫描平面：XY和XZ和独特点、线、面扫描。2.2激光扫描共聚焦显微镜软件系统
ACASULTIMa312系统采用独特设计的软件将激光细胞仪与先进的计算机技术结合，产生快速、高效、灵活的操作系统，完备的数据采集、分析与管理功能。基于生物医学研究有如下的软件。
ImageAnalyze—对于单色、比色和三色标记的二维荧光图像的定量分析，可产生透射光图像重叠，同时AutoImage可多个区域的自动扫描和荧光定量，以及相同区域的时间顺序扫描。 RatioAnalysis和Kinetics—测定细胞内的离子变化，可有点扫描、线扫描及图像扫描三种测定形式，以监测各种速率的生物反应。 Cell–CellCommunicationandFRAP-相邻细胞的FRAP分析。该软件首先用可光淬灭特异的细胞荧光，然后在多个时间点扫描，此扫描可对单一区域或细胞的多个选择区域，可产生透射光图像并与其它图像重叠。 CellList—储存被选择细胞的位置，即可自动对较大样品进行扫描，又可产生较小样品特异部位的网络位置表，以进行自动的测量、筛选和重复测定。 CellSorting—ACAS具备如下四种分选方式： AblationSort:预选定义一个荧光阈值，然后对特定细胞杀伤。②CookieCutterSort在用户定义的中心点四周切割Cookies。③QuickSort：对已定义的细胞表列，用Ablation或CookieCutter作分选。④ManualSort：直接使用鼠标控制载物台位置及激光脉冲，并杀灭和分选细胞，进行细胞显微外科，染色体切割和光隐阱等操作。 ConfocalImaging—共聚焦分析，可实现Z轴定量，三维立体图像分析（包括SFP模拟荧光处理法，DP深度投影法和SP文体投影法），以及视点移动动画。
3激光扫描共聚焦显微镜在细胞生物学中的应用
3.1定量荧光测量
ACAS可进行重复性极佳的低光探测及活细胞荧光定量分析。利用这一功能既可对单个细胞或细胞群的溶酶体，线粒体、DNA、RNA和受体分子含量、成份及分布进行定性及定量测定，还可测定诸如膜电位和配体结合等生化反应程度。此外，还适用于高灵敏度快速的免疫荧光测定，这种定量可以准确监测抗原表达，细胞结合和杀伤及定量的形态学特性，以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的准确定位及定量信息。
3.2定量共聚焦图像分析
借助于ACAS激光共焦系统，可以获得生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图像。可得到完整活的或固定的细胞及组织的系列及光切片，从而得到各层面的信息，三维重建后可以揭示亚细胞结构的空间关系。能测定细胞光学切片的物理、生物化学特性的变化，如DNA含量、RNA含量、分子扩散、胞内离子等，亦可以对这些动态变化进行准确的定性、定量、定时及定位分析。
3.3三维重组分析生物结构
ACAS使用SFP进行三维图像重组，SFP将各光学切片的数据组合成一个真实的三维图像，并可从任意角度观察，也可以借助改变照明角度来突出其特征，产生更生动逼真的三维效果。
3.4动态荧光测定
Ca2+、pH及其它细胞内离子测定，利用ACAS能迅速对样品的点，线或二维图像扫描，测量单次、多次单色、双发射和三发射光比率，使用诸如Indo-1、BCECF、Fluo-3等多种荧光探针对各种离子作定量分析。可以直接得到大分子的扩散速率，能定量测定细胞溶液中Ca2+对肿瘤启动因子、生长因子及各种激素等刺激的反应，以及使用双荧光探针Fluo-3和CNARF进行Ca2+和pH的同时测定。
3.5荧光光漂白恢复（FRAP）--活细胞的动力学参数
荧光光漂白恢复技术借助高强度脉冲式激光照射细胞某一区域，从而造成该区域荧光分子的光淬灭，该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散，可通过低强度激光扫描探测此扩散速率。通过ACAS可直接测量分子扩散率、恢复速度，并由此而揭示细胞结构及相关的机制。
3.6胞间通讯研究
动物细胞中由缝隙连接介导的胞间通讯被认为在细胞增殖和分化中起非常重要的作用。ACAS可用于测定相邻植物和动物细胞之间细胞间通讯，测量由细胞缝隙连接介导的分子转移，研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用，以及胞内Ca2+,PH和cAMP水平对缝隙连接的调节作用。
3.7细胞膜流动性测定
ACAS设计了专用的软件用于对细胞膜流动性进行定量和定性分析。荧光膜探针受到极化光线激发后，其发射光极性依赖于荧光分子的旋转，而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性，因此极性测量间接反映细胞膜流动性。这种膜流动性测定在膜的磷脂酸组成分析、药物效应和作用位点，温度反应测定和物种比较等方面有重要作用。
3.8笼锁—解笼锁测定
许多重要的生活物质都有其笼锁化合物，在处于笼锁状态时，其功能被封闭，而一旦被特异波长的瞬间光照射后，光活化解笼锁，使其恢复原有活性和功能，在细胞的增值、分化等生物代谢过程中发挥功能。利用ACAS可以人为控制这种瞬间光的照射波长和时间，从而达到人为控制多种生物活性产物和其它化合物在生物代谢中发挥功能的时间和空间作用。
3.9粘附细胞分选
ACAS是目前唯一能对粘附细胞进行分离筛选的分析细胞学仪器，它对培养皿底的粘附细胞有两种分选方法：（1）Coolie-CutterTM法，它是Meidian公司专利技术，首先将细胞贴壁培养在特制培养皿上，然后用高能量激光的欲选细胞四周切割成八角形几何形状，而非选择细胞则因在八角形之外而被去除，该分选方式特别适用于选择数量较少诸如突变细胞、转移细胞和杂交瘤细胞，即使百万分之一机率的也非常理想。（2）激光消除法，该方法亦基于细胞形态及荧光特性，用高能量激光自动杀灭不需要的细胞，留下完整活细胞亚群继续培养，此方法特别适于对数量较多细胞的选择。
3.10细胞激光显微外科及光陷阱技术
借助ACAS可将激光当作“光子刀”使用，借此来完成诸如细胞膜瞬间穿孔、切除线粒体、溶酶体等细胞器、染色体切割、神经元突起切除等一系列细胞外科手术。通过ACAS光陷阱操作来移动细胞的微小颗粒和结构，该新技术广泛用于染色体、细胞器及细胞骨架的移动。
4、结语
激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学图像分析仪器，与传统的光学显微镜相比，大大地提高了分辨率，能得到真正具有三维清晰度的原色图象。并可探测某些低对比度或弱荧光样品，通过目镜直接观察各种生物样品的弱自发荧光。能动态测量Ca2+、pH值，Na1+、Mg2+等影响细胞代谢的各种生理指标[9]，对细胞动力学研究有着重要的意义。同时激光扫描共聚显微镜可以处理活的标本，不会对标本造成物理化学特性的破坏，更接近细胞生活状态参数测定。可见激光扫描共聚焦显微镜是普遍显微镜上的质的飞跃，是电子显微镜的一个补充，现已广泛用于荧光定量测量，共焦图像分析，三维图像重建、活细胞动力学参数分析和胞间通讯研究等方面，在整个细胞生物学研究领域有着广阔的应用前景。
细胞生长
【摘要】 本文从细胞水平论述了生命生长的三种形式与作用，以及细胞生长与个体生命、生命(医学)科学、生物技术的重要关系。发育生长是生殖细胞全能分化生长，作用是繁衍生命诞生个体，延续物种。
【关键词】 细胞 生长 发育 基因
细胞是构成生命体及进行生命活动的基本单位。每个生命体都是由细胞生长分化而来，细胞生长在生命体诞生、死亡及生命物种延续发展和维护个体生命中均起着重大作用，也是生物科学技术建立及应用的基础，有非常重要意义。现就细胞生长的作用，简述如下。
1 细胞生长形式
细胞在生命活动中，其生长形式有所不同，根据生长作用结果可分为发育式生长、再生式生长和肿瘤式生长。
1.1 发育式生长 发育生长是有性繁殖生物，经两性(雌雄)生殖细胞结合形成受精卵细胞生长分化形成胎儿，并成长为(性)成熟个体的整个生命历程，分为胚胎发育和胚后发育。
胚胎发育是由一个受精卵细胞生长分化出具有不同组织器官能单独生活的胎儿的过程，包括卵裂期、囊胚期，原肠胚期、器官形成〔1〕。胚后发育是由胎儿生长到生命终结(死亡)的整个历程，包括幼年期、青春期、成年期和老年期。
1.2 再生式生长 再生生长是生命体的一部分在损伤、脱落或截除之后重新生长出的过程，分为生理再生和病理再生。
生理再生是生命体在生命活动中，对不断衰老死亡组织细胞的更换补充，如表皮细胞脱落的补充，红细胞死亡的更替等。病理再生又称损伤再生，是对受伤部分组织器官的修复或补偿。根据再生能力分为愈合修复伤口(称愈合)和重新长出缺失部分(器官)，称再生。其再生过程包括创面愈合、再生芽基形成、芽基生长和分化〔2〕。
2 细胞生长的作用和结果
2.1 发育生长 发育生长结果第一步通过胚胎发育生长分化出一个具有生命活动的幼体，即胎儿；第二步由胎儿生长成具有繁殖能力的成熟个体，并继续发育生长新的幼体。同时，成熟个体继续发育生长走向衰老死亡，完成生命历程即生命周期。
发育生长的作用是不断的诞生生命个体、增加群体数量。自然界中大部分生命群体(包括人类)都是由不断的发育生长延续生命，以达到生命不灭的，同时两性结合发育生长也是生物自然选择、杂交进化、个体变异的主要途径。
2.2 再生生长 再生生长作用是保护个体生命，维护机体生命所需正常生理功能。确保幼体(胎儿)发育生长成熟，继续繁衍生命，直至保护生命个体走完生命历程。如生理再生中皮肤再生，保证了皮肤作为机体第一道防线，阻止外界因素对机体的侵害和对机体内脏器的保护作用〔4〕。红细胞不断再生补充凋亡的红细胞，保证了对机体氧的供应和二氧化碳排出〔5〕。白细胞和淋巴细胞的再生在对入侵体内的有害物(病菌)的清除和增加机体免疫力上，均起着重要作用〔5〕。损伤再生中的伤口愈合，在及时有效的防止有害物质通过伤口进入机体，确保血液正常循环，阻止血液大量流失危及生命上具有不可缺少作用。再生在补偿机体因损伤丢失器官免除残疾，功能恢复上有着重要意义，如蜥蜴再生尾〔2〕、蝾螈再生肢体〔6〕。
再生生长除保护生命、恢复功能、为个体生命保驾护航外，还有无性繁殖生命、纯洁物种、减少变异的作用，如水螅出芽生殖、植物扦插、组织培养、动物克隆等。
3 细胞生长条件
细胞生长需要激活(刺激、诱导)使细胞处于生长状态，同时生长还需要在一定的环境条件下进行。主要有足够的营养(包括氧)和适合生长的温度及湿度(水分)。
3.1 发育生长 发育生长细胞激活是通过两性(精卵)结合形成受精卵细胞实现的〔1〕。发育生长分为胎生和卵生，胎生发育生长是受精卵细胞在母体子宫内进行，营养靠母体通过胎盘提供，体温和子宫内的水分就是适合发育生长所需要的温度和湿度。卵生发育生长是受精卵(分体内和体外受精)细胞在母体外进行，营养由卵内卵黄提供，温度靠外界提供。如：鸟类的孵卵、壁虎借助自然环境温度(6～9月份)〔7〕，湿度是卵内具有的水分加外界环境湿度。
3.2 再生生长 再生生长细胞激活是机体组织细胞受到损伤刺激或正常工作细胞程序死亡丢失情况下被激活，营养靠机体血液通过血管循环供给，温度和湿度借助机体环境，生长以机体为宿主。 人类是社会生活群体，在经济全球化的今天，每个人的生活都与社会息息相关。
总之，人类在竞争发展、追求经济利益、占有财富的同时，更应追求和谐健康，人生最大的财富是健康快乐生活100岁。
