Butcher A, Spadoro J: Using PCR for detection of HIV-1 Infection. Clin Imm Newsletter, 1992，12:73－76.Guidelines for the Use of Antiretroviral HIV-Infected Adults and Adolescents MMWR Recommendations and Reports April 24, 1998/47（RR-5）; 42-82.Bayer HIV-1 RNA3.0 Assay （bDNA） Operation manual Rev.2006-07Roche AMPLICOR HIV MONITOR™ TEST Procedure Manual,version 1.5Nuclisens ® EasyQHIV-1 Operation Manual, V1.0-2, 2002-05Fractions of HIV-1 Seropositive Persons by Two Nucleic Acid Amplification Assays, AIDS Research and Human Retrovirus 1993，9:259-265.《HIV-1病毒载量测定及质量保证指南（试行）》 （（中国疾病预防控制中心，2008年2月）全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版 ）
在平时的学习、工作或生活中，大家都接触过作文吧，作文根据体裁的不同可以分为记叙文、说明文、应用文、议论文。还是对作文一筹莫展吗？下面是我帮大家整理的做核酸检测作文，供大家参考借鉴，希望可以帮助到有需要的朋友。
妈妈带着我和妹妹来到体育中心做核酸检测。
虽然现在已经是秋天了，但天气还是跟三伏天似的。大中午的太阳像一个超级大的火球一样，炙烤着大地，阳光是那么强烈，整个世界都笼罩在一片耀眼的光芒之中。
到了体育中心，只见做核酸检测的队伍像一条条长龙，一眼望不到边，每人间隔一米，大家井然有序地排着队，等待做核酸检测。
左等右等，终于轮到我了。我手拿身份证给工作人员登录信息。登记完之后，我就往前走，由另一位医人护人员给我做核酸检测。我打量着眼前这位医护人员，她顶着炎炎烈日，身上穿着密不透风的防护服，只见她拿出一支棉签让我张开嘴巴。这时，我很紧张。医护人员看我很紧张，便安慰我：“检查真不可怕，只是有点痒。”然后，我照着她说的做了。这时，我仔细观察这位医护人员，她被防护服包得很紧，紧得和一个在蒸笼里的一个包子一模一样，她的汗水像豆子般滴下。哦，在这样闷热的如包包子似的医务人员，对待我们却还却还是那样有耐心。她们真了不起。
在这里，我想说：“医护人员们，你们辛苦了！谢谢你们顶着炎炎烈日给我们做核酸检测。谢谢你们！”
一阵阵秋风吹落了金黄的树叶，带来了丝丝寒意，同时也没收了我的健康。看到体温表上37。3度的数字，我的心怦怦直跳，心想：“按照学校的要求，我必须做核酸检测。”
于是，我被衣服包成了一个大圆球和妈妈飞快的来到人民医院发烧门诊。下了楼远远望去在干净明亮的大厅我们看见有三四名小朋友在等待。我走到那个可怕的地方，一看见白大褂就想起了姐姐说的话太吓人了！正好，我透过窗户看见美丽的喷泉，心想：“这应该能让我变得不害怕吧。”但是我刚看了一会儿，就想，“我是小孩儿，应该不会从鼻子里吧。”我自言自语的说。但是，该干啥还得干啥，我只能面对现实。
只见那位医生拿出一个大概有1分米长的棉签，直向我嘴巴冲去，“哦，兴好，兴好，不是从鼻子眼儿里捅到嗓子眼儿里，如果是的话我就该跑了。”我正想着，一边张大嘴巴，当那根又细又长的棉签，捅到我嗓子眼儿那一刻，我都快吐了，那个味儿是真的难受，现在回想起那个味儿还想吐呢，等他把那根又细又长又难闻的棉签拿出来时，我的心情由阴变成了晴，心从紧张到放松，我心想，啊，终于结束“战斗”了，终于不用在难受了。但是啊，我觉得核酸检测并不疼，就是恶心，其他也到没有我想的那么怕。
这件事让我知道了在生活上其实有些事并不像想象的那样可怕，一定要面对现实。
突然爆发的疫情打破了往日的宁静，为防控疫情，烟台市全体市民要做核酸检测。8月4日，妈妈接到了村里的通知，说是明天早上在村广场做核酸检测。听到这个消息，我又惊又喜，心想：做核酸会不会很痛呢？
8月4日傍晚，跟着妈妈到广场排队拿号。我看到敬爱的医护人员，穿着防护服，戴着护目镜和口罩，早就做好了准备。不一会下起了大雨，我们赶紧找地方躲避。一会儿，雨停了，我们回到广场等候。激动的心，颤抖的手，我的心像打鼓一样砰砰直跳。“我的妈呀，做核酸检测疼不疼呀！”我非常忐忑，心里直犯嘀咕。我的腿就像灌了铅一样，一步都不想往前迈，可是医生的检测真是神速，不一会儿就轮到我了。
首先要登记，负责登记的志愿者对我说：“贺玉利，你害不害怕啊？”正在我疑惑之际，我发现原来是我们学校老师在跟我说话，看着穿防护服的老师，顿时我觉得不那么害怕了。登记之后，医生让我坐下，和蔼地对我说：“小朋友，把口罩摘下来吧。”哎呀！把我吓得都忘了摘口罩了，我飞快地摘下口罩。医生又说：“把嘴巴张开，啊——”我照着做了，医生拿出棉棒，向我口中伸去，直达咽部，在喉咙里转了一圈儿，我的喉咙里痒了一下，很快就好了。“小朋友，你可以走啦。”抬起头，看到医护人员浸湿防护服，看到志愿者老师忙碌的身影，我不由得一阵心酸，情不自禁的打了一个庄严的队礼。他们真不容易，我真盼望疫情早点儿结束！
今天是8月19日，妈妈接到了通知，说是明天早上7：45准时到达学校做核酸检测。妈妈告诉了我，我又惊又喜，心想：做核酸会不会很痛呢？但是能和好朋友一起学习，玩耍，能和老师相遇，再痛我也不怕！
一大早我就起来了，听见外面正在下着倾盆大雨，即使再大的雨也阻挡不了我的脚步。我和爷爷打着伞往学校走去。到了学校，我看到了一个小篮球厂，大树的叶子非常茂盛，到了教室，老师说了几句话，就去楼道找家长排队，我站在第十三个，过了一会儿，终于走到了做核酸的地？方了，我往前面看到了医护人员在准备，我快坚持不住了，心里还是特别的紧张，老师告诉我不要害怕，一点儿都不痛，只是拿着棉签往嘴里搅一圈，就好了。轮到我了，医护人员首先拿出一根棉签伸到我的嘴里。搅一圈，然后又拿出来把它放到小瓶子里，最后把它弄断。我感到很恶心，想吐，爷爷说我很坚强！
其实一点儿都不可怕，我希望结果早点儿出来，这样我就能和好朋友一起学习、玩耍，还能跟老师相遇，还能学习更多的知识！
“啊……”你问我为什么要“啊”，接着往下看，你就明白了。
今天一大早，我就被妈妈叫醒了。唉，我的梦还没做完呢！我还想再睡一会儿，但是今天得做第二次全民核酸检测（放假前做了第一次核酸检测），所以我只好慢悠悠地起床。起床后，我想吃完饭再去，妈妈说：“做完核酸检测，再吃饭吧！”于是，我就和妈妈戴上口罩出发了。
来到学校门口，这里已经有许多人在排队了。忽然，一位老奶奶说：“啊，身份证忘拿了！”她这么一说，妈妈才想起来我们也没带证件。“苍天啊，为什么你也忘带了？！”我感叹了一声，赶紧和妈妈回家去拿。
等我们再次来到学校时，人已经所剩无几，我们连忙跑过去，正好十个人。走进校门，只见许多阿姨坐在椅子上，她们是给我们统计信息的。轮到我做核酸检测了。我先张开嘴巴，“啊……”了几声，医生用棉签在我的喉咙里转了几圈，就放进了一个管子里，我有点想吐的感觉。听妈妈说，这些管子都要统一送到城里去做检测，一天以后才能出结果。
但愿这是我们定州最后一次做全民核酸检测，希望病毒早日被消灭，人们重新过上安居乐业的生活。
前段时间郑刚刚经历了一小场千年不遇的暴雨，汛情还未结束，疫情又来势汹汹，让我们的城市雪上加霜，为了能够尽快控制疫情，郑州市全员进行核酸检测。
今天下午，我们一家人也来到了小区的检测点。离检测点还有很远我就看见了一条“长龙”，爸爸妈妈带着我连忙加入了检测大军。我抬头一看，根本就看不到队首，心想：这要等多长时间才能轮到我呀！
10分钟过去了，30分钟过，一个小过去了还没有轮到我，我等得不耐烦了，于是就问爸爸：“什么时候到我们呀？我都快热死了，站了这久我又累又热，难受死了，我不想检测了，咱们回家吧。”爸爸看了我一眼说：“不行疫情当前，我们要严格遵守国家规定，这也是为抗疫做出自己的贡献。”我点了点头，又继续等待。
又过了半个小时，终于轮到了我。我坐在座位上，看到了身穿防护服的白衣天使，突然想起了我刚才的抱怨，羞愧万分。炎炎烈日这些白衣天使牺牲了自己的休息时间，穿着密不透风的防护服为我们检测，她们不累吗？她们不热吗？我有什么理由抱怨呢？她们才是最辛苦的。做完检测我站了起来向她们深深地鞠了一躬说道：“您们辛苦了，谢谢！”
回到家，爸爸表扬我，说我长大了，懂得感恩了。疫情当前，人人有责！作为小学生应该积极响应国家号召，遵守国家规定，就是为抗疫做出贡献。
今天早上，妈妈说要带我去做核酸检测，我有点紧张，因为我听说核酸检测要戳到我的喉咙。
我们来到检测点，人非常非常多。妈妈说，核酸检测其实就是用一根棉签往嘴里一搅就好了，很简单的。我一听，原来就是在喉咙里捣鼓几下嘛，有什么好怕的，心里顿时安定了许多。
马上要轮到我了。我看到前面一个人正在做核酸检测。医生刚把棉签伸进她的嘴巴，她就往后一缩。医生又把棉签伸进去，她还是一缩，也不知道最终医生到底有没有采到样。我想，我要做得更好一点，做一个大人都佩服的榜样。于是，我就大踏步走向前，很快就轮到我了。
可是想起来容易做起来难，我还是紧张起来了。医护人员拿出一根棉签，要往我嘴里塞。我感觉这根棉签像一条毒蛇要钻进我的嘴里。“别怕！”我一边默默给自己打气，一边张开了嘴巴。一开始，棉签在我的舌头根部搅和着。我平时有个小癖好，喜欢用舌头在自己的嘴巴里卷来卷去，医生搅和的这个地方我平时好像都卷过，我感觉不怎么难受，稍微有点梗，就像感冒时鼻腔堵塞的那种感觉。接下来，就来点猛料了。棉签突然往我喉咙里一戳，我感觉我的后脑勺好像被戳出了一个洞。正当我快承受不住的时候，医生把棉签拿了出来。呀，终于好了，我松了口气。我看到医生在棉签上涂了点红药水，放进了一个试管里，大概是要拿到医院里去做检查吧。
唉，虽然核酸检测没有我想象中那么恐怖，但是也有点儿难受的。真希望疫情赶快过去，让我们能开开心心地过一个暑假。
5月17日，早上八点，外婆带着我去做核酸检测，地点在金水农场幼儿园。
我们来到幼儿园，就发现一条长龙似的的队伍，从幼儿园的办公室门口一直延伸到幼儿园的大铁门，我们跟着队伍排在后面。每个人都要站在同一条黄线上，并且要保持一米的距离。
大约站了二十分钟的时候，一位穿着防护服的医务人员来到我的身旁，核对我的身份信息，给我一张写着我名字的小纸条。另一位医务人员用消毒液在我身上喷了一下。
又过了五分钟的时刻，终于轮到我做检测了。只见一位穿着防护服的医务人员让我把身份证给她看，她核实信息之后，就把身份证还给了我。还递给我一个小药瓶和一根棉签。
接着，一位医生叫我坐在椅子上，仰起头，张开嘴，她用那根棉签在我口腔里刮了几下，核酸检测就做完了。
一开始，我很害怕，做完之后，才发现并没有我想象中的那么可怕。
在回家的路上，我想：这么热的夏天，我就只穿着一件单衣服，都感到很热，那些穿着像大熊猫的医生们，一定会很难受的。长大以后，我也要当一位医生，治好病人，保护大家!
第一次做核酸检测，真兴奋！
妈妈一大清早就去当志愿者了，我起床后只喝了一杯牛奶，吃了几片面包，然后跟随爸爸去他们学校做核酸检测。由于学校在村里，自然少不了走山路。
公路像一条带子，沿着山坡，或者就搭在坡上，车子一会儿左拐弯，一会儿右拐弯，一会儿上坡，一会儿下坡，很颠簸。车子前行，只见一座一座山躲到了我的后面，一、二、三，我默默地数着山，不一会儿就睡着了……
车停了，我被惯性震了一下，顿时清醒起来。我打开车门，深吸了一空气，农村的气息好清爽！周围都是矮矮的居民房，一个院子一户人家，像极了老家村里的样子，太亲切了。我不觉兴奋起来，可我要保持冷静，因为爸爸顺便稍上了同事家的老奶奶和一个小女孩，要注意形象。我双手插兜，挺胸抬头，佯装自若，尽量把自很己装得很帅很酷。
今天村里要检测的.人不多，我们很快排上了队。排在前面的人也就有五六个。医护人员的操作真熟练，从录入信息到咽拭子检测不到三分钟，挺快的。可是不知为什么检测突然中止了，我向前瞄去，只见几个医护阿姨正拿着手机点着一个系统，可半天也没动静。于是，爸爸上前去帮助，掏出手机登录那个系统，可还是不行，听说是登录用户太多，系统正在抢修升级。此刻，我仿佛看到了很多网络工程师忙碌的身影。
我前面只剩一个人了，虽然近在咫尺，可又仿佛遥隔千里！没办法，等，再等，还是没办法。很快到午饭时间了，大家只好作罢，各自离去。
爸爸带我到了学校食堂，狼吞虎咽地吃了满满一大碗面条。吃完了，我就去找那个女孩儿玩，不一会儿，我们熟悉了，我们玩捉迷藏，跳方格，玩健身器材，玩得很开心。
下午时间到了，医护阿姨又来了，系统也修好了，不一会儿就到轮我了，我坐在椅子上，仰头张嘴，喉咙里发出“啊……”阿姨拿着一根像棉棒的细长木棍，在我的嗓子眼里桶了几下，顿时感觉嗓子里翻江倒海，恶心想吐！眼泪也瞬间涌出了眼眶，不疼，有点难受而已。“好了”，只见医护阿姨把细棍子折断，有棉的一截给放进了玻璃管里。
啊！终于完了，再回头看看医护阿姨，她们依旧在忙碌，医护阿姨可真伟大！
疫情期间“核酸检测”是我们经常听到的一个词，那你们知道做核酸检测时，是会感到舒服，还是会感到疼痛呢？是用什么工具进行检测呢？会不会打麻药呢？今天，就让这个刚刚做完检测的我，给大家提个醒吧！
最近鼻子总是一到晚上睡觉就容易堵塞，呼吸不畅，妈妈今天决定带我去医院做个检查。因为需要做鼻腔镜检查，必须先做核酸检测，没有问题才能去做进一步检查，我怀着一颗既忐忑又期待的心跟着妈妈去缴费。不一会就来到专门做核酸检测的小帐篷前排队。
“韩欣格来了吗？”随着工作人员的叫喊声，我也被妈妈“推”到了医生面前，其实我一开始也跟别人一样满怀期待地在小帐篷前排队等候。但当我看到前面检测的人满脸恶心地从帐篷里出来时，我那期待的眼神在下一秒就凝固了。“到你啦！快过去啊！”妈妈把我往前推了推，“这个……我……”我开始犹豫了，可妈妈的力气就像大力水手，一下子就把我送到医生面前，我知道，这场灾难甩不掉了。
只见一位医生冲我微微一笑，但在我心里，这个微笑让我浑身一颤。随后她拿出一根长长的棉签，对我保证地说：“一定不会痛的，我会很轻哟！”可在我心里，长长的棉签仿佛一根长针，迎接我的必定是强烈的疼痛感，我身体紧绷的站着。一切准备就绪后，那位医生拿起“针”慢悠悠地伸进我的喉咙，不停地搅动，搞得我满脸通红，十二分的难受，恶心的感觉慢慢向我袭来。可那医生完全没有停下来的意思，哎，算了，忍不住了“呕！呕！不行了——”看着我那狼狈的样子，妈妈也是哭笑不得。
这就是我惊心动魄的全部检查过程，现在，你们还对核酸检测感兴趣吗？
莆田，敲响了抗疫的警钟，还启动全市核酸的方案。这个方案一确定下来，我家楼下和小区里的人，不管是老幼妇孺都从四面八方涌向马路。那空荡荡的马路一眨眼的工夫就排起了一条长龙。于是我们决定明天再去做核酸检测。
可到了晚上凌晨一点左右，正在睡梦中的我被一个电话吵醒了，是姑姑打来的电话。她说：“赶紧起床下来做核酸，这个时候人不会多。"于是我揉了揉眼睛爬下了床，很不情愿地下楼来到了马路上。一看，虽然人没有白天那么多，但还是排着一条“龙”。刚排没一会儿，我和妹妹就开始有些不耐烦了，妹妹一直吵着要睡觉，这时妈妈把手机给了她，并让我边排队边照看妹妹，妈妈就飞奔到楼上搬了把椅子下来，让我和妹妹坐在旁边等待。
不知过了多久，队伍慢慢地移动到了学校门口，工作人员要求十人一组出示健康码才可以入校。进入校内，我们来到第一个帐蓬前，工作人员要求将身份证放在胸前拍照登记，随后我们便来到护士面前，我有些紧张地四处张望，有正在排队的，有在维持程序的，还有一些不肯配合哭闹的幼小儿童……终于到我了，只见穿着密不透风的防护服的护士将一根一次性的棉签伸入我的嘴里不停搅动后，拿出来放入装着药水的瓶子里折断，我和妈妈、妹妹做完核酸检测便火速离开了现场。
回家路上，我边走边想，这些护士太伟大了！她们冒着危险、不眠不休、加班加点地给我们做核酸检测，我才是半夜排了一会儿队都不耐烦，可她们还要从早忙到黑地为我们做核酸检测啊！我真想对她们说:“谢谢您们！您们辛苦了！”
当你第一次做一件事之前，可能会觉得很难，但在你真正去做的时候，可能会发现并没有想象中的那么难。
记得上学的一天，全体学生要核酸检测。我是第一次做核酸检测，所以并不知道核酸检测是怎样的。我便提心吊胆，想着核酸检测是什么样？：打针？吃药？量体温？……这些我并不害怕，但是打针和吃药让我有一点点紧张，想着想着，我变得又害怕，又紧张！
排队的时候，我紧张地在原地踱步，突然看见一间教室里有几名“白衣战士”不知道，在给学生干什么？有几个学生从后门走出去，边走边擦眼泪。啊！他们一定非常痛苦吧？他们到底遭受了怎样的痛苦呢？走进教室，我的心“怦怦，怦怦”的打起鼓来，脚步也变得沉重了，不敢再往前移，真想打退堂鼓。
这时，一名“白衣战士”对我说：“小朋友，过来。”他那没有学生了，我坐在椅子上，张大嘴巴，只感觉喉咙痒痒的。不一会儿，“白衣战士”就说好了，耶，终于好了！我高兴地回到了教室，原来核酸检测就一下子，几秒钟而已，把嘴巴张大，说个“啊”字就结束了，而且一点也不疼！
我明白了一个道理：一些事情看起来很难，但只要勇敢去面对，就会发现这并没有自己想象中的那样可怕。
从十五号起，小区的广场上就总有一长条队伍，也不知到是干什么的。后来我才知道楼下在做核酸检测。
今天是周末，所以我还在床上睡懒觉。睡到了十点多才起来。我赶紧洗漱了一下就来吃早餐了。刚吃完早餐，我们就接到了爸爸的电话。“吴佳璇，赶紧叫妈妈他们准备准备，马上就要去做核酸检测了，快点换好衣服下楼吧!”我跟妈妈报告：“妈，爸爸叫我们下楼做核酸检测。”“那你先叫弟弟去换衣服，我马上好。”
我们做好了准备，拿上身份证就下楼了。在去核酸检测的路上，我问妈妈：
“妈，啥是核酸检测啊?”
“就是拿一根很长的棉签在你喉咙里转来转去。”
“那会不会把我弄吐吧!”
“有可能。”
听到这里，我有点害怕了，因为我以前一吐就要把胆汁也吐出来，嘴里还非常苦，所以我非常怕我吐。
我们来到“长龙”的“尾巴”那里，排了进去，后面还有人不断的排过来。队伍中的人们看上去很轻松的样子。我却表现得很沉重，因为我从来没有做过核酸检测。眼看我马上就要成为“龙头”了，因此，我非常紧张。我只好找吴佳烨(我的弟弟)玩“石头剪刀布”来缓解。我俩玩的很开心，一下就把紧张抛到了九霄云外。排着排着，我们来到了一个棚子底下妈妈在帮我们登记。我又开始紧张了：完了完了，马上要做核酸检测了我肯定要吐了，到时候可不要丢人啊!妈妈带着我们来到检测处，我拿着一个小瓶子，想着：它是干嘛的?难道是放样品的?还是抽血的?我来到了另一个棚子下，棚子下有一个医护人员，旁边有一个牌子，上面写着“二号检测处”。由于我害怕，就让弟弟先去检测。弟弟出于好奇，就真的走过去检查，没有犹豫一下。只见医务人员拿出了一根比普通棉签长两倍的棉签伸到弟弟嘴里搅，然后又拿出来，把它放在小瓶子里，然后把它弄断。我看弟弟一下就做完了，我也去做。也就是把棉签伸到喉咙里转。然后就是喉咙有点干。
其实核酸检测也不是很恐怖，只不过是我的心理作用而已……
【综述】
几种用于发现未知病毒核酸序列的技术及其应用
翁康生
病毒是引发人类传染性疾病的主要病原体之一, 它们极
大地威胁着人类健康。目前还存在人类尚未认知或新出现的
病毒, 随时可能严重危害人类健康安全〔1 - 3〕。及早地发现,
鉴别未知的或新出现的病毒, 是有效的预防和控制的先决条
件之一。因此, 建立、储备、改良、发展、乃至创新应用于
发现、鉴别未知或新出现病毒的技术方法是十分必要的。
近20 多年来, 常采用传统的微生物学技术方法和现代分
子生物学技术方法相结合的途径, 发现和鉴别未知病毒。通
过细胞培养的方法分离病毒、电镜观察、用已知病毒的抗血
清建立的免疫学方法作排他性检测、用已知病毒核酸序列建
立的PCR、杂交等方法, 作特异核酸序列的检测、用分子生物
学技术获得未知病毒核酸序列, 查询基因数据库, 检出并确
定未知病毒基因组序列, 最终发现鉴别出未知病毒。
对于无法用细胞分离培养的未知病毒, 有的采用免疫学
与分子生物学技术相结合, 筛选获取病毒特异抗原编码基因
的克隆, 进而发现鉴别出该病毒。更多的则是采用相应的分
子生物学技术, 从被检样品中发现获取未知病毒的核酸序列,
进而发现鉴别未知病毒。无论未知病毒是否可以用细胞培养
分离, 最终对其基因组序列的测定分析, 是鉴别和判断的决
定性依据之一, 而获取未知病毒的核酸序列是前提条件。
从少量样品中, 从高度复杂的宿主细胞核酸物质中, 分
离、扩增、获取足够量的无基因序列资料的未知病毒的核酸
片段, 供进一步克隆、测序、生物信息学分析, 是用分子生
物学技术发现、鉴别未知和新出现病毒的关键之一〔4〕, 也是
最终测定分析, 拼接出未知和新出现病毒基因组序列的瓶颈
步骤。病毒所携核酸物质有DNA 和RNA 之分, 可采用的技术
方法也有所不同, 现将有关技术与其应用作一简介, 以供
参考。
1 代表性差异分析法
代表性差异分析法是为寻找分析两个生物样品复杂的基
因组间有何差异而发展建立起来的分子生物学技术方法, 并
不断得到演化, 发展和应用。病毒感染宿主细胞后, 与未感
染的同类细胞相比, 二者核酸物质间的差异主要在于是否存
在病毒核酸。消减去二者核酸间相同序列的背景部分, 扩增、
比较、选取余下可能存在差异的部分, 进一步分析以发现未
知病毒的核酸序列。病毒的核酸结构各有不同, 可选用相应
的代表性差异分析法, 见表1 。
111 DNA 代表性差异分析法(DNA Representation difference
analysis , DNA RDA)
此方法是Lisitsyn 等〔5〕利用核酸消减杂交技术〔6〕、PCR 方法
和双链DNA 热变性后互补链退火复性的二级动力学原理〔7 - 8〕
作者单位:上海市疾病预防控制中心 200336
表1 病毒核酸类型与各代表性差异分析法的选用
病毒核
酸类型
DNA RDA c DNA RDA
非rRNA 序列
6 核苷酸引导
c DNA RDA
ds DNA 线状√
ds DNA 环状√
ss RNA polyA( + ) √
ss RNA polyA( - ) 3 √
ds RNA polyA( - ) √
3 负链ss RNA polyA( - ) 视病毒在宿主细胞的转录机制而定。
而建立的。方法中将需分析的样品DNA(Test DNA ,T- DNA) 和
对照DNA(Driver DNA ,D - DNA) 设为二组,分别用同一种限制
性内切酶酶切处理,并接上5′端去磷酸化的人工接头,补齐接
头后,加入与接头序列互补的引物作PCR 扩增。切除扩增产物
上的人工接头后,切出的T - DNA 连上第二种人工接头,变性
后与过量的变性D - DNA 杂交。通过杂交,消减去T- DNA 中
与D - DNA 中同源的核酸序列,而只存在于T - DNA 中的靶序
列DNA(Target DNA) 则自我退火复性,其两端连有第二种人工
接头。加入与第二种接头互补的引物作PCR ,只有靶序列DNA
呈指数扩增,因而得到进一步富集。进过如此重复的几个轮回
后,以电泳检测比较T- DNA 和D - DNA ,将T- DNA 中呈现的
差异部分作分离,克隆,序列分析。
Lisitsyn 等以10μg 人淋巴细胞基因组DNA 作为D - DNA ,
在相同的人DNA 中加入相当于单拷贝量的120 pg 腺病毒DNA
作T- DNA。以此作为实验模型,用DNA 代表性差异分析法成
功的寻找、鉴定出外加入的腺病毒DNA 序列。应用此技术,
Chang 等〔9〕在艾滋病相关的卡波西肉瘤(Kaposis Sarcoma) 中发现
一段类似人类疱疹病毒的基因, 并由此发现一种新的病毒
HPV8。以后人们又以此技术发现鉴定了HPV6、TTV 病毒、黄热
病毒样基因组、MDV 等〔10 - 13〕DNA 病毒。
112 cDNA 代表性差异分析法(cDNA Representation difference
analysis , cDNA RDA)
Hubank 等〔14〕针对mRNA 所含序列相对简单的特点,提出
了cDNA 代表性差异分析法。它的基本原理与DNA RDA 相同,
主要不同在于,采用识别4 核苷酸序列的限制性内切酶,它的
识别位点在mRNA 反转录成的cDNA 中出现的频率更高,平均
酶切片段长度约256 bp ,保证了cDNA 序列群中绝大多数序列,
至少被切出一个片段可扩增,供差异分析,分离鉴定。
cDNA RDA 技术相对经济,可高效灵敏地用于非常少的起
始材料而获得结果〔15〕。具有polyA( + ) - RNA 病毒,其核酸可
类似于mRNA 分离纯化,因此可应用此技术。利用cDNA RDA
技术,发现鉴定了TiV、MenV ,等〔16 ,17〕RNA 病毒。
113 非rRNA 序列6 聚核苷酸引导反转录的cDNA RDA
中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13 ·317 ·
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polyA( - ) - RNA 病毒,其核酸物质不似于mRNA ,需和宿
主细胞总RNA 同时分离,并用随机引物作反转录。因为宿主细
胞总RNA 中rRNA 约占80 % ,由于竞争反应、靶序列信号被湮
灭等原因,从这样的总RNA 抽提物中,用随机6 聚核苷酸引物
引导反转录的cDNA RDA 技术,发现鉴别polyA( - ) - RNA 病
毒核酸序列是困难的。Endoh 等〔18〕罗列了6 聚核苷酸所有可
能的排列组合,共计4 096 个序列模式,以大鼠18S、518S、28S 等
rRNA、微卫星重复序列、SARS - CoV、BI - 3 病毒等的序列数据
为模型,筛选出在rRNA 序列中出现频率极低或不出现的6 聚
核苷酸序列模式共96 种。将这些序列分别合成并混合后,称
之为非rRNA 序列6 聚核苷酸引物。生物信息学分析96 种序
列模式在哺乳动物病毒科具代表性的1 791 个病毒基因组序列
中出现的频率,数据表明,非rRNA 序列6 核苷酸引物可引导绝
大多数病毒的cDNA 合成。分别用非rRNA 序列6 聚核苷酸引
物和随机6 核苷酸引物作cDNA 反转录效率、cDNA RDA 试验,
结果表明,二类引物对人工合成的RNA (二类引物在其序列中
出现的频率相似) 反转录效率几乎相等,而前者对细胞总RNA
反转录效率远低于随机引物。用二类引物作cDNA RDA ,检测
人工合成的RNA ,前者灵敏度是用随机引物的30 倍。在模拟
实验中用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物引导反转录,串联cDNA
RDA 技术,检测鉴别出感染细胞的BI - 3 和SRAS - Cov 核酸序
列片段。
此方法能从1μg 总RNA 中检测出3 ng 的外来RNA ,其检
测灵敏度不及普通的PCR 检测方法,但对于检测鉴别在宿主细
胞中复制,但不知其基因序列的poly A( - ) - RNA 病毒而言,也
是一个可选择的方法。
114 抑制消减杂交
cDNA RDA 技术结合消减杂交和PCR 抑制作用〔19〕的技术
原理,Diatchenks 等〔20〕等发展出了抑制消减杂交技术( suppression
subtractive hybridization ,SSH) 。与前两种RDA 技术不同点在于,
SSH 技术将内切酶酶切处理的T - cDNA 分为两份,分别接上
不同序列的去磷酸化的接头1 和2 ,分别于过量的D - cDNA
作第一轮杂交。杂交过程中两组中的单链T - cDNA 浓度趋
同,T- cDNA 中的非靶序列单链cDNA 与D - cDNA 中相应序列
形成杂交双链而被消减, T - cDNA 中差异表达的单链cDNA
被显著富集。合并一轮杂交物,加入过量变性D - cDNA ,作第
二轮杂交。合并的二组份一轮杂交物中剩下的趋同化、经消减
杂交后的单链T - cDNA 能互补杂交, 可以形成: 原组内
T- cDNA 单链间的杂交、T - cDNA 与D - cDNA 单链间的杂
交、二组间T- cDNA 单链间的杂交。补齐杂交反应后双链cD2
NA 末端,用分别与接头1 和2 的外侧部分序列互补的寡核苷
酸为引物,作PCR 扩增。二组份间T- cDNA 互补单链杂交物,
因两端分别具有接头1 和2 ,可被指数扩增;T - cDNA 与D -
cDNA 杂交物和剩余单链T- cDNA ,因一端具接头序列,被线性
扩增;而同组间T- cDNA 杂交物两端具反转重复长序列,因抑
制性PCR 效应,在PCR 反应循环中分子内退火形成稳定的“锅
柄结构”〔19〕而不被扩增。因此,SSH 技术通过二轮消减杂交和
抑制性PCR 特异扩增,使假阳性大大降低,提高了检出低丰度
靶mRNA 的灵敏度。
Hu 等〔21〕应用SSH 技术,结合反转录酶的模板切换(tem2
plate - switching) 功能, 以HCV RNA 阳性血清体外感染的人
MOLT- 4 急性淋巴母细胞白血病T 细胞系为模型,通过反转录
合成全长cDNA、抑制性消减杂交、消减的cDNA 文库构建、反相
斑点杂交筛选,在被筛的96 个克隆里,T- cDNA 探针杂交呈特
异阳性的16 克隆中,序列分析后得到4 个插入HCV 序列的
克隆。
2 非特异多重引导滚环式扩增法
乳头瘤病毒、痘病毒等,其基因物质为环状DNA 分子。在
事前未知基因序列的情况下,发现和鉴别这类病毒核酸序列还
可选择非特异多重引导滚环式扩增法(multiply primed rolling -
circle amplification ,RCA) ,扩增、分离、获取其基因片段供进一步
分析。
自然状况下,环状DNA 经常以滚环方式进行复制。Dean
等〔22〕应用随机6 聚核苷酸作引物,加入φ29 DNA 聚合酶,以质
粒DNA 和噬菌体DNA 为模型,建立了多重引物引导的滚环式
扩增法。φ29 DNA 聚合酶可长距离( > 70 000 nt) 地结合于DNA
模板,进行链置换DNA 合成。而随机6 聚核苷酸引物可多位
点的与单链环状DNA 互补复性。在φ29 DNA 聚合酶作用下,
以随机引物引导,合成与模板互补的DNA 链。当合成链延伸到
与模板结合的随机引物5′端时,在φ29 DNA 聚合酶的链置换活
性作用下,下游被延伸的随机引物链被“甩”出模板。而上游的
延伸链继续在环状模板上复制合成。同时,被从单链环状模板
上“甩”出的互补链,又成为新的模板,随机引物与之结合,在
φ29 DNA 聚合酶作用下,继续以枝杈的形式进行链延伸和链置
换,最后以双链DNA 串联体形式释放。用此法可使1 ng 纯
pCU18 环状DNA 模板延展式地扩增至107倍。
Rector 等〔23〕以此原理建立了不依赖已知的特定基因序列
(非序列依赖性) 的多重引导滚环式扩增环状DNA 病毒基因组
方法,并应用其扩增获取了HPV 16 的基因组DNA。在接近实
样的试验样品中,由于稀释倍数和环状DNA 分子较大等原因,
将HPV 16 基因组DNA 扩增了214 ×104 倍。
3 病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增
病毒核酸可包裹于病毒外壳内,病毒的蛋白外壳或脂膜对
病毒核酸具有保护作用。而病毒颗粒具有不同于细菌或其他
真核细胞的理化特性。利用这样的特点Allender 等〔24〕和Stang
等〔25〕各自建立了病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增
方法(sequence - independent amplification) 。两种方法的共同点在
于,依据病毒颗粒小、具一定密度,用0122μm 滤器过滤、或再串
上超速密度梯度离心,从样品中分离出病毒颗粒,DNA 酶酶解
游离的DNA ,裂解病毒颗粒,抽提获取较纯的病毒颗粒相关
核酸。
Allender 等〔24〕借鉴RDA 原理,对病毒颗粒相关核酸用限制
性内切酶酶切后,作非序列依赖性单引物PCR 扩增( sequence -
independent single primer amplification ,SISPA) :将抽提获取的DNA
或RNA 分别补齐,合成第二链DNA ,或反转录,合成双链cDNA。
限制性内切酶酶切后,酶切片段两端连接一种接头,并以与接
头同序列的单一寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。扩增产物进一
步克隆与序列分析。用此法检验HBV 阳性血清和GBV - B 阳
性血清样品,结果在相当于106/ ml 个基因组拷贝浓度的50μl
样品中,可重复试验检出相应的病毒基因片段。
Stang 等〔25〕则在得到双链DNA 或双链cDNA 后加入k - 随
机引物,此种引物5′端含有20 个固定序列的核苷酸,3′端则有
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MNNMNM6 核苷酸随机简并序列。与变性模板退火时,6 核苷
酸随机简并序列随机地与模板相应序列互补退火,在T4 DNA
聚合酶作用下作链延伸。然后在延伸产物中加入k - 随机引物
中固定序列部分的20 寡核苷酸作引物,进行PCR 扩增。扩增
产物电泳分析、克隆、测序。用此方法检验由实时- PCR 定量,
包括病毒颗粒相关核酸及游离核酸在内的病毒基因组拷贝数
为109/ ml 的Cox - 3 和MAV - 1 培养物。前者的12 克隆中,
9 个克隆插入有肠道病毒的四个不同区域的同源基因片段;而
6 个MAV - 1 中分离的克隆内,5 个含有99 % 同源MAV - 1 基
因片段。
基于病毒颗粒分离纯化、DNase 处理、病毒颗粒相关核酸的
非序列依赖性PCR 扩增,获取、鉴定未知病毒的基因片段,尽管
灵敏度不够高,但其实验时间较短,步骤相对简单,对于病毒拷
贝数高,时间紧急的样品鉴别,是较适宜的一套方法。
病毒的种类、结构、特性多种多样,感染病毒后需要检验的
样品又各不相同,因此用于发现鉴别未知病毒的核酸序列的技
术,也不是固定不变和完全通用的。以上的技术方法各有优缺
点和适用范围。而针对扩增获取未知病毒基因组序列片断,这
一发现鉴定未知病毒的分子生物学技术的要点或瓶颈,必然还
会有新的改进、创新技术出现,将会更快、更灵敏、更简便、更准
确的发现鉴别未知病毒。
参 考 文 献
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1、打开微信，进入核酸表格填写。
2、输入姓名和（S-F-Z）信息。
3、输入地址和核酸检测时间。
4、输入核酸检测结果信息。
5、选择采集时间，点击提交即可。
6、核酸检测的物质是病毒的核酸。核酸检测是查找患者的呼吸道标本、血液或粪便中是否存在外来入侵的病毒的核酸，来确定是否被新冠病毒感染。因此一旦检测为核酸“阳性”，即可证明患者体内有病毒存在。
不要。核酸检测的物质是病毒的核酸，常说的核酸检测是指对新冠病毒进行核酸检测。其学校核酸检测不需要1200字，只需要把起因，过程与结果写出即可，写不写1200字没什么影响。起因是指事情发生的原因。
