浙江科技学院毕业设计（论文）、学位论文
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细菌纤维素高产菌的筛选及培养条件优化
学生姓名：马书勤 指导教师：魏培莲
（浙江科技学院生物与化学工程学院）
摘 要：细菌纤维素是一种新型微生物合成材料，在食品、医药、纺织、化工等方面有着巨大的应用潜力。本论文以从小和山市场购买的袋装醋、水果以及浙江科技学院校内采集的土壤为筛选原料，经过菌种的富集培养,采用稀释涂布分离法反复筛选，从久置的醋中分出了一种菌株BV02。该菌株经静态培养，可产生不溶性的凝胶膜, 通过纤维素酶水解实验，初步确定其发酵产物为纤维素。并探讨了接种量、种龄、初始pH值和发酵周期对细菌纤维素产量的影响，以确定静态培养发酵生产细菌纤维素的条件。结果显示，菌株BV02的静态培养发酵生产细菌纤维素的培养条件是：接种量为10％、种龄为24h、发酵周期7d、发酵温度30℃、初始pH值最适范围是6.0。
关键词：细菌纤维素；菌株筛选；鉴定；静态培养；发酵条件
Screening of high Cellulose-Production Strain and Optimization of culture conditons
Student’s name: MA Shu-qin Advisor: WEI Pei-lian
（School of Biological and Chemical Engineering Zhejiang University of Science and Technology）
Abstract: The bacterial cellulose is widely appllied in food, medicine, textile and chemical industry as a new biosynthetic materia1. This article use some fruit and bagging vinegar brought from market in Xiaoheshan and soil collected in Zhejiang University of Science and Technology as screening material, after enrichment culture and repeated screening by diluting and spreading method, strain BV02 with stable productivity from vinegar was obtained. Through static culture, it can form insoluble gel-like cellulose in the liquid, The main component of gel-like cellulose by BV02 was confirmed to be cellulose. Investigating the fermentation conditions, the results showed that the static fermentation condition of BV02 was 10％ of inoculum size, 24h of seed age, fermentation temperature 30℃, optimal initial pH 6.0 and culture time 7 days.
Key words：Bacterial cellulose; Strain screening; Identification; Static cultivation; Fermentation condition
目 录
中文摘要............................................................Ⅰ
英文摘要............................................................Ⅱ
目录................................................................Ⅲ
1 绪论 1
1.1 细菌纤维素的介绍 1
1.1.1 细菌纤维素的结构和特点 1
1.1.2 合成纤维素的菌属 2
1.1.3 细菌纤维素的生物合成途径 2
1.1.4 细菌纤维素在国内外的应用 3
1.2 菌种鉴定 4
1.3 菌种保藏 5
2 实验部分 5
2.1 实验材料 5
2.1.1 菌种来源 5
2.1.2 培养基 5
2.1.3 仪器与试剂 6
2.2实验方法 7
2.2.1 菌株筛选 7
2.2.2 培养方法 7
2.2.3 细菌纤维素膜的处理 7
3 结果与讨论 9
3.1 菌株筛选结果 9
3.2 纤维素检测 11
3．2．1 纤维素酶水解法 11
3.2.2 定性观察纤维素 11
3.3 培养基组成的优化实验 11
3.3.1 不同碳源对产膜量的影响 11
3.3.2 不同氮源对产膜量的影响 12
3.3.3 乙醇对细菌纤维素产量的影响 13
3.4 培养方式的确定 14
3.4.1 接种量对发酵的影响 14
3.4.2 种龄对发酵的影响 15
3.4.3 初始pH值的确定 15
3.4.4 发酵周期的确定 16
3.4.5 小结 17
3.5 菌种初步鉴定 17
3.5.1固体培养特征 17
3.5.2 液体培养特征 17
3.5.3 革兰氏染色后结果 19
3.5.4 芽孢染色结果 19
4 总结与展望 20
致谢................................................................21
参考文献............................................................22
1 绪论
1.1 细菌纤维素的介绍
纤维素是地球上最丰富的碳水化合物[1]，也是造纸、纺织、生物降解材料、医药、食品添加剂等工业的重要生产原料。目前，人类获取纤维素的途径主要分为两类：一类是天然合成，即通过植物、微生物的光合作用；另一类是人工合成，即将纤维二糖的氟化物经酶催化合成，或者将新戊酰衍生物开环聚合生成。但是，无论是植物合成的，还是人工合成的，它们都不能很好的满足人们的要求。植物合成的天然纤维素，含有50～60％的以木质素为主的非纤维类物质[2]，要使用大量化学物质在高温下才能除去，导致大量难处理的废水生成，对环境造成严重的污染；而人工合成的纤维素聚合度较低，难以达到高结晶度、高整齐度的织态结构。因此如何有效提高纤维素纯度、积极寻求新的纤维素来源就成为纤维素科学迫切需要解决的课题之一。
近年来的研究表明， 某些细菌能以异养方式产生胞外细菌纤维素，其结构与天然纤维素非常相似，都是由葡萄糖以β-1,4-糖苷键连接而成的高分子化合物。与自然界中存在的植物纤维素相比, 具有纯度高、结晶度高、重合度高、吸水性强、抗张强度好、生物适应性强等独特的性质，作为一种新型的生物材料可广泛地应用于食品、医药、化工和精纺等多个领域。
1.1.1 细菌纤维素的结构和特点[3]
细菌产生的纤
维素是Ⅰ型，是由位于细胞壁上的约有50～80个孔往外分泌纤维素，先由10～15条直链多糖聚合成1.5nm的胶状聚合物，然后再由上述聚合物形成走向与菌体长轴平行的纤维束，纤维束进一步伸长，束间由氢键相互连接，多束合并形成一根长度不定的菌纤维丝带[4]。用电镜观察到细菌纤维素由独特的束状纤维的宽度大约为l00nm，厚度为3～8nm，直径一般为0.01～0.1/μm，每一束由许多微纤维组成，而微纤维又与其晶状结构相关。
细菌纤维素具有如下独特的性质。(1)高持水量(或称高亲水性[5])。微生物纤维素的纤维直径在0. 01μm～0. 1 μm 之间, 它的表面积是植物纤维素的300 倍, 因此它就具有比植物纤维更强的吸水性、粘稠性,它能结合比自身干重大60 ～700 倍的水。(2)极佳的抗撕强度和形状维持能力。微生物纤维素的弹性模数为一般纤维的数倍至10倍以上，并且抗撕强度高。微生物纤维素膜的抗撕能力比聚乙烯膜和聚氯乙烯膜要强5倍。(3)高结晶度、高纯度、高重合度。(3)超细(纳米级)。(4)有较高的生物适应性和良好的生物可降解性。(5)生物合成时的物理性能的可调控性[6]。微生物纤维素在培养过程中, 可通过调节培养条件得到各种物理性能不同的纤维素。
1.1.2 合成纤维素的菌属
细菌纤维素(Bacterial Cellulose，Bc)最早是在1886年由英国科学家Brown发现。目前已发现的能合成纤维素的菌属，除醋酸菌属(Acetobacter)外，还有土壤杆菌属(Agrobac terium)、假单细胞杆菌属(Pseudomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、产碱杆菌属(Alcaligcncs)、根瘤菌属(Rhizobium)和八叠球菌属(Sarcina)。在众多微生物中，醋酸菌属中的木醋杆菌(Acetobacter Xylinum)纤维素生产能力最强[7]。
1.1.3 细菌纤维素的生物合成途径
纤维素生物合成是一个复杂的过程，细菌纤维素是由D-葡萄糖以β-1,4糖苷键聚合成分子链，具有(C6H10O5)n的组成。分子内和分子间的氢键形成网状结构，其生物合成可分为聚合、分泌、组装与结晶四个大过程：(1)葡萄糖在葡萄糖激酶的作用下转化为6-磷酸-葡萄糖；(2)6-磷酸-葡萄糖在异构酶的作用下转化为l-磷酸-葡萄糖；(3)l-磷酸-葡萄糖在焦磷酸化酶的作用下生成尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)；(4)在细胞膜上，通过纤维素合成酶的催化作用, 将UDPG(纤维素的直接前体物质)合成为β-1, 4-葡萄糖苷链,，然后再聚合成纤维素。果糖在激酶、磷酸化酶和异构酶等的催化作用下转变为6-磷酸-葡萄糖后同样依照上述步骤参与细菌纤维素的合成。细菌纤维素的合成速度很快，一个木醋杆菌细胞在ls可以聚合200,000 个葡萄糖分子。将纤维素合成酶用毛地黄皂苷溶解, 在一定的条件下, 数分钟内即可以在体外合成细菌纤维素丛。
1.1.4 细菌纤维素在国内外的应用
(1) 在食品方面
由于细菌纤维素具有更强的亲水性、粘稠性和稳定性，可将它作为增稠剂应用于食品工业，0.4 %醋酸菌纤维素加0.1 %羧甲基纤维素的混合胶体具有比黄原胶更强的稳定性，醋酸菌纤维素和其他胶体包括黄原胶在内具有共效作用，为了降低成本常与其他胶体混合使用。它的高持水性，较低的固形物含量，较高的离子及胶体强度以及产物细、醇酯和乳酸等混合物的特殊风味可作为食品成型剂、高档乳化剂、分散剂。如可加入口香糖、香肠等中改善口感和食品特性，作为肠衣和某些食品的骨架，是一种新型食品基料。如nata，一种有微生物经液态发酵形成于液体表面的凝胶膜状物，主要成分是纤维素，它持水性好，具有独特的凝胶状半透明质地，其最广泛的应用是加工成各种nata食品，这些食品以其爽滑脆嫩细腻有弹性的独特口感倍受消费者的青睐，同时它可促进肠道蠕动，降低食物的滞肠时间，促进排便，并可减少肠道对致癌物质的吸收，另外可促进粪便中胆酸的排放，因而它具有一定的美容防癌等保健功能。还有红茶菌以茶叶浸出液通过发酵制成的一种保健饮料,也能帮助肠胃消化,增强吸收能力,降低血脂。
(2) 在生物医学方面[8]
现已有用其制成人工皮肤、纱布、绷带和“创口贴”等伤口敷料商品。其优点在于潮湿情况下机械强度高、对水分及电解物有良好的通透性、有良好的生物适应性、无刺激性，能防止细菌感染，有利于皮肤组织生长。
(3) 在造纸方面
在造纸纸浆中加入细菌纤维素，增加了纸张强度，抗膨胀性能，弹性和耐用性，解决了废纸回收再利用后纸纤维强度下降的问题，并可利用其生物可降解性而有利于三废处理、环保。还可与其他材料混合制成各种膜片、无纺布和纸张。产品很牢固，充分利用了细菌纤维素的纳米级超细特点。
(4) 其他[9]
美国将细菌纤维素应用于三次采油、硅酸盐矿石浮选、无纺棉、高吸水纤维织品、膜滤器，还有具有环保性能的纸杯、药物载体等，由于纤维素纯度高，还可作为纤维素酶活力测定的底物。
由于细菌纤维素的生产成本高，难以广泛应用。为降低生产成本，获得一株高产细菌纤维素菌株是一条可行的途径。为此，我们利用所收集到的微生物菌种资源，分离筛选出一株具有高产细菌纤维素的优良菌株并对该菌株作了初步鉴定。
1.2 菌种鉴定
微生物的分类和鉴定在微生物实验中有着至关重要的作用。通常可把微生物的分类鉴定方法分成4个不同水平：①细胞的形态和习性水平；②细胞组分水平；③蛋白质水平；④核酸水平。在微生物分类学发展早期的经典的分类鉴定方法为利用常规方法鉴定微生物细胞的形态、构造和习性等表型特征水平上。
不同的微生物往往有自己不同的重点鉴定指标，主要为形态特征、生理生化特征，生态特性等等。形态特征只要通过革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢、荚膜等，生理特征主要是菌落形态、生长温度和耐热性、碳源利用等，生化特征的测定为氧化酶、接触酶、葡萄糖氧化发酵等等[10]。
通过这些菌种鉴定的一系列实验，我们可以将所筛选得到的微生物确定到种，并可以查阅相关资料获得该种菌的特性及在生产中的应用状况。
本实验所采用的是革兰氏染色、芽孢染色和接触酶反应。
革兰氏染色：通过结晶紫液初染和碘液媒染后，在细菌的细胞膜内可形成不溶于水的结晶紫与碘的复合物。G+细菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次多和交联致密，故遇脱色剂乙醇处理时，因失水而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇的处理不会溶出缝隙，因此能把结晶紫与碘的复合物牢牢留在壁内，使其保持紫色。反之，G-细菌因其细胞壁薄、
外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄和交联度差，遇乙醇后，以类脂为主的外膜迅速溶解，结晶紫与碘的复合物溶出，因此细胞呈无色，再用番红复染，则呈红色。
芽孢染色：某些细菌在其生活史的一定阶段，在营养细胞内形成一个圆形、卵圆形或圆柱形的称为芽孢的休眠体。芽孢对不良环境尤其对热具有较强的抗性。它具有高度的折光性，在显微镜下容易观察到，但它难以着色，故需要用特殊的染色方法。能否形成芽孢是细菌种的重要特性。
1.3 菌种保藏
细菌的保存方法很多，原理是根据细菌的生理生化特性，人为创造低温、干燥或缺氧等条件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态，从而延长细菌生命以及使细菌保持原有的性状，防止变异。常用的方法主要有半固体穿刺保藏法、斜面保藏、砂土管保藏法、液体石蜡保藏法、冷冻干燥保藏法、液氮保藏法和生理盐水保藏法等[11]。本次实践中所采用的保藏方法为斜面保藏法。该法是最简便最普通的保存方法。即将生长良好的斜面细菌置于冰箱中，在4℃左右低温下保藏，但保藏期长为3-6个月。
2 实验部分
2.1 实验材料
2.1.1 菌种来源
本实验所要筛选的微生物都来自于自然界，主要为以下几种：
(1) 从小和山市场购买的袋装醋；
(2) 从小和山市场购买的水果；
(3) 浙江科技学院校内采集的土壤；
(4) 浙江遂昌村田间的土壤；
(5) 茶叶地里的土壤；
(6) 杭州菜园地里的土壤；
(7) 杭州花圃中的土壤；
(8) 杭州茶叶试验场正在发酵中的红茶。
2.1.2 培养基[12]
富集培养基：葡萄糖5％，酵母膏0.5％，乙酸钠0.2％，CaCO31％，用乙酸调pH至5.0，121℃灭菌20min，灭菌后加入2％乙醇和50mg/L制霉菌素。
分离培养基：葡萄糖10％，酵母膏1％，CaCO3(或乳酸钙)1％，琼脂2％，调pH至6.2，121℃灭菌20min，灭菌后加入乙醇2％。
斜面保藏培养基：葡萄糖2％，酵母膏0.5％，K2HPO40.1％，MgSO41.5％，乙醇1.5％，琼脂1.7％，pH自然。
种子培养基：葡萄糖7％，酵母膏0.5％，K2HPO40.5％，MgSO41.5％，乙醇2％，pH自然。
发酵培养基：葡萄糖2％，酵母膏0.5％，K2HPO40.1％，MgSO41.5％，乙醇1.5％，pH 自然。
2.1.3 仪器与试剂
本实验所涉及到的主要实验试剂见表1，实验仪器见表2。
表1 主要实验试剂
试剂 纯度 生产厂家
葡萄糖 化学纯 北京双旋微生物培养基制品厂
酵母膏 化学纯 北京双旋微生物培养基制品厂
硫酸镁 分析纯 上海市四赫维化工有限公司
乙酸钠 分析纯 温州润华化工实业公司
碳酸钙 分析纯 温州润华化工实业公司
乙醇 ›95% v/v 安徽安特生物化学有限公司
乙酸 分析纯 安徽安特生物化学有限公司
琼脂 粉状 福建泉州市泉港化工厂
制霉菌素 — 上海楷祥生物技术有限公司
磷酸氢二钾 分析纯 上海化学试剂有限公司
表2 主要仪器设备
仪器 型号 生产厂家
电子天平 YP1201 良平仪器
分析天平 BS-110S 北京赛多利斯天平有限公司
漩涡混合器 XW-80A 上海医大仪器厂
立式压力蒸汽灭菌锅 YXQ-LS-SI 上海博讯实业有限公司医疗设备厂
生化培养箱 SPX-250B-Z 上海博讯实业有限公司医疗设备厂
超净工作台 SB-JC-LB-Z 上海博讯实业有限公司医疗设备厂
恒温培养振荡器 SKY-2100C 上海苏坤实业有限公司
生物显微镜 XSD-9 上海光学仪器厂
精密数显酸度计 PHS-25 中国雷磁分析仪器厂
此外，还有接种针、接种环、镊子、涂棒、酒精灯、试管、培养皿、锥形瓶；移液管；量筒等玻璃器皿等。
2.2实验方法
2.2.1 菌株筛选[13]
富集：将水果、红茶、土壤样品粉碎或打浆后以1:l0(V/V)无菌水稀释，取稀释液1ml接入经灭菌装有9ml富集培养液的试管中，28℃静态培养。
将醋敞开放置一段时间,表面会长出薄膜。在无菌条件下吸取1mL长膜的醋样,加入装有9mL无菌生理盐水的试管中,制成浓度梯度为10-1的菌悬液,然后逐步稀释为10-5、10-6、10-7浓度梯度, 吸取后3个浓度梯度的菌悬液各1mL加入到9mL富集培养基中, 每个浓度梯度准备2支试管28℃静态培养。
分离：观察管内液面长有乳白色胶质膜者为阳性。将长膜试管中的菌液采用划线分离方法接种于灭菌后的分离培养基上，28℃恒温培养。
纯化：培养5d后，对上述分离培养基平板上有透明圈产生的菌落进行菌落形态和细菌显微结构的观察，挑取产胶量最大的单菌落接入富集培养基，28℃恒温培养，观察长膜情况。以上富集和分离操作反复进行2次，直到分出纯菌株，并筛选细菌纤维素膜生长快且产量大的菌株。
挑取其中菌落长势良好、分布均匀且个数适中的一个平板中的全部单菌落,保藏于斜面培养基中,28℃恒温培养,长出丰厚的菌苔后,置于4℃冰箱中保存。
2.2.2 培养方法
由斜面取一单菌落，接入种子培养基，在30℃，200 r/min摇床培养24 h，然后将其按10％的接种量接入发酵培养基，30℃静态(或摇床)培养l0天。
2.2.3 细菌纤维素膜的处理
2.2.3.1 纤维素膜的提取方法[14]
静置培养后生成的细菌纤维素膜浮于液面。膜取出后，用去离子水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于0.1mol/L的NaOH溶液，100℃煮沸20min，去除膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明。然后连续用去离子水、0.5％乙酸、去离子水洗涤至pH为中性。80℃干燥至恒重，冷却至室温进行称重。纤维素的产量表示为：g/L[纤维素/培养基][15]。
2.2.3.2 膜组分的定性研究[16]
纤维素酶水解法：取烘干的薄膜样品，剪碎，放入l0mL 0.3％的纤维素酶液中保温水解直到溶液清亮透明。
定性观察纤维素法：挑起培养1d～2d液面产生的薄膜于装水的培养皿中,使其自然平展于载玻片上，取出载玻片，晾干。参考植物叶片组织定性观察纤维素的方法，在膜上滴66.7％的硫酸，再滴加碘液进行染色，观察显色情况。
3 结果与讨论
3.1 菌株筛选结果
经富集分离的80个样品中有16个样品出现纤维素胶质膜的阳性反应。袋装醋和残次水果的阳性率最高，分别达到24.0和17.1，土壤样品尤其是稻田土的阳性率最低，见表3。
表3 天然样品中纤维素产生菌检出率
样品来源 检测数 检出数 检出率（%）
残次水果 35 6 17.1
土壤 10 0 0
袋装醋 25 8 24.0
红茶 10 2 5.0
用划线法分离得到16个可在培养液面形成凝胶膜的单菌落，分别接入斜面保藏，备用。对分离出的菌株进行发酵培养，其部分发酵结果如表4所示。由表4可知，菌株BV02产量较高，故以菌株BV02为实验用菌株，进行纤维素发酵工艺研
究。
表4 部分菌株发酵培养产生凝胶膜的情况
菌种编号 重量（g/L） 膜外观质量
CG02 0.071 膜很薄半透明，摇晃后呈絮状，如图1-a
CG03 0.023 同上
GM15 0.053 同上
GM16 0.054 同上
GM19 0.029 同上
GM23 0.044 同上
BV02 0.116 膜较厚，与瓶壁结合好，摇晃不易破坏，如图1-b
BV04 5.303 膜较厚，摇晃后与瓶壁分离，如图1-c
BV06 3.187 同上
BV08 3.201 同上
BV09 2.177 同上
BV12 4.339 同上
BV15 2.221 同上
BV19 3.131 同上
BT02 2.039 膜较薄，摇晃后呈絮状
BT03 2.321 膜较薄，摇晃后呈絮状
a CG02菌株产膜情况
b BV02菌株成膜情况
c BV04菌株成膜情况
图1 不同菌株的成膜情况
3.2 纤维素检测
3．2．1 纤维素酶水解法
菌株生物合成的凝胶膜经粗纤维素酶水解48 h后溶液清亮透明，凝胶膜被完全水解，由于纤维素酶对纤维素具有专一性水解作用，因此可初步确定该菌株所产凝胶膜由纤维素组成。
3.2.2 定性观察纤维素
所产纤维素膜经硫酸水解，碘液染色后，肉眼观察呈蓝黑色。
图2 结晶紫染色后显微摄影图
综上分析结果，本实验用菌株所产凝胶膜的主要成分是纤维素。
3.3 培养基组成的优化实验
3.3.1 不同碳源对产膜量的影响
菌株BV02可利用多种碳源来合成纤维素，其结果见表5。
表5 不同碳源对纤维素产量的影响
碳源(20g/L) 纤维素产量(g/L) 碳源(20g/L) 纤维素产量(g/L)
葡萄糖 5.303 D-半乳糖 0.092
蔗糖 3.608 D-木糖 0.052
乳糖 0.116 D-果糖 0.089
可溶性淀粉 2.923
图3 不同碳源对纤维素产量的影响
表5可见，该菌株利用葡萄糖、蔗糖时，纤维素产量较高。其中以葡萄糖为碳源时，细菌纤维素的产量最高，可达5.303g/L；能直接利用淀粉。
3.3.2 不同氮源对产膜量的影响
表6 不同氮源对纤维素产量的影响
氮源(5g/L) 纤维素产量(g/L) 氮源(5g/L) 纤维素产量(g/L)
尿素 11.629 蛋白胨+酵母膏 0.830
蛋白胨 0.678 酵母膏+胰蛋白胨 0.820
酵母膏 5.303 酵母膏+尿素 0.492
硫酸铵 — 酵母膏+硫酸铵 0.140
胰蛋白胨 0.694
图4 不同氮源对纤维素产量的影响
从表6可见，该菌株生产纤维素所利用的氮源中有机氮源好于无机氮源，其中尿素为氮源时产量最高。
3.3.3 乙醇对细菌纤维素产量的影响
图5 不同乙醇浓度对细菌纤维素产量的影响
由图5可知，当乙醇浓度达l0ml/L时，纤维素产量最高达5.061g/L，比不添加乙醇时产纤维素的量提高了24.9％。一般情况下，30mL／L是乙醇产生影响的敏感浓度，浓度再增加细胞生长将受到抑制。
3.4 培养方式的确定
3.4.1 接种量对发酵的影响
接种量的多少决定生产菌种在发酵中生长繁殖的速度。采用较大的接种量，可以缩短延迟期，加快菌体生长．使产物形成期提前。但是接种量过多，超过一定值后常导致底物前期消耗过快，不利于后期产物积累，对产量影响的效果反而不明显；接种量过少，则会延长发酵周期，对生产纤维素不利。为此作了如下实验：取一环活化好的斜面种子接入种子培养基，30℃振荡培养24h，摇床转速为160r/min。以2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％和20％的接种量接入发酵培养基。接种量对纤维素产量的影响如图6所示。
图6 接种量对细菌纤维素产量的影响
从图3可知，接种量在2％～10％的区间内．随着接种量的增加，纤维素的产量有明显的增长；但超过10％以后，由于菌体的快速繁殖，会导致溶解氧浓度低下，细菌活力降低，从而影响到纤维素的产量；接种量过小时，纤维素的合成效率较低，在相同培养时间其产膜量偏低，发酵周期较长。所以确定细菌纤维素发酵最适接种量为10％。
3.4.2 种龄对发酵的影响
种龄不够，种子生长不成熟，纤维素产量很低；种龄过长，种子老化，也会使纤维素的产量下降。因此．选择合适的种龄，是提高纤维素产量的必要条件。本实验的方法是取一环活化好的斜面种子接入种子培养基，30℃振荡培养，摇床转速为160r/min。作为种子培养基。依次于12h、24h、36h、48h、60h和72h取10％的接种量接入发酵培养基，接种时需充分振荡，以使菌液均匀，30℃恒温静置培养7d，结果见图7。
图7 种龄对细菌纤维素产量的影响
由图7可知．种龄在24h时的产量最高为2.852g/L，说明种龄为24h最适合发酵。
3.4.3 初始pH值的确定[17]
pH值对菌体的生长和产物的积累有很大的影响，引起各种酶活力的改变，影响菌体对底物的利用速度和细胞结构，以至影响菌体的生长和产物的合成。取一环活化好的斜面种子接人液体培养基，30℃振荡培养24h，摇床转速160r/min，作为种子培养基。以10％的接种量接入发酵培养基，调节发酵培养基的初始pH值分别为4、4.5、5、5.5、6、6.5和7，接种时需充分振荡，以使菌液均匀，30℃恒温静置培养7d，结果见图8
图8 初始pH对细菌纤维素产量的影响
由图8可知，当pH值<5时没有细菌纤维素产生，醋酸杆菌合成细菌纤维素的最适pH值范围是6.0-6.5。
3.4.4 发酵周期的确定
在上述确定的最适条件下进行细菌纤维素的静态培养，确定合适的发酵周期，结果见图9。
图9 发酵周期对细菌纤维素产量的影响
由图9可知，随着发酵的进行，到第7d达到最大值，确定发酵周期为7d。
3.4.5 小结
菌株BV02的静态培养生产细菌纤维素的条件是：最适接种量为10％、最适发酵种龄24h、发酵周期7d、最适初始pH6.0-6.5。
3.5 菌种初步鉴定
3.5.1固体培养特征
菌株BV02生长于平板培养基上的菌落,直径为2mm～3mm，大多是圆形，凸起，半透明，颜色呈微黄，能形成皮革状菌膜。进一步培养，菌落呈菌苔，菌落质地呈粘胶团状。如图10。
图10 平板培养的菌落形态
3.5.2 液体培养特征
从生产果胶的菌液中分离得到产纤维素膜的菌株BV02，该纤维素膜在培养液中呈凝胶状，乳白色，半透明。静置培养时，胶体浮于液面，见图11-a；振荡后，胶体呈絮状或小团块沉淀物，见图11-b。
a 静止时膜状态
b 摇动后膜状态
图11 液体培养的特征
细菌纤维素膜经预处理后呈乳白色半透明胶状液膜，外表均匀光滑，质地柔韧，见图12。
图12 细菌纤维素湿膜
3.5.3 革兰氏染色后结果
菌体革兰氏染色阴性，细胞椭圆杆状、直或弯，单个、成对或成链状，见图13。
图13 革兰氏染色
3.5.4 芽孢染色结果
通过芽孢染色实验，我们在显微镜下观察到，实验所筛选分离得到的菌株BV02不存在芽孢，见图14。
图14 芽孢染色
菌种鉴定的
初步结论：根据以上特征，初步鉴定该菌属于醋杆菌属。
4 总结与展望
本研究利用本地土壤、水果、醋等原料，静态培养，利用细菌纤维素产生菌在液体静止培养时会产生乳白色胶质，在固体培养时菌落周围也会出现粘胶团这一现象，快速地实现细菌纤维素产生菌的初筛，然后反复筛选从中得到产纤维素能力强的细菌。大致筛选方案如下：样品采集→试管富集培养→固体平板稀释分离→取产胶量较大的单菌落接入斜面→定性实验→纯化筛选[18]。
然后进行了产物的定性研究，利用纤维素酶对纤维素水解的专一性，确定所分离的实验菌株所产代谢产物为纤维素。
还进行了发酵条件的初探，研究了碳源、氮源、乙醇、接种量、培养方式等因素对该菌株合成纤维素产量的影响。结果显示：菌株BV02的静态培养发酵生产细菌纤维素的培养条件是：接种量为10％、种龄为24h、发酵周期7d、发酵温度30℃、初始pH值最适范围是6.0。
目前细菌纤维素已经在很多方面得到应用。但是大规模生产还存在很多问题[19]。好氧微生物工业化大生产的菌体筛选方向仍旧是通气搅拌条件下的深层发酵。A．xylinum绝大部分菌株只适于表面静态培养。被A. xylinum产纤维素1:50持水率特性所决定，要进一步提高纤维素产量的菌株选育，应选纤维素胶持水率低的而不能仅看产胶量。这可能涉及纤维素产物的构型改变，有待继续深入研究[20]。
致 谢
在做毕业设计的这半年里，首先要感谢我的导师魏培莲老师对我的悉心指导。感谢魏老师解答实验过程中的所有问题，并且给我实验很大的自由发挥的空间，让我顺利完成实验。无论是魏老师的实验思路，还是实验技能都对我有非常大的帮助，为毕业论文过程打下坚实的基础。同时导师渊博的知识、严谨的治学态度、忘我的工作精神令人钦佩不已。藉此向辛勤指导我的导师致以崇高敬意和真挚的感谢！
论文的完成离不开实验室全体成员的精诚团结和密切合作及共同努力，衷心地感谢师兄王辉和杨洁在论文期间给予我的指导和帮助；也非常感谢在同一微生物实验室里的张云邦同学平时给予我的各种建议和帮助。此外，校图书馆所提供的图书以及论文、电子书，都是本次毕业论文能够顺利进行必不可少的资源，非常感谢浙江科技学院生化学院微生物实验室为我提供了良好的实验环境。
感谢班主任徐晖老师在四年大学生活中给予我的教育、指导、关怀和鼓励。感谢生工051班的所有同学，从他们身上，我学到了很多东西，和他们在一起的日子是我大学四年中最快乐的时光。
特别感谢我的家人，正是他们对我的理解、宽容、支持和鼓励，使我不断激励自己、超越自己，不断取得学业上的进步。养育之恩，无以回报，他们永远健康、快乐是我最大的心愿。
值此论文完成之际，谨向所有关心和帮助过我的老师、同学、朋友们致谢！
马书勤
2009年6月10日于杭州
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