学生姓名：吴 丹 龙 指导教师：黄 俊
（浙江科技学院生物与化学工程学院）
摘要：毛竹是禾本科属植物，为我国分布最广、面积最大、蓄积量最多、用途最广的主要经济竹种。生物技术为竹类遗传育种开辟了一条新的途径，如通过植物组织培养技术进行无性系选育，甚至还可以通过基因转化等途径突破传统育种局限，培育出符合需求的新品种，缩短育种周期。其中竹子组织培养是上述一系列竹子生物技术得以实现的重要基础，而愈伤组织诱导和植株再生是竹子组织培养技术的关键。本研究希望通过对毛竹愈伤组织和分化规律的研究，建立起毛竹愈伤组织诱导体系，为毛竹的分子育种打下基础；通过研究毛竹愈伤组织分化规律，为毛竹植株再生和调控提供实验依据。同时，也期望通过该研究对其它散生竹种的愈伤诱导和植株再生的研究起到积极的推动作用。
关键词：毛竹 组织培养 愈伤
Research of inducement of callus tissue on embryo of bamboos
Student’s name: Danlong Wu Advisor: Huangjun
（School of Biological and Chemical Engineering, Zhejiang University of Science and Technology）
Abstract: Bamboo belongs to gramenious plant, a main sort that is the most distribution,the most area,the most cumulatin,the most useful. Biology technology create a new way of inheritance and breeding for bamboo. Et,it can be selected through tissue culture and breakthrough the localization of traditional breeding through the technology of gene translation,create a new product that meet the need of people and shorten the period of breading.The technology of tissue culture is a very important elements for the realization of such biology technologys and the technology of inducement of callus tissue and regeneration is the key for tissue culture of bamboo.We hope to make up a system of callus tissue of bamboo and a foundation for molecule breeding of bamboos through this research about callus tissue and polarization disciplinarian.Simultaneity,We also hope to make a positive impulse effect for the other bamboos of callus inducement and regeneration.
Key words: Bamboo; Tissue culture; Callus
目 录
中文摘要 Ⅰ
英文摘要 Ⅱ
目录 Ⅲ
1 绪论 1
1. 1 前言 1
1.2 散生竹愈伤组织诱导和植株再生 1
1.3 丛生芽诱导和植株再生 1
1.4 竹子组织培养中外植体防褐变技术 2
1.5 存在的问题和前景 4
1.6 研究的目的和意义 4
2 实验部分 6
2.1 实验材料 6
2.1.1 主要试剂 6
2.1.2 设备和仪器 6
2.2 实验内容与方法 6
2.2.1 毛竹种子的形态观察 6
2.2.2 毛竹种子含水量的测定 6
2.2.2.1 测定样品的选取 6
2.2.2.2 测定过程 6
2.2.2.3 种子含水量的计算 7
2.2.3 毛竹种子不同灭菌方法的效果对胚愈伤组织培养污染研究 7
2.2.4 比较不同蔗糖浓度和胚乳多少对愈伤组织质量的影响 9
2.2.5 利用超声波对竹子种子的愈伤诱导实验 11
3 结果与讨论 13
3.1 毛竹种子形态观察结果 13
3.2 毛竹种子含水量的测定结果 14
3.3 通过不同浓度的次氯酸钠对毛竹种子的消毒情况 14
3.3.1 正交实验结果分析 15
3.3.2 分析影响次氯酸钠杀菌作用的因素 15
3.4 比较不同蔗糖浓度和胚乳多少对污染控制和愈伤组织质量的影响 16
3.5 利用超声波对竹子种子的愈伤诱导的效果 18
4 总结与展望 20
致谢 21
参考文献 .22
1 绪论
1.1 前言
竹类资源是陆地森林生态系统的重要组成部分，具有分布广、速生丰产、再生能力强，用途广泛，经济价值高的特点，有很好的经济效益、生态效益和社会效益，它已成为世界森林资源的重要组成部分。毛竹是禾本科竹亚科刚竹属植物，为我国分布最广、面积最大、蓄积量最多、用途最广的主要经济竹种。近年来随着国内外造纸工业、建筑材料、食品工业的发展，对毛竹的需求量大增，使得竹产品供应出现短缺，因而尽快扩大竹林面积已成当务之急。由于毛竹开花间隔期长，开花具不可预测性，种子的获取十分困难，且易发生性状分离，因此其主要以埋鞭、埋秆、埋节等传统的无性繁殖方法进行繁殖。但传统无性繁殖方法取材困难、繁殖系数小、成本高，难以满足当前生产的需要。现代生物技术为竹类遗传育种开辟了一条新的途径，如通过植物组织培养技术进行无性系选育，甚至还可以通过基因转化等途径突破传统育种局限，培育出符合需求的新品种，缩短育种周期。
1.2 散生竹愈伤组织诱导和植株再生
从目前的报道来看，有将近90%是关于丛生竹种，有关散生竹成功的报道很少，特别是尚未见有关诱导散生竹的愈伤形成植株的报道。开展散生竹组织培养研究，对全面了解和利用竹子资源也是不可缺少的一个环节。
李忠光和龚明[2]等以毛竹种子为材料进行过无菌苗诱导，杨淑琴[3]等用毛竹春笋为培养材料进行愈伤组织诱导，研究表明以MS 为基本培养基，添加激素组合3 mg/ L 氯化苯氧乙酸（简写为2 ,4 – D） + 1 mg/ L6-苄氨基嘌呤（简写为6 – BA） 在20℃、3%蔗糖、0.9%琼脂、暗培养条件下愈伤组织诱导率100%，且状态最好。李惠英[4]等对毛竹愈伤组织中的褐变现象进行了详细的研究。
1.3 丛生芽诱导和植株再生
外植体不经过愈伤组织而直接诱导器官发生，然后形成完整植株是竹类组培中一种相对较成熟的快繁技术。如麻竹、绿竹、勃氏甜龙竹、牡竹撑绿竹、菲白竹、金镶玉竹等竹种已经可以通过这些技术规模化生产竹苗。近年来，就已有的报道来看，不少关于竹类组织培养的最新报道都将侧重点放在愈伤组织诱导进而植株再生方面。
Saxena[27]成功地进行了马甲竹微繁殖。使种子在M S 培养基上萌发后取芽作外植体，在含8×10- 6mol BA 的M S 培养基2%蔗糖上诱导芽，并在改良的M S 培养基上诱导生根，其中10- 5 mol IAA生根效果最好，4 周龄的生根小植株移植到盆栽混合介质中，在试管中控制水分进行炼苗，成活率可达到80%～ 90%。
肖关丽[5]等以不同比例的M S和不同浓度的BA、NAA 为培养基，通过的以芽繁芽途径实现了麻竹竹苗在试管里的大量繁殖。谭源杰[8]筛选出勃氏甜龙竹幼年竹茎段芽诱导最佳培
养基为MS+6 mg/ L BA。张光楚等还对成熟竹的组织培养做了专门的研究。用26年生撑麻7号竹作材料。已完成外植体选择、试管诱导丛芽发生、增殖、生根及组培苗移栽到林地的全过程，基本上解决了苗在试管里长势不好的问题。
张桂和以MS为基本培养基成功的进行了麻竹胚离体培养。张桂和利用麻竹嫩枝休眠芽的茎尖离体培养形成试管苗。实现了麻竹的离体快速繁殖。对试管苗的生根和移栽技术也作了系统的研究，繁殖的试管苗成苗已应用于生产。张铁等以勃氏甜龙竹新萌发的嫩枝为外植体， 以3/ 4MS + 6-BA 2 mg/ mL + KT 1 mg/ mL + 蔗糖20 g/ L为初始培养基，3/ 4MS + 6-BA 2 mg/ mL + NAA 0.05 mg/ L+ 蔗糖20g/ L为丛生芽继代增殖培养基；生根培养基为1/ 2MS + NAA 3 mg/ L +IBA 5 mg/ L + 蔗糖10g/ L，无菌苗移栽成活率90 %以上。张春霞等以菲白竹含芽的节作为外植体，实现植株再生。王光萍等以金镶玉竹等11种观赏竹新萌发的嫩芽为材料，在MS培养基上进行培养，获得了7种观赏竹的再生植株，无菌苗移栽成活率达9 0 % 以上。
丛生竹生长在温暖湿润的热带地区，器官再生能力强，秆及枝条上大多具有隐芽，在适宜条件下处于休眠状态的隐芽可萌发生根，长成新植株。而生长在冷暖气候交替分明地区的散生竹，器官再生能力很弱。此外，他们染色体数目也有差别，丛生竹通常为6 倍体(2n= 72)，散生竹通常为4 倍体(2n=48)，组培难度更大。
1.4 竹子组织培养中外植体防褐变技术
培养过程中的污染、褐变和玻璃化是组织培养中公认的三大难题。关于组织培养中存在的问题及改进方法已有很多研究。竹子组织培养也不例外，外植体尤其是愈伤组织极易发生褐变，使试验无法进行下去，甚至导致整个试验的失败。外植体褐变是在组织培养过程中建立外植体时酚类化合物溢出，在多酚氧化酶的催化下迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类物质进而在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，导致组织代谢活动紊乱，并且生长停滞，最终衰老死亡。在竹类愈伤组织培养已有的报道或者实例中，最大的难点就是愈伤组织的褐变问题。因此，如何防止和减少外植体特别是愈伤组织发生褐变，是竹子组织培养研究中亟待解决的问题。目前主要采用以下几种方式防止外植体褐变。
（1）如果在培养前先将易褐化的外植体在黑暗条件或在弱光下培养有一定的防褐变效果。因为在黑暗条件下，一些光诱导参与酚类合成和氧化的酶活性减弱，导致酚类合成减少，其氧化产物醌类也相应减少，使褐变得到一定程度的控制。（2）用Gelrite 做固化剂，来防止褐化。王光萍等诱导丛生芽在含有Gelrite 的培养基上外植体不易褐化,在使用 Agar 的培养基上,外植体易褐化。在诱导初期宜选用Gelrite 作凝固剂。因二者对丛生芽增殖系数相差不大，诱导芽产生后可改用琼脂，以降低成本。（3）培养时经常转移或在培养基中加入抗氧化剂或其他抑制剂也会有较好的预防效果。常用适量PVP聚丙烯吡咯烷酮或活性炭来防止和清除褐化现象。活性碳的浓度常采用2 g/L，但是活性碳易抑制愈伤组织的发育，而高水平的生长调节剂能补偿活性碳所产生的副作用。
王光萍[14]等在对毛竹愈伤组织中的褐变现象进行研究发现在培养过程中，低温下暗培养有利于抑制褐变发生，AgNO3对褐变有一定的抑制作用，而且高浓度的2，4 – D 对褐变有明显的抑制作用。顾晓平等报道添加抗氧化剂控制愈伤组织褐变的效果要优于吸附剂，其防褐化能力:抗坏血酸(5 mg/L)>半胱氨酸((100 mg/L)> PVP(1 mg/L)>活性炭(1 mg/L)。外植体在无菌水或半胱氨酸(100 mg/L )溶液中浸泡2～4 h 也有利于控制褐化。暗培养有利于愈伤组织生长，对控制褐化也有一定作用。如果把种子的预处理、抗氧化剂和暗培养三种措施结合起来，预计会取得更好的防褐变效果。
当然无论采取哪种措施不仅要考虑控制褐变的程度、能否方便实用以及是否与外植体进一步增殖分化相矛盾，否则控制褐变就失去了意义。
再生植株白化现象在禾本科植物组织培养中很普遍。再生植株白化程度与基因型、培养物的培养时间和培养条件等多种因素有关。随着胚性愈伤组织和胚性悬浮培养物继代保存时间的延长，再生植株中白苗的比例升高。
1.5 存在的问题和前景
竹子组织培养研究工作主要集中在一些易培养的竹种上，关于这些竹种培养难易的内在原因或机制并未深入探讨。目前，基因工程在农作物育种上已有明显成效，很多农作物通过基因工程获得了优良品种，如大豆、玉米、水稻、马铃薯等。但利用基因工程进行竹子育种还几近空白。
总之，虽然对竹子组织培养中出现的问题、机理及控制进行了一定的研究，但是尚未能找到普遍适用的行之有效的解决办法，成为提高竹子组织培养繁殖率和增加培养过程稳定性的主要障碍。因此对这些问题的研究仍需继续深入，以其找到更好的解决办法，使控制措施从治标走向治本，从而使竹子植物组织技术发挥更大的作用。因此应重视竹子组织培养基础研究，特别是组织培养机理的探讨与规律的总结，完善竹子组织培养技术，充分发挥其在竹子生理、遗传、细胞等研究中的基础作用。
近几年来，我国在散生竹组织培养技术方面有了长足的进步，已经有8种散生竹通过以芽繁殖芽的形式实现植株再生。许多科研机构长期不懈的开展竹子组织培养研究，初步建立了完整的适于竹子转基因研究的组织培养体系。吴益民等参考禾亚科成熟的基因工程育种技术，结合竹子特点，提出竹亚科的基因工程育种技术较有效的途径可能为：竹子外植体—愈伤组织—悬浮细胞系—基因转化—愈伤组织—植株再生。相信随着生物技术的飞速发展，开展竹子基因工程育种将成为可能。
1.6 研究的目的和意义
毛竹( Phyllostachys heterocycla. cv. pubescens) 是禾本科竹亚科刚竹属植物，为我国分布最广、面积最大、蓄积量最多、用途最广的主要经济竹种。近年来随着国内外造纸工业、建筑材料、食品工业的发展，对毛竹的需求量大增，使得竹产品供应出现短缺，因而尽快扩大竹林面积已成当务之急。由于毛竹开花间隔期长，开花具不可预测性，种子的获取十分困难，且易发生性状分离，因此其主要以埋鞭、埋秆、埋节等传统的无性繁殖方法进行繁殖。但传统无性繁殖方法取材困难、繁殖系数小、成本高，难以满足当前生产的需要。现代生物技术为竹类遗传育种开辟
了一条新的途径，如通过植物组织培养技术进行无性系选育，甚至还可以通过基因转化等途径突破传统育种局限，培育出符合需求的新品种，缩短育种周期。其中竹子组织培养是上述一系列竹子生物技术得以实现的重要基础，而愈伤组织诱导和植株再生是竹子组织培养技术的关键。关于毛竹却没有一套成熟的组织培养体系，而且关于愈伤组织诱导及其分化的研究还一直没有突破性进展，尚未见到关于毛竹愈伤组织诱导并进行分化的系统研究。
本研究希望通过对毛竹愈伤组织和分化规律的研究，建立起毛竹愈伤组织诱导体系，为毛竹的分子育种打下基础；通过研究毛竹愈伤组织分化规律，为毛竹植株再生和调控提供实验依据。同时，也期望通过该研究对其它散生竹种的愈伤诱导和植株再生的研究起到积极的推动作用。
2 实验部分
2.1 材料和方法
2.1.1 主要试剂
N6macro B5micro B5 vitamin Fe2+ Ca2+ Sucrose Agar 次氯酸钠
脯氨酸 谷氨酰氨 水解酪蛋白 蔗糖 琼脂 NaOH 2-4-D
2.1.2 主要仪器设备
超净工作台
KQ－50型超声波
电子显微镜
2.2 实验内容与方法
2.2.1 毛竹种子的形态观察
取少量毛竹种子，剥开外壳后，显微镜观察其胚的性状、位置和大小，并进行拍照。
2.2.2 毛竹种子含水量[22]的测定
种子含水量是指所含水分的重量占种子重量的百分率。竹子种子取之不易，为适应后续研究的开展，有必要测定种子含水量，为不同条件保存种子提供依据。
2.2.2.1 测定样品的选取
将待检测的种子混合均匀，共称取10g左右去壳种子，并平均分成3份，记作○1，○2，○3；并将去掉的看上去不饱满的种子和壳，也平均分成三份，记作○4，○5，○6，为了避免测定误差，应尽量缩短检验样品暴露在空气中的时间。
2.2.2.2 测定过程
将6份测定样品分别装入预先烘至恒重（5个小时, 105℃±2℃）和编号的铝盒中，并记下盒重和瓶号。然后连同带盖的铝盒及其中的测定样品一起称量，记下读数。将铝盒放入105℃±2℃的烘箱中，敞开盖子，从温度回升到105℃时开始计时，连烘5个小时左右。取出后盖上盖子，放入干燥器中冷却30分钟。用坩锅钳取出称重，记下读数。再敞开瓶盖用105℃烘1小时左右，再按上法称重，记下读数。直到前后两次的重量之差小于0.01克时，即认为已达到恒重。
关于称量的精确度：所有称重的精确度应达到1毫克，并使用同一架天平。
2.2.2.3 种子含水量的计算
根据测定结果[27]，按下式分别计算两份测定样品的相对含水量百分率，精度到小数点后一位。
相对含水量（%）=(b-c/b-a)×100
式中 a铝盒及盖子的重量（克）
b铝盒和盖子及检验样品烘前的重量（克）
c铝盒和盖子及检验样品烘后的重量（克）
两份测定样品测定结果不得超过0.5%。如超过此数，必须重新测定。如第二次测定的差异不超过0.5%，则按第2次结果计算含水量。如果第2次差异仍大于0.5%，则从四组中抽出差异小于0.5%的两个组，以其平均值的含水量作为本次测定结果。测定含水量的方法有很多，包括低恒温烘干法、温烘干法、以及红外线水分速测仪快速测定法。本实验采用的是低恒温烘干法。
2.2.3 毛竹种子不同灭菌方法的效果对胚愈伤组织培养污染研究
竹子种子取之不易，有必要研究不同灭菌方法的效果，同时发芽能力是反映种子播种品质的重要因子之一，为后续试验研究做好准备。设计了不同的灭菌方法，通过改变活性剂、消毒剂、时间、消毒剂和种子的体积比找到较为有效的灭菌方法，比较其萌发情况。
控制毛竹胚愈伤形成过程中污染程度，提高愈伤诱导率[28]，获得具有再生能力的毛竹愈伤组织。
1） 正交实验设计
表1 毛竹种子灭菌正交设计
标号 活性剂（%） 消毒剂（%） 时间（min） 体积比(ml/g)
2） 种子准备
种子称重，剥壳。
本次称取带壳种子17.6g，剥壳后取去壳种子120粒，重1.91g，则平均一粒去壳种子大概16mg。去壳种子总重11.46g，则推测有716颗。
所称取的去壳种子均已去掉看上去不饱满或有病害的。
3） 种子预处理
把种子放进烧杯，加水，筛去漂浮的种子，并留取部分种子，放置于滤纸上（为对照做准备）。剩余种子用70%酒精消毒一分钟，立即加水，将水倒掉后把种子倒出置于滤纸上，稍晾干后将种子分成9份，为进一步消毒做准备；
种子消毒1分钟的时间掌握（到倒进水为止）。
4） 种子的灭菌
表2 不同浓度的次氯酸钠对种子的灭菌实验
标号 重量（g）
36颗 次氯酸钠（1.5%）
(ml) 水
(ml) 活性剂
(ul) 时间
(min)
5） 点种子
将种子移到已经用紫外灯灭菌后的超净工作台中，根据种子的编号对培养皿做标记，培养皿上铺层滤纸，少量加水吸湿（以滤纸完全湿润为度）然后开始点种子。培养皿中的水不要加得太多，否则种子容易移动。
6） 人工气候箱内培养
点完放置于人工培养箱内。条件为:25度 80%湿度。其中编号12 放入水中浸泡24h，再培养；编号11放进4度冰箱24h，再培养。
2.2.4 比较不同蔗糖浓度和胚乳多少对愈伤组织质量的影响
1） BC3 和BC4培养基的配制
表3 BC3培养基
母液 加入量/L 加入量/250mL
N6macro (50×) 20 ml 5 ml
B5 micro (200×) 5ml 1.25ml
B5 vitamin (50×) 20 ml 5ml
Fe2+ (AT, 100×) 5.6ml 1.4 ml
Ca2+ (B5,100×) 11.1 ml 2.8 ml
2,4-D (0.5mg/ml) 4 ml 1 ml
脯氨酸（pro） 500 mg 125mg
谷氨酰氨（Gln） 500 mg 125 mg
水解酪蛋白（CH） 500 mg 125mg
蔗糖 (Sucrose) 30 g 7.5g
琼脂 (Agar) 8 g 2 g
用NaOH调PH 5.8 (3%的蔗糖)
表 4 BC4培养基
母液 加入量/L 加入量/250ml
N6macro (50×) 20 ml 5 ml
B5 micro (200×) 5ml 1.25ml
B5 vitamin (50×) 20 ml 5ml
Fe2+ (AT, 100×) 5.6ml 1.4 ml
Ca2+ (B5,100×) 11.1 ml 2.8 ml
2,4-D (0.5mg/ml) 4 ml 1 ml
脯氨酸（pro） 500 mg 125mg
谷氨酰氨（Gln） 500 mg 125 mg
水解酪蛋白（CH） 500 mg 125mg
蔗糖 (Sucrose) 30 g 15g
琼脂 (Agar) 8 g 2 g
用NaOH调PH 5.8 (6%的蔗糖)
2）毛竹种子灭菌前处理
称取约6g 带壳种子，去壳，将大部分胚乳切去。
取一部分的种子切去一半的胚乳，用“-”表示
另一部分的种子切去尽量多的胚乳，
用“+”表示
3）种子灭菌
将种子放入500ml无菌烧杯中，加75%酒精200ml左右，处理约1min，倒掉，再加入0.5浓度安替福民（有效氯为2.5%）250ml，加盖常温下，摇床上振荡灭菌30min。
4）灭菌后漂洗
振荡灭菌后，将烧杯移至超净台，其中的种子移至新的无菌烧杯中，加无菌水漂洗。一共洗4遍，每遍放置5min。最后一遍，倒大约250ml无菌水，并将原来的盖子盖上，置于超净台，等所有平板倒好，将浸泡的种子用无菌水换洗后，倒出无菌水，在无菌药勺协助下，将种子刮到预先准备好的无菌滤纸上。
5）倒培养基
倒平板，超净台吹20min左右。
6）接种
表 5 蔗糖浓度和胚乳处理的种子接种
实验编号 来源 培养基 备注 种子数
71201BC3+
71201BC4+
71201BC3-
71201BC4- 709281A2 BC3
BC4
BC3
BC4 6个平板 49
6个平板 54
8个平板 64
7个平板 56
7）培养箱内培养
25度，置于培养箱内暗处诱导愈伤[29]组织。
2.2.5 利用超声波[30]对竹子种子的愈伤诱导实验
通过接种前种子的超声波处理和接种前未用超声波处理的比较，来观察愈伤质量是否有所改善比如出愈时间、愈伤的大小等方面。主要是利用超声波处理对种子产生大量伤口。
1） 毛竹种子灭菌前处理
称取约2.5g (约160颗种子去壳)种子，将大部分胚乳切去。
平均放到三个烧杯中分别记作（1）、（2）、（3）。
2） 种子灭菌
将烧杯1的种子放入500ml灭菌烧杯中，加75%酒精200ml左右，处理1min，倒掉，再加入0.5浓度安替福民（有效氯为4%）250ml，加盖常温下，摇床上振荡灭菌30min。
烧杯（2）和烧杯（3）的种子灭菌方法同上
3） 灭菌后漂洗
将三个烧杯移至超净台，其中的种子分别移至新的无菌烧杯中，加无菌水漂洗。一共洗4遍，每遍放置5min。最后一遍，放250ml无菌水，该上无菌盖子，置于超净台，等所有平板倒好，将浸泡的种子用无菌水换洗后，倒出无菌水，在无菌药勺协助下，将部分种子刮到预先准备好的无菌滤纸上。把2和3分别装到无菌的150ml的烧杯中，并盖上盖子，移到外面，准备用超声波处理。
4） 超声波处理
将烧杯2和烧杯3的种子进行超声波灭菌，烧杯2用超声波处理1min ，烧杯3用超声波处理2min。
5） 倒培养基
超净台吹20min左右。
6） 接种
表 6 用超声波处理的种子接种
实验编号 来源 培养基 备注 粒数 灭菌情况
80112L11C1
80112L11C2
80112L11C3
80112L11C4 709281A2
709281A2
709281A2
710142A1 80111BC2
80111BC2
80111BC2
80111BC2 5个平板 50 30min
4个平板 36 30min
4个平板 36 30min
9个平板 90 30min
放在暗室中培养。80112L11C1按正常步骤，80112L11C2用超声波处理1min，80112L11C3用超声波处理2min，80112L11C4的种子预先用热水浸泡了36小时。
3 结果与讨论
3.1 毛竹种子形态观察结果
（从左至右，从上至下）种子外观，种子内部，种子中间横切，种子头部的胚。
a．种子外观图 b.种子内部图
c.种子中间横切 d.种子头部的胚
图1 毛竹种子形态观察图
种子的种皮是包被在种子最外面的结构，棕色，较薄，呈膜质。具有保护功能，可以保护种子内的胚，避免水分丧失、机械损伤和病虫害侵入。其竖切面呈乳白色，由前半部分的胚和后半部分的胚乳构成，中部的横切面，用肉眼看起来呈乳白色，在电子显微镜下观察其中间部分是絮状的乳白色。头部的胚，其胚根和胚芽体积较小。胚轴较短，在种子中不显著。种子萌发时，胚轴随之生长，变长，成为植物幼根或幼茎的一部分，胚是构成种子的最重要部分，是新一代竹子的幼体。胚乳是种子内贮藏营养物质的场所，由贮藏组织构成，为胚的发育和生长提供营养。
3.2 毛竹种子含水量的测定结果
表7 毛竹种子含水量的测定结果
铝 盒 号 1 2 3 4 5 6
盒重
瓶样重
烘重
含水量 16.4891
19.7152
19.4340
8.71 17.1372
20.1163
19.8584
8.66 16.4914
20.2447
19.9200
8.65 16.8786
17.9937
17.87777
10.4 16.1244
17.1413
17.0328
10.7 16.2971
17.3757
17.2662
10.2
种子的含水量种子是检验项目和种子质量指标之一。种子内所含水包括游离水、束缚水和化合水3种。种子水分测定的主要对象是游离水。中国主要作物种了安全贮藏水分的最高限度为：灿稻13.5%，粳稻14%，小麦12%，大麦、大豆、玉米均为13.5%，棉籽12%等。
毛竹的种子含水量平均达到9.0%, 测定其含水量有重大意义，不仅对研究其贮藏条件有直接影响，而且关系到到种子的发芽率和活力。而同科的水稻，它的含水量平均只有5％～6％，含水量也是其中一个很重要的因素。
3.3 通过不同浓度的次氯酸钠对毛竹种子的消毒情况
表8 毛竹种子发芽率的测定结果
标号 发芽率（%） 发霉率
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 8.3
19.4
66.7
5.6
47.2
11.1
19.4
2.8
3.9
0 77.8
47.2
13.9
30.6
30.6
47.2
58.3
55.6
30.6
0
3.3.1 正交实验结果分析
可以看出处理3的效果最好，即80%，30min的处理较好，发芽率可以达到66.7％，发霉率仅为13.9％。次氯酸钠在消毒的过程中，同时也在一定程度上抑制了种子的活性和愈伤组织的形成。次氯酸钠属于高效的含氯消毒剂。含氯消毒剂的杀菌作用包括次氯酸的作用、新生氧作用和氯化作用。次氯酸的氧化作用是含氯消毒剂的最主要的杀菌机理。含氯消毒剂在水中形成次氯酸，作用于菌体蛋白质。次氯酸不仅可与细胞壁发生作用，且因分子小，不带电荷，故侵入细胞内与蛋白质发生氧化作用或破坏其磷酸脱氢酶，使糖代谢失调而致细胞死亡。
R-NH-R+HC10---RNC+H2O（细菌蛋白质）
次氯酸钠的浓度越高，杀菌作用越强。
而次氯酸钠在水中能解离为次氯酸
NAC10+H2O---NAOH+HC10
所以说次氯酸钠溶液是一种高效的消毒液。
3.3.2 分析影响次氯酸钠杀菌作用的因素：
①、 pH：pH值对次氯酸钠杀菌作用影响最大。PH值愈高，次氯酸钠的杀菌作用愈弱，PH值降低，其杀菌作用增强。
②、 浓度：在pH、温度、有机物等不变的情况下，有效氯浓度增加，杀菌作用增强。
③、 温度：在一定范围内，温度的升高能增强杀菌作用，此现象在浓度较低时较明显。
④、 有机物：有机物能消耗有效氯，降低其杀菌效能。
⑤、 水的硬度：水中的Ca2+、Mg2+等离子对次氯酸盐溶液的杀菌作用没有任何影响。
⑥、 氨和氨
基化合物：在含有氨和氨基化合物的水中，游离氯的杀菌作用大大降低。
⑦、 碘或嗅：在氯溶液中加入少量的碘或臭可明显增强其杀菌作用。
⑧、 硫化物：硫代硫酸盐和亚铁盐类可降低氯消毒剂的杀菌作用
3.4 比较不同蔗糖浓度和胚乳对污染和愈伤组织质量影响
表9 毛竹种子培养一周后的污染统计结果
实验编号 污染数 总数 污染率
71201BC3+
71201BC4+
71201BC3-
71201BC4- 2
4
22
28 50
54
64
56 4%
7.4%
34.4%
50%
“-”表示种子切去一半的胚乳
“+”表示种子切去较多的胚乳
胚乳（endosperm）：是种子内贮藏营养物质的组织。胚乳的主要成分是蛋白质、淀粉、脂肪，不同种子各成分的含量高低不同，胚乳的作用是在种子萌发、胚生长和愈伤组织诱导的过程中提供营养物质，如蔗糖和淀粉。但是在运送营养物质的过程中，也带入了某些对种子产生一定污染性的物质，通过71201BC3+和71201BC3-的比较发现，71201BC3-的污染率明显高于71201BC3+，但是对于种子污染到底是由于哪种物质引起的，目前尚未有相关文献记载。邢树堂等人[31]研究了一种有效地提高银杉人工菌根苗诱导率的方法，通过将银杉种子播种于琼脂培养基7 d后，切除1/5 ～1/3的种皮以及胚乳，从而使银杉种子的发芽率达到60％以上。该实验的结果表明：当银杉种子直接播种在培养基上，其自然发芽率仅达3．3％(1／30)，而种子经过种皮以及胚乳部分切割后，发芽率平均达到60％以上 , 并且，1/5 ～ 1/3的切割程度是该发芽率的一个重要因素。当将胚乳全部切割后，大大影响种子的发芽率，绝大多数胚不能进行萌发。这与王维飞[32]等人在研究高山茅的组织培养条件实验有一致的结果，他们研究发现将羊茅的成熟种子去除胚乳，可使诱导率提高17%。
通过对比发现，胚乳多的外植体污染率明显偏高，而且随蔗糖加入量的增加，污染率也会增加。
表10 接种9天后对芽和愈伤数的统计
培养基编号 种子数 长芽数 长芽率 愈伤数 愈伤诱导率
71201BC3+
71201BC4+
71201BC3-
71201BC4- 49
54
64
56 31
30
20
56 63.2%
55.5%
31.2%
100% 12
3
5
0 24.4%
5.5%
9.3%
0
a.带胚乳多胚诱导的愈伤 b.带胚乳少胚诱导的愈伤
图2 典型的愈伤组织图
71201BC3+的愈伤诱导率明显比71201BC4+来的高，可能是由于糖的加入量增加，渗透压升高，不利于愈伤的形成。说明无胚乳要比半胚乳的愈伤和芽的形成有利。
胚乳多的愈伤相对长得大一些，蔗糖浓度高而且胚乳多的长芽率高，蔗糖浓度低而且胚乳少的愈伤诱导率来得高
有上述数据还可以看出，胚乳较少的愈伤诱导率要高于胚乳较多的，但胚乳多的愈伤相对长得大一些，可能一旦胚上带有大一点的胚乳会突破愈伤出现时的限制，则胚乳中含有的营养物质和激素可以有助于愈伤的生长。
3.5 利用超声波对竹子种子的愈伤诱导实验
表11 超声波处理愈伤诱导一周天后对芽和愈伤数的统计
实验编号 愈伤数 发芽数 总数 污染数 发芽率 愈伤诱导率
80112L11C1
80112L11C2
80112L11C3
80112L11C4 12
7
8
15 29
23
15
15 50
36
36
90 0
1
0
1 24%
19.4%
53.3%
16.6% 58%
63.8%
41.6%
16.6%
统计标准：发芽——以长出1mm以上的芽为标准
长根——以长出1 mm以上的根为标准
从本次观察结果来看，80112L11C1是正常的种子。
80112L11C2是用超声波处理1min，结果愈伤诱导率反而比正常的种子的愈伤诱导率要低，据文献表明[33]，经超声波处理的种子并不一定会提高种子的活力，要看种子本身的活力，含水量和处理方式，但是和80112L11C3的对比来看，种子是同一批的，可能是由于误差引起的。
80112L11C3是用超声波处理2min，结果愈伤诱导率果然增加了种子的愈伤率，而且增加了将近一倍，效果十分明显。可以考虑在提高超声波处理的时间。
超声波是一种频率超过20 kHz的弹性机械波，能促进许多植物种子萌发超声波处理能改变质膜通透性，促进细胞内外的物质交换． 超声波的生物学效应主要是由空化作用引起． 当超声波在液体中传播时，将引起媒质分子以其平衡位置为中心的震动，在超声波压缩相内，分子间的距离缩小；而在稀疏相内，分子间距离将增大。如果声强足够大，液体受到的相应的负压也足够大，分子间的平衡距离将增大，以至超过相限距离，从而破坏液体结构的完整性。该作用可能导致空泡周围的细胞壁和质膜的击穿或可逆的质膜透性改变。另外，高强度的超声波可导致细胞破碎和酶失活，而当超声波强度适宜时，这种改变是可逆的。细胞自身能修复壁和膜的破损． 因而这种可修复的损伤可改变细胞质膜的通透性，促进细胞内外物质的交换，从而促进种子的萌发任兴安等对水稻种子萌发的研究表明，超声波可提供能量，使某些酶的活性增强而破除对种子的休眠作用。近年研究表明，种子经射线、超声波、电场处理后，可以打破休眠，促进种子的萌发，提高种子活力，电场或射线处理后，种子得到物理能量，引发一系列反应，使有些关键酶的活性增强，而破除了种子的休眠。
80112L11C4是原先的种子用温水浸泡了36小时后进行接种的，结果其愈伤诱导率和发芽率明显比正常种子来得低，尤其是发芽率。陈信波[33]等人研究发现种子经过浸泡之后会降低种子的活性，而只有在浸泡后在干燥，才会提高种子的活力。
a.种子预先用超声波处理的 b.种子预先用温水浸泡了36小时
图3 超声波处理后的愈伤效果对照图
80112L11C3的种子用超声波处理2min，80112L11C4预先用热水浸泡了36h。
80112L11系列的种子形成的愈伤质量基本上一样，a图是一个典型的带愈伤和芽的种子。b图是80112L11C4中用热水浸泡过的，一个典型的未发芽的种子。
提高种子活性的方法还有渗透调控处理、湿平衡处理和浸泡—干燥处理、化学药物处理和物理因素处理（磁场及磁化水处理、电场处理、射线处理、超声波处理）等。种子活力的高低是由种子的遗传特性及其发育形成过程中的条件所决定的：种子的成熟度、成熟过程中的外界条件及收获、运输、贮藏过程中的环境条件都会影响种子活力的表达。有关种子活力的各种影响因素及保持种子活力的方法已有大量的研究报道，并在生产上得到了应用，但由于成熟和收获过程中不良环境的影响及现有的收获、加工、贮藏条件的限制
，种子活力的降低仍是农业生产上的一大问题。种子预处理是提高种子活力的一条重要途径。它具有提高种子田间出苗率，提高成苗的速率和整齐度，促进幼苗生长增加种子在不良环境条件下的发芽率和成苗率，提高作物的产量，增加作物成熟及品质一致性等作用。
4 总结与展望
竹子组织培养，90%集中于丛生竹种，有关散生竹组织培养成功的报道较少。近几年来，我国在散生竹组织培养技术方面有了长足的进步，已经有8种散生竹通过以芽繁殖芽的形式实现植株再生。其余关于散生竹的研究都集中在毛竹上，许多科研机构在长期不懈的开展竹子组织培养研究，初步建立了完整的适于竹子转基因研究的组织培养体系。参考禾亚科成熟的基因工程育种技术，结合竹子特点，提出竹亚科的基因工程育种技术较有效的途径可能为：竹子外植体—愈伤组织—悬浮细胞系—基因转化—愈伤组织—植株再生。相信随着生物技术的飞速发展，开展竹子分子育种将成为可能。
外植体不经过愈伤组织而直接诱导器官发生，然后形成完整植株是竹类组培中一种相对较成熟的快繁技术。如麻竹、绿竹、勃氏甜龙竹、牡竹撑绿竹、菲白竹、金镶玉竹等竹种已经可以通过这些技术规模化生产竹苗。而通过愈伤组织诱导得到植株再生是进行竹子转基因的重要基础，目前这方面较为成功的主要是麻竹和绿竹等少数丛生竹。
本研究通过对毛竹胚愈伤组织和分化规律的研究，建立了毛竹愈伤组织诱导体系，为毛竹的分子育种打下了基础；通过研究毛竹愈伤组织分化规律，为毛竹植株再生和调控提供实验依据。同时，也通过该研究对其它散生竹种的愈伤诱导和植株再生的研究起到了积极的推动作用。
致 谢
首先要感谢我的指导老师黄俊老师和彭华正博士在学习上对我的谆谆教导、工作上的关心和支持。在承担繁忙的事务的同时，仍对我们实验进行细心的指导。彭老师严谨的治学态度、敏锐的科学洞察力、渊博的学识、勤奋而一丝不苟的工作精神给了我许多启迪，同时导师的言行也让我学会了许多做人的道理，导师永远是弟子学习的楷模。十分感谢彭老师为我们提供了最好的实验环境，并在各方面都给了我很大的帮助。
同时，我也要感谢我的师姐李楠和师弟夏逢湖在实验上对我的鼓励和帮助，还要感谢生化系所有曾经教导过，帮助过我的老师和同学们，更要感谢默默支持着的我的家人，没有他们，我就不可能顺利完成学业。今后我将更加努力的工作，取得更大、更多的成绩来回报他们。
也衷心的感谢审阅此文的各位老师。
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