1.绪论
1.1 枯草芽孢杆菌概况
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌，其生理特征多样，分布广泛，极易分离培养。该菌在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力[1]。
国内外关于枯草芽孢杆菌的研究与应用已有100多年的历史，早期大部分工作集中在形态观察、分类鉴定、生理机制、功能发掘及防治等方面。近年来，对枯草芽孢杆菌的研究渐进到遗传学与分子生物学领域，研究内容体现在特定功能基因的寻找并克隆到需要的物种中或者通过诱变、基因工程等手段对枯草芽孢杆菌生产菌进行遗传改造等。
1.1.1 国外研究概况
1945年Johnson等报道，枯草芽孢杆菌具有防治植物病害的作用。此后，用枯草芽孢杆菌制备生防制剂防治植物病害的研究成为国内外研究的热点。1980年Papavizas G C报道，枯草芽孢杆菌可以防治水稻等作物的多种土传真菌病害。1992年Hwang等报道，用枯草芽孢杆菌可以防治豌豆的Rhizoctoni根腐病。20世纪90年代后，国外已有多种枯草芽孢杆菌制剂投放市场。美国Agraquest公司用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)QST 713菌株和QST 2808菌株分别开发出活菌杀菌剂SerenadeTM和Souata AS，已在美国登记使用，叶面施用可防治蔬菜、樱桃、葡萄、葫芦和胡桃的白粉病、霜霉病、疫病、灰霉病等细菌和真菌病害。2001年Gustafson将解淀粉枯草芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌混合制成混合生防药剂，称为BioYield。解淀粉枯草芽孢杆菌变种(B.subtilis var.amyloliquefaciens FZB24)作为植物促长剂被Taensa公司商品化生产，商品名TaegroTM。施用于温室或室内栽培树苗、灌木和装饰植物根部，可防治由镰刀菌和丝核菌引起的根腐病和枯萎病。
1.1.2 国内研究概况
国内一些单位也对具有生防作用的枯草芽孢杆菌进行了研究，涉及的防治对象有大田作物的叶部病害、土传病害和果实病害等。不同菌株的抑菌谱、抑菌作用乃至抑菌机理等亦有较大差异。现已从作物的根际土壤、根表、植株及叶片上分离筛选出多株对不同作物的真菌和细菌病害具有拮抗作用的枯草芽他杆菌株，并采用人工诱变方法提高了菌株的防病效率，对这些菌株进行了发酵条件的研究，分离出一些抗菌物质并对其特性进行了研究，同时开展了生防菌剂的温室和大田试验。国内已开发成功并投入生产的枯草芽孢杆菌商品制剂有百抗、麦丰宁、纹曲宁、依天得、根腐消等[2]。云南农业大学和中国农业大学共同研制的微生物农药“百抗”(10亿/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂)获得农业部登记注册，已在多个省推广使用，推广面积约4 667hm2，主要防治水稻纹枯病、三七根腐病、烟草黑胫病。百抗的主要有效成分是枯草芽孢杆菌B908。大田应用中，百抗对水稻纹枯病防效70％以上。其抑菌机制为营养竞争、位点占领等。南京农业大学研发的麦丰宁是由枯草芽孢杆菌菌株B3制成的活体生物杀菌剂，对小麦纹枯病田间防效达50％～80％，其防病机制主要表现在产生抑制小麦纹枯病病菌菌丝生长、菌核形成和菌核萌发的抗菌物质。根腐消为昆明沃霖生物工程公司登记注册的由枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌复配的可湿性粉剂，通过灌根处理防治三七根腐病。武汉天惠生物工程有限公司完成登记并投产的枯草芽孢杆菌BS-208可湿性粉剂抗灰霉、白粉2种病害，为细菌性植物保护剂，是多种植物病原菌的竞争性抑制剂。它通过竞争性生长繁殖占据生存空间的方式来阻止植物病原菌的生长，能在植物表面迅速形成一层保护膜，使农作物免受病原菌为害。枯草芽孢杆菌还能分泌抑菌物质，抑制病菌孢子发芽和菌丝生长。江苏省农业科学院陈志谊等[3]经过多年生物防治水稻病害的研究获得了防治水稻纹枯病的效果达50.0％～81.0％的枯草芽孢杆菌B-916菌株，现已在江苏等地得到广泛推广。
1.1.3 应用
随着人们对枯草芽孢杆菌研究的深入开展，发现其在工业、农业、医药卫生、食品保健、水产养殖、环境保护等方面具有广泛应用价值。
1.1.3.1 枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用
工业酶的生产是工业微生物发酵的重要组成部分。据来自BBC的统计数字，2004年全球酶的交易额达到20.0亿美元(15.3亿欧元)，其中食品酶占29％，饲料酶占15％，一般的工业酶占56％。枯草芽孢杆菌是当今工业酶生产应用最广泛的菌种之一，据不完全统计，枯草芽孢杆菌所产的酶占整个酶市场的50％。由于其产酶量高、种类多、安全性好和环保等优点，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种，其发酵生产的酶已在食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸和医药等领域均发挥着十分重要的作用。
枯草芽孢杆菌生境多样，可利用的营养物质种类十分丰富，这决定了其自身含有丰富的产酶系统，具备生产多种酶的应用潜力。研究资料表明，枯草芽孢杆菌能够产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等十几种酶。在过去的10年，利用基因工程技术，枯草芽孢杆菌几乎可以在短期内大量生产任何种源的新酶，从而省略了大量的原始菌种改造、驯化、毒理学实验等工作；利用蛋白质工程技术，能够在生产新酶之前对该酶的性质进行改良和调整，从而改善酶的活性或者赋予酶新的所需性质。这些新技术的应用使新酶种的开发周期大大缩短，难度和成本降低，产品更加稳定有效。
枯草芽孢杆菌酶的主要应用领域是食品工业，全世界食品工业用酶约占总量的60％，而我国则高达85％以上。这些酶在动物蛋白水解行业中的骨素加工、植物蛋白水解中的大豆蛋白和大豆肽生产、乳制品和婴儿食品生产等工业过程中都已得到广泛的应用，如在面包生产中α-淀粉酶、蛋白酶能有效提高面团工艺性能和面包质量(体积、内部结构、风味等)，并延长面包保鲜期；在玉米深加工领域，采用耐高温淀粉酶和糖化酶的“淀粉喷射液化”技术以及“双酶法”糖化技术全面带动了我国淀粉糖、味精和柠檬酸等生产工艺的改革。
1.1.3.2 枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用
枯草芽孢杆菌作为植物病害生防细菌之一，具有较强的防病作用。美国迄今已有4株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可，如美国AgraQuest公司用枯草芽孢杆菌QST713菌株开发出活菌制剂杀菌剂SerenadeTM。并于2000年通过美国环保局(EPA)的登记，用于防治多种作物的白粉病、霜露病
、疫病、灰霉病等病害。枯草芽孢杆菌MBI600在英国的MicroBio Group Ltd.、日本的Idemistu Kosan Co.，Ltd.等均已获得注册登记，并进行产业化生产，用于防治叶部病害(灰霉病、白粉病)和根部病害(枯萎病、根腐病、黑斑病等)。
1.1.3.3 枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用
枯草芽孢杆菌是我国允许使用的饲料微生物菌种，因其无毒、无害，经常被制成微生物添加剂，用于改善动物肠道功能、促进动物生长和预防疾病。枯草芽孢杆菌在制剂中以内生孢子形式存在，孢子进入动物肠道后，在肠道上部能迅速复活并分泌高活性的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，有助于降解植物性饲料中复杂的碳水化合物，产生具有拮抗肠道致病菌的多肽类物质等，起到抑菌和预防作用。另外，枯草芽孢杆菌是好氧菌，可通过消耗肠道内的氧气造成厌氧环境，促进肠道内优势菌厌氧菌的繁殖，维持肠道生态平衡。如，研究发现猪采食含107CFU/g枯草芽孢杆菌制剂的饲粮3周后，粪中双歧杆菌数量显著上升，而链球菌和梭菌的数量则显著下降，且这种趋势仔猪较母猪更明显；猪饲料中添加枯草芽孢杆菌不仅可以提高饲料转化率和氮利用率，而且可以减少氨的产生。此外，枯草芽孢杆菌具有耐高温、耐酸碱和耐挤压等特性，在饲料加工中保存良好，有利于推广应用。
1.1.3.4 枯草芽孢杆菌在医药卫生领域的应用
研究证明，枯草芽孢杆菌的活菌制剂可以作为口服液用于治疗肠炎、支气管炎和腹泻等多种疾病，也用来预防和治疗烧伤面的感染。最近，科学家发现从枯草芽孢杆菌提取到的淀粉酶、纤维素酶能够补充体内消化酶的不足，恢复正常消化机能；蛋白酶能够分解发炎部位纤维蛋白的凝结物，消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑。日本人日常生活中食用的纳豆就是利用枯草芽孢杆菌生产的，研究表明，纳豆中含有的溶栓酶(纳豆激酶)对心血管疾病有很好的预防和治疗作用；而同样由枯草芽孢杆菌合成的聚谷氨酸可用作药物缓释材料和医用高分子纤维材料等。
1.1.3.5 枯草芽孢杆菌在水产养殖领域中的应用
枯草芽孢杆菌在水产养殖中的应用起步较晚，由于它能分泌蛋白酶等多种酶类和抗生素，使池底积累的大量残余饵料、排泄废物、动植物残体以及有害气体(氨、硫化氢等)，使之先分解为小分子(多肽、高级脂肪酸等)，后分解为更小分子的有机物(氨基酸、低级脂肪酸、单糖、环烃等)，最终分解为二氧化碳、硝酸盐和硫酸盐等，有效降低了水中的COD、BOD，使水体中的氨基氮(NH3-N)、亚硝基氮(NO2-N)和硫化物浓度降低，从而有效地改善水质，同时还能为以单细胞藻类为主的浮游植物提供营养物质，促进繁殖。这些浮游植物的光合作用，又为池内底栖水产动物的呼吸、有机物的分解提供氧气，从而使养殖水体形成一个良性的生态循环；另外，它们分泌的多种酶类和抗生素可以抑制其他细菌的生长，进而减少甚至消灭水产养殖动物的病原体。越来越多的学者已通过研究发现，枯草芽孢杆菌可在水产养殖中发挥重要的作用[4]。
1.1.3.6 枯草芽孢杆菌在环境保护方面的应用
尹文林等[5]不同养殖水体用20亿/g枯草芽孢杆菌B115株0.5mg/L后，对养殖水体的溶氧和pH无明显的影响；氨氮最大降解值出现在使用后的第3～4天，平均降低(45.40±5.06)％；亚硝酸盐氮的最大降解值出现在使用后第3天，平均降低率为(16.03±3.82)％；硫化物的最大降解值出现在使用后第3.4天，平均降低率为(23.01±7.27)％。与对照组相比有明显差异(P >0.1)，对总大肠茵群也有明显的抑制作用。此外，枯草芽孢杆菌在降解多环芳烃和乐果方面也有较好的应用前景。李丽等[6]从长期受多环芳烃污染的土壤中分离出1株菲降解菌—菌Ⅱ，经生理生化及16SrDNA析鉴定，该菌株为枯草芽孢杆菌。在单基质菲、芘反应体系中，该菌株具有较强的降解能力。该菌不但可以在高浓度的多环芳烃存在下生长良好而且对高浓度多环芳烃有较高的降解能力。
1.2 本项目的研究目的及意义
国内外对枯草芽孢杆菌的研究大都把视线放在了营养体细胞和代谢物质上，而对芽孢杆菌的抗逆性休眠体——芽孢，却研究得不多。芽孢是产芽孢细菌在生长过程中形成的一种抗逆休眠体，并非细菌生活史中的一个不可缺少的部分，但由于芽孢具有极强的抗热、抗辐射、抗化学药物和抗静水压等一些特殊的性质，因此对芽孢形成条件的研究是极具意义的，它的形成受营养物质和环境因素的影响，不同菌种形成芽孢的条件不同。枯草芽孢杆菌的芽孢较其营养体细胞易保存，复活率高，是制备枯草芽孢杆菌制剂的理想存在形式 ，而制剂中的芽孢含量是影响制剂应用效果的关键因素。因此，一些学者对枯草芽孢杆菌的发酵培养进行了研究，以期获得较高的含菌量或芽孢量。张丽霞等[7]采用 Plackett-Bruman设计法和响应面分析法，在摇瓶发酵条件下，使含菌量明显提高；张根伟[8]通过单因素试验和正交试验，对枯草芽孢杆菌BS-6液体发酵条件进行了研究；郭小华等[9]也在枯草芽孢杆菌MA 139增埴培养基的优化研究中，使芽孢产量大幅度提高。
本文对枯草芽孢杆菌黑色变种ATCC 9372的产孢特性进行研究，以期获得较佳产孢条件，为其制剂的产业化生产提供基础资料。同时，本课题为直线式无菌设备微生物安全性检测的一部分。通过对枯草杆菌黑色变种菌株的芽孢形成条件进行研究，获得较高的芽孢形成率，以用于设备的无菌检测，也使学生通过实验掌握微生物培养、芽孢计数等基本微生物实验技术。
2.实验部分
2.1 材料与方法
2.1.1 材料
2.1.1.1 实验菌种
枯草芽孢杆菌黑色变种（Bacillus subtilis var. niger）ATCC 9372，购自中国工业微生物菌种保藏中心。
2.1.1.2 试剂
蛋白胨、小牛浸膏、酵母浸膏、D-果糖、可溶性淀粉为国产生化试剂；蔗糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖，NaCl、CaCO3、 kH2PO4、K2HPO4、MgSO4•H2O、MnSO4•H2O为国产分析纯试剂。
2.1.1.3 仪器
752紫外可见分光光度计，上海精通；Boxun SB-JC-1B-Z超净工作台,上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HH-4数显恒水浴锅，上海精化仪器有限公司；SUKUN SKY-2102C 智能光照培养箱，宁波海曙赛福实验仪器厂；LDZX-50KB 立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂； SUKUN SKY-200B 摇床培养箱；J-2菌落计数器，江苏姜堰市康泰医疗器材厂；SX2-2.5-10型电炉，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；其他玻璃
仪器，如烧杯、平皿、试管等。
2.1.1.4 培养基
斜面培养基
牛肉膏蛋白胨培养基（g/L）：小牛浸膏3g，蛋白胨5g，NaCl5g,琼脂15～20g,水1L，pH7.0。
液体培养基
摇瓶培养基包括①种子培养基 (g/L)：小牛浸膏3g，蛋白胨5g，NaCl5g，水1L，pH7.0；②碳源源基础培养基（g/L）：酵母浸膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，pH7.0；
③氮源基础培养基（g/L）：葡萄糖5g，NaCl5g，pH7.0；④无机盐基础培养基（g/L）：葡萄糖5g，蛋白胨10g，酵母浸膏10g，pH7.0；⑤SDAY培养基（g/L）：葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母浸膏10g，pH7.0。
活菌及芽孢检测用培养基
NA培养基：小牛浸膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15～20g，水1L，pH7.0。
2.1.2 方法
2.1.2.1 菌种活化
将冷藏的菌种接种到斜面培养基上，30℃培养24h。
2.1.2.2 种子液的制备
用无菌水将种子从斜面上刮洗下来，并取适量接入盛有100ml无菌种子培养基的300ml锥形瓶中。置30℃，150r/min的摇床中振荡培养24h。
2.1.2.3 摇床培养
在无菌超净台里，用无菌移液管从种子液中取1ml接种量（v/v）分别接入不同配方的培养液中，置摇床中30℃, 150r/min，振荡培养24h后，取样检测。
2.1.2.4 测定方法
Ⅰ.枯草芽孢杆菌ATCC 9372生长曲线[10]的测定
①最大吸收波长的确定
菌种经30℃摇床培养24h后，取样，利用紫外可见分光光度计对样品在波长400～600nm处进行扫描，选出最大吸收峰。
②比浊法测定生长曲线
菌悬液的制备：将30℃培养24h的菌斜面一支，用5mL无菌水，洗下菌苔制成菌悬液，吸取0.3mL菌悬液，接种到装有20mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的锥形瓶中，于30℃摇瓶培养24h。
接种：取12支装有灭菌过的牛肉膏蛋白胨液体培养基的培养管（每管5mL），接种上述菌悬液，每管0.1mL，轻振摇匀。
培养：将接种后的12支培养管，置于摇床上，30℃振荡通气培养，分别在培养0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22h后取出，放冰箱中保存，最后一起以1cm比色皿比浊，以未接种的液体培养基为参比，测定其在最大吸光峰下的吸光度A值。
Ⅱ.活菌及芽孢数的测定
①活菌总数的测定：以倾注法进行活菌计数。取合适的稀释度2～3个，每个稀释度取1ml做3个平板,然后于30℃恒温培养箱中培养24h后计数。
②芽孢数的测定：菌液于80℃水浴加热20min,杀死活体营养细胞，再用倾注法进行芽孢计数。
③芽孢得率计数公式：芽孢率％ =(芽孢数／活菌总数)X100％ 。
2.2 试验设计
2.2.1 Strain ATCC 9372的生长曲线的测定
采用比浊法测定该菌种的生长曲线。
2.2.2 培养基组成试验
用单因素法，对不同的C源、N源、微量元素及无机离子对芽孢形成的影响进行了研究，确定并选取其主要影响因子，再做正交试验，确定最佳培养基组成。
2.2.3 培养条件单因素试验
在最佳培养基基础上，对不同初始pH、培养温度、接种量和溶氧水平对芽孢形成的影响进行了研究，确定最佳培养条件。
2.2.3.1 初始pH对该菌株芽孢形成的影响
在筛选出的最佳培养基中，用适当浓度的盐酸和氢氧化钠溶液调节初始pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0，研究初始pH对芽孢形成的影响。
2.2.3.2 培养温度对该菌株芽孢形成的影响
在上述试验基础上（确定最佳初始pH值为7.0），研究不同培养温度，分别为25℃、30℃、35℃，对芽孢形成的影响。
2.2.3.3 接种量对该菌株芽孢形成的影响
在100ml/250mL锥形瓶中分别接入1％、5％、10％、15％（v/v）的种子液。
2.2.3.4 溶氧水平对该菌株芽孢形成的影响
在250mL锥形瓶中分别加入最佳培养液25、50、75、100、150mL。
3.结果与讨论
3.1 Strain ATCC 9372生长曲线的测定
3.1.1 最大吸收波长的确定
由图可知，530nm 为最大吸收峰。
3.1.2 生长曲线的绘制
以培养时间t为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制A—t标准曲线。枯草芽孢杆菌ATCC9372的生长曲线见下图。
图2 枯草芽孢杆菌的生长曲线
由图可知，4h前，枯草芽孢杆菌生长缓慢，数量增加并不明显；4h后大量繁殖，呈对数增长，并在10h左右达到最大值；然后进入平稳期；14h后进入衰亡期。
3.2 最佳培养基组成试验结果
根据试验结果，选用果糖、乳糖做C源，牛肉膏、蛋白胨做N源，pH均为7.0，NaCl5g/L，Mn2+ 浓度为2.4mmol/L，设计4种培养基，于30℃摇床培养24h后，根据芽孢产量确定最佳培养基。
表1 ATCC9372培养基配方（g/L）
培养基号 小牛浸膏 蛋白胨 葡萄糖 乳糖 NaCl MnSO4•H2O
① 5 5 5 0.04
② 5 5 5 0.04
③ 5 5 5 0.04
④ 5 5 5 0.04
表2 不同培养基对芽孢形成的影响
培养基号 ① ② ③ ④
细胞总数×106（cfu/ml） 17.8 10.2 11.1 19.2
芽孢数×106（cfu/ml） 14.7 1.85 2.88 16.8
芽孢形成率 ％ 82.6 18.1 25.9 87.5
实验结果表明，④号培养基最佳，芽孢形成率达到87.5％。
3.3 培养条件单因素试验结果
3.3.1 初始pH对该菌株芽孢形成的影响
不同菌株的生长所需的酸碱条件不一[11]，为了考察该菌株生长所需的最适初pH值，我们设计了4不同的pH值，分别为5.0、6.0、7.0、8.0，250ml锥形瓶培养基100ml，30℃摇床培养24h后，观察pH对芽孢形成的影响，结果如图所示。
图3 不同初始pH对芽孢形成的影响
试验结果表明，当pH为5.0时，芽孢产量非常低，随着pH升高，芽孢产量明显提高；pH7.0时，达到最大值，芽孢产量为 2.2×107cfu/ml，与其他初始 pH值下有显著差异；初始 pH值为8.0时，芽孢产量急剧下降，但细菌总数却是最多的。该种现象说明该菌种在偏碱条件下细胞生长较好，但芽孢形成缓慢。兼顾芽孢产量和芽孢得率的考量，选pH7.0为最佳。
3.3.2 温度对该菌株芽孢形成的影响
将培养温度设为 25℃、3O℃、35℃，250mL锥形瓶分装培养基100mL，150r/min摇瓶，考察培养温度对芽孢形成的影响，试验结果见图。
图4 培养温度对芽孢形成的影响
试验结果表明，在25～30℃范围内，该菌种在30℃时，芽孢数和芽孢得率最高，芽孢数为1.3×108cfu/ml，芽孢率为92.8％，因此选30℃为最佳。
3.3.3 接种量对该菌株芽孢形成的影响
接种量大小对菌株生长及芽孢形成有一定影响，接种量过大会带入较多的种子培养期的代谢产物，并使菌体前期生长过快，而使最终菌体数量及芽孢数量下降；接种量过小则使菌体增殖缓慢，芽孢形成缓慢，培养时间延
长[12]。试验在250mL锥形瓶中分装培养基100mL，接种ATCC 9372种子液，接种量（v/v）分别为1％，5％，10％，15％，考察其对芽孢形成的影响，结果如表3所示。
表3 不同接种量对芽孢形成的影响
接种量 细菌总数 芽孢数 芽孢率
（v/v） （cfu/ml） （cfu/ml） （％）
1％ 2.2×107 2.0×107 90.9
5％ 4.1×107 3.6×107 87.8
10％ 4.8×107 3.7×107 77.1
15％ 5.0×107 3.8×107 76.0
试验验结果表明：随着接种量的增大，菌体的生长量和芽孢形成数量都增大，但芽孢形成率确呈下降的趋势。综合芽孢形成量和芽孢形成数，接种量5%为宜。
3.3.4 溶氧水平对该菌株芽孢形成的影响
溶氧对芽孢的形成也有较大影响，有些在有氧条件下形成芽孢，有些却在无氧条件下才形成芽孢 ，有些芽孢形成率随溶氧浓度升高而升高，有些却又相反。Mohamed Ismall等[13]研究过球形芽孢杆菌溶解氧与芽孢形成的关系，发现随着溶解氧浓度升高，芽孢形成率也越高。但有的学者却得出了相反的结论[14]。枯草芽孢杆菌是好氧菌，溶氧水平不同，最终获得的菌体数量、芽孢数量不同。氧气是影响芽孢形成的一个重要因素，在以芽孢为目标的生产中，采用通风发酵，溶氧是发酵的关键环节之一。通常以不同的装液量控制溶氧量。试验采用250ml锥形瓶中分别加入最佳培养液25、50、75、100、150mL，进行摇瓶培养24h，考察溶氧对枯草芽孢杆菌ATCC 9372芽孢形成的影响，结果如图所示。
图6 装液量对菌种ATCC 9372芽孢形成的影响
试验结果表明，不同的装液量对枯草芽孢杆菌ATCC 9372的生长及芽孢的形成影响很大，溶氧增加促进了细胞的生长及芽孢的形成，装液量低 ，则通气量大，溶氧水平高，菌体的生长和芽孢的形成，装液量为25ml/250ml锥形瓶芽孢数量及芽孢形成率均最高，芽孢数达到3.4×107cfu/ml，芽孢形成率为94.4％，因此为最合适的装液量。
3.4 小结
综上所述，初步确定枯草芽孢杆菌ATCC 9372产芽孢的优化培养条件为：在最佳培养基（葡萄糖5g，蛋白胨 5g，NaCl5g，MnSO4•H2O0.04g）基础上，于pH7.0，接种量5%，装瓶量为25ml/250 ml锥形瓶，30C摇床培养24小时，此时，芽孢数量最多可达到3.4×107cfu/ml，芽孢形成率达到94.4％。
4.总结与展望
芽孢是产芽孢细菌在生长过程中形成的一种抗逆休眠体，并非细菌生活史不可缺少的部分，它的形成受营养物质和环境因素的影响。
本实验在确定最佳培养基基础上，研究了培养条件，包括初始pH、培养温度、接种量和溶氧水平，对枯草芽孢杆菌ATCC 9372芽孢产量的影响。
对于培养基的初始pH值来说，在5.0～8.0的考察范围内，菌体生长和芽孢形成对pH值的要求有所不同，pH5.0～6.0不适宜菌体及芽孢的形成；pH7.0～8.0适宜菌体生长，但pH7.0适宜芽孢形成而pH8.0不利于芽孢形成。因此，为了在提高菌体量的同时提高芽孢数量，pH值7.0最适宜。在温度25～35C的试验考察范围内，30℃时，芽孢数和芽孢得率最高，因此选30℃为最佳。接种量（v/v）1％～15％的试验考察范围内．接种量的提高有利于芽孢数量的提高，但接种后芽孢的倍增率则下降了，芽孢接种量在5％可取得最佳的平衡。
枯草芽孢杆菌ATCC 9372是好氧菌，溶氧是菌体生长和芽孢形成的重要因素。摇瓶试验结果显示，通气量大有利于菌体生长，提高芽孢形成率。
综上所述，初步确定枯草芽孢杆菌ATCC 9372产芽孢的优化培养条件为：在最佳培养基（葡萄糖5g，蛋白胨 5g，NaCl5g，MnSO4•H2O0.04g）基础上，于pH7.0，接种量5%，装瓶量为25ml/250 ml锥形瓶，30C摇床培养24小时，此时，芽孢数量最多可达到3.4×107cfu/ml，芽孢形成率达到94.4％。
本试验对枯草芽孢杆菌ATCC 9372产芽孢条件的研究是通过摇瓶发酵进行的，若要用于生产实际，需进一步进行发酵罐培养条件的探索。
致 谢
感谢指导老师魏培莲对本毕业论文从选题、构思、资料收集到最后定稿的各个环节给予的细心指引和教导,使我对于无菌检测有了深刻的认识,并最终得以完成毕业论文。同时也要感谢徐辉老师在使用实验仪器过程中,对我们的默默支持。
感谢实验过程中陈勇毅、王子宝、蒋增良等同学提供的帮助。
感谢潘碧静、叶细首等同学在论文写作过程中提供的软件操作方面的指导。
最后，我要向在百忙之中抽时间对本文进行审阅、评议和参加本人论文答辩的各位老师表示感谢！
参考文献
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