1 绪论
虾青素是一种具高附加值的酮式类胡萝卜素，具有极强的淬灭单线态氧和清除自由基的能力，它天然存在于甲壳纲动物（如虾、蟹壳）、鱼类（如红鳟鱼）、鸟类（如红鹤）和某些微藻中[1]。虾青素有很强的抗氧化功能［2，3］及抗光敏作用，其抗光敏作用比β- 胡萝卜素更强［4］,因其能清除体内的自由基，增强宿主免疫功能，具有抑制肿瘤发生、延缓衰老［5-8］等许多重要的生理和生物学功能，因而在食品添加剂、水产养殖、化妆品、保健品和医药工业等方面具有广阔的应用前景。
目前市场上虾青素的售价很高,其人工合成品的单价达 2000～2 500美元/kg[9]，因此研究和开发虾青素，特别是天然虾青素，具有重要的商业和经济价值。
法夫酵母(Phaffia rhodozyma)是一类能积累大量虾青素的红酵母，野生型的红法夫酵母虾青素含量为200～300 mg/ kg[10]，其虾青素含量占总占总类胡萝卜素的4 0%～9 5%，具有繁殖快、生长周期短、发酵工艺成熟等优点，是一种极具有产业化应用前景的天然虾青素原料[11]。但其工业化生产虾青素因其长时间低温（20℃）发酵, 以及稳定高产菌株的难以筛选而受到限制［12］。如何提高虾青素的产量以及降低生产成本，使其能工业化生产是现在需要解决的问题。目前国内外的研究热点主要是高产菌株的筛选、发酵条件的优化和细胞内虾青素的提取等三个方面。
本文主要介绍了虾青素的结构、性质、来源、功能、应用、发展前景等，通过实验初步研究了红法夫酵母（Phaffia rhodozyma）发酵生产虾青素的培养基的优化以及各组分的最佳配比。
1.1 虾青素的结构
虾青素是一种氧化型的类胡萝卜素，其化学结构为 3, 3 '- 二羟基 -β，β '- 胡萝卜素 - 4，4 '- 二酮酮式类胡萝卜素，分子通式为C40H52O4，相对分子量为596.86，熔点216℃, 从化学结构上虾青素可认为是在β-胡萝卜素的2 个β-紫萝酮环上3 4 位分别由一个羟基和酮基取代以后的产物，其结构式如图1：
图1 虾青素的结构式
1.2 虾青素的性质
虾青素在某些绿藻、细菌和某些酵母菌中以次生类胡萝卜素形态积累，它不仅同其他类胡萝卜素一样在分子中有很长的共轭双键，而且在共轭双键链的末端还有不饱和酮基和羟基，构成α-羟基酮。这些结构具有比较活泼的电子效应，极易与自由基发生反应并清除，因此，虾青素具有较一般类胡萝卜素更强的抗氧化性。除此之外，虾青素具有较强的水不溶性和亲脂性，易溶于氯仿、丙酮、苯和二硫化碳中，色泽为粉红色，在酸、氧、高温及紫外光条件下均不稳定,易氧化降解，氧化后成为鲜红色的虾红素（astancene）[13]。
1.3 虾青素的来源
1.3.1 化学合成
虾青素是类胡萝卜素合成的终点, 由β- 胡萝卜素转变为虾青素需加上个酮基和羟基,因此化学合成困难,且大多数为顺式结构, 生产成本高。同天然虾青素相比, 动物体对化学合成虾青素的吸收能力较弱，在体内也不能转化成天然的反式构型。出于安全性考虑, 在食品、饲料、医药及化妆品上的应用都受到很大限制[14]。美国食品卫生管理局( FDA) 仅批准反式结构的虾青素用于水产养殖的添加剂。目前, 仅有瑞士Hoffmann-La Roche 公司成功地合成了反式虾青素并投入市场, 商品名为Carophyll Pink( 加丽素粉红) , 虾青素含量约为5 %~10 %。动物体对化学合成的虾青素吸收能力较弱, 并且与天然虾青素相比其着色能力和生物效价低得多[15], 随着天然虾青素产业的兴起, 这种低效的产品会逐渐被淘汰。目前, 由于生物来源的虾青素产量还不够高, 化学合成的虾青素在水产养殖中仍具有一定的竞争优势。
1.3.2 酵母菌
1976 年，ANDREWES 等人［15］首次在法夫酵母中发现虾青素，引起了世人的极大关注。在野生酵母所产的10 多种类胡萝卜素中，虾青素是最大的组分，占总类胡萝卜素的40％~95％。法夫酵母已成为工业化生产虾青素的优良菌种。利用法夫酵母生产虾青素的特点是：生产速度快，细胞中不但含有丰富的蛋白质、脂类、维生素，而且还含有大量的不饱和脂肪酸及多种虾青素的前体。
1.3.3 藻类
研究发现一些藻类也含有虾青素，目前国内外报道最多的是雨生球藻（H.pluvialis）。雨生球藻是一种单细胞生物，在培养过程中，氮源缺乏，则在体内积累虾青素，若在培养基中添加二价亚铁离子，虾青素的合成能明显提高，含量可达40mg/L培养液和43 mg/g干细胞。雨生球藻生产虾青素的特点是：单细胞生物繁殖快、培养简单、易于提取，且藻粉可直接应用于食品及饲料工业，降低了成本。除雨生球藻外，还有通过培养绿藻（chlorrela spp）提取虾青素的报道。另据报道，衣藻（halamidomonas）、裸藻（euglena）、伞藻（acetabularin）等均含有虾青素［16］。
1.3.4 甲壳类水产品加工的废弃物
水生甲壳类动物中均含有虾青素。目前，国外的虾蟹加工业每年有1 000 万吨的甲壳类废弃物，从水产品加工的废弃物中提取虾青素既能增加经济收益，又有利于减弱废水的色度，减少污染。从水产品加工的废弃物中提取虾青素虽效率低、成本高，但人工合成的虾青素的生态安全性还未被证实之前，国内外仍然广泛采取这种方法生产虾青素。
1.4 虾青素的功能
1.4.1 着色功能
虾青素呈艳丽的红色,具有极强的色素沉积能力,作为一种功能性色素,在食品、饲料、化妆品等工业中有广阔的应用前景。
1.4.2 抗氧化作用
虾青素除可着色外,还可猝灭单线液态氧,清除自由基,防止脂质过氧化。虾青素具有极强的抗氧化能力,与其它类胡萝卜素相比,抗氧化顺序为虾青素>α- 胡萝卜素>β- 胡萝卜素> 红木素> 玉米黄质> 黄体素> 胆红素>胆绿素。虾青素的抗氧化能力比α-胡萝卜素高10 倍,比维生素E 高100倍,故又被称为“超级维生素E ”。
1.4.3 增强免疫力的作用
虾青素能显著影响动物的免疫功能,在有抗原存在时,能显著促进脾细胞产生抗体的能力,增强T 细胞刺激下人体血细胞免疫球蛋白的产生[17] 。
1.4.4 提高繁殖率
虾青素对水产生物的生长繁殖具有十分重要的作用。鲑鱼卵中的虾青素的含量水平可影响其孵化率,高含量时可减少胚胎死亡率,促进生长,增强生殖能力。
1.4.5 抗肿瘤作用
对于天然虾青素的抗肿瘤(抗癌)作用,国内外均有这方面的报道.汪振诚等通过体外培养大肠癌细胞菌株实验发现虾青素对其具有明显的抑制增殖作用[18] 。
1.4.6 其它作用
根据一
些最新的报道表明,虾青素还有帮助减弱时差反应的作用,虾青素能通过血脑屏障,有效防止视网膜氧化及感光细胞的损伤。说明虾青素在预防和治疗年龄相关性黄斑变性,改善视网膜具有良好效果,除此之外虾青素还可以保护心血管及中枢神经系统，预防动脉粥样硬化。
1.5 虾青素的应用
1.5.1 在养殖业中的应用
虾青素最大的市场是水产养殖业和家禽养殖业，主要用作鱼类（鲑鱼、鲟鱼、虹鳟鱼、真鲷等）、虾蟹等甲壳类动物以及家禽的饲料添加剂。虾青素是类胡萝卜素合成的终点，因此，进入动物体后可以不经修饰或生化转化而直接贮存在组
织中，并可与肌红蛋白非特异性结合。因而，鱼类和甲壳类对虾青素的吸收和积累要比其他类胡萝卜素如角黄质（canthaxanthin）、叶黄素(luxin)和玉米黄素(zeaxanthin)有效得多。虾青素不仅可以改善水生动物及禽类的色泽，还可作为激素促进鱼卵受精、减少胚胎发育的死亡率，促进个体生长、增加成熟速度和繁殖力。Bendich[19]认为，虾青素及其它类胡萝卜素之所以可以提高未成年鲑、鳟鱼类的存活率，是因为它们可以提高动物的免疫力。虾青素不仅可以提高鱼类的存活率和繁殖力，而且可提高母鸡的产蛋率、促进蛋鸡的健康。在家禽饲料中添加虾青素，可使鸡蛋黄增加色素含量，这是欧洲消费者首先考虑的商品参数。虾青素还能够增加鱼类的风味。
1.5.2 用作食品添加剂
虾青素目前已被作为食品添加剂用于食品的着色、保鲜及营养。虾青素为脂溶性，具艳丽红色和强抗氧化性能，对于食品尤其含脂类较多的食品，既有着色效果又可起到保鲜作用。Bjerkeng等的实验结果表明虾青素有助于鳟鱼片的保鲜。在日本，含虾青素的红色油剂用于蔬菜、海藻和水果的腌渍已申请专利，用于饮料、面条、调料的着色均有专利报道。
1.5.3 在药品和保健品中的应用
随着虾青素生物功能研究和药理药效试验的逐步深入，虾青素的最新应用是药品和高级营养保健食品产业。在化妆品中添加虾青素可以起到抗衰老、防晒的效果，用于唇膏可长时间保持着色且有利于皮肤健康。日本已有利用虾青素的抗光敏作用生产化妆品的专利。研究表明，虾青素能通过血脑屏障，有效防止视网膜的氧化和感光器细胞的损伤，可用于预防和治疗“年龄相关性黄斑变性”，改善视网膜功能。虾青素具有保护神经系统尤其是大脑和脊柱受到氧化损伤的功效，能有效治疗缺血性的重复灌注损伤、脊髓损伤、Parkinson综合征、Alzheimer综合征等中枢神经系统损伤最新的研究表明，给小鼠饲喂富含虾青素的红球藻藻粉，能显著降低幽门螺杆菌对胃的附着和感染，国外已开发了口服制剂作为抗感染药物。
1.5.4 虾青素在化妆品中的应用
天然海藻提取物-虾青素作为自然界中最强的抗氧化维生素,具有“超级维生素E”的美誉,其抗氧化活性是维生素E的550倍,能够有效的保护皮肤免受紫外线(UVA ,UVB) 的损害,在皮肤受到光照时消耗腐胺[20] ,作为潜在的光保护剂,用于阻止皮肤光老化防止诱发皮肤癌。其超强的消灭自由基的能力,可以防止皮肤细胞受到自由基的损伤,减少皱纹及雀斑的产生。虾青素除了具有许多药用和添加剂用途外,现阶段作为新型化妆品原料以其优良的特性广泛应用于膏霜、乳剂、唇用香脂、护肤品等各类化妆品中[21]。
1.6 天然虾青素的生物安全性
人类日常食用的天然虾蟹、鱼类等水生动物中皆含有丰富的虾青素，虾青素对人类和水生动物是绝对安全的。对虾青素的生物安全性进行了大量动物和人体试验。美国Aquasearch公司做过系统的人体安全性实验，在29天的实验期内，33名健康成人分高（19.25 mg/d）低(3.85 mg/d)两个剂量组服用雨生红球藻粉来补充虾青素。监测志愿者的体重、皮肤颜色、血压、近距离和远距离视力、理解力、眼睛健康状况，耳、鼻、喉、口、齿、胸、肺和反射反应，以及全面的血液和尿样分析，结果表明，口服富含天然虾青素的雨生红球藻粉对人体无任何致病效应或毒副作用。该公司的产品也已经被美国食品与药物管理局批准作为膳食商品上市[22]。
综上所述，虾青素是一种非维生素A 原的天然类胡萝卜素，在功能食品和医药等方面有广阔的应用前景, 可开发多种保健食品、医药产品和生物营养饲料[23]。
2 实验部分
2.1 酵母培养工艺
2.1.1 发酵及菌体获取方法
法夫酵母菌株→斜面活化→一代摇瓶菌种→二代摇瓶菌种→离心→收集菌体→烘干至恒重
2.1.2 虾青素的提取流程
干燥的菌体→破壁处理→浸提→检测提取液中的类胡萝卜素的含量。
2.2 实验材料
2.2.1 菌种
红法夫酵母Phaffia rhodozyma，本实验室保藏
2.2.2 试剂和主要原料
葡萄糖、麦芽粉、蔗糖、玉米粉、可溶性淀粉、蛋白胨、（NH4）2SO4、尿素、硝酸铵、KNO3 、NaNO2 、酵母膏、KH2PO4、MgSO4•7H2O、CaCl2•H2O、二甲亚砜、丙酮，（均为分析纯）
DNS试剂[24]
α-淀粉酶（无锡酶制剂厂）
2.2.3 主要实验设备
恒温培养振荡器（SUKUN,SKY-2102）
超净工作台（苏州净化设备有限公司，SW-CJ-1B型）
生化培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂，MJX-250B-Z型
紫外分光光度计（上海天美科学仪器有限公司，UV1000型）
电子天平（北京赛多利斯系统有限公司，BS 224S型）
离心机（Thermo，SCIENTIFIC SORVALL）
灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂，YXQ-LS-18SL）
烘箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂，GZX-9070MBE）
电冰箱（博西华家用电器有限公司，KKV21120TI）
数显恒温水浴锅（国华电器有限公司，HH-4）
药品保存箱（青岛海尔特种电器有限公司，HYC-326A）
2.2.4 主要培养基
种子斜面培养基A：葡萄糖10g/L，麦汁3g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏3g/L，琼脂20g/L
种子液体培养基B：葡萄糖10g/L，麦汁3g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏3g/L
发酵基础培养基C：葡萄糖20g/L，(NH4)2S04 2g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4•7H2O 0.5g/L，CaCl2•H2O 0.1g/L，酵母膏 2g/L, pH 6.0
2.3 实验方法
2.3.1 菌种扩大方法
将保藏的菌种无菌操作接种到多支试管的培养基A上，22℃培养6天，将培养好的菌种保藏在冰箱中。
2.3.2 种子培养方法
从斜面上挑五环菌体于50ml培养基B/250ml摇瓶中，22 ℃，200r/min旋转振荡培养48h。
2.3.3 摇瓶发酵培养方法
吸取5ml种子液与实验的不同培养基50m
l/250ml摇瓶中，22 ℃，200r/min旋转振荡培养96h。
2.3.4 菌体生物量的测定
干重法，取l0 m1发酵液于5000 r/min下离心5 min后，55℃烘箱烘12h至恒重，称取重量。
2.3.5 类胡萝卜素总量的分析
二甲基亚砜(DMSO)法，取10ml发酵液，5000 r/min下离心5 min后用去离子水洗涤离心3次，于55℃烘箱12h烘干，加2 m1 55℃的DMSO破壁20min，最后用5ml丙酮提取，在480nm下测其OD值，用2 ml DMSO和5 ml丙酮混匀调零。 计算公式如下[24]：
类胡萝卜素总量(μg/ gCDW) =（A ×Va）/（E ×G）；
类胡萝卜素总量(μg/ ml) =（A ×Va）/（E ×Vb）。
式中A：吸光度；Va：类胡萝卜素溶液的体积(ml)；Vb ：分析时所用发酵液体积(ml)；E：消光系(0.16)；G：Vbml 发酵液的细胞干重(CDW) /(g) 。
2.3.6 发酵液残糖的测定
用3，5 - 二硝基水杨酸比色法(DNS 法) [25]。
2.3.7 酵母生长曲线测定方法
取活化后斜面种子5环接至盛有70ml摇瓶种子培养基的500ml三角瓶中，22℃，200r/min振荡培养48h。然后分别取培养液10ml接至另外3个盛有不同葡萄糖浓度（10g/L、20g/L、30g/L）的100ml发酵液的发酵基础培养基的500ml三角瓶中，22℃，200r/min振荡培养。每12小时平行测定发酵液的酵母生物量、虾青素含量、虾青素产量和糖浓度，结果取均值,96小时后结束。
3 结果与讨论
3.1 种龄和接种量的选择
微生物接种最适浓度必须在预试验中确定。根据实验结果，种龄为48h时为最好，所以选择种龄为48小时[26]。将法夫酵母菌株从斜面接5环到摇瓶,培养48h作为种子,接种量分别取2%、4%、6%、8%、10%、12%(相对于摇瓶装液量) ,培养4天。结果见表1和图2。
表1 不同接种量类胡萝卜素的产量
接种量 种瓶号 A480 类胡萝卜素总量（mg/l) 平均值
2% 1 0.395 1.234 1.256
2 0.409 1.278
4% 3 0.41 1.281 1.291
4 0.416 1.300
6% 5 0.454 1.419 1.436
6 0.465 1.453
8% 7 0.452 1.416 1.384
8 0.434 1.356
10% 9 0.425 1.328 1.309
10 0.413 1.291
12% 11 0.407 1.272 1.209
12 0.367 1.147
图2 接种量的选择
从图2看出，随着接种量的增大，类胡萝卜总量也增大，当接种量为6%时达到最大值为1.43mg/l,之后又逐渐减少，所以，本次实验选择种龄为48小时，接种量为6%。
3.2 培养基最优碳源的选择
最优碳源的选择也是在预实验中做的，选用葡萄糖（20 g/L）、蔗糖（20 g/L）、可溶性淀粉（20 g/L）、麦芽粉（20 g/L）、玉米粉作为碳源，分别代替培养基C中的葡萄糖。每种培养基都要制备两个装液量50 ml 的250ml锥形瓶，接种量10%即5ml。再将其灭菌，在22℃，摇速200r/min的摇床里摇瓶培养96小时。用干重法测得生物量，用DNS法测定剩余葡萄糖量。实验结果如下：
表2 不同碳源下的生物量与类胡萝卜素产量
碳源(20g/l) 生物量（g/l） 均值（g/l） A480（nm） 类胡萝卜素产量（mg/l） 均值 （mg/l）
葡萄糖 5.500 5.325 0.581 1.816 1.756
5.150 0.681 1.697
蔗糖 5.830 5.755 0.688 2.150 2.139
5.680 0.681 2.128
可溶性淀粉 5.400 5.24 0.569 1.778 1.742
5.080 0.546 1.706
麦芽粉 3.940 3.67 0.542 1.694 1.506
3.400 0.422 1.319
玉米粉 5.260 4.675 0.508 1.588 1.738
4.090 0.302 1.888
图3 不同碳源下生物量与类胡萝卜素产量
碳源是培养基的主要成分之一,它是细胞和各种代谢产物的主要元素 ,同时又是异养微生物生长的能源来源。不同的法夫酵母对不同碳源的利用的情况也是不一样 的,而不同的研究者所得到的结果也不一样。施安辉[27]等发现，红法夫酵母最佳碳源为葡萄糖和纤维二糖。本次实验从图3中可以看出碳源是蔗糖时，所得虾青素含量最大，为2.139 mg/l，葡萄糖和可溶性淀粉也还可以，最差的是麦芽粉，这与施文的结果有所出入，可能的菌种或者培养条件的差异所致，本次实验就选蔗糖为碳源。
从图3还可看出生物量跟类胡萝卜素总量存在一个正比关系，生物量大的类胡萝卜素的量也大。
表3 不同碳源下的残糖含量
碳源 种瓶号 A540 残糖含量（g/l) 均值（g/l）
葡萄糖 1 0.611 0.340 0.322
2 0.543 0.304
蔗糖 3 0.413 0.235 0.248
4 0.462 0.261
可溶性淀粉 5 0.611（稀释2倍） 0.680 0.711
6 0.670（稀释2倍） 0.742
麦芽粉 7 0.23 0.138 0.125
8 0.181 0.112
玉米粉 9 0.595 0.331 0.327
10 0.577 0.322
从表3可以看出，麦芽粉的残糖含量是最低的，说明酵母菌对其的葡萄糖的利用率是最高的，但它的类胡萝卜素的含量却不是最高的，这说明葡萄糖利用率高的并不一定能得到较高的类胡萝卜素的产量。
3.3 培养基最优氮源的选择
为探求不同氮源对法夫酵母的类胡萝卜素合成的影响，将以下几种氮源分别代替培养基C中的硫酸铵，以相同的含氮量为标准。摇瓶发酵，结果如表4。
表4 不同氮源下的生物量与类胡萝卜素产量
氮源 生物量(g/l) 均值(g/l) A480 类胡萝卜素总量(mg/l) 均值（mg/l)
硫酸铵
（2 g/l） 5.180 5.035 0.449 1.403 1.423
4.890 0.462 1.444
硝酸钾
（3.06g/l） 4.610 5.050 0.418 1.306 1.425
5.490 0.494 1.544
尿素（0.91g/l） 6.630 6.590 0.561 1.753 1.953
6.550 0.689 2.153
亚硝酸钠
（2.09 g/l） 0.920 0.895 0.004 0.013 0.020
0.870 0.009 0.028
蛋白胨
（3.03 g/l） 5.170 4.990 0.436 1.363 1.280
4.810 0.383 1.197
图4 不同氮源下生物量与类胡萝卜素产量
从图4中可以看出,尿素所对应的类胡萝卜素产量最高，其次是（NH4）2SO4和KNO3, NaNO2所对应的类胡萝卜素产量最低。尿素成本较低，在实际生产中应可以有效降低成本，所以本次实验选择尿素作为氮源。
表5 不同氮源下的残糖含量
碳源 种瓶号 A540 残糖含量（g/l) 均值（g/l）
硫酸铵 1 0.277 0.163 0.156
2 0.251 0.149
硝酸钾 3 0.291 0.171 0.163
4 0.262 0.155
尿素 5 0.456 0.258 0.245
6 0.408 0.233
亚硝酸钠 7 0.221（稀100倍） 13.358 11.718
8 0.159（稀100倍） 10.078
蛋白胨 9 0.492 0.277 0.264
10 0.444 0.252
从表5可以看出亚硝酸钠的残糖含量最高，说明以亚硝酸钠为氮源时，酵母菌无法利用氮源生长，这一点也可以从图4得到验证，所以其消耗的糖类物质也少。
3.4 正交设计试验
3.4.1 正交设计方案
本实验利用正交设计助手设计正交设计试验，以培养基C中最佳碳源、氮源、酵母膏为三个因子，每个因子取三个适宜的水平。实验结果以类胡萝卜素含量为指标，根据软件设计出的表格进行
正交实验。实验结果见表6。
正交试验方案如下：
氮源浓度： A1：1.0g/L A2：2.0g/L A3：3.0g/L
碳源浓度： B1：15g/L B2：20g/l B3：25g/l
酵母膏浓度： C1：2g/L C2：3g/L C3：4g/l
准备1、2、3、4、5、6、7、8、9，10、11、12、13、14、15、16、17、18号18个250ml锥形瓶。按上面的配方配培养基，每瓶配成50ml溶液。
3.4.2 正交设计直观分析
表6 正交设计实验的直观分析
正交设计实验的直观分析
所在列 A B C
因素 尿素(g/l) 蔗糖(g/l) 酵母膏(g/l) 类胡萝卜素含量(mg/l)
1 1 15 2 0.717
2 1 20 3 1.064
3 1 25 4 1.916
4 2 15 3 1.373
5 2 20 4 1.223
6 2 25 2 1.806
7 3 15 4 1.031
8 3 20 2 1.044
9 3 25 3 1.405
K1 1.232 1.04 1.189 1.115
K2 1.467 1.11 1.281 1.3
K3 1.16 1.709 1.39 1.444
极差R 0.307 0.669 0.201 0.329
在一项试验中，诸因素对相应的影响是有主有次的。在菌体生长试验中，直观上很容易得出，一个因素对菌体生长影响大，是主要的，那么这个因素不同水平相应的菌体生长之间差异就大；一个因素影响不大，是次要的，相应的菌体生长之间的差异就小。
从表6中可以看出各因素对实验结果的影响:
极差R： B＞A＞C
各因素对实验影响的主次关系，依次（主→次）为:B(蔗糖)→A（尿素）→C（酵母膏）。
A因素列：K2＞K1＞K3
B因素列：K3＞K2＞K1
C因素列：K3＞K2＞K1
所以，最优方案为A2B3C3,即尿素2g/l，蔗糖25 g/l，酵母膏4 g/l，这个方案并不包含在正交中已做过的9试验方案中，这正体现了正交试验设计的优越性。通过验证，方案A2B3C3所得的类胡萝卜素含量为2.336mg/l,确实为该实验的最优方案。
3.5 酵母生长曲线测定
3.5.1 还原糖标准曲线绘制
表7 不同糖浓度下的吸光度
试管号 0 1 2 3 4 5 6
葡萄糖浓度（g/l) 0 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
A540 0 0.066 0.167 0.359 0.554 0.752 0.923
图5 还原糖标准曲线
3.5.2 红法夫酵母酵母生长曲线
按照2.3.7中的方法，对红法夫酵母进行摇瓶发酵培养，间隔一定时间取样，以含10mg/ml葡萄糖浓度为起始浓度的类胡萝卜素产量以类胡萝卜素１表示；以20mg/ml葡萄糖浓度为起始浓度的类胡萝卜素产量以类胡萝卜素2表示；以30mg/ml葡萄糖浓度为起始浓度的类胡萝卜素产量以类胡萝卜素3表示，其结果如下：
表8 不同葡萄糖浓度的发酵液的类胡萝卜素产量
试管号 1 2 3 4 5 6 7 8
类胡萝卜素1
类胡萝卜素2
类胡萝卜素3 0.17
0.14
0.19 0.54
0.37
0.42 0.68
0.55
0.56 0.95
0.73
1.07 0.88
1.02
2.06 0.83
0.92
2.09 0.79
1.13
1.92 0.78
1.04
1.97
图6 不同葡萄糖浓度发酵液的类胡萝卜素产量
从图6可以看出，类胡萝卜素随时间的推移一直在增长。虾青素是次级代谢产物，其合成主要集中在稳定期，但从上图中可以看出无论是哪个浓度的红法夫酵母，在它们的对数期阶段，它们的虾青素产量一直在增长，这是由于对数期的生物量的增加而引起的。以含10mg/ml葡萄糖浓度为起始浓度的发酵液为例可以看出，在36小时候，该浓度的发酵液的红法夫酵母已差不多步入稳定期，而虾青素产量的值却在48小时后，才步入稳定期。这说明红法夫酵母的虾青素的合成与生物量的增加并不完全一致，但很明显虾青素的合成与生物量的生长是相互关联的，这与某些酵母只有在细胞停止生长以后才开始合成类胡萝卜素是大相径庭的。从上图看出，在第二次即第三次取样的时候，但是，从图中也可以看出，以含10mg/ml及20mg/ml葡萄糖浓度为起始浓度的发酵液里的红法夫酵母也在36小时后已步入稳定期，以含10mg/ml葡萄糖浓度为起始浓度的发酵液里的红法夫酵母虾青素的产量在48小时后已趋于稳定，但以含20mg/ml葡萄糖浓度为起始浓度的发酵液里的红法夫酵母，在48小时后仍有增长，这可能是以20mg/ml葡萄糖浓度为起始浓度的发酵液里的红法夫酵母的生物量较以10mg/ml葡萄糖浓度为起始浓度的发酵液多的原因造成的。从图上还可以看出，以含30mg/ml葡萄糖浓度为起始浓度的发酵液里的红法夫酵母，在36小时左右取样，它的虾青素产量仍旧比含10mg/ml葡萄糖浓度为起始浓度的发酵液里的红法夫酵母低，但在48小时就突然超过该浓度的红法夫酵母，可能是由于含10mg/ml葡萄糖浓度为起始浓度的发酵液里的红法夫酵母，在36小时差不多已步入稳定期，而以30mg/ml葡萄糖浓度为起始浓度的发酵液里的红法夫酵母，在36小时后细胞继续生长，在48小时左右才步入稳定期引起的。
4.总结与展望
4.1 总结
本次先通过单因子实验确定了最优碳源、氮源、接种量，最有利于虾青素积累的碳源是蔗糖，最有利于酵母胞内虾青素合成的的是尿素。再通过正交试验得出最佳的实验条件为尿素2g/l，蔗糖25 g/l，酵母膏4 g/l，尿素廉价易得，可以工业化生产。
通过不同葡萄糖浓度发酵液所得的类胡萝卜素的分析，初始糖浓度对类胡萝卜素的合成油很大的影响，在一定范围内，糖浓度高的法夫酵母步入稳定期的时间长，生长时间比较长，虾青素的积累量也多。
在实验过程中，存在很多不足之处，有待进一步研究。因时间和实验条件的限制，只对培养基进行了初步的优化，很遗憾没有再继续进行研究如何提高虾青素的产量。
4.2 展望
虾青素因其特殊的性质被用于食品添加剂、水产养殖、化妆品、保健品和医药工业等方面，具有广阔的市场前景。近年来国内外对虾青素的需求量越来越大, 但目前从水产品废弃物中提取虾青素普遍存在虾青素含量低、提取费用高的缺点, 不能满足大规模商业化生产的需要。因此, 建立切实可行的技术方案是关键, 同时，寻找和开发新的资源与方法, 如选育高产酵母菌、 发酵培养红球藻等, 也将是未来要解决的问题。
随着虾青素生物来源的不断发现以及提取分离纯化技术的进一步发展，虾青素必将具有更为广阔的应用前景。
致 谢
从三月到五月，经过两个多月的努力，我的毕业设计顺利完成了。在这里，我向所有指导过我的老师、帮助过我的同学和一直关心支持着我的家人，对他们表示深深的谢意。
感谢我的指导老师—陈劼老师，他严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。本设计从题目的选择到最终完成，陈老师都始终给予我细心的指导和不懈的支持。没有他的悉心指导，就没有这次毕业设计的顺利完成。
同时感谢叶春林老师、袁秋萍老师、袁海娜、肖功年老师在实验期间提供的实验场所和设备，没有他们的帮
助，我也不可能顺利完成本次课题。
还有感谢大学期间授我业、解我惑的全体老师。他们的谆谆教导，使我获得丰富的基础理论知识和一定的实践经验，为顺利完成毕业设计打下了坚实的基础。
此外，我要感谢与我的搭档张建丽同学的帮助和配合，我们一起讨论、解决实验过程中的遇到的难题。还有感谢本专业的各位同学，很荣幸能够和他们成为同学和朋友，大家在生活与学习中一起互相帮助，互相鼓励，共同进步，这段美好的学习和生活经历将成为我一生最珍贵的回忆，祝愿各位同学在今后的人生路上都能走好、走顺。
感谢我的父母亲，一直以业对我无私的关怀，他们永远是支撑我前行的最大动力。
最后，我还要向百忙之中抽时间对本文进行审阅，评议和参与本人论文答辩的各位老师表示深深地感谢。
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