中文摘要 I
英文摘要 II
目录 III
1 绪论 1
1.1 乳清蛋白的营养价值 1
1.2 乳清多肽研究国内外现状 2
1.3 本实验研究的目的和意义 2
2. 实验部分 4
2.1 实验材料与设备 4
2.1.1 实验材料 4
2.1.2 主要设备 4
2.1.3 实验菌种 5
2.2 方法 5
2.2.1 乳清多肽酶解流程 5
2.2.2 酶解后乳清多肽分子量测定 6
2.2.3 水解度的测定 7
2.2.4 氨基酸组分测定 8
2.2.5 多肽抑菌性研究 9
3 结果讨论 10
3.1 样品电泳结果 10
3.2 液相色谱结果 11
3.3 水解度的测定 13
3.3.1 凯氏定氮测定水解度标准曲线 13
3.3.2 茚三酮比色法测定水解度标准曲线 14
3.3.3 乳清水解液的水解度 15
3.4 氨基酸组分分析 15
3.5 多肽抑菌性研究 17
3.6 本实验讨论 17
4． 总结和展望 19
4.1 总结 19
4.2 展望 19
致谢 20
参考文献 21
1 绪论
1.1 乳清蛋白的营养价值
作为大自然最完整的食品之一，牛奶的营养价值已被人们认知，科技的发展使人类通过成熟的加工工艺，已经生产出了多种形式的乳清蛋白，它能更方便和有效的提供高价值的牛奶营养。乳清蛋白是一类利用现代先进工艺从牛奶中提取出来的蛋白质，它易消化吸收、具有很高的代谢效率和生物学价值。乳清蛋白主要的蛋白质成分有β-乳球蛋白（48%）、α-乳白蛋白（19%）、蛋白酶-胨（20%）、免疫球蛋白(8%)、牛血清白蛋白(5%)，此外还含有一些具有生物活性或保健特性的微量成分，如乳铁蛋白、乳过氧化物酶、溶菌酶、酪蛋白巨肽、脂肪球膜蛋白、生长因子等也能从乳清蛋白中分离出来。正是这些成分提供了乳清蛋白卓越的应用价值[1]。
近年来研究表明，多种具有生物活性的乳清活性肽，在乳清蛋白应用中发挥了主要作用。乳清多肽在人体内的吸收代谢方面有重要的生理功能，它的消化吸收优于氨基酸，且有独特的体内输送体系；乳清多肽还具有很高的生物活性，在体内和体外显示不同的功能，如抗高血压、抗微生物、抗氧化、抗血栓、免疫调节、促进矿物质吸收等[2]高含量的优质乳清蛋白还可以用来构建重要的肌肉群并修复人体细胞。科学研究表明，乳清蛋白浓缩了牛奶中多数的营养成分，因而它可以抗击衰老、促进心脏健康、抗癌、提高免疫力、提高骨质和控制体重。乳清蛋白是当今最常见的蛋白质摄入的补充产品，有利于促进人们身体健康，同时乳清也是制酪的副产品，是优质生物活性蛋白质、碳水化合物和矿物质的可靠来源，具有很高的营养价值。例如：乳清蛋白因其具有易消化、对机体无刺激的优点，可作为癌症病人蛋白质的良好来源。乳清蛋白可以广泛的添加人食物或饮料中，以增加蛋白质含量而不会影响食物口感，从而发挥其对癌症病人治疗的支持作用 。癌症病人谷氨酰胺水平下降，免疫功能低下；而谷氨酰胺是机体启动免疫反应的燃料，通过支链氨基酸提供原料。乳清蛋白是迄今所知道的支链氨基酸最丰富的来源 。
1.2 乳清多肽研究国内外现状
在1979年以前乳蛋白仅仅被人们看成是膳食蛋白质的主要来源，自从Brantl等从喂食牛乳酪蛋白的豚鼠小肠中发现了类吗啡活性肽后，外源活性肽的研究领域备受关注。国际上在乳肽食品的开发研究和生产方面以日本森永乳业公司为代表。早在20世纪50年代，该公司即以乳酪蛋白酶解制取了第一代的酪蛋白肽和氨基酸混合物，含5～8个氨基酸组成的肽和70％以上的游离氨基酸，用于低抗原性防过敏牛奶粉，在市场上行销40多年；60～70年代，开发出第二代的高度水解乳清蛋白肽混合物，含10～12个氨基酸组成的肽和40％～60％的游离氨基酸。以上两代产品的游离氨基酸含量过高，影响了产品的风味和生物效价；90年代，推出了低度水解乳清蛋白肽混合物，含10～15个氨基酸组成的肽和20％以下的游离氨基酸，产品风味明显改善，生物效价提高。去年，日本森永乳业公司功能材料乳业部开发的“森永乳多肽8000”已在市场上销售。该乳多肽以无苦味、氨基酸组成优良和消化吸收性良好等众多优点在多领域中广泛应用。美国某公司在2003年完成了1项医学临床试验，证明该公司用酶法水解乳清蛋白所生产的产品BioZal®具降血压作用[3]。
我国乳清多肽和蛋白水解物的研究相对滞后，于90年代开始研究乳清多肽。对乳肽的研究不多，主要是进行蛋白酶的筛选和酶解工艺的优化，如1991年，肖安乐等人筛选出胰蛋白酶的胰酶是水解变性乳清蛋白质的最佳酶种[4]；1994年，张和平等人采用胰蛋白酶水解热敏性乳清蛋白，获得热稳定好、易溶解的多肽，并以此开发出稳定性良好的乳清饮料。目前我们开始了乳清多肽利用方面的研究。近日，中国农业大学罗永康等人以乳清蛋白为原料，采用生物酶解技术，对乳清蛋白制备ACE抑制肽生产工艺和技术进行了详细地分析比较和研究，对开发产品的功能特性经过体外（ACE抑制效果）和动物试验（血压调节功能）进行测定，筛选出具有较好降血压功能的乳清蛋白降血压肽的生产工艺。
1.3 本实验研究的目的和意义
乳清是生产干酪、干酪素等的副产品，营养价值丰富，其中牛乳中有55%的营养成分残留在乳清中，乳清蛋白属全价优质蛋白，效价高，又具有多种保健功能，通过选择性地水解乳清蛋白，可获得不同长短片段的生物活性肽。
利用这些活性肽，可以开发活性肽类食品，它们具有易消化、易吸收、抗过敏性、治疗低血压和降低胆固醇等作用。乳中最早被发现的活性肽类是类鸦片肽类，具有受体结合功能；吗啡类活性肽和许多生理反应密切相关，如BCM7有增加血浆中胰肽作用，诱导肠上氨基酸的积累，增加肠道细胞层的交换，改变肠道的蠕动性，诱导人腹膜淋巴球上组织胺的游离，酿蛋白素C有利于回肠收缩。降血压活性肽在食品蛋白中存在着某些具ACEI活性的序列，可以通过酶解方法获得，从而起到防止或治疗高血压的目的。乳清蛋白的生理活性机能主要集中在免疫球蛋白等的分解物及蛋白多肽。
虽有乳清蛋白产品上市，而且乳清蛋白生物学活性的研究已经有许多报道，然而其机制原理的研究都不太一样，而且更新的研究资料几乎每天都有。主要由于这些产品对人体的生物学活性研究多数多处于应用阶段，对相关功能的结构基础研究却少有报道，例如乳清蛋白较均一活性水解物活性多肽的获得条件控制、乳清蛋白水解物活性多肽的组成分析以及乳清活性肽序列分析、结构特征等。
本研究将以乳清蛋白水解物乳清多肽为研究对象，在一定条件下目的获得较多的活性多肽，
然后对这些活性多肽通过通过电泳和高效液相色谱来分析其分析其分子量大小，通过茚三酮比色法来测定其水解度，并通过氨基酸分析仪来测定乳清的氨基酸组分，最后通过滤纸片法测定其抑菌性，最终达到初步分析和研究多肽性能的目的。
2 实验部分
2.1 实验材料与设备
2.1.1 实验材料
表1 实验材料
名称 生产商
乳清30粉 杭州燕牌乳业赠送
乳清80粉 贝因美集团赠送
胰蛋白酶 酶活力≥2500μ/mg 国药集团化学试剂有限公司
N,N,N′,N′-四甲基乙二胺 上海凌峰化学试剂有限公司
丙烯酰胺 化学纯CP 上海凌峰化学试剂有限公司
三羟甲基氨基甲烷（Tris） 中国医药上海化学试剂有限公司
N, N′－亚甲基双丙烯酰胺 天津市化学试剂研究所
琼脂糖（电泳用） 上海伯奥生物科技有限公司
十二烷基硫酸钠（SDS） 汕头市西陇化工厂
无水Na2CO3，硫酸铜（CuSO4），硫酸钾（K2SO4），硫酸（H2SO4），浓盐酸，氢氧化钠（NaOH），磷酸氢二钠（Na2HPO4），磷酸二氢钾（KH2PO4），无水乙醇（CH3CH2OH），甘氨酸(C2H5NO2)，40％乙醇，2％硼酸（H3BO3），水合茚三酮（C9H4O3•H2O），D-果糖（C6H12O6），丙酮，冰醋酸，甲醇，过硫酸铵，甘油，溴酚蓝，β-巯基乙醇等试剂均为分析纯，购自华东医药。
2.1.2 主要设备
表 2 实验设备
名称 生产商
VIS-723G可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司
KDN-08消化炉 上海新嘉电子有限公司
予华ZHQ型电热套 巩义市英峪予华仪器厂
DYY-Ⅲ-6B型稳压稳流电泳仪 北京市六一仪器厂
DYY-Ⅲ型电泳槽 北京市六一仪器厂
PHS-3C精密pH计 上海雷磁仪器厂
DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市英峪予华仪器厂
数显恒温水浴锅HH－4 常州国华电器有限公司
数显不锈钢鼓风干燥箱GZX-9023MBE 上海博迅实业有限公司医疗设备厂
DKZ-2型电热恒温振荡水槽 上海精宏实验设备有限公司
冷冻高速离心机CF15R HITACHI公司
高效液相色谱仪1525-2996 Waters
水解管 浙江大学玻璃加工厂
烧杯等玻璃仪器。
2.1.3 实验菌种
金黄色葡萄球菌（S.aureus）和枯草芽孢杆菌（B.subtilis），本院实验室保藏菌株。
2.2 方法
2.2.1 乳清多肽酶解流程
称取乳清蛋白粉――→加水搅拌溶解――→预热至所需温度，加NaOH或HCl溶液调至所需初始pH――→加入水解所需的蛋白酶――→恒温水浴中酶解――→到水解时间后，取出放入沸水浴灭酶活5min――→冷却，离心15分钟――→取上清液 ――→ 上清液――→丙酮沉淀――→离心分离――→取沉淀风干――→多肽粉末。
2.2.2 酶解后乳清多肽分子量测定
2.2.2.1 SDS-PAGE电泳
（1） 电泳溶液配制
①样品缓冲液（10ml）[5]
表3样品缓冲溶液
0.5mol/L Tris-Hcl(pH6.8) 甘油 10%SDS 0.1%溴酚蓝 β-巯基乙醇
2.5ml 2.0ml 4.0ml 0.5ml 1.0ml
② 凝胶储液(100ml)
丙烯酰胺 29.2g，亚甲基双丙烯酰胺 0.8g,加重蒸水至100ml外包锡纸4℃冰箱保存。
③ 染色液：
表4 染色液
考马斯亮蓝R250 50%甲醇 冰醋酸
0.25g 91ml 9ml
④ 脱色液：甲醇 50ml，冰醋酸 75ml，重蒸水 875ml。
⑤缓冲液的配制[5]
表5电泳缓冲溶液
Tris(mol/L) Tricine(mol/L) SDS(%) pH
阳极缓冲液 0.2 1 8.9
阴极缓冲液 0.1 0.1 0.1 8.25
凝胶缓冲液 3 0.3 8.45
⑥胶的制备[5]
表6胶的制备
30%凝胶储液/ml 凝胶缓冲液/ml 尿素
/g 四甲基乙二胺/μL 10%过硫酸胺/μL 水
/mL
分离胶 14.85 9 9.72 45 600 3
浓缩胶 1.62 3 20 300 7.2
（2）样品的处理
将多肽粉末产物取30μL样品，再加入等量的上样缓冲液，100℃水浴加热10 min,然后取出冷却到室温。
（3）电泳
用20μL的移液管按标号依次向每个孔里加20μL处理后的样品，然后在上下槽中分别倒入阴极缓冲液和阳极缓冲液，电泳时利用恒定电压，在浓缩胶中电压为70 V，电流开始时约为30mA；在分离胶中，电压为120 V，电流开始时约为50 mA 。当溴酚蓝指示剂快到胶片末端时候停止电泳。
（4）胶片的处理
先将胶放入50%甲醇和10%醋酸中固定15-30min。然后用染色液在45℃加热染色15-30min。随后用10%醋酸在45℃下加热快速脱色，并更换脱色液3-5次，直至条带清晰、背景干净为止，1h内即可见所检测的清晰条带。
2.2.2.2 液相色谱
（1）液相色谱条件
配置Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液：Na2HPO4 10.925g, NaH2PO4 3.042g, 定容至500ml；
柱子：SRT SEC-150 ，7.8×300mm, 粒径：5μm ，流速：0.8ml/min，检测波长：241nm ，柱箱温度：30℃。流动相：Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液(pH7.0)。进样量：5μL。工作时间30min。
（2） 样品预处理
样品溶液要经过微滤和超声波除气泡处理；
2.2.3 水解度的测定
2.2.3.1 凯氏定氮测定水解度[10]
（1）标准曲线的绘制：取0.1000g干燥过的甘氨酸溶解后定容至100mL。取2.00mL定容至100mL得20μg/mL的溶液。取此液分别稀释成含量为2～20μg/mL的溶液用于标准曲线的绘制。取2.00mL测定用稀释液于试管中加入1.00mL显色剂，混匀后沸水浴中加热15min，同时作空白实验，然后冷水冷却，加入5.00mL的40％乙醇溶液混匀，放置15min后用1cm比色杯以空白管于570nm处调零测吸光值A，并绘制A－C关系曲线。
（2）蛋白质含量的测定 微量凯氏定氮法（GB/T15673-1995）
2.3.2 茚三酮比色法测定水解度[11]
（1）乳清蛋白完全水解液的制备：准确称取40mg WPI（由于WPC中乳糖的存在严重的干扰了酸解反应，故以WPI替代）于水解管中，加入浓度为 6mol/L 的盐酸 40mL，在真空装置上安装水解管抽真空，待真空度达到后用喷灯密封水解管。于 115℃ 恒温器中反应 24h ，水解完后，把水解管开封，用旋转蒸发仪去除盐酸。干涸后样品用蒸馏水溶解，并定容至100mL。
（2）标准曲线的绘制：取出上述制备的完全水解液0.2～4.0mL 于各个试管中，加蒸馏水稀释至20.00mL，（即将此液稀释成质量浓度为4.0～80 mg/L的溶液） 用于标准曲线的绘制。然后取2.0mL稀释液于干净试管中，加入茚三酮显色剂1.0mL，混匀，沸水浴加热15min，冷却后加入5.0mL体积分数为40%乙醇溶液充分混匀，放置15min后，于570nm处测定光密度（水做参比）。另取40mg WPI，加蒸馏水100mL，振荡均匀后，取相应体积的溶解液，按上述方法
测定光密度值。相同体积样品的光密度之差与蛋白质质量浓度做工作曲线，取线形部分做标准曲线。
（3）取灭酶后的水解液 1.0mL，加 90mL蒸馏水稀释并调pH值至6.0，定容 100mL，取2.0 mL稀释液于试管，加入1.0mL茚三酮显色剂，混匀后置沸水浴中加热15min ，冷水冷却，加入5.0mL体积分数为40%乙醇溶液充分混匀，放置15min后，于570nm处测定光密度（水做参比）。另取相同浓度未水解蛋白溶液1.0mL，按上述方法测定光密度，以二者光密度之差从工作曲线上查蛋白质质量浓度，其水解度为：
DH（%）=C（1/1000W）V1（100/V2）×100
式中：C为查表的蛋白质质量浓度（g/L）；W为 WPC的蛋白质克数；V1为水解液总体积（mL）；V2为显色时所用稀释液的总体积（mL）。
2.2.4 氨基酸组分测定
2.2.4.1 氨基酸分析前的预处理
（1） 称样50mg，样品直接移入已准备好的水解管中，加入约5mL的6 mol/L HCl，真空密封。
（2） 在110℃烘箱内水解24h。
（3） 开管将样品全部移入蒸发皿中，在水浴上蒸发出去浓盐酸。
（4） 样品过滤、定容后，待上机。
2.2.4.2 氨基酸分析及其分析条件
进样量20 μl。泵1 流速：0.4ml/min， 压力 10.5Mpa。 泵2 流速：0.35ml/min，压力 0.8Mpa。分离柱温度：50℃ 。反应柱温度： 136℃。
2.2.5 多肽抑菌性研究
2.2.5.1 培养基的配置
表7 牛肉膏蛋白胨
试剂名称 试剂用量
牛肉膏 3g
NaCl 10g
蛋白胨 5g
琼脂 15～20g
水 1000mL
pH 7.0～7.2
121℃灭菌
2.2.5.2 实验操作
① 将已灭菌并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌平皿中，水平放置待凝固。
② 将多肽水解液经已灭菌过的微滤头进行微滤除菌。
③ 用无菌吸管取金黄色葡萄球菌和枯草牙孢杆菌菌液各0.2mL加入到上述平板中，用无菌三角涂棒涂布均匀。
④ 用无菌镊子将已灭菌的小圆滤纸片分别浸入装有不同浓度的多肽水解液的试管中浸湿。
⑤ 将上述贴好滤纸片的含菌平板倒置放于37℃温室中，24h后取出观察抑菌圈大小。
3 结果讨论
3.1 样品电泳结果
乳清蛋白在55.8℃，pH7.0，底物量3.0 g的条件下，酶解5h所的酶解液，电泳结果如图
图 1 多肽电泳结果
根据回归方程：y=-1.7528x+5.0527，得出乳清蛋白酶解液中多肽的分子量大小，见表：
表8 乳清蛋白酶解液多肽分子量大小
名称 迁移率 分子量大小/Da
多肽1 0.0216 103466.9
多肽2 0.1005 75244.12
多肽3 0.1297 66882.07
多肽4 0.6485－0.6919 8236.61-6917.54
多肽5 0.7946 4570.19
从分子量大小看，多肽1、多肽2、多肽3分子量较大，多肽4呈一段长约1cm的色带，分子量大约为8200～6900，根据文献所示，分子量在这一区间的多肽多具有生物活性。在下一阶段的研究中，可重点针对这一区间分子量的多肽进行分离、纯化、测氨基酸序列等。
3.2 液相色谱结果
图2 乳清蛋白(酶解) 流速 0.8 ml/min 酶解
Retention Time Area % Area Height Peak Type
1 5.595 163348 5.24 6924 Unknown
2 8.847 11651 0.37 553 Unknown
3 9.410 51052 1.64 2005 Unknown
4 9.955 82125 2.64 3351 Unknown
5 11.160 1199425 38.51 25717 Unknown
6 11.581 913608 29.33 25737 Unknown
7 12.150 609859 19.58 20875 Unknown
8 13.255 69610 2.23 3629 Unknown
9 16.286 13978 0.45 697 Unknown
图3 乳清蛋白(未水解, 1:20稀释)流速： 1ml/min 未酶解
Retention Time Area % Area Height
1 6.127 430335 21.80 19328
2 6.439 222486 11.27 15161
3 8.317 8918 0.45 491
4 9.213 592397 30.01 19438
5 10.279 439874 22.28 19569
6 12.031 70949 3.59 3061
7 12.616 7298 0.37 334
8 13.670 186121 9.43 9241
9 14.911 15769 0.80 907
根据图2（酶解后）和图3（未酶解）两幅液相色谱比较，图2（酶解后）在保留时间6min的时候有一波峰，表明有一种大分子量多肽，不过多肽主要集中在9.955-12.150min之间以小分子量多肽为主；图3（未酶解）在滞留时间6.127min、9.213min、10.279min等三个波峰，表明未酶解的时候以大分子量蛋白质为主。
根据电泳结果得到，乳清多肽SDS-PAGE电泳时，大分子蛋白质电泳效果比较理想，出现比较明显的着色带，但是低分子多肽部分分离效果不理想。由于缺少标准蛋白不能进行蛋白质测定，所以不能确定蛋白质的分子量。通过液相色谱结果表明乳清用胰蛋白酶在这种最佳条件下水解比较完全，但是酶解后以小分子量多肽较多且比较接近使小肽部分成分比较复杂不易分离纯化，而未酶解的乳清蛋白大多为大分子量的蛋白质，小肽部分的成分比较少。
3.3 水解度的测定
3.3.1 凯氏定氮测定水解度标准曲线
茚三酮显色法测定水解度，主要是依据不同含量的－NH2基与茚三酮显色剂反应，显色后产生的吸光值不同。所以，首先确定显色剂对不同浓度甘氨酸标准溶液进行显色时，浓度C与吸光值A570的关系。A－C关系如图4。
图4 不同浓度甘氨酸标准溶液A－C关系曲线
3.3.2 茚三酮比色法测定水解度标准曲线
首先确定不同质量浓度下WPI完全水解液及其及其相应的未水解样品的光密度，然后相同体积样品的光密度之差与蛋白质质量浓度做工作曲线，再取其线形部分做标准曲线。
图5 茚三酮比色法标准曲线直线部分
3.3.3 乳清水解液的水解度
通过茚三酮比色法测定水解度得在pH 7.0， 55.8℃，不同酶液（2g/L）下水解乳清所得的OD值，再根据图5和公式计算得水解度：
表9 水解度
酶液量（2g/L）mL OD值 水解度%
6 0.7916 19.93
5.5 0.6801 17.12
5 0.6522 16.42
4.5 0.6332 15.94
4 0.6027 15.17
3 0.5403 13.60
3.4 氨基酸组分分析
通过日立L—8800高速氨基酸分析仪分析这两种乳清的氨基酸组分，可的它们的氨基酸组分如下两表：
表10 贝因美 WPC 80氨基酸组分 分析浓度：1.26 mg/mL
成分 ng/20μg ng/μL g/100g %
ASP 2197.520 109876.00 8.7203 10.84
THR 1483.200 74160.00 5.8857 7.32
SER 1048.050 52402.50 4.1589 5.17
GLU 3704.160 185208.00 14.6990 18.28
GLY 399.726 19986.30 1.5862 1.97
ALA 1093.830 54691.50 4.3406 5.40
CYS 539.837 26991.85 2.1422 2.66
VAL 1147.100 57355.00 4.5520 5.66
MET 418.017 20900.85 1.6588 2.06
ILE 1151.250 57562.50 4.5685 5.68
LEU 2345.890 117294.50 9.3091 11.58
TYR 584.24 29201.20 2.3176 2.88
PHE 636.035 31801.75 2.5239 3.14
LYS 1870.860 93543.00 7.4240 9.23
NH3 280.007 14000.3
5 1.1111 1.38
HIS 336.129 16806.45 1.3338 1.66
ARG 497.353 24867.65 1.9736 2.45
PRO 531.975 269598.75 2.1110 2.63
总计 20264.96 1013248.15 80.4165 100.00
表11 燕牌乳清 WPC30氨基酸组分分析浓度：1.276mg/mL
成分 ng/20μg ng/μL g/100g %
ASP 987.650 49382.50 3.8701 10.37
THR 666.415 33320.75 2.6113 7.00
SER 490.245 24512.25 1.9210 5.15
GLU 1788.510 89425.50 7.0083 18.78
GLY 177.692 8884.60 0.6963 1.87
ALA 472.697 23634.85 1.8523 4.96
CYS 195.806 9790.30 0.7673 2.06
VAL 532.663 26633.15 2.0872 5.59
MET 183.275 9163.75 0.7182 1.92
ILE 530.987 26549.35 2.0807 5.58
LEU 1055.810 52790.50 4.1372 11.09
TYR 232.051 11602.55 0.9093 2.44
PHE 300.830 15041.50 1.1788 3.16
LYS 808.442 40422.10 3.1679 8.49
NH3 151.185 7553.25 0.5924 1.59
HIS 158.884 7944.20 0.6226 1.67
ARG 217.670 10883.50 0.8529 2.29
PRO 573.481 28674.05 2.2472 6.02
总计 9524.29 476214.65 37.3209 100.00
通过以上两表表10和表11分析可得，两种乳清氨基酸组分成分以及各种氨基酸所占的百分比。通过两种乳清中氨基酸的百分含量比较可知，除脯氨酸在贝因美 WPC 80里的百分含量是2.63%而在燕牌乳清里的含量却有6.02%两者相差比较大外，其他氨基酸的百分含量相差不大，两者相差不超过1%。所以两者乳清在相同条件下水解后的多肽片段应该大致相同。
3.5 多肽抑菌性研究
上述贴好滤纸片的含菌平板倒置放于37℃温室中，24h后，得到结果如图：
图 6 枯草芽孢杆菌 图7 金黄色葡萄球菌
通过图6和图7观察可得，不同浓度的多肽液在金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌培养基中培养24h并未形成抑菌圈。说明这几种多肽液并不具有抑制金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的特性。
3.6 本实验讨论
利用SDS-PAVGE 电泳测定低分子多肽的分子量，必须控制凝胶孔径的大小。Schagger等在凝胶中加入6mol/L 尿素，分子量在2.512-16.949 ku之间的小肽，其分子量对数和迁移率呈良好的线性关系。本实验在用三羟基甲基氨基甘氨酸代替甘氨酸作为尾随离子，增加浓缩胶效果，并且在分离胶8mol/L尿素，降低聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小，取得了较好的效果。
在浓缩胶和分离胶中间容易有蛋白滞留，染色后，形成一条很浓的带，而且操作比较复杂。低分子多肽和染料的结合力较弱，长时间的染色和脱色容易扩散丢失，试验中通过先固定后染色，在染色和脱色中通过水浴加热提高温度，一方面可以加快染色和脱色的过程，减少小肽扩散丢失；另一方面可以避免凝胶长时间地浸泡在低离子强度的染色和脱色液中，防止凝胶肿胀变形，蛋白带扭曲变形。
通过SDS-PAGE电泳来分离纯化多肽水解液并测定其大概的分子量，可知乳清多肽的分子量主要集中在10000以下，特别是在8200～6900之间；再通过液相色谱来分析多肽粉末组分，分析可知酶解后多肽保留时间主要在6～12min之间，多数大分子蛋白已经被酶解成小分子多肽。
对于茚三酮比色法，有人认为比色测定时读数不稳定，很难读出一个准确的数值；并且它采用单一氨基酸作为标准，而不同的氨基酸对茚三酮的显色度有偏差，因此所得的结果不够准确。除此之外，显色剂的现用现配也会增加实验的工作量。而其中比色测定数据不稳定的主要原因在于反应中生成过量的棕红色还原茚三酮。在比色测定时，残留的棕红色还原茚三酮能和空气中的氧气慢慢反应，因而干扰了比色测定。使读数不稳。为消除此种误差，可在加入乙醇展色剂后，用涡流混合器充分混匀数分钟，直到棕红色全部褪去。此时过量的棕红色还原茚三酮被空气中氧气全部氧化变成无色，蓝紫色充分呈现出来，可以使比色在一小时内稳定。茚三酮显色剂利用AOAC（1980版）所采用的显色剂，可以在棕色瓶中冰箱放置1周。
本实验采用待水解的蛋白质的完全水解液作为标准溶液， 用以消除由于蛋白质水解液中不同的氨基酸对反应试剂的响应不同所带来的误差。乳清浓缩蛋白乳糖含量很高，在制备完全水解液时，采用高温酸水解时，有棕褐色生成，引起氨基酸的损失，所以我们选用乳清分离蛋白。比较甘氨酸和完全水解液之间的差异，选择甘氨酸并参照文献[13]也绘制了标准曲线。得出采用甘氨酸得出的水解度偏低，且这种方法能够更加简单的测定水解度。
通过氨基酸分析仪，分析出这两种乳清蛋白具体的氨基酸的组成，从而能更加精确分析乳清多肽的组分和及其可能具有生理活性的片段。
抗菌肽是由生物体产生的具有抗菌作用的小分子蛋白质，是宿主先天性非特异性防御系统的重要组分。抗菌肽的氨基酸残基数目通常小于100，带正电荷，能杀伤细菌、真菌、原虫，而且还能抑制病毒的繁殖和特异性抑制某些肿瘤细胞的生长[14]。而通过本次实验对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌性实验，未发现乳清蛋白水解具有的抑制细菌的功能。
4． 总结和展望
4.1 总结
（1） 确定酶解后的乳清多肽的分子量都在10000分子量以下，特别在8200～6900之间。
（2） 液相色谱分析可知，酶解后，多肽保留时间在6～12min之间，多数大分子蛋白质已经被分解成小分子量多肽。
（3） 用多肽液对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌进行抑菌性实验，实验表明多肽对这两种菌不具有抑菌性。可能这个条件下的水解肽段的分子量还没未达到具有抑菌性的肽段大小。
（4） 氨基酸分析表明，乳清80粉和30粉的氨基酸组成相近。
4.2 展望
下一步准备进行的工作：
（1） 多肽成分分析、序列测定、结构特征分析。
（2） 分析各种成分的生物学活性。
（3） 进一步水解，从而获得具有抑菌性的理想的肽段。
（4） 将多肽制作成食品饮料或食品添加剂等产品以应用人们生活。
致谢
本课题从实验设计﹑实施及论文的撰写都是在导师吴元锋老师的悉心指导下完成的。吴老师多次询问研究进程，并为我指点迷津，帮助我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励。当然要感谢一下刘士旺老师在实验后期进行中给我的帮助。在我即将完成学业之际，谨向我的导师致以最衷心的感谢和崇高的敬意！其他老师在本课题进行中给于
我的帮助，在此，我要向诸位老师深深地鞠上一躬。
感谢陈海波﹑王焕坚、潘祖波、李亚飞﹑李晓婷等同学的支持和帮助。感谢生化学院的领导和老师的辛勤培养。还要感谢培养我长大含辛茹苦的父母，谢谢你们! 再次向所有关心和帮助过我的老师们和同学们表示我最诚挚的谢意！
陈雷
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