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固定化酶水解植物蛋白的条件研究的条件分析

2015-09-30 09:51 来源:学术参考网 作者:未知

. 绪论
1.1 大豆蛋白的研究背景
近年来,随着人们生活水平的提高,对膳食结构的要求也越来越高,而大豆的营养价值很高,是一种优质的高蛋白、高脂肪作物,含蛋白质40%-45%,每100g含蛋白质36-50g,生物学价值接近肉类。氨基酸组成也与动物蛋白质近似,并含有较多的赖氨酸,属于完全蛋白质(完全蛋白质就是包含有人体所需的22种氨基酸,且比例适当的蛋白质,动物蛋白和豆类蛋白都属完全蛋白),可以充足地提供人体所需的八种必需氨基酸以及多种维生素和矿物质等,并有降低人体血液中胆固醇含量的作用,因此被越来越多的人所认可。并且,其在食品加工领域也有广泛的应用前景,可制成各种富有营养的食品,充分使人体最大限度地吸收大豆蛋白质以满足恢复期病人、消化功能衰退的老年人、消化能力尚束成熟的婴幼儿及急需体力补充的运动员及高血脂、高血压等人群的营养要求[1]。
大豆蛋白资源丰富,原料成本低廉,具有乳化性、起泡性等功能特性。同时,大豆蛋白也有一些性质不能满足人们的要求,从而影响它作为食物的可接受性,例如溶解性、胀气因子、不良气味等。因为大豆蛋白主要由7s和11s球蛋白组成,从而使得SPI的消化率和生物效价远不及牛奶等动物蛋白质:一般动物蛋白质的消化率为90%-98% ,而植物蛋白质的消化率为73%。但经过对大豆蛋白的酶法水解,将大分子大豆蛋白质水解成小分子多肽和氨基酸,可提高大豆蛋白的生物效价,易为人体吸收和消化。同时还可以提高溶解度,降低粘度,改善大豆蛋白的功能特性[2]。
1.2 固定化酶的研究背景
1.2.1 酶固定化的方法
   酶的固定化是利用化学或物理手段将游离酶定位于限定的空间区域,并使其保持活性和可反复使用的一种技术[3]。
酶的固定方法有很多,主要有吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法等。
吸附法:利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上,而使酶固定化的方法。采用吸附法制备固定化酶或固定化菌体,操作简单,条件温和,不会引起酶变性失活,载体廉价易得,而且可反复使用,但由于靠物理吸附作用,结合力较弱,酶与载体结合不牢固而容易脱落,所以使用受到一定的限制。
包埋法:将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中,使酶固定化的方法。包埋法制备固定化酶或固定化菌体时,根据载体材料和方法的不同,可以分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两大类。包埋法不需要化学修饰酶蛋白的氨基酸残基,反应条件温和,很少改变酶结构[4],应用最为广泛。包埋法对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都适用,包埋材料主要有琼脂、琼脂糖、卡拉胶、明胶、海藻酸钠、聚丙烯酰胺、纤维素等,其中海藻酸钠具有无毒、安全、价格低廉、材料易得等特点,是食品酶工程中常用的包埋材料之一[5]。
结合法:选择适宜的载体,使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定方法。根据结合的化学键不同,结合法可分为离子键结合法和共价键结合法。用离子键结合法固定,条件温和,操作简便。只需要在一定的pH值,温度和离子强度等条件下。用共价键结合法制备的固定化酶,结合很牢固,酶不会脱落,可以连续使用较长时间。但载体活化的操作复杂,比较麻烦,同时由于共价结合时可能影响酶的空间构想而影响酶的催化活性。
交联法:借助双功能试剂使用酶分子之间交联作用,制成网状结构的固定化酶的方法。交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固,可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈,酶分子的多个基团被交联,致使酶活力损失较大,而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小,给使用带来不方便。
热处理法:将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间,使酶固定在菌体内,而制备得到的固定化菌体。交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固,可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈,酶分子的多个基团被交联,致使酶活力损失较大,而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小,给使用带来不方便。
以上这5种常见的酶的固定方法各自有各自的优点和缺点,必要时可以结合其中的不同种方法进行固定以取长补短,可以制备出酶活性高、机械强度又好的固定化酶或固定化菌体[6]。
1.2.2 固定化酶的应用
   固定化酶既保持了酶的催化特性,又克服了游离酶的不足之出,具有显著的优点。因此已广泛地应用于食品、医药、环境等领域。
(1) 固定化酶在食品方面的应用
固定化酶得到最早和最广泛应用的领域是食品工业,目前已有几十种酶应用于食品工业。据2000 年的统计,国际上所生产的酶总产量有近40%应用于食品工业的生产。而且应用的酶剂还在不断增加。食品工业中应用的酶法生产方式也由传统的向现代化的方式转变。而且,固定化酶和固定化细胞在食品领域的应用越来越广泛 [7]。比如说,固定化酶在乳酸生产、果汁生产等食品工业方面都有一定的应用。
(2) 固定化酶在医药方面的应用
固定化酶在医药方面的应用已经越来越广泛。固定化酶应用于医学工业不仅仅限制于药物合成上。如Odaci 等[8]将漆酶固定于生物传感器的氧极制成酶电极,用于检测药物扑热息痛(paracetamol)。Tang 等[9]基于固定anti-AFP酶制成了一种免疫测定系统,并分析了它的作用原理,并预期能在临床上有广泛的用。
(3) 固定化酶在环境方面的应用
废水处理中,由于废水组分复杂而且经常变化,利用单一的固定化酶,很难收到好的处理效果。因此,要用多种单一的固定化酶组合处理,才能使有机物完全无机化和稳定化。如德国将九种降解对硫磷农药的酶共价组合固定在多孔玻璃珠、硅胶珠上,制成酶柱处理硫磷废水获得95%以上的处理效果,连续工作70天酶的活性没有变化,说明多种酶的作用大于单一酶的作用[10]。
(4) 固定化酶应用的展望
毋庸置疑,固定化酶已经在多个方面都有了广泛的应用,而且仍有很多尚在研究过程中。不过,有一点是可以明确地:随着固定化技术的发展, 将会有更多的固定化酶应用于生产, 充分显示出固定化技术的优越性, 开启固定化技术的新局面。
1.3 固定化酶水解大豆蛋白的优势
    传统工业从大豆中得到能被人体直接吸收的游离氨基酸是采用酸水解,但是在酸水解过程中常会产生对人体有害的致癌物——氯丙醇[11]。中性蛋白酶具有较高的蛋白水解能力,但是如果直接用游离酶进行水解,酶的稳定性差,酶只能使用一次,所得的产物难以分 离。而固定化酶可提高酶的稳定性,其热稳定性、pH稳定性均显著高于游离酶[12],还有易于和产物分离、可反复多次使用等优点,因而受到越来越广泛的重视和应用。目前世界各国都在不断研究这一领域。
2.实验部分
2.1 材料和准备工作
2.1.1 实验材料与仪器设备
(1) 主要实验材料
木瓜蛋白酶(BR):  江苏天锡天达酶制剂有限公司
    无水氯化钙(AR):  衢州巨化试剂有限公司
    海藻酸钠(AR):    中国医药上海化学试剂公司
    无水乙醇(AR):    安徽安特生物化学有限公司
    氢氧化钠(AR):    杭州萧山试剂厂
    甲醛(AR):        衢州巨化试剂有限公司
    草酸(AR):        上海美兴化工有限公司
    其他试剂均为常规试剂
    大豆:               市售

(2) 主要实验设备
  SW-CJ-1B型单人单面净化工作台:    苏州净化设备有限公司
  XQ-LS-30SI型立式压力蒸汽灭菌锅: 上海博迅有限公司医疗设备厂
  DHZ-DA型摇床:                   太仓实验设备厂
  HZ-9210K型摇床:                 太仓市科教器材厂华利达实验设备公司
    MJX-250B-Z型霉菌培养箱:         上海博迅有限公司医疗设备厂
  双层铁皮电炉:                   浙江嘉兴市凤桥电热器厂
  GO-5003B型搅拌机:               广东省中山市哥尔电器有限公司
    自制固定床装置如图1所示。

                                         ↑产物
   大豆蛋白液→
图1 自制固定床装置图
2.1.2 准备工作
(1) 大豆蛋白液制备
称取一定量大豆加一定量温水浸泡12h后在0.1Mpa高压蒸汽灭菌锅内煮熟10min,迅速降压至常压下取出,用豆浆机磨浆,过滤去渣, 调pH值到中性(pH=7.0),再用高压蒸汽灭菌锅灭菌,冷却后放入4OC冰箱中备用。

(2) NaOH标准溶液的配制及标定
a. 快速称取化学纯固体氢氧化钠约4g(因它易吸潮,不易称准),先用烧杯将NaOH溶解,倒入容量瓶中加蒸馏水定容到1L。
 
b. 标定:用草酸标定
干净的碱式滴定管用少量NaOH溶液洗三遍, 再将NaOH溶液装入滴定管中,赶走橡皮管和尖嘴部分的气泡,调整管内液面的位置恰好为“0.00”。
用洗净且已用标准草酸溶液润洗过三遍的移液管准确量取20.00mL标准草酸溶液,加入锥形瓶中,加入2-3滴酚酞指示剂,摇匀。
将NaOH溶液滴入锥形瓶中,边滴边摇动,开始时,滴定速度可快一点,当接近终点,粉红色消失较慢时,开始逐滴加入碱液,每加入一滴都应摇匀,观察红色是否消失,决定是否再滴加,最后应控制加入半滴碱液,并用洗瓶冲洗锥瓶内壁,摇匀,30s内粉红色不消失,即认为已达终点,记下滴定管液面的位置。
如此标定三次(求三次液量相差不超过0.05mL),取其平均值。按N1V1=2N2V2公式计算当量浓度。
2.2 实验方法
2.2.1 酶的固定化方法
本实验采用海藻酸钠包埋法。
用天平准确称取一定量的海藻酸钠于100mL水中,再准确称取10g CaCl2于200mL水中,放入立式压力蒸汽灭菌锅灭菌中灭菌(另量取一定体积的水放入其中一起灭菌以制备无菌水)。
先将仪器、玻璃器皿等在净化工作台中在紫外灯的照射下灭菌15min,再用天平准确称取一定量的酶,在净化工作台将酶缓慢加入灭菌好的海藻酸钠溶液中,一边加一边搅匀(因中性蛋白酶在海藻酸钠溶液中极易结成颗粒状,不搅匀会导致酶的分布不均匀,而且会引起后面用注射器制备海藻酸钠凝胶珠过程中堵塞注射器)。混合均匀后,用注射器逐滴滴入灭菌好的5%(w/v)CaCl2溶液中进行凝胶化反应,于4oC冰箱中钙化2-3h,制备成直径约为3mm的海藻酸钠凝胶珠,用无菌水洗涤3次以洗去附在表面的CaCl2溶液,即得球状固定化颗粒。

    
图2 用注射器滴入CaCl2中
 
图3 包埋法固定化酶模式
2.2.2 自制固定床的安装 
    取固定化酶填充至反应柱, 将一定量一定浓度的大豆蛋白溶液倒入1500mL三口烧瓶中,并置于恒温水浴锅保温,然后用皮管将固定床、泵和三口烧瓶连成一个密封的循环,以恒流泵控制较缓和的系统流速, 循环反应。皮管中间连一段玻璃管,以便运行过程中观察循环是否正常,而且留一个取样口,平时用夹子夹住以维持无菌状态。此固定床下口为进口,上口为出口,如图1 所示。固定床在使用前要在净化工作台紫外线杀菌15min,装固定化酶过程中,手及皮管要用75%的乙醇杀菌。
2.2.3 游离氨基酸的测定方法
游离氨基氮的测量用双指示剂甲醛滴定法。
水溶液中的氨基酸为兼性离子,因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。甲醛可与氨基酸上的—N+H3结合,使N+H3上的H+游离出来,与甲醛的反应:用过量的中性甲醛与氨基酸反应,可游离出氢离子,然后用NaOH滴定,从消耗的碱量可以计算出氨基氮的含量。

(1) 具体测量步骤
用10.00mL移液管精确吸取10.00mL样品水解液放入250mL烧杯中用于氨基氮的测量,加入蒸馏水80.00mL及3滴1%酚酞指示剂,用标定好的NaOH标准溶液滴定至刚显微红色(与未滴定的一瓶对照),所耗用的NaOH标准溶液毫升数即总酸滴定数。然后吸取甲醛10.00mL加入其中,摇匀,马上再用标定好的NaOH标准溶液滴定至粉红色(颜色与第一次相比,红色更深),记下加入甲醛后所耗的NaOH标准溶液毫升数(V),同时做空白实验,用蒸馏水代替样品液在同一条件下,作一空白滴定,记下所耗的NaOH标准溶液毫升数(V1)。


(2) 游离氨基氮计算:
      氨基酸氮(g/100mL)=

式中V——加入甲醛后所耗用的已标定好的NaOH标准溶液毫升数
           V1——空白滴定所耗用的已标定好的NaOH标准溶液毫升数
           N——所用标定好的NaOH标准溶液的当量浓度
           0.014——氮的毫克当量
           10——吸取样品水解液10.00mL
2.2.4 实验流程
配海藻酸钠、CaCl2溶液→灭菌→将酶加入海藻酸钠中→酶的固定化
                                                          ↓       
大豆浸泡→大豆磨浆→调大豆蛋白液PH值→灭菌  →在无菌条件下放

入摇床(或者固定床)→每12小时测游离氨基值


3. 结果与讨论
3.1 NaOH标准溶液的浓度
经过3次标定,得值:10.19,10.21,10.23,取平均值10.21代入CNaOHVNaOH=2C草酸V草酸计算得NaOH浓度:
          CNaOH=0.098mol/L
3.2空白滴定的结果
经滴定得空白对照:V1=1.09mL
3.3 固定化酶与游离酶的性能比较
固定化酶和游离酶对大豆蛋白的水解效果有较大的差别。取底物浓度(大豆:水)为1:7,固定化时间为2.5h,酶浓度(酶量:海藻酸钠溶液体积)为1%,海藻酸钠浓度(w/v)为3%,进行对比实验,实验结果如图4所示。
  
图4 游离酶和固定化酶的活性比较
由图4可看出:水解刚刚开始后,游离酶的水解效果要明显好于固定化酶。因为酶固定化后,酶与底物的接触受到了一定程度的阻碍,固定化酶与底物的接触明显没有游离酶与底物的接触充分。因此,游离酶在水解刚开始时得水解效果要好得多,并比固定化酶早12h到达峰值。
然而,游离酶与底物极难分离,如果要从中分离出游离酶则要付出较大的成本。
3.4 单因素实验确定最佳固定化条件
3.4.1 海藻酸钠浓度对酶固定化的影响
海藻酸钠浓度不但影响到凝胶珠的机械强度,而且还影响着底物及产物的扩散,进而影响带固定化酶的生物活性。当海藻酸钠浓度为2.0%时,形成的凝胶珠的机械强度较弱,有明显的拖尾现象,且凝珠脆弱,易破壁;当海藻酸钠浓度为4.0%时,由于溶液粘度较高,固定化时不易成球。
取底物浓度(大豆:水)为1:7,固定化时间为2.5h,酶浓度(酶量:海藻酸钠溶液体积)为1%,海藻酸钠浓度(w/v)分别为2.0%、3.0%、4.0%,进行单因素实验,实验结果如表1和图5所示。

表1 不同海藻酸钠浓度对酶固定化效果的影响
海藻酸钠浓度 凝胶珠强弱 凝胶珠形状 使用时间 游离氨基峰值(g/100mL) 成球难易度
2.0% 较弱 偏圆形 10d 0.129 较难
3.0% 适中 圆形 25d 0.120 易
4.0% - 不成球 - - -


  
图5 不同海藻酸钠浓度下水解效果
从表1和图5可知:海藻酸钠浓度过低,虽然游离氨基的峰值,可以达到较高水平,但是其可使用时间稍短,不利于固定化酶的反复使用,如2%浓度下,游离氨基峰值要高于3%浓度,这可能是因为在酶促反应期间底物和产物易通过凝珠微孔,反应速度较快。但其可是使用时间太少;海藻酸钠浓度过高,使用时间可以达到比较理想的状态,但是与外界的能量和物质的传递都受到了不小的障碍,酶的活性受阻,其游离氨基的峰值并不理想;而且当海藻酸钠浓度为4.0%时,由于溶液粘度较高,固定化时不易成球。当海藻酸钠浓度为3.0%时,虽然游离氨基的峰值有少许的降低,但是其可利用时间可达25d,符合反复使用的特性,凝珠的机械强度适宜,反应速度也较快。
3.4.2 固定化时间对酶固定化的影响
海藻酸钠的固定化过程是一个化学反应过程:CaCl2溶液中的Ca2+通过海藻酸钠凝胶珠由外向内置换Na+而形成海藻酸钙,而置换反应是需要一定时间的。不同固定化时间对大豆蛋白水解效果有所影响。取底物浓度(大豆:水)为1:7,酶浓度(酶量:海藻酸钠溶液体积)为1%,海藻酸钠浓度(w/v)为3.0%,固定化时间分别为2h、2.5h、3h,进行单因素实验,实验结果如表2和图6所示。


表2 不同固定化时间下水解大豆蛋白的峰值
固定化时间 游离氨基峰值(g/100mL)
2h 0.107
2.5h 0.119
3h 0.088


 
图6 不同固定化时间下水解效果
由表2和图6可以看出,固定化时间较短时,固定化酶的活性较低;固定化时间2.5h时效果最好,游离氨基峰值可达0.119g/100mL;当固定化时间继续增加,固定化酶的活性又降低,这主要是因为固定化时间较长,交联程度高,高分子链结较致密,底物扩散阻力增加,固定化酶活性降低[13]。
3.4.3 固定化酶浓度对水解效果的影响
固定化酶量直接关系到固定化酶的活性。酶液浓度越高,反应所需时间越短,反应速度越快。取底物浓度(大豆:水)为1:7,固定化时间为2.5h,海藻酸钠浓度(w/v)为3.0%,将酶浓度(固定化酶量:海藻酸钠溶液体积)调整为0.5%,1%,1.5%进行固定化后,进行单因素实验,测定固定化酶的活性,实验结果如表3所示。

表3 不同酶量下水解大豆蛋白的峰值水解大豆蛋白的峰值
固定化酶浓度 游离氨基峰值(g/100mL)
0.5% 0.105
1% 0.123
1.5% 0.124
由表3可以看出,在其他条件不变时,随着酶液量的增加,酶的活性有所提高。当酶液量与海藻酸钠用量比从0.5%增加到1%时,固定化酶活性极显著提高,之后酶液量与海藻酸钠用量从1%增加到1.5%,固定化酶活性变化不大。而酶的价钱是比较昂贵的,因此酶液量与海藻酸钠用量比为1%较为合适。
3.4.4 底物浓度对水解效果的影响
不同底物浓度对固定化酶水解大豆蛋白液效果有重要的影响。取固定化时间为2.5h,酶浓度(酶量:海藻酸钠溶液浓度)为1%,海藻酸钠浓度(w/v)为3%,改变最佳底物浓度(大豆:水)分别为1:5、1:6、1:7、1:8,进行单因素实验,实验结果如表4和图7所示。

表4 不同底物浓度下水解大豆蛋白的峰值
大豆:水 游离氨基峰值(g/100mL)
1:5 0.098
1:6 0.100
1:7 0.129
1:8 0.121
          

 
图7 不同大豆蛋白液浓度下水解效果
从表4和图7可以看出,当大豆蛋白稀释较小时,底物浓度过高,而固定化凝胶珠与底物接触不良,很容易覆盖固定化凝胶珠,从而影响水解效果[14];而当大豆蛋白稀释较大时,底物浓度过低,底物中含有大量的水,在不断的使用中,固定化凝胶珠会吸水胀破,影响固定化酶的使用时间。由图可知:大豆:水=1:7时水解效果最好。
3.5 固定化酶在固定床与摇床中的比较实验
取最适固定化时间为2.5h,最适酶浓度(酶量:海藻酸钠溶液体积)为1%,最适海藻酸钠浓度(w/v)为3%,最佳底物浓度(大豆:水)为1:7,其比较实验结果如表5和图8所示。
3.5.1固定化酶在固定床与摇床中的性能比较
表5 固定化酶在固定床与摇床中对水解效果的影响
 使用时间(d) 嗅觉 游离氨基峰值(g/100mL)
固定床 〉40 轻微异味 0.122
摇床 25 强烈异味
0.118
从表5中可知,固定化酶在摇床和固定床中对水解效果的影响有一定影响:对游离氨基峰值影响不大,但在使用时间和嗅觉方面有较大的差异。固定化酶在固定床中可以反复使用的时间大大高于在摇床中,这主要是因为摇床的不断摇动使得固定化酶珠之间、酶珠与三角烧瓶壁之间不断的发生摩擦,酶珠与大豆蛋白液之间的剧烈冲洗,从而使固定化酶在使用一段时间以后破裂,导致仍具剩余活性的酶不能实现再利用,减少了固定化酶重复使用次数,降低了酶活性的利用率。
而在嗅觉方面的差异,主要是由于染菌引起的,因反应时间较长,反应温度为50 oC,比较适合一些菌种的生长。实验过程中,固定床取样是从事先设计好的取样口取样的,不易染菌;而从摇床中的锥形瓶中取样测量时,虽然在净化工作台中进行,手与相关器皿也都用75%乙醇杀菌,但其染菌的概率仍然大大高于在固定床中。
3.5.2固定化酶在固定床与摇床中水解效果的比较
 
图8 摇床和固定床 中水解效果
    从图8可以看出,在反应之初,固定化酶在摇床中的水解效果要略微好于在固定床中,这主要是因为在摇床中,底物与固定化酶之间的接触要比在固定床中更充分。但随着时间的推移,在摇床中的水解效果反而不如在固定床中。这主要是因为,在多次取样测量游离氨基以后,摇床中染菌造成的。细菌消耗了一部份产物或者尚未被完全水解的蛋白质,从而降低了游离氨基的值。
3.6 实验中注意点
(1) 滴定完毕后,尖嘴外不应留有液滴, 尖嘴内不应留有气泡。
 (2) 由于空气中CO2影响,已达终点的溶液放久后仍会褪色,这并不说明中和反应没有
完全,而是因为溶液中的NaOH与空气中的CO2反应成中性的Na2CO3,从而使溶液成中性而褪色。
(3) 因本实验过程需要3-4d,并且反应温度为50OC,大豆蛋白液极易染菌变质,所以实验中的各步骤都尽量应在净化工作台中进行,如取样测值等操作。
(4) 本次实验中取样测值的次数较多,所以应尽量减少取样对水解反应的影响,应采取的措施:减少取样次数,或者以相同的比例增加反应所需的各溶液量。

4.总结与展望
4.1 总结
经过这段时间的实验,我学到了很多知识与技能。通过查阅文献,我巩固了文献检索的方法,进一步学习了固定化酶的研究进展、应用、优点和水解蛋白的相关知识,还探索了固定床在固定化酶水解植物蛋白方面应用的可能性。而实验中,我更将理论知识应用到实际中去,提高了动手能力:学会了海藻酸钠固定化酶的具体操作步骤、水解植物蛋白的条件控制,并在导师的指导下,参与固定床的自制和安装。
经过实验,我得出:
(1) 固定化酶水解植物蛋白最佳参数:最佳底物浓度(大豆:水)为1:7;最适固定化时间为2.5h;最适酶浓度(酶量:海藻酸钠溶液体积)为1%;最适海藻酸钠浓度(w/v)为3%。
(2) 并在此最佳参数基础上,进行在固定床与摇床条件下的对比实验,得出:在固定床中,固定化酶使用次数和时间方面有很大的改善,从而使得酶的利用率更高;而且实现批量或连续操作模型的可能,更适于产业化、连续化、自动化生产。
由于客观条件所限制和关于固定化酶在固定床中水解植物蛋白的研究寥寥无几,本实验尚有诸多不足之处,比如:蛋白水解液仍有染菌几率,对实验有些许影响;实验中所用的自制固定床比较容易堵塞,且会发生泄漏现象,从而要经常检查;因时间紧迫,酶的固定化条件除了本实验所研究的4个参数外,还有pH、温度等因素的影响没有研究,而是经过查询相关文献取最佳参数的。
4.2 展望
展望未来,固定化技术作为一项新兴技术有着不可限量的活力,引起了酶工业极大的变化。固定化酶作为第二代酶制剂正日益成为酶应用方面的主力军。可以预期,今后最引人注目的进展将会是优良菌株固定化技术和连续反应器的巧妙结合。 毫无疑问,这将在工业生产中将发挥越来越重要的作用。

致  谢
首先我要感谢我的导师王克明教授。本课题在选题及研究过程中得到王克明教授的悉心指导。王克明教授在百忙之中,仍对我们的实验进行细心的指导,多次询问研究进程,并为我指点迷津,帮助我开拓研究思路,精心点拨、热忱鼓励。王老师一丝不苟的作风,严谨求实的态度,踏踏实实的精神,不仅授我以文,而且教我做人,给予我终生受益之道。在此,学生谨向导师表示衷心的感谢!
其次,我要感谢生化学院的全体老师和学校,是你们让我在大学的四年里,不但学到了知识,更学会了做人;是你们为我提供了良好的研究条件。
再次,我要感谢我的同学。在我迷茫时,你们鼓励我;在我困难时,你们帮助我。并在实验过程中不断地对我伸出援助之手。
最后,我要衷心感谢审阅此文的各位老师。


                                             程 慧
                                            2007年6月17日

参考文献
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