绿豆植物组织培养研究论文

菊科植物菊科是比较年青而进化程度较高的一个大科。虽然出现在地球上的时间较晚，但由于该科植物在形态结构上先进，对环境适应能力强，使这个年青的科在较短的时间内，不论在种的数量上还是分布范围上，均跃居世界种子植物之冠。许多植物分类专家和系统演化专家都一致认为它在被子植物（尤其是双子叶植物）系统演化中的地位，发展到了最高阶段。菊科植物的绝大部分属、种的营养体都是草本，木本者甚少，仅占本科植物种数的1.5%。从进化角度看，草本植物以种子或地下器官（根、根茎、块茎、球茎等）度过环境的不良时期，比木本植物适应性强，因而较木本植物进化。菊科植物除少数种类（如百日草、鬼针草）为对生叶外，多为互生单叶。1．菊科植物繁殖器官的特点是头状花序。头状花序是由许多无柄小花（或仅有一朵花）密集着生于花序轴的顶部，聚成头状。外形酷似一朵大花，实为由多花（或一朵）组成的花序。一般再由许多头状花序组成圆锥花序、伞房花序等。漏芦属的头状花序小，只包含一朵花，由许多小的头状花序又组成较大的复头状花序。头状花序的最外面，包有总苞，一般为绿色，叶状，它的功能无疑是在头状花序未开放之前，包在外面起保护作用。但本科中许多属、种的总苞，特化成具有特殊用途的器官，如蜡菊的总苞变成膜质，并有鲜艳的色彩，用它吸引昆虫；牛蒡、苍术及苍耳等的总苞变成钩刺，腺梗菊、豨莶等的总苞上具粘质的腺毛，可利用动物来传播果实、种子。由许多小花集成头状花序，这就使本来不太明显的每个小花集在一起，显得较大而醒目，尤其当某些属、种花序边缘的舌状花开放后，使花序变得更大、更醒目，以利于招引更多的昆虫。有些属、种的头状花序中，各小花之间有了明确的分工，如向日葵，花序边缘的舌状花是不能结实的无性花，中间的管状花既能产生花粉，又能结果实，是两性花，而金盏菊与之不同，边缘的舌状花是能结实的雌花，而中间的管状花全是只能产花粉而不能结实的雄花。2．头状花序上每朵花的结构，简要概括有如下几点：萼片变成冠毛，花瓣5枚连合，雄蕊聚药、子房2心皮下位。但各属、种之间差异很大，简化或特化现象很普遍。萼片：萼片是保护器官，尤其在花蕾时期。菊科的头状花序外围有总苞统一保护，所以萼片失去了它原有的作用，有些种类特化成为果实顶端刺状、毛状或片状的“冠毛”，成为果实种子的传播器官，如蒲公英、鸦葱等具毛状冠毛，可借风力使果实到处飘扬。又如鬼针草，冠毛变成刺状，可使果实附着于动物身体上，借以传播。花瓣：5枚，互相连合成管状或舌状。从进化角度看，合瓣花是后出性状，要比离瓣花进化。若花瓣的基部连合成较长的管，顶端五个花瓣呈辐射对称排列的，叫管状花，如向日葵花序中央的小花。若花瓣基部连合成较短的管，五个花瓣连合成为片状，两侧对称，向一侧伸展的叫作舌状花，花瓣顶端五个齿，表明该舌状花是由五枚花瓣连合而成。如蒲公英的花。有的种类花瓣基部连合成较长的管，但花瓣五枚形成唇形，分上下二唇，往往有的只发育一个唇，另一个唇退化，形成假舌状花，如金盏菊和向日葵花序外围的小花。在花冠管的基部，有环形的蜜腺，可分泌花蜜贮存在管的基部。雄蕊：5枚，花丝互相分离而花药边缘互相连合形成空筒形，即聚药雄蕊。每当花药成熟时，将花粉粒撒在聚药雄蕊的“筒”中，待雌蕊花柱生长时，将它们“推”出筒外。有些种类花药的基部特化成“尾”状，其功用是保护花瓣管基部的蜜腺和花蜜，免遭灰尘或雨水的侵蚀。在每个花药的顶端有突出的“药隔”，在雄蕊未成熟时，此五个药隔互相靠合形成一个“盖子”，封住花药管的口部，起防护作用。雌蕊：子房下位，二心皮构成，一室，一枚倒生胚珠，基底着生。花柱一条，伸于花药管中，顶端柱头2裂，但在雌蕊尚未成熟时，柱头不张开。在花柱上部，常生有一圈毛，叫“扫粉毛”，每当花柱发育而伸长的过程中，此“扫粉毛”即可将雄蕊花药“撒”在花药管中的花粉粒“推”出，便于来访的昆虫携带。菊科植物花一般都是雄蕊先熟，花柱伸长过程中将花粉粒“推”出后，顶端的柱头再张开来接受其它花传来的花粉。这是避免自花传粉的适应。但是，一旦柱头上没接受到其他花传来的花粉，即异花传粉遭到失败，也无妨，柱头可以下弯，将“授粉面”接触到自己的花柱上，沾上自花产生的花粉粒，完成自花授粉。3．菊科的果实是不开裂的干果，果皮致密，其中只含有一粒种子，一般认为是瘦果。但它来源于二心皮，并且是子房下位形成的，这与由一心皮形成的子房上位的瘦果有所不同，严格说起来应叫“菊果”或“连萼瘦果”（Cypsela）。菊科植物大多数花序较大而鲜艳，适于虫媒传粉，但另外有些属、种的花并不鲜艳，例如蒿属（Artemisia）、苍耳属（Xanthium）及豚草属（Ambrosia）等，它们的花序很小，黄绿色，很不鲜艳。这些植物是由虫媒特化成风媒的一个类型。苍耳属植物是雌雄同株，异花，雄花序较小，还保留扁平的头状花序，花期很短，花谢后即脱落，往往不被人们注意到。雌花序（即所谓的“苍子”）的花序轴（托）木质化，外有许多钩刺，其中包有两朵雌花，每朵雌花只剩下一个子房和二裂的花柱，成熟时整个花序脱落。向日葵在我国各地广为种植，取材容易，而且花序及花都较大，便于观察，下面将它的各部器官作一简述，供教学参考。向日葵是原产北美洲的一年生大型草本油料作物，种子含油量43.9～52%。高2～4米，大型的心脏形叶，互生。头状花序单生于茎顶，一般直径30厘米，大的可达60厘米。头状花序的花序轴（托）扁平，其中充满白色海绵状的填充物（薄壁细胞）。花序边缘围有3～4层绿色的总苞。最外圈的花为鲜黄色的“舌状花”（边花），中央为黄褐色的管状花（盘花）。舌状花（边花）（见图c）是不育性的无性花，功能就是吸引昆虫来访，帮助传粉。花瓣基部连合成短管，花瓣上部扁平、伸展，由三枚花瓣连合而成，另外两枚花瓣退化，所以有人称它为“假舌状花”。子房三角柱状，内无胚珠，花柱和雄蕊皆退化，不复存在。萼片退化成膜质的“冠毛”，一般三枚，分别着生在子房三个角的顶端。子房基部无明显的苞片。管状花（盘花）（见图B）的五枚花瓣基部连合成管状，上部五个齿，辐射对称。在花瓣管的下部膨大成球形，上生纤毛，其作用有二：1．膨大的空腔内贮花蜜供来访的昆虫采食。2．膨大的部分彼此靠得紧密，填充了花冠管之间的空隙，防止雨水、灰尘或长吻昆虫伤害下面的子房。萼片退化成膜质三角形的小薄片，着生在扁平子房的两个上角，已无明显的作用，果实成熟时脱落。雄蕊的花药黑褐色，连合成管，药隔三角形，黄褐色。雌蕊的子房下位，未成熟时白色，壁薄而软，待成熟后，果皮变硬而具黑色花纹。每个子房的基部都有一枚膜质的苞片包住子房，白色，顶端有三个裂齿，当果实成熟脱落时，此苞片仍存留在扁平的花序轴上。菊科植物依据头状花序内花的形态及乳汁的有无可分为两个亚科12个族。划分标准即：管状花亚科（Asteroideae）植物体不含乳汁，头状花序皆为管状花或至少花序中的盘花为管状花。包括11个族，大多数菊科植物都属于此亚科。应当说明的是我们日常栽培的菊花（Dendranthema morifolium）虽花序中央的盘花似舌状，那是长期人工选择的结果，它无乳汁应归于本亚科。蒿属、向日葵等，也都属于本亚科。舌状花亚科（Cichorioideae）植物体含乳汁，头状花序上皆为舌状花。只包含一个族。蒲公英、莴苣、苣荬菜等都属于本亚科。菊科植物与人类生活关系较为密切。其中有许多著名的观赏花卉如菊花、大丽菊、万寿菊、金盏菊、翠菊、蜡菊、大波斯菊（秋英）、瓜叶菊、雏菊等。日常食用的蔬菜有莴苣、茼蒿（北京称蒿子秆），菊芋（姜不辣），生菜等。药用种类较多如除虫菊、红花、牛蒡、蛔蒿（花序中产驱蛔虫有效成分——山道年）、苍术、泽兰、大蓟等。可提取芳香油的植物有艾纳香（Blumeabalsamifera），蒸馏后提取的挥发性物质即冰片，黄花蒿（Artemisia annua）全草可提取芳香油。橡胶草（Taraxacum kok-saghyz）是北方较寒冷地区的草本橡胶资源植物，苏联曾大量栽培。对人类生活有害的植物如蒿属某些种，专门生长在农田中，是庄稼的大敌。豚草属一些种的花粉对某些人易产生过敏反应。

罗宗洛的第一篇论文，是在1925年与他老师坂村彻合作发表的，题为《不同浓度的氢离子对植物细胞质的影响》。文中推论细胞质是由种种胶体的混合体所构成的多相系统，其中多数的两性电解质，各自独立存在，各有它的独立等电点，提出细胞质等电点的多点论。在1930年前后，欧美科学家正在讨论胶体化学应用于生物学的问题，细胞质等电点的一点论、多点论，引起很多讨论。他们的论文是这方面最早的研究工作之一。1925—1931年，罗宗洛在坂村彻实验室从事植物溶液培养的研究。当时生物学研究中许多工作集中注意于氢离子溶度对一般生命现象的影响，植物离子吸收机制的研究正在从新的观点、新的技术的基础上发展。农业方面正在讨论硝酸盐、铵盐作为农作物的氮肥，何者效果为好。他用NaNO3 、NH4NO3、NH3Cl、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4、NH4H2PO4、NH4HCO3代替Knop溶液中的Ca（NO3）2、KNO3，来培养水稻、燕麦、蚕豆、羽扁豆，每天测定培养液的pH变化。根据实验结果，证明铵盐并不是高等植物不好的氨源，使用铵盐引起培养液中氢离子的增加是可以避免的。在培养液中加入Ca2+，就可以消除铵盐作为氮源对植物生长的不良影响。罗宗洛在以上的工作基础上，开始玉米苗根对NH4+、NO3－吸收的研究。当时在无机营养的研究方面，对溶液中氢离子实际浓度影响根系离子吸收的工作还很少，这是一项具有开拓意义的研究。罗宗洛在1927—1929年进行这项研究，积累了丰富的实验资料。当培养液中（Knop溶液里Ca（NO3）2，KNO3用NH4NO3代替）除NH4NO3外，其他盐类的浓度比较高时，玉米幼苗吸收NH4+到一定程度后，才开始吸收NO3－。当其他盐类浓度很高时，NH4+的吸收量超过NO3－很多，引起培养液的pH降低；当其他盐类浓度低时，NO3－的吸收多于NH4+；当这种培养液内其他盐类浓度与Knop溶液相等时，NH4+的吸收量与NO3－相等。他进一步做玉米幼苗在不同浓度NH4NO3单盐溶液中的吸收，发现玉米根与含有NH4NO3的培养液相接触，培养液的pH很快变化，而培养液的偏酸、偏碱都会影响玉米幼苗的生长。要避免这种偏酸、偏碱的变化，铵盐是合宜的植物氮源。如以NH4HCO3与（NH4）2SO4按一定比例配制溶液，使溶液在培养玉米以后，pH不致变化很大，玉米就可以生长得很好。以上有关植物吸收NH4+、NO3－的实验结果，证实了当时苏联科学院院士Лрянцщников关于铵盐可作为氮源的论点，受到他的赞赏。50年代我国化学氮肥严重不足，建设了许多小化肥厂生产、推广碳酸氢铵（炭铵）。事先曾征求罗宗洛的意见，他提供了有关碳酸氢铵肥效及如何使用的科学依据，对这些工厂的生产发挥了指导作用。虽然，对NH4+、NO3－的吸收、利用研究已在向纵深发展，对吸收机制的认识已更为深入，但罗宗洛在上个世纪研究中观察到的许多现象，应该说是今天工作的先导。1934—1937年罗宗洛在南京中央大学开展无菌条件下玉米离体根尖的研究，当时植物组织培养还处在萌芽阶段，只有法、德、美等国的少数人在工作。他和清华大学的李继侗（当时做银杏离体胚的培养）是我国植物组织培养方面的先驱和倡导人。罗宗洛最初做叶提取物对根尖生长的影响，目的在于探讨叶提取物中是否存在“成根素”一类的生长促进物质。用柳、桑、茶、旱金莲、番茄和小麦的新鲜叶沸水的提取物，加入液体培养基中培养玉米根，发现这些提取物对主根的增长及侧根的发生有促进作用，对根表面细胞的排列起调节作用，细胞排列整齐；不加叶提取物的，根表面细胞的排列呈锯齿状。桃、洋槐的叶提取物不能增长玉米的长度及侧根数，但根表面的细胞排列整齐。随后，试验培养基中不同氮源（无机和有机的）对玉米根尖生长的影响，以硝酸盐作为氮源，玉米根尖长得最长，侧根最多，干重也最大。铵盐对玉米根尖的生长不是最好的氮源。玉米根尖能利用尿素、天门冬酰铵、白蛋白等作为氮源，而只单独加一种氨基酸对促进玉米根尖的生长不明显。以上成果，从1935年起连续发表了3篇论文，引起国际上的重视。当时Protoplasma杂志邀请他撰写一篇综合性的论文。组织培养的工作由于1937年8月13日日军在上海发动侵略战争而告停顿。尽管如此，我国的组织培养研究，后来所以能够得到日益蓬勃的发展，不能不追溯到当年的肇始工作及培养的人才。1940年起罗宗洛开始研究微量元素的生理功能。他设想凡是植物生长上必要的物质，凡是能促进植物生长的物质，在理论上都应该有引起燕麦胚芽鞘弯曲的功能。他指导两位学生进行此项试验，结果低浓度的硫酸锰能引起胚芽鞘弯曲，近似生长激素的效应。同年夏季，他在浙江大学极其简陋的条件下，继续进行微量元素的研究，此时实验室的助教、学生多了，做了许多试验。观察到微量锰能促进水稻、绿豆、玉米、油菜的发芽和小麦种子内糖化酶的活性，使胚乳中的淀粉、糊精的消失速率比对照为快。锰还能促进菜豆初生叶中淀粉的分解。水稻、小麦、玉米、烟草、油菜等的花粉萌发及花粉管的生长，锰也都有促进作用。锌、锰、硼还能引起丝瓜的单性结实。关于微量元素的研究，先后发表了8篇论文。他在这方面的研究成果，在当时是一个创举。1958年罗宗洛开始进行高等植物辐射生理研究，他开展此项工作的目的是：在理论上了解生物对不良环境的适应过程，在实践上探测如何减轻辐射伤害的途径。研究结果表明植物对辐射的敏感性随生长状况不同而异，生长旺盛时期对辐射很敏感，促进生长的物质增加植物对辐射的敏感性，抑制生长的物质则增加耐受性。分次辐射比一次辐射损伤小，表明在间歇期损伤在恢复。他注意到在辐射损伤和恢复时期植物体内谷胱甘肽含量的变化。他特别重视辐射伤害恢复的研究。这些工作当时国际上方才开始，已成为辐射生理研究中的重要领域，可见他的科学远见。

收稿日期：2007-10-25基金项目：深圳市科技和信息局基金资助项目作者简介：王丹（1982-），女，辽宁本溪人，硕士研究生，从事植物生物技术研究。注：雷江丽为通讯作者。大花美人蕉茎尖组织培养技术研究王 丹1,2，雷江丽2，吴燕民3，吕 慧2，郁继华1(1.甘肃农业大学 农学院，甘肃 兰州 730070；2.深圳市园林科学研究所，广东 深圳 518003；3.中国农业科学院 生物技术研究所，北京 100081)摘 要：以大花美人蕉（Canna×generalis）根茎茎尖为外植体进行组织培养技术研究，筛选出芽诱导适宜的培养基为MS + 6-BA 8.0mg/L（单位下同）+ TDZ 0.03；MS + 6-BA 8.0 + TDZ 0.03 + NAA 0.1 培养基能较好地诱导分化出丛生芽, 继代增殖培养中与MS + 6-BA 3.0 + TDZ 0.03 + NAA 0.1 培养基交替使用可减少畸形芽，增殖系数达1.67；适宜的生根培养基为MS + 6-BA 1.0 + NAA 0.5，生根率达66.67%，且植株生长健壮，移栽易成活。关键词：大花美人蕉；茎尖；组织培养中图分类号：Q943.1 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2008)01-0033-04Research on Shoot-tip Culture of Canna×generalisWANG Dan1,2, LEI Jiang-li2, WU Yan-min3, LÜ Hui2, YU Ji-hua1(1.College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu China; 2.Shenzhen Institute of LandscapeGardening, Shenzhen 518003, Guangdong China; 3.Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of AgriculturalSciences, Beijing 100081, China)Abstract: The paper mainly studied on tissue culture of Canna×generalis with the stem tips asexplants. The results showed that the bud inoculation medium was MS + 6-BA 8.0mg/L+ TDZ0.03mg/L; the best of clump shoot induction and differentiation medium was MS + 6-BA 8.0mg/L +TDZ 0.03mg/L + NAA 0.1mg/L; using MS + 6-BA 3.0mg/L + TDZ 0.03mg/L + NAA 0.1mg/L asproliferation medium, an optimal proliferation rate was obtained. When the two kinds of mediumused alternatively, the effect was better. The optimum rooting medium was MS + 6-BA 1.0mg/L +NAA 0.5mg/L, the rate of rooting could reach 66.67%, and cultured in this medium, the plant grewwell and easy to survival.Key words: Canna×generalis; shoot-tip; tissue culture大花美人蕉(Canna×generalis)属美人蕉科(Cannaceae)美人蕉属(Canna)的园艺杂交种[1]，是多年生喜光宿根草本花卉，原产美洲热带和非洲等地。其枝叶茂盛、花朵艳丽、姿态优美、花期长，在深圳地区几乎全年开花，是配置大型花坛的优良品种。大花美人蕉不仅观赏价值高，而且能吸收硫、氯、氟、汞等有害物质，具有净化空气、保护环境的作用，因此，世界许多城市的园林绿化中都广泛应用。美人蕉传统的繁殖方式主要采用分切地下根茎的方法，繁殖速度慢、增殖效率低，而且连续营养繁殖造成病毒积累致使病毒病在各地相当普遍，严重影响其观赏价值。利用茎尖组织培养进行脱毒试管苗快繁，是目前大力繁殖与推广美人蕉的主要手段。关于美人蕉组织培养的研究报道较少[2,3]，本研究探索其组织培养高效的再生体系，以期为品种提纯复壮及遗传转化、性状改良奠定基础。2008,37(1):33-36.Subtropical Plant Science第·34· 37 卷1 材料与方法1.1 材料供试材料为目前城市绿化中普遍应用的大花美人蕉‘President’品种。1.2 外植体选择与处理选择生长健壮、无病虫害的优良母株，挖取带芽胞的根茎，去除表面老皮并用肥皂水清洗。用75%乙醇棉擦拭，然后采用不同的消毒剂及处理时间（0.1%升汞10min、2%次氯酸钠10min、2%次氯酸钠20min、2%次氯酸钠 + 0.1%升汞5min、2%次氯酸钠 + 0.1%升汞10min），封闭式振摇灭菌。无菌水冲洗5 次，置于超净工作台上备用。接种前，剥去外部叶片，露出生长点，立即切取茎尖进行接种。1.3 培养方法及培养条件试验于2006 年10 月在深圳市园林科学研究所组培室进行。诱导、增殖和生根培养基均选用MS为基本培养基，在不同培养阶段附加不同种类、不同浓度配比的植物生长调节剂（表2～表4），蔗糖3%，pH 5.8。培养温度(28±2)℃，光照强度2 500 lx，光照周期为14h/d，相对湿度70%～80%。每处理接种30 瓶。定期观察试管苗生长与分化情况。2 结果与分析2.1 不同消毒处理方式对外植体无菌化的影响因供试外植体取自美人蕉地下根茎，表面污染物较多，不易消毒，且不同植物及外植体的成熟度对消毒剂的反应不同，故本试验选用升汞和次氯酸钠进行灭菌效果比较，以筛选合适的消毒剂及消毒处理时间。由表1 可知，2%次氯酸钠20min 处理的无菌化效果较好，但茎尖褐化较严重，说明灭菌时间过长对去老皮后的幼嫩根茎影响较大。0.1%升汞10min 处理与2%次氯酸钠 + 0.1%升汞 10min处理，无菌化效果差异不大，但2%次氯酸钠 + 0.1%升汞 10min 处理有轻微药害。因此，后续实验选用0.1%升汞处理10min 进行外植体消毒。2.2 不同生长调节剂配比对芽诱导的影响以MS 为基本培养基，附加不同浓度6-BA、NAA、2,4-D、KT、TDZ 等（表2），以筛选出较适宜美人蕉茎尖诱导分化的配方。因美人蕉根茎具有休眠特性，芽诱导分化较难。TDZ 具有很强的促进细胞分裂活性，0.05～1.0μmol/L 即可有效促进分化[4]，因此，本实验对TDZ 的诱导效果进行初步探索。试验表明，在不添加任何生长调节剂的MS 基本培养基（1 号）上，茎尖接种10d 后开始生长，叶片展开后，生长停止；15d 后转接到新的MS 培养基上无明显生长，随后叶片逐渐变黄、萎蔫，说明基本培养基中添加生长调节剂是美人蕉离体培养的必要条件。在仅添加6-BA 的2、3、4 号培养基中，高浓度的2 号培养基分化率为33.33%，明显好于3、4号培养基，说明美人蕉启动芽诱导分化需要高浓度的细胞分裂素（表2）。11～16 号培养基添加物为不同生长调节剂与TDZ 组合（表2）。仅添加TDZ 的培养基分化率为0，而多种生长调节剂配合使用分化效果更好[5]。其中15 号培养基的侧芽分化率最高，达63.33%，且每个茎尖可增殖2～3 个侧芽，但个别茎尖经多次转接后有畸形芽；与2 号培养基相比，分化率明显提高，说明添加低浓度TDZ 可促进芽诱导分化（表2）（图版-a）。5、6、7 号培养基为生根培养基，探讨NAA 对美人蕉茎尖生长和生根的影响。试验结果初步说明美人蕉在6-BA/NAA 小于2/0.5 时生根率可达50%以上（表2）。8、9、10 号培养基，探讨美人蕉脱分化，诱导愈伤组织，但结果均不理想。因此，建立高效的美表1 不同消毒剂及处理时间对外植体无菌化的影响处 理 接种数污染数污染率(%) 药害情况0.1%升汞10min 30 5 16.67 基本无药害2%次氯酸钠10min 30 12 40.00 无药害2%次氯酸钠20min 30 4 13.33 20%有轻微药害2%次氯酸钠+0.1%升汞5min 30 10 33.33 3%有轻微药害2%次氯酸钠+0.1%升汞10min 30 5 16.67 7%有药害第1 期 王丹,等：大花美人蕉茎尖组织培养技术研究 ·35·人蕉遗传转化再生体系还需进一步探索愈伤组织诱导途径。2.3 芽继代增殖为了探讨优化的芽继代增殖培养基配方，按表3 设计6-BA、NAA、TDZ 的正交实验，以15 号培养基上分化出的丛生芽为接种材料，进行继代增殖培养（图版-b）。由表3 可见，除17、18 号培养基外，低浓度TDZ（0.03mg/L）的分化促进作用较高浓度（0.3mg/L）的效果好，说明高活性的TDZ 浓度过高反而抑制分化。当TDZ0.03mg/L 时, NAA 0.1mg/L 促分化作用显著优于NAA0.5mg/L。在TDZ、NAA 浓度相同的情况下，随着6-BA 浓度的升高，分化率提高。但随着继代次数的增多，含高浓度6-BA的27 号培养基分化率略有下降，甚至有个别畸形芽产生，说明高浓度细胞分裂素对短期的分化有促进作用[9]，但继代数次后，芽已经萌动，自身具有分化能力，需适当降低6-BA 浓度进行壮苗，以避免畸形芽产生。因此，在增殖过程中交替使用分化增殖系数较高的19 号培养基和27 号培养基，既可保证较高的芽分化率，又可使继代苗生长健壮，减少畸形芽。2.4 生根诱导增殖芽3～5cm 长时，转接到生根培养基上培养约10d 后，可见到根生成（图版-c）。接种20d 后统计生根结果（表4）。从表4可见，所用培养基上都有根生成，说明美人蕉生根较容易；结合生根率和生长势，我们认为MS + 6-BA 1.0 + NAA 0.5培养基较适宜美人蕉生根。表2 不同植物生长调节剂组合的比较植物生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA 2,4-D KT TDZ分化率(%) 生根率(%) 备注1 0 0 0 0 02 9 0 0 0 0 33.33 参考[2]3 5 0 0 0 0 23.33 参考[3]4 3 0 0 0 0 6.675 2 1 0 0 0 60.006 2 0.5 0 0 0 56.677 2 0.2 0 0 0 08 0 0 4 0 09 0 0 2 1 0 参考[6]10 0 0.2 0 2 0 参考[7]11 0 0 0 0 0.2 012 0 0.1 0 0 0.2 23.33 参考[8]13 0 0 0.5 0 0.1 3.3314 0 0 1 0 0.1 6.6715 8 0 0 0 0.03 63.3316 5 0 0.5 0 0.03 50.00表3 不同生长调节剂配比对芽继代繁殖的影响生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA TDZ接种数分化率(%)增值系数 生长势17 3.0 0.5 0.03 30 30.00d 1.20d ++18 3.0 0.5 0.30 30 36.67cd 1.50bc ++19 3.0 0.1 0.03 30 56.67a 1.67a ++20 3.0 0.1 0.30 30 33.33cd 1.46bc ++21 5.0 0.5 0.03 30 43.33c 1.60ab ++22 5.0 0.5 0.30 30 26.67d 1.33c ++23 5.0 0.1 0.03 30 56.67a 1.60ab ++24 5.0 0.1 0.30 30 53.33ab 1.57b +25 8.0 0.5 0.03 30 50.00b 1.53b ++26 8.0 0.5 0.30 30 26.67d 1.37c +27 8.0 0.1 0.03 30 60.00a 1.73a ++28 8.0 0.1 0.30 30 26.67d 1.37c +注：++ 表示生长势强；+表示生长势弱。同列中不同字母表示差异显著(P＜0.05＝，表4 同。表4 不同的生长调节剂配比对组培苗生根的影响生长调节剂(mg/L) 编号6-BA NAA接种数生根苗数生根率(%)植株生长势29 0 0.5 30 19 63.33b +30 0 1.0 30 21 70.00a ++31 1.0 0.5 30 20 66.67ab +++32 1.0 1.0 30 16 53.33c ++注：+++ 表示生长势强；++表示生长势中等；+表示生长势弱。第·36· 37 卷3 结 论美人蕉根茎生长在土壤中，无菌化操作较困难。灭菌试验表明，0.1%升汞震荡灭菌10min 效果较好，采回的外植体应尽快处理接种，放置时间过长伤口处易染菌，导致接种后褐化较严重。MS + 6-BA 8.0 + ZDT 0.03 + NAA 0.1 培养基能较好地诱导分化丛生芽，MS + 6-BA 3.0 + TDZ 0.03+ NAA 0.1 为较好的增殖培养基，在增殖培养过程中这两种配方交替使用效果更好；短时间使用高浓度生长调节剂对增殖有促进作用，但长时间使用高浓度生长调节剂会使组培苗质量下降。在试验中还发现，转接次数多的茎尖较转接次数少的分化率大，建议在接种后的10～20d 内及时转接。选用MS + 6-BA 1.0 + NAA 0.5 为生根培养基，生根率较高，根系粗壮、根毛密集，植株生长健壮（图版-d），且移栽成活率较高。参考文献:[1] Segeren W, et al. The genus Canna in Northern South America[J]. Acta Bot Neerl., 1971,20(6): 663-680.[2] 刘文萍,等. 美人蕉茎尖组织培养及快繁技术[J]. 北方园艺, 2001(6): 32.[3] 丁爱萍,等. 美人蕉组织培养及快速繁殖技术[J]. 园林科技, 2006(1): 11-12.[4] Singh N D, et al. The effect of TDZ on organogenesis and somatic embryogenesis in pigeonpea (Cajanus cajan L. Millsp)[J].Plant Science, 2003,164(3): 341-347.[5] 王关林,等. 高活性细胞激动素TDZ 在植物组织培养中的应用[J]. 植物学通报, 1997,14(3): 47-53.[6] 宣朴,等. 生姜茎尖组培快繁技术研究[J]. 西南农业学报, 2004,17(4): 484-486.[7] Kromer K, et al. In vitro cultures of meristem tips of Canna indica L.[J]. Acta Horticulturace, 1985,167: 279-286.[8] Vendrame W A, et al. In vitro propagation and plantlet regeneration from Doritaenopsis Purple Gem 'Ching Hua' flowerexplants[J]. HortScience, 2007,42(5): 1 256-1 258.[9] 刘敏. 花卉组织培养与工厂化生产[M]. 北京: 地质出版社, 2002: 101-102.

植物组织培养及其应用研究概况在世界各国科学家的不断努力下，近几十年来，植物组织培养技术迅速发展。利用组织培养，不仅可以大量生产优良无性系，获得人类需要的多种代谢物质，还可获得单倍体、三倍体、多倍体及非整倍体。通过细胞融合可以打破种属间的界限，克服远缘杂交不亲合性，在植物新品种的培育和种性的改良中发挥了巨大作用。组织培养的植物细胞是在细胞水平上分析研究的理想材料，从植物快繁、花药培养发展到细胞器培养、原生质融合以及DNA重组技术等，植物组织培养技术广泛应用于植物科学的各个领域及农业、林业、工业、医药等多种行业，已经成为当代生物科学中最有生命力的一门学科。1 植物组织培养的基本概念、原理和试验步骤1．1概念植物组织培养是在无菌条件下，将离体的植物器官(根尖、茎尖等)、组织(形成层、花药组织等)、细胞(体细胞、生殖细胞等)、胚胎(成熟或未成熟的胚)、原生质体等在人工配制的培养基上培养，给予适宜的培养条件，诱发其产生愈伤组织或潜伏芽或长成完整的植株的技术。1．2原理 植物组织培养的依据是植物细胞的“全能性”及植物的“再生作用”。1902年，德国著名植物学家 G．Haberlandt根据细胞学理论提出了一个观点，“高等植物的器官和组织可以不断分割，直至单个细胞，即植物体细胞，体细胞在适当的条件下具有不断分裂、繁殖并发育成完整植株的潜力”。1943年，美国人White在烟草愈伤组织中偶然发现形成一个芽，证实了G．Haberlandt的论点。 不同植物所需要的生长条件不同，所用的培养基也有所不同。较常用的基础培养基有MT、MS、 SH、N6、White等。在组织培养中，愈伤组织和胚状体能否形成是培育出新植株的关键。通过在基础培养基里添加一定浓度的外源激素，可以诱导出愈伤组织、胚状体、不定芽、根等器官，最终获得再生植株或次生物质。 用于植物组织培养的材料称为外植体，其主要形式有器官、胚胎、单细胞、原生质体等。根据外植体的不同，所需要的培养基种类、培养条件、外源激素的种类及比例等均不同。植物组织培养中，影响培养力的因素是多方面的，诱导愈伤组织成败的关键在于培养条件，植物激素是诱导愈伤组织和绿苗分化的关键因素。最常用的诱导愈伤组织的生长素是IAA、NAA和2，4一D，所需浓度为O．01～10 mg／L。最常用的细胞分裂素是KT和ABA，使用浓度为O．1～10 mg／L。KT的主要作用是促进细胞分裂和愈伤组织分化。ABA对植物体细胞胚的发生与发育具有重要作用。各类植物激素的生理作用虽有相对专一性，但是植物的各种生理效应是不同种类激素之间相互作用的综合表现。1．3试验步骤1．3．1选择和配制培养基 培养基是植物组织培养中的“血液”，血液的成分及其供应状况直接关系到培养物的生长与分化，因此了解培养基的成分、特点及其配制至关重要。1．3．2灭茵灭菌是组织培养中的重要工作之一，通常采用物理的或化学的灭菌方法。培养基用常压或高压蒸煮等湿热灭菌、器械采用灼烧灭菌、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌、不耐热的物质采用过滤灭菌、植物材料表面用消毒剂灭菌、物体表面用药剂喷雾灭菌、接种室等空间采用紫外线或熏蒸灭菌。1．3．3接种将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块放入培养基，整个接种过程要在无菌条件下进行。 l.3．4培养把培养材料放在有一定光照和温度等条件的培养室里，使之生长、分裂和分化，形成愈伤组织或进一步分化成再生植株。1．3．5试管苗驯化移栽 试管苗是在特殊环境条件下生长的幼苗，与自然生长的幼苗有很大差异，只有通过驯化，使之适应自然环境后才能移栽。2 植物组织培养的应用2．1植物快速繁殖和无病毒种苗生产植物快速繁殖技术始于20世纪60年代，法国的Morel用茎尖培养的方法大量繁殖兰花获得成功，从此揭开了植物快速繁殖技术研究和应用的序幕。目前，通过离体培养获得小植株并且具有快速繁殖潜力的植物已有100多科1 000种以上，有的已经发展成为工业化生产的商品。世界上80％～85％的兰花是通过组织培养进行脱毒和快速繁殖的。培养的植物种类也由观赏植物逐渐发展到园艺植物、大田作物、经济植物和药用植物等。在我国，同类的研究始于20世纪70年代。马铃薯无毒种薯和甘蔗种苗已在生产上大面积种植，30余种植物已进行规模化生产或中间试验。利用组织培养进行植物快速繁殖及无病毒种苗生产，不仅能够挽救珍惜濒危物种，而且能够解决植物野生资源缺乏的问题。2．2植物花药培养和单倍体育种 将植物花药培养成单倍体植株，再经过染色体加倍，能很快得到纯合的二倍体，这样将大大缩短育种年限。到目前为止，世界上通过花粉和花药培养已获得了几百种植物的单倍体植株。印度科学家应用这种方法培育的水稻品系，比对照产量提高15％～49％。韩国先后育成了5个优质、抗病、抗倒伏的水稻品种。我国自20世纪70年代开始该领域的研究，已经培育了40余种由花粉或花药发育成的单倍体植株，其中有10余种为我国首创。玉米获得了100多个纯合的自交系；橡胶获得了二倍体和三倍体植株。仅“九五”期间就育成高产、优质、抗逆、抗病的农作物新品种44个，种植面积超过660万 hm2。2．3植物胚胎培养杂交育种中，杂种胚常常败育，因此将早期生长的胚取出，应用组织培养方法，就有可能培育出杂交植物。已经有100篇以上幼胚培养成为植株的报道。国内外科学家应用植物胚胎培养技术获得了多种远缘杂交的重组体、栽培种和杂交品种。2．4植物愈伤组织或细胞悬浮培养利用植物愈伤组织或细胞悬浮培养可以生产用于预防和治疗疾病的植物次生代谢产物。近年来，这一领域的发展极为迅速，已经研究了400多种植物，从培养细胞中分离到600多种次级代谢产物，其中60多种在含量上超过或等于原植物，20种以上干重超过原植物的1 9，6。例如，从薯芋愈伤组织和悬浮细胞生产的diosgenin用于合成甾体药物。最近抗癌药物紫杉醇一红豆杉细胞培养物，可用75t发酵罐培养，已达到商业化生产水平。另外，达到商品化水平的还有紫草、人参、黄连、老鹳草等；长春花、毛地黄、烟草等已实现工业化生产；牙签草、红花等20多种植物正在向商品化过渡。2．5细胞融合与原生质体培养自1960年英国学者Cocking首次利用纤维素酶从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功以来，到1990年已有100种以上植物的原生质体能再生植株。我国获得了30余个品种的原生质体再生植株，其中包括难度较大的重要粮食作物和经济作物，如大豆、水稻、玉米、小麦、谷子、高梁、棉花等。在木本植物、药用植物、蔬菜和真菌原生质体培养方面的进展也十分迅速。国外已先后获得了种内及种间的体细胞杂种植株。植物原生质体培养还可应用于外源基因转移、无性系变异及突变体筛选等研究，因而越来越受到人们的重视。2．6植物细胞突变体筛选植物细胞突变体的筛选最早始于1959年，G． Melchers在金鱼草悬浮细胞培养中获得了温度突变体。1970年，P．S．Carlson，H．Binding和Y．M． Heimer等分别分离出烟草营养缺陷型细胞、矮牵牛抗链霉素细胞系及烟草抗苏氨酸细胞系。迄今为止，已经在不少于15个科45个种的植物细胞培养中筛选出100个以上的植物细胞突变体或变异体。其中包括抗病细胞突变体，如玉米抗小斑病突变体和小麦抗赤霉病、根腐病突变体；抗氨基酸及其类似物细胞突变体，如甘蓝型油菜抗HYP突变体[263；抗逆境胁迫细胞突变体，如水稻耐盐突变体和小麦抗盐突变体；抗除草剂细胞突变体及营养缺陷型细胞突变体，如玉米抗除草剂变异体；株高突变体的筛选，如水稻矮秆变异体。2．7植物体细胞胚胎和人工种子1958年，Reinert在胡萝卜的组织培养中最先发现了体细胞胚胎(胚状体)。据不完全统计，能大量产生胚状体的植物有43科92属100多种。一些重要作物如水稻、小麦、玉米、珍珠谷等，也能通过离体培养产生胚状体。这些胚状体用褐藻酸钠等包埋，再加上人工种皮，就形成了人工种子。人工种子的优点是：繁殖快速，成苗率极高；不受气候影响，四季皆可工厂化生产。上世纪80年代初，美、日、法等国家相继开展了人工种子的研究，我国也于“七五”期间开展了此项研究，并于1987年列入了国家“863”高技术研究发展计划。2．8 植物组织细胞培养物的超低温保存与种质库建立植物细胞全能性的发现和证实，为植物种质资源的长期保存开辟了一条新途径。采用液氮超低温保存技术，能保持很高的存活率，并且能再生出新植株和保持原来的遗传特性。如建立茎尖分生组织培养物的超低温保存种质库，不仅可以防止种质的遗传变异和退化，而且可以长期保存无病毒的原种。2．9 植物组织培养与转基因技术的应用 我国第一个T—DNA插入突变体库的构建和研究为我国水稻功能基因组学研究奠定了良好的技术和材料基础，为确保我国拥有一批有自主知识产权的基因资源做出了积极贡献。由中国水稻研究所农业部水稻生物学重点开放实验室和中科院上海植物生理研究所合作，通过建立大规模、高效的农杆菌介导的转基因技术体系，将玉米转座子Ac—Ds等外源基因导入水稻未成熟胚和种子诱导的愈伤组织，获得了1．2万个独立的T—DNA插入株系，并构建了水稻突变体的数据库。 3 展望植物组织培养研究与应用是20世纪科技进步的重大成果之一，为研究植物生长发育、抗性生理、激素及器官发生与胚胎发生等提供了许多良好的实验材料和有效途径。植物组织培养方法不断提高的同时，也相应拓宽了其应用范围。由于组织培养在人工控制的条件下进行，容易掌握花芽分化和开花成因；通过胚胎培养，能够得到杂种或自交种；通过分离单倍体细胞，能培育纯合的二倍体优良品系；提高育种多样性的同时缩短了育种时间；通过突变体筛选，提高植物的品质，增强抗逆境胁迫能力，扩大植物的生长范围；将体细胞冷藏在低温下，建立基因库，达到保存物种的目的；获得药用价值高和工业生产所需要的次生产物，加快药物生产的时间并且减少了单纯依靠天然植物的被动性。植物组织培养技术已经渗透到科研、生产和生活各个领域，必将日臻完善。黑龙江农业科学2006，(3)