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1/35 【题 名】社会责任视角下的景区公司成长模式研究——以天龙旅游开发投资经营有限责任公司为例 【作 者】李乐京 陈志永 梁玉华 【刊 名】安徽农业科学.2007,35(20).-6263-6265 2/35 【题 名】以六大转变推进我省旅游经济又好又快发展 【作 者】纪根立 【刊 名】今日浙江.2007(11).-50-51 3/35 【题 名】25年来秦俑馆旅游生命周期与结构变化研究 【作 者】孙根年 薛刚 【刊 名】干旱区地理.2007,30(2).-283-288 4/35 【题 名】山东省旅游饭店人才对策深层透视 【作 者】孙凤芝[1] 秦绪霞[2] 【刊 名】集团经济研究.2007(02Z).-275-275 5/35 【题 名】从概念到实证：中国旅游研究的未来 【作 者】马聪玲 【刊 名】旅游学刊.2007,22(3).-6-7 6/35 【题 名】西部旅游企业高成长的影响因素分析 【作 者】王香茜 【刊 名】商业时代.2007(6).-104-105 7/35 【题 名】中国六大遗产地旅游非线性成长及比较研究 【作 者】孙根年 吴晓娟 【刊 名】陕西师范大学学报：自然科学版.2007,35(1).-107-111 8/35 【题 名】我国旅游产业丛集研究 【作 者】强亦锐 【刊 名】合作经济与科技.2007(03S).-43-44 9/35 【题 名】成长期的自助旅游与迎合策略 【作 者】曹宇 【刊 名】桂林旅游高等专科学校学报.2006,17(6).-657-660 10/35 【题 名】甘肃段丝绸之路旅游产品生命周期成长研究 【作 者】何喜刚 高亚芳 【刊 名】开发研究.2006(5).-85-86,73 11/35 【题 名】旅游是重心 文化是品位——答龙源期刊网记者问 【作 者】季成家 【刊 名】丝绸之路.2006(9).-66-73 12/35 【题 名】试论环鄱阳湖旅游成长三角的构建 【作 者】冯淑华 【刊 名】商业研究.2006(14).-165-168 13/35 【题 名】甘肃省旅游产业中的市场成长问题研究 【作 者】彭睿娟 【刊 名】甘肃联合大学学报：社会科学版.2006,22(3).-48-51 14/35 【题 名】制度、技术、管理：中国旅游产业化成长的制度安排 【作 者】沈和江 【刊 名】石家庄学院学报.2006,8(3).-90-94 15/35 【题 名】企业成长理论与我国旅游企业并购的路径策略 【作 者】胡春林 【刊 名】特区经济.2006(4).-195-196 16/35 【题 名】旅游与家教 【作 者】裴毅然 【刊 名】家庭教育.2006(02S).-22-23 17/35 【题 名】数字化与企业持续成长的战略选择——以温州旅游企业为例 【作 者】汪升华[1] 刘洋[2] 顾文静[2] 【刊 名】经济管理.2006(3).-64-66 18/35 【题 名】浅议中等职业学校旅游专业职业技能的培养 【作 者】杨亚娟 【刊 名】农业职业教育.2005(6).-26-26 19/35 【题 名】对发展苏州博物馆旅游的思考 【作 者】于萍 【刊 名】苏南科技开发.2005(11).-39-40 20/35 【题 名】旅游管理专业本科实践教学规律与体系 【作 者】谭白英 【刊 名】理工高教研究.2005,24(5).-118-119 21/35 【题 名】我国主题旅游丛集的成长及其空间特征研究 【作 者】聂献忠[1,2] 张捷[1] 刘泽华[1] 章锦河[1] 【刊 名】人文地理.2005,20(4).-65-68 22/35 【题 名】我国旅游企业并购混合路径偏好的实证研究 【作 者】胡春林 【刊 名】旅游学刊.2005,20(3).-48-52 23/35 【题 名】浅析假期旅游对青少年学生成长的积极影响 【作 者】邓宇凡 【刊 名】和田师范专科学校学报：汉文综合版.2005,25(1).-59-60 24/35 【题 名】旅游社营销中心的成长档案 【作 者】韩阳 【刊 名】出版参考：业内资讯版.2005(04X).-22-23 25/35 【题 名】推动旅游学科发展与中国旅游产业共同成长——著名旅游学者杜江教授评介 【作 者】文武 【刊 名】生产力研究.2005(3).-220-223 26/35 【题 名】旅游业区域合作机制创新研究——以成长中的“泛珠三角”为例 【作 者】秦学 张伟强 【刊 名】思想战线.2005,31(2).-128-133 27/35 【题 名】基于战略联盟的旅游企业组织创新 【作 者】张显春 【刊 名】商场现代化.2005(1).-28-29 28/35 【题 名】浅议旅游高等职业教育的发展 【作 者】王旭科 宋健 【刊 名】中国成人教育.2005(1).-56-57 29/35 【题 名】国外自助旅游图书的细分市场策略 【作 者】易晓春 【刊 名】编辑学刊.2004(6).-72-76 30/35 【题 名】区域旅游业时空演变形式与机制探析 【作 者】秦学 邹春洋 【刊 名】学术交流.2004(11).-83-88 31/35 【题 名】旅游市场呼唤品牌和声誉投资 【作 者】符国群 【刊 名】销售与市场.2002(01S).-31-31 32/35 【题 名】制度变迁与中国旅游产业的成长阶段和发展对策 【作 者】贾生华 邬爱其 【刊 名】旅游学刊.2002,17(4).-19-22 33/35 【题 名】城市旅游空间成长及其空间结构演变机制分析 【作 者】卞显红 【刊 名】桂林旅游高等专科学校学报.2002,13(3).-30-35 34/35 【题 名】实施六大战略 培育支柱产业——关于建设旅游经济强省的思考 【作 者】薛荣哲 【刊 名】山西旅游.2001(6).-4-7 35/35 【题 名】过渡区旅游空间成长初步研究 【作 者】卫旭东 【刊 名】宝鸡文理学院学报：自然科学版.2001,21(3).-223-225,229

据新华社讯息，我国目前已基本掌握了机器人操作机的设计制造技术、控制系统硬体和软体设计技术、运动学和轨迹规划技术，生产了部分机器人关键元器件，开发出喷漆、弧焊、点焊、装配、搬运等机器人。“九五”期间我国工业机器人的需求量以每年30％以上的速度增长。2000年，我国工业机器人的拥有量约为3500台，其中以点焊、弧焊、喷漆、注塑、装配、搬运、冲压等各类机器人为主，销售额为6．7亿元。 据专家对国内542家使用者以及汽车、电子电器、工程机械3个行业的部分使用者进行的统计分析，就全国而言，弧焊、点焊、装配、喷涂机器人应用的最多；其次是搬运、上下料（冲压、压铸、铸锻、注塑等用的大多是上下料机器人）；再次是包装、码垛、拆垛机器人和密封涂胶机器人；其他机器人用量很少。就行业而言，汽车行业以焊接、喷涂、涂胶作业较多，冲压、搬运、装配次之；电子电器行业集中在装配，如华录一家就用了近300台，其次是搬运和喷涂；工程机械行业集中用于弧焊，喷涂其次。此外包装、码垛、拆垛机器人目前主要用于石化、轻纺和菸草行业。 据对724家使用者的统计分析，大机械行业（机械制造和汽车工业）使用者共有467家，占用户的65％；电子电器和邮电通讯业使用者有92家，占用户的13％。可见，目前国内工业机器人主要应用在汽车、机械制造等行业。 机器人及其自动化成套装备是指以机器人为核心，以资讯科技和网路技术为媒介，将所有装置连线到一起而形成的大型自动化生产线。机器人及其自动化成套装备的拥有量和水平是衡量一个国家制造业综合实力的重要标志之一。机器人及其自动化成套装备已成为目前国内外极受重视的高新技术应用领域。 目前，国外机器人自动化生产线成套装备已成为自动化成套装备的主流以及未来自动化生产线的发展方向。 国外汽车行业、电子和电器行业、物流与仓储行业（企业级）等已大量使用机器人自动化生产线， 从而保证了其产品的质量和生产的高效。典型的如机器人有大型轿车壳体冲压自动化系统技术和成套装备、大型机器人车体焊装自动化系统技术和成套装备、电子和电器等的机器人柔性自动化装配及检测成套技术和装备、机器人整车及发动机装配自动化系统技术和成套装备、AGV物流与仓储自动化成套技术及装备等，这些机器人装置的使用大大推动了这些行业的快速发展，提升了制造技术的先进性。 当前，国外将机器人自动化生产线成套装备的共性技术作为重点开发内容： 1．大型自动化生产线的设计开发技术。利用CAX及模拟系统等多种高新技术和设计手段，快速设计和开发机器人大型自动化生产线，并进行数字化验证。 2．自动化生产线“数字化制造”技术。虚拟制造技术发展很快，国外几家早期从事模拟软体的开发公司已经推出可进入实用的所谓“数字化工厂”（DMF）商品化软体。国外企业已利用这类软体建立起自己的产品制造工艺过程资讯化平台，再与本企业的资源管理资讯化平台和车身产品设计资讯平台结合，构成支援本企业产品完整制造过程生命周期的资讯化平台。自动化生产线的设计、制造、整定及维护也必须要基于上述资讯化平台进行，开展并行工程，实现资讯共享，这是最大限度地压缩自动化生产线投产周期所必须的，另外也有利于实现生产线的柔性和质量控制的功能。 3．大型自动化生产线的控制协调和管理技术。利用计算机和资讯科技，实现整条生产线的控制、协调和管理，快速响应市场需求，提高产品竞争力。 4．自动化生产线的线上检测及监控技术。利用感测器和机器人技术，实现大型生产线的线上检测，确保产品质量，并且实现产品的主动质量控制。利用网路技术，实现生产线的线上监控，确保生产线安全执行。 5．自动化生产线模组化及可重构技术。利用设计的模组化和标准化，能够实现生产线的快速调整及重构。 6．生产线快速整定（missioning time）技术。如建立完整的制造过程资讯科技，发展机器人等自动化装置的离线程式设计技术、生产线上的机电装置实现网路控制管理技术、关键工位线上100％产品检测技术、先进的生产线现场安装精度测试技术。

序号 题名 来源 年期 来源资料库 1 西安旅游业发展中存在的问题及对策分析 Business China 2010/02 2 西安在“关中—天水经济区”旅游业率先发展的思考 Modern Enterprise 2010/04 3 A RESEARCH ON INNOVATION AND DEVELOPMENT OF THE TOURISM INDUSTRY IN XI' AN FROM THE PERSPECTIVE OF COMMUNICATION STUDIES Human Geography 2010/04 4 旅游业可持续发展下西安古城文化的传承研究 China Business & Trade 2010/26 5 Research on Great-leap-forward Develepment Strategic Position of Xi'an Touri *** Journal of Guilin Institute of Touri *** 2007/01 6 On highway traffic and touri *** development in Xi'an Shanxi Architecture 2007/10 7 大力发展西安体育旅游业的探索 Market Modernization 2007/21 8 Net Culture and Development of Touri *** in Xian Journal of Anhui Agricultural University(Social Science Edition) 2007/04 9 A Tentative Study on the Orientation and Development of Touri *** of Xi'an Tangdu Journal 2006/04 中国期刊全文资料库 应提升西安旅游业的文化品味 Chinese Culture 2003/03 中国期刊全文资料库 12 Influence and countermeasure of xi'an touri *** after enter WTO Journal of Shaanxi Administration School and Shaanxi Economic Management School 2003/03 中国期刊全文资料库 13 西安旅游业——带动经济发展的主导产业 Outlook 2002/11 中国期刊全文资料库 14 The travel trade of Xi'an speed up fair contract to melt manage the pressingness Journal of Shaanxi Administration School and Shaanxi Economic Management School 2002/02 中国期刊全文资料库 15 On Advantage Shift in Xi, an ' s Tourist Industry Journal of Xi'an Petrdleum Institute(Social Sciences Edition) 2002/02 中国期刊全文资料库 16 以国际旅游城市为目标 加快西安旅游业发展步伐 Ningbo Newsreport 2002/01 中国期刊全文资料库 17 Problems and Their Solutions in Sustainable Touri *** Development in Xi'an Journal of Xi'an United University 2001/02 中国期刊全文资料库 18 Study on the development of Xi'an urban touri *** Journal of Northwestern Institute of Architectural Engineering 2001/04 中国期刊全文资料库 19 以高新技术产业和旅游业为主导产业带动西安经济发展 CHINA SOFT SCIENCE 1999/07 中国期刊全文资料库 20 西安旅游业组成“联合舰队” The World of Economy and Trade 1999/04 中国期刊全文资料库

徐亚非.温宁军.杨先明 民族宗教经济透视 1991 罗竹风 人·社会·宗教 1995 刘稚.秦榕 宗教与民俗 1991 张桥贵.陈麒书 宗教人类学 1993 祥和 佛教文化：新世纪云南旅游发展的一个新亮点 [期刊论文] -思想战线2000(5) 缪家福.张庆和 世纪之交的民族宗教—云南少数民族宗教形态与社会文化变迁 1999 李江敏.李志飞 文化旅游开发 2000

[1] 孟祥茹;第三方物流企业的运作模式及对策研究[J];商业研究;2007年02期 [2] 代文锋;我国第三方物流发展问题及对策研究[J];电子商务;2007年01期 [3] 余竑蒋;第三方物流的发展动因、特征及其实施策略研究[J];金融与经济;2006年01期 [4] 陈雅萍;我国第三方物流的问题及其发展策略初探[J];科技管理研究;2007年01期 [5] 于伟;李红涛;中国第三方物流发展问题及对策研究[J];物流科技;2006年01期 [6] 黄文松;第三方物流研究[J];商场现代化;2006年04期 [7] 郭秀春;第三方物流企业运作模式探讨[J];商场现代化;2007年10期 [8] 韩长军;我国第三方物流发展概况及思索[J];中国市场;2007年02期 [9] 陈可;我国第三方物流企业的现状及营销对策[J];商场现代化;2006年19期 [10] 姜丹丹;我国第三方物流企业核心竞争力研究[D];哈尔滨工程大学;2007年 [11] 王艳.第三方物流与企业核心竞争力[D]. 中国优秀博硕士学位论文全文资料库 (硕士),2004,(04)

感觉相关的就行吧,这是我今天刚交老师的 Solidarity trade The current fair trade movement was shaped in Europe in the 1960s. Fair trade during that period was often seen as a political gesture against neo-imperiali *** : radical student movements began targeting multinational corporations and concerns that traditional business models were fundamentally flawed started to emerge. The slogan at the time, “Trade not Aid”, gained international recognition in 1968 when it was adopted by the UNCTAD (United Nations Conference on Trade and Development) to put the emphasis on the establishment of fair trade relations with the developing world. The year 1965 saw the creation of the first Alternative Trading Organization (ATO): that year, British NGO Oxfam launched "Helping-by-Selling", a program which sold imported handicrafts in Oxfam stores in the UK and from mail-order catalogues. In 1969, the first Worldshop opened its doors in the Netherlands. The initiative aimed at bringing the principles of fair trade to the retail sector by selling almost exclusively goods produced under fair trade terms in “underdeveloped regions”. The first shop was run by volunteers and was so suessful that dozens of similar shops soon went into business in the Benelux countries, Germany, and in other Western European countries. Throughout the 1960s and 1970s, important segments of the fair trade movement worked to find markets for products from countries that were excluded from the mainstream trading channels for political reasons. Thousands of volunteers sold coffee from Angola and Nicaragua in Worldshops, in the back of churches, from their homes, and from stands in public places, using the products as a vehicle to deliver their message: give disadvantaged producers in developing countries a fair chance on the world’s market, and support their self-determined sustainable development. The alternative trade movement blossomed, if not in sales, then at least in terms of dozens of ATOs being established on both sides of the Atlantic, of scores of Worldshops being set up, and of well-anized actions and campaigns attacking exploitation and foreign domination, and promoting the ideals of Nelson Mandela, Julius Nyerere, and the Nicaraguan Sandinistas: the right to independence and self-determination, to equitable aess to the world’s markets and consumers.

团结贸易 现今公平贸易运动形塑于1960年代的欧洲，公平贸易于这时期通常被视为一种反抗新帝国主义的政治姿态，基进的学生运动开始关注跨国公司，并出现了一种认为传统商业模式基本上是有缺陷的共识，那时的口号“贸易，而非援助”(Trade not Aid)，被1968年所召开的联合国贸易及发展会议（United Nations Conference on Trade and Development，简称UNCTAD）所采用，并得到国际认同，会议中强调与发展中世界建立公平的贸易关系。 1965年诞生了第一个另类贸易组织（Alternative Trading Organization，简称ATD）：那年，英国的非 *** 组织乐施会(Oxfam)发起了”以销售来帮忙”(Helping-by-Selling)的活动，一个以邮购及在乐施会商店销售进口手工艺品的计划。 1969年，第一个“世界商店”在荷兰开张，这个开创性的构想，是以销售符合公平贸易规则的“发展中区域”的产品，将公平贸易的法则带入零售部门，第一个商店由志工营运，非常成功，之后数十个类似的商店开始在比利时、荷兰、卢森堡及德国等其他西欧国家开始营业。 在1960和1970年代，公平贸易运动里很重要的部份是，为那些因为政治因素而被排斥于主流贸易管道的国家，协助他们的产品寻找市场。数千名志工在教会后面和世界商店销售来自安哥拉及尼加拉瓜的咖啡豆，以这些产品从家里和公共场所的摊位传达一个讯息：给那些来自发展中国家的弱势生产者一个公平的机会，就是支援他们自主的永续发展。另类贸易活动的盛行，若不从贸易量来说，至少以在数量上，有数十个另类贸易组织（ATO）在大西洋两岸成立，同时随着世界商店的扩张，有许多计划性的行动与专案，抨击国际间的剥削与支配的现象，宣扬著曼德拉、朱利叶斯•尼雷尔及尼加拉瓜桑定政权的理念：自主及独立的权利，与接触全球市场及消费者的公平管道。

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1、摘要中应排除本学科领域已成为常识的内容；切忌把应在引言中出现的内容写入摘要；一般也不要对论文内容作诠释和评论(尤其是自我评价)。 2、不得简单重复题名中已有的资讯。比如一篇文章的题名是《几种中国兰种子试管培养根状茎发生的研究》，摘要的开头就不要再写：“为了……，对几种中国兰种子试管培养根状茎的发生进行了研究”。 3、结构严谨，表达简明，语义确切。摘要先写什么，后写什么，要按逻辑顺序来安排。句子之间要上下连贯，互相呼应。摘要慎用长句，句型应力求简单。每句话要表意明白，无空泛、笼统、含混之词，但摘要毕竟是一篇完整的短文，电报式的写法亦不足取。摘要不分段。

从简单地剪切致病基因，到开发出不再传播疾病的工程动物，基因编辑技术已经释放出巨大的潜力。随着研究的深入，科学界还发现，除了编辑具有遗传讯息的DNA片段，编辑RNA可以在不改变基因组的情况下，帮助调整基因表达方式，此外，RNA的寿命是相对短暂的，这也意味着它的变化是可以逆转的，从而避免基因工程中的巨大风险。

2017年10月，来自Broad研究所的张锋研究团队在《自然》期刊上发表了题为“RNA targeting with CRISPR-Cas13”的文章，首次将CRISPR-Cas13系统公之于众，证实了CRISPR-Cas13可以靶向哺乳动物细胞中的RNA。仅仅时隔三周，又一篇名为“RNA editing with CRISPR-Cas13”的力作发表于《科学》期刊。在该研究中，张锋研究团队再次展示了这一RNA编辑系统，能有效地对RNA中的腺嘌呤进行编辑。

在CRISPR出现之前，RNAi是调节基因表达的理想方法。但是Cas13a酶一大优势在于更强的特异性，而且这种本身来自细菌的系统对哺乳动物细胞来说，并不是内源性的，因此不太可能干扰细胞中天然的转录。相反，RNAi利用内源性机制进行基因敲除，对本身的影响较大。但CRISPR-Cas13系统还有一个重要的问题，Cas13a酶本质上是一种相对较大的蛋白质，因此很难被包装到靶组织中，这也可能成为RNA编辑技术临床应用的一大障碍。

2018年3月16日，一项发表在《细胞》期刊的重磅成果为RNA编辑技术带来一大步飞跃，来自美国Salk研究所的科学家利用全新的CRISPR家族酶扩展了RNA编辑能力，并将这个新系统命名为“CasRx”。

CasRx（品红色）在人类细胞核中靶向RNA（灰色），Salk研究所

“生物工程师就像自然界的侦探一样，在DNA模式中寻找线索来帮助解决遗传疾病。CRISPR彻底改变了基因工程，我们希望将编辑工具从DNA扩展到RNA。”研究领导者Patrick Hsu博士表示，“RNA信息是许多生物过程的关键介质。在许多疾病中，这些RNA信息失去了平衡，因此直接靶向RNA的技术将成为DNA编辑的重要补充。”

除了高效性且无明显脱靶效应，新系统的一个关键特征是其依赖于一种比以前研究中物理尺寸更小的酶。 这对RNA编辑技术至关重要，这使得该编辑工具能够更容易被包装到病毒载体，并进入细胞进行RNA编辑。来自东京大学的科学家Hiroshi Nishimasu并未参与这项研究，他表示：“在这项研究中，研究人员发现了一种较Cas13d更加‘紧凑’的酶CasRx。从基础研究到治疗应用，我认为CasRx将成为非常有用的工具。”

此外，在这项研究中，研究人员还展示了利用这种新型RNA编辑系统来纠正RNA过程的能力。他们将CasRx包装到病毒载体中，并将其递送到利用额颞叶痴呆（FTD）患者干细胞中培养的神经细胞，最终使tau蛋白水平恢复到健康水平上，有效率达到80%。

Patrick Hsu博士最后说道：“基因编辑技术通过对DNA的切割带来基因序列的改变。在经过基因编辑的细胞中，其效果是永久的。虽然基因编辑技术能够很好地将基因完全关闭，但对调节基因的表达上并不那么优秀。展望未来，这一最新工具将在RNA生物学研究中发挥重要作用，并有望在未来凭借该技术对RNA相关疾病进行治疗。”

该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默。

3月18日，《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文，该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默，证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性，通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时，利用AAV递送CasRx和靶向Pscsk9的sgRNA到小鼠肝脏，有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，以及小鼠血液中的胆固醇水平。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。

同时，杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作，也探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性，研究人员发现在体内使用CasRx敲低Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积，验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。

近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势，因而成为近年来的研究热点。2018年，加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比，Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％，shRNA达到65％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比，Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。

此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性，杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性，为临床提供了可能性。为证明CasRx在动物体内的活性，研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选，然后采用尾静脉注射敲低Pten的质粒、尾静脉注射敲低Pcsk9的AAV8病毒、眼部注射敲低Vegfa的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析，分别得到Pten基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调，Pcsk9下调造成血清胆固醇下调；Vegfa下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积。

2020年3月18日，《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文，该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向 Pten 基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了 Pten 的高效沉默， 证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性， 通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时，利用AAV递送CasRx和靶向 Pscsk9 的sgRNA到小鼠肝脏， 有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，以及小鼠血液中的胆固醇水平 。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。

同时，杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作，也 探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性，研究人员发现在体内使用CasRx敲低 Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积**，验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。

近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势，因而成为近年来的研究热点。2018年，加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比， Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％ ，shRNA达到65％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比， Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的 ，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。

此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性，杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性，为临床提供了可能性 。为证明CasRx在动物体内的活性，研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选，然后采用尾静脉注射敲低 Pten 的质粒、尾静脉注射敲低 Pcsk9 的AAV8病毒、眼部注射敲低 Vegfa 的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析，分别得到 Pten 基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调， Pcsk9 下调造成血清胆固醇下调； Vegfa 下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积。

图1 CasRx介导的 Pten 体内体外的下调（ Protein & Cell ）

A.质粒示意图；B.N2a细胞中 Pten 的下调；C.Western检测PTEN及AKT的表达； D.CasRx与shRNA脱靶比较；E.尾静脉注射质粒示意图；F.G.H.免疫荧光，qPCR，western分别检测 Pten 及p-AKT的表达

图2 血清胆固醇的调节以及 Pcsk9 的可逆调控（ Protein & Cell ）

A.针对 Pcsk9 的AAV8病毒注射示意图；B.肝组织中 Pcsk9 的表达量；C.血清 PCSK9 的表达量；D.血清胆固醇水平；E.F.血清ALT和AST的测定；G.可逆调节注射示意图； H. Pcsk9 的动态调控。

图3 AAV介导CasRx减少了AMD小鼠模型中CNV的面积（National Science Review）

A.小鼠和人序列比较以及sgRNA示意图；B.C.在293T和N2a细胞中敲低 Vegfa ；D.VEGFA蛋白的表达；E.AAV病毒质粒示意图；F.实验流程图；G.CasRx的mRNA表达水平；H.I.激光烧伤之前或之后7天的 Vegfa mRNA水平；J.CNV诱导3天后的VEGFA蛋白水平；K.激光烧伤7天后，用PBS或AAV-CasRx- Vegfa 注射的代表性CNV图像；L.M.CNV面积统计。

2020 年 4 月 8 日， Cell 期刊在线发表了题为 《Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice》 的研究论文，该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室 杨辉 研究组完成。

该项研究通过运用最新开发的 RNA 靶向 CRISPR 系统 CasRx 特异性地在视网膜穆勒胶质细胞中敲低 Ptbp1 基因的表达，首次在成体中实现了视神经节细胞的再生，并且恢复了永久性视力损伤模型小鼠的视力。同时，该研究还证明了这项技术可以非常高效且特异地将纹状体内的星形胶质细胞转分化成多巴胺神经元，并且基本消除了帕金森疾病的症状。该研究将为未来众多神经退行性疾病的治疗提供一个新的途径。

人类的神经系统包含成百上千种不同类型的神经元细胞。在成熟的神经系统中，神经元一般不会再生，一旦死亡，就是永久性的。神经元的死亡会导致不同的神经退行性疾病，常见的有阿尔兹海默症和帕金森症。此类疾病的病因尚不明确且没有根治的方法，因此对人类的健康造成巨大威胁。据统计，目前全球大约有 1 亿多的人患有神经退行性疾病，而且随着老龄化的加剧，神经退行性疾病患者数量也将逐渐增多。

在常见的神经性疾病中，视神经节细胞死亡导致的永久性失明和多巴胺神经元死亡导致的帕金森疾病是尤为特殊的两类，它们都是由于特殊类型的神经元死亡导致。我们之所以能看到外界绚烂多彩的世界，是因为我们的眼睛和大脑中存在一套完整的视觉通路，而连接眼睛和大脑的神经元就是视神经节细胞。

作为眼睛和大脑的唯一一座桥梁，视神经节细胞对外界的不良刺激非常敏感。研究发现很多眼疾都可以导致视神经节细胞的死亡，急性的如缺血性视网膜病，慢性的如青光眼。视神经节细胞一旦死亡就会导致永久性失明。据统计，仅青光眼致盲的人数在全球就超过一千万人。

帕金森疾病是一种常见的老年神经退行性疾病。它的发生是由于脑内黑质区域中一种叫做多巴胺神经元的死亡，从而导致黑质多巴胺神经元不能通过黑质-纹状体通路将多巴胺运输到大脑的另一个区域纹状体。目前，全球有将近一千万人患有此病，我国尤为严重，占了大约一半的病人。 如何在成体中再生出以上两种特异类型的神经元，一直是全世界众多科学家努力的方向。

该研究中，研究人员首先在体外细胞系中筛选了高效抑制 Ptbp1 表达的 gRNA，设计了特异性标记穆勒胶质细胞和在穆勒胶质细胞中表达 CasRx 的系统。所有元件以双质粒系统的形式被包装在 AAV 中并且通过视网膜下注射，特异性地在成年小鼠的穆勒胶质细胞中下调 Ptbp1 基因的表达。

大约一个月后，研究人员在视网膜视神经节细胞层发现了由穆勒胶质细胞转分化而来的视神经节细胞，并且转分化而来的视神经节细胞可以像正常的细胞那样对光刺激产生相应的电信号。

研究人员进一步发现，转分化而来的视神经节细胞可以通过视神经和大脑中正确的脑区建立功能性的联系，并且将视觉信号传输到大脑。在视神经节细胞损伤的小鼠模型中，研究人员发现转分化的视神经细胞可以让永久性视力损伤的小鼠重新建立对光的敏感性。

为进一步发掘 Ptbp1 介导的胶质细胞向神经元转分化的治疗潜能，研究人员证明了该策略还能特异性地将纹状体中的星形胶质细胞非常高效的转分化为多巴胺神经元，并且证明了转分化而来的多巴胺神经元能够展现出和黑质中多巴胺神经元相似的特性。

在行为学测试中，研究人员发现这些转分化而来的多巴胺神经元可以弥补黑质中缺失的多巴胺神经元的功能，从而将帕金森模型小鼠的运动障碍逆转到接近正常小鼠的水平。

需要指出的是，虽然科学家们在实验室里取得了重要进展，但是要将研究成果真正应用于人类疾病的治疗，还有很多工作要做：人类的视神经节细胞能否再生？帕金森患者是否能通过该方法被治愈？这些问题有待全世界的科研工作者共同努力去寻找答案。

（上）CasRx 通过靶向的降解 Ptbp1 mRNA 从而实现 Ptbp1 基因表达的下调。

（中）视网膜下注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将视网膜穆勒胶质细胞转分化为视神经节细胞，转分化而来视神经节细胞可以和正确的脑区建立功能性的联系，并且提高永久性视力损伤模型小鼠的视力。

（下）在纹状体中注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将星形胶质细胞转分化为多巴胺神经元，从而基本消除了帕金森疾病模型小鼠的运动症状。

RNA-editing Cas13 enzymes have taken the CRISPR world by storm. Like RNA interference, these enzymes can knock down RNA without altering the genome , but Cas13s have higher on-target specificity. New work from Konermann et al. and Yan et al. describes new Cas13d enzymes that average only 2.8 kb in size and are easy to package in low-capacity vectors! These small, but mighty type VI-D enzymes are the latest tools in the transcriptome engineering toolbox.

Microbial CRISPR diversity is impressive, and researchers are just beginning to tap the wealth of CRISPR possibilities. To identify Cas13d, both groups used very general bioinformatic screens that looked for a CRISPR repeat array near a putative effector nuclease. The Cas13d proteins they identified have little sequence similarity to previously identified Cas13a-c orthologs, but they do include HEPN nuclease domains characteristic of the Cas13 superfamily. Yan et al. proceeded to study orthologs from Eubacterium siraeum (EsCas13d) and Ruminococcus sp. (RspCas13d), while Konermann et al. characterized orthologs from “Anaerobic digester metagenome” (AdmCas13d) and Ruminococcus flavefaciens (nicknamed CasRx), as well as EsCas13d.

Like other Cas13 enzymes, the Cas13d orthologs described in these papers can independently process their own CRISPR arrays into guide RNAs. crRNA cleavage is retained in dCas13d and is thus HEPN-independent. These enzymes also do not require a protospacer flanking sequence, so you can target virtually any RNA sequence ! In bacteria, Cas13d-mediated cleavage promotes collateral cleavage of other RNAs. As with other Cas13s, this collateral cleavage does not occur when Cas13d is expressed in a mammalian system.

Since Cas13d is functionally similar to previously discovered Cas13 enzymes - what makes these orthologs so special? The first property is size - Cas13d enzymes have a median length of ~930aa - making them 17-26% smaller than other Cas13s and a whopping 33% smaller than Cas9! Their small size makes then easy to package in low-capacity vectors like AAV, a popular vector due to its low immunogenicity. But these studies also identified other advantages, including Cas13d-specific regulatory proteins and high targeting efficiency, both of which are described below.

The majority of Type VI-D loci contain accessory proteins with WYL domains (named for the three conserved amino acids in the domain). Yan et al. from Arbor Biotechnologies found that RspCas13d accessory protein RspWYL1 increases both targeted and collateral RNA degradation by RspCas13d. RspWYL1 also increased EsCas13d activity, indicating that WYL domain-containing proteins may be broader regulators of Cas13d activity. This property makes WYL proteins an intriguing counterpart to anti-CRISPR proteins that negatively modulate the activity of Cas enzymes, some of which are also functional in multiple species (read Arbor Biotechnologies' press release about their Cas13d deposit here ).

Not all Cas13d proteins are functional in mammalian cells, but Konermann et al. saw great results with CasRx and AdmCas13d fused to a nuclear localization signal (NLS). In a HEK293 mCherry reporter assay, CasRx and AdmCas13d produced 92% and 87% mCherry protein knockdown measured by flow cytometry, respectively. Cas13d CRISPR array processing is robust, with CasRx and either an unprocessed or processed gRNA array (22 nt spacer with 30 nt direct repeat) mediating potent knockdown. Multiplexing from the CRISPR array yielded >90% knockdown by CasRx for each of four targets, including two mRNAs and two nuclear long non-coding RNAs.

One interesting twist to Cas13d enzymes is their cleavage pattern: EsCas13d produced very similar cleavage products even when guides were tiled across a target RNA, indicating that this enzyme does not cleave at a predictable distance from the targeted region. Konermann et al. show that EsCas13d favors cleavage at uracils, but a more detailed exploration of this cleavage pattern is necessary.

Konermann et al. compared CasRx to multiple RNA regulating methods: small hairpin RNA interference, dCas9-mediated transcriptional inhibition (CRISPRi), and Cas13a/Cas13b RNA knockdown. CasRx was the clear winner with median knockdown of 96% compared to 65% for shRNA, 53% for CRISPRi, and 66-80% for other Cas13a and Cas13b effectors. Like previously characterized Cas13 enzymes, CasRx also displays very high on-target efficiency; where shRNA treatment produced 500-900 significant off-targets, CasRx displayed zero. Unlike Cas9, for which efficiency varies widely across guide RNAs, each guide tested with CasRx yielded >80% knockdown. It seems that CasRx may make it possible to target essentially any RNA in a cell.

Since catalytically dead dCasRx maintains its RNA-binding properties, Konermann et al. tested its ability to manipulate RNA species through exon skipping. Previous CRISPR exon-skipping approaches used two guide RNAs to remove a given exon from the genome, and showed success in models of muscular dystrophy . In this case, Konermann et al. targeted MAPT , the gene encoding dementia-associated tau, delivering dCasRx and a 3-spacer array targeting the MAPT exon 10 splice acceptor and two putative splice enhancers. After AAV-mediated delivery to iPS-derived cortical neurons, dCasRx-mediated exon skipping improved the ratio of pathogenic to non-pathogenic tau by nearly 50%, showing proof-of-concept for pre-clinical and clinical applications of dCasRx.

The identification of Type VI Cas13d enzymes is another win for bioinformatic data mining. As we continue to harness the natural diversity of CRISPR systems, only time will tell how large the genome and transcriptome engineering toolbox will be. It is, however, certain that the impact of CRISPR scientific sharing will continue to grow, and we at Addgene appreciate our depositors for making their tools available to the broader community.

References

Konermann, Silvana, et al. “Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.” Cell (2018) pii: S0092-8674(18)30207-1. PubMed PMID: 29551272

Yan, Winston X., et al. “Cas13d Is a Compact RNA-Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein.” Mol Cell. (2018) pii: S1097-2765(18)30173-4. PubMed PMID: 29551514

\1. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors

\2. CRISPR genetic editing takes another big step forward, targeting RNA

\3. How Editing RNA—Not DNA—Could Cure Disease in the Future

[ https://www.obiosh.com/kyfw/zl/aav/209.html](