大黄提取物质量检测方法研究论文

大黄可减轻内毒素性低血压，消除氧自由基，降低再灌注期血浆、肺、小肠等内源性一氧化氮的水平，降低肠、肝、肺毛细血管通透性，减轻内毒素引起的肠壁血管通透性增加，防止肠道细菌移位及内毒素进入血循环等等。临床可用于严重创伤、感染性休克、MODS等危重病预防及治疗胃肠功能衰竭。我们的经验：生大黄30克煎成100ml，灌肠或口服，100ml,1-3次/日，亦可灌肠和口服并用。直到肠鸣音恢复开始减量大黄含有蒽类衍生物、苷类化合物、鞣质类、有机酸类、挥发油类等。 1. 蒽类衍生物分为：⑴ 游离蒽醌衍生物，如芦荟大黄素（aloe emodin）、土大黄素（chrysaron）、大黄酚（chrysophanol）、大黄素（emodin）、异大黄素（isoernodin）、虫漆酸D（laccaic acid D）、大黄素甲醚（physcion）、大黄酸（rhein）；⑵ 结合蒽醌化合物，有大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚的单和双葡萄糖甙；大黄素、大黄素甲醚的单糖甙；蒽酚和蒽酮化合物：大黄二蒽酮（rheidin）、掌叶二蒽酮（palmidin）以及与糖结合的甙如番泻甙（sennoside）A、B、C、D、E、F等。 2. 苷类化合物：土大黄甙（rhaponticin）、3，5，4’-三羟基芪烯一4’-O-β-D-（6’-O-没食子酰）葡萄糖甙（3，5，4’-trihydroxy-stilbene－4’-O-β-D-（6’-O-gallayl）-glucoside）、3，5，4’-三羟基茋烯-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖甙（3，5，4’-trihydroxy stilbene-4’-O-β-D-glucopyranoside）。 3. 萘衍生物：torachrysone-8-O-β-D-glucopy ranoside，torachrysone-8-（6′-oxaly）-glucoside及决明松（torachryson）。 4. 鞣质类：没食子酰葡萄糖、d-儿茶素、没食子酸、大黄四聚素（tetrann）等。大黄四聚苯经水解，得没食子酸、肉桂酸及大黄明（rheosmin）。此外合有树脂。 尚含有有机酸：苹果酸、琥珀酸、草酸、乳酸、桂皮酸、异丁烯二酸、柠檬酸、延胡紊酸等。 大黄中还含有挥发油、脂肪酸及植物甾醇等。本品横切面：根木栓层及皮层大多已除去。韧皮部明显；薄壁组织发达。形成层成环。木质部射线较密，宽2～4列细胞，内含棕色物；导管非木化，常1至数个相聚，稀疏排列。薄壁细胞含草酸钙簇晶，并含多数淀粉粒。根茎髓部宽广，其中常见黏液腔，内有红棕色物；异型维管束散在，形成层成环，木质部位于形成层外方，韧皮部位于形成层内方，射线呈星状射出。粉末黄棕色。草酸钙簇晶直径20～160μm，有的至190μm。具缘纹孔、网纹、螺纹及环纹导管非木化。淀粉粒甚多，单粒类球形或多角形，直径3～45μm，脐点星状；复粒由2～8分粒组成。 取本品粉末少量，进行微量升华，可见菱状针晶或羽状结晶。 取本品粉末0.1g，加甲醇20ml浸渍1小时，滤过，取滤液5ml,蒸干加水10ml使溶解，再加盐酸1ml,置水浴上加热30分钟，立即冷却，用乙醚分2次提取，每次20ml,合并乙醚液，蒸干，残渣加氯仿1ml使溶解，作为供试品溶液。另取大黄对照药材0.1g,同法制成对照药材溶液。再取大黄酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照溶液。照薄层色谱法（附录Ⅵ B）试验，吸取上述三种溶液各4μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶Ｈ薄层板上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸(155:1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的五个橙黄色荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气中熏后，日光下检视，斑点变为红色。 【检查】土大黄苷 取本品粉末0.2g，加甲醇2ml,温浸10分钟，放冷，取上清液10μl,点于滤纸上，以45％乙醇展开，取出，晾干，放置10分钟，置紫外光灯(365nm)下检视，不得显持久的亮紫色荧光。 干燥失重 取本品，在 105℃干燥6小时，减失重量不得过15.0％（附录Ⅸ G）。 总灰分 不得过10.0％（附录Ⅸ K）。 酸不溶性灰分 不得过0.8％（附录Ⅸ K）。 【含量测定】照高效液相色谱法(附录Ⅵ D)测定。 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1％磷酸溶液(85:15)为流动相；检测波长为254nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于1500。 对照品溶液的制备 精密称取大黄素、大黄酚对照品各5mg，分别置50ml量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；分别精密量取大黄素溶液1ml、大黄酚溶液2ml，分别置25m l量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得(大黄素每1ml中含4μg、大黄酚每1ml中含8μg)。 供试品溶液的制备 取本品粉末(过四号筛)约0.1g[同时另取本品粉末测定水分(附录ⅨH 第二法)]，精密称定，置50ml锥形瓶中，精密加甲醇25ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤5ml，置50ml圆底烧瓶中，挥去甲醇，加2.5mol/L硫酸溶液10ml，超声处理5分钟，再加氯仿10ml，加热回流1小时，冷却，移置分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，并入分液漏斗中，分取氯仿层，酸液用氯仿提取2次，每次约8ml，合并氯仿液，以无水硫酸钠脱水，氯仿液移至100ml锥形瓶中，挥去氯仿，残渣精密加甲醇10ml，称定重量，置水浴中微热溶解残渣，放冷后，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 测定法 分别精密吸取上述两种对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。 本品按干燥品计算，含大黄素(C15H10O5)和大黄酚(C15H10O4)的总量不得少于0.05％。

大黄中大黄素的提取、分离和鉴定（1）酸水解一、实验目的1、 学习酸水解的方法2、 得到大黄粉酸水解药渣二、实验原理大黄中蒽醌类化合物有结合态和游离态两种形式存在，为得到游离蒽醌类化合物，先酸水解，使蒽醌类化合物以苷元的形式游离出来。三、方法 10g大黄粉 20%H2SO4直火回流加热1小时，抽滤滤渣 水洗中性，干燥滤饼四、注意事项1、药粉在水洗中性过程中尽量避免损失；2、药渣干燥前要松散；3、水解液酸性强，避免用手直接接触。五、思考题1、酸水加热为什么要用回流装置？2、要得到大黄中的蒽醌苷元，还有什么办法？（2）总羟基蒽醌苷元的提取一、实验目的1、学习连续回流提取方法2、得到大黄中总羟基蒽醌苷元提取物二、实验原理苷元为亲脂性成分，用乙醚提取。三、实验方法 滤饼 置索氏提取器中，加150ml Et2O, 提2.5hr（提取液无色）Et2O液（大黄中总羟基蒽醌苷元）四、注意事项1、 纸筒的包法：原则是药粉不漏出2、 提取器的装法（1）纸筒的高度不超过侧管的高度；（2）药粉的高度不超过虹吸管的高度；（3）线头在管内，保持提取器闭封。3、 溶剂的倒法50ml由提取器上端倒入，浸泡药粉；100ml倒入平底烧瓶中。4、 温度的控制溶剂蒸气至冷凝管第二个球处，水浴温度约60℃。5、 实验室禁止明火，实验过程中保持通风，尽量避免乙醚挥出。6、 平底烧瓶要干燥。五、思考题1、同回流提取相比，该方法的优点？2、还可选用哪些溶剂提取？3、若平底烧瓶中有水，将会有什么结果？4、为什么温度控制在溶剂蒸气至冷凝管第二个球处？（3）PH梯度萃取一、实验目的1、学习PH梯度萃取的方法和原理2、得到大黄素粗品二、实验原理 依据大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的酸性强弱不同，采用强弱不同的碱水萃取，得到大黄素。三、实验方法 1、 分离方法 乙醚液（T） ↓120ml(40mlX3)2.5%NaHCO3 ↓-------------------------↓ 乙醚液（1） NaHCO3液 ↓120ml(40mlX3)2.5%Na2CO3 ↓--------------------------↓ 乙醚液（2） Na2CO3液 ↓120ml(40mlX3)2.5%Na2CO3 ↓调 pH3 ↓－－－－－－－－↓ 沉淀 Na2CO3液 乙醚层（3） ↓100ml(25mlX4)0.5%NaOH ↓－－－－－－↓ NaOH 乙醚层（4） 2、TLC跟踪检查硅胶-CMC-Na展开剂：Pet-EtOAc(7:3) 样品：乙醚液（T，1-4）四、注意事项1、分液漏斗使用前检查是否漏。2、乙醚提取液倒入分液漏斗中，若有沉淀留在瓶中，用待萃取的碱液洗后再倒入分液漏斗中，直至沉淀全部被溶解。3、 产生乳化层，解决的方法是：（1）轻摇；（2）长时间静置；（3）用电吹风加热（4）玻棒搅动（5）抽滤4、待完全静置分层后放出水层。五、思考题1、 萃取时碱水层的颜色？2、 比较五种蒽醌类化合物极性大小、酸性大小。3、 在TLC中，五种蒽醌类成分Rf值的大小顺序？4、 萃取大黄素时，碱水中若含少量乙醚，酸化后能得到沉淀吗？5、 判断各种蒽醌类成分分离的依据是什么？6、 你能设计出比该方法更完善的实验条件吗？写出实验方法及验证方案。（4）柱色谱精制大黄素 一、实验目的1、学习硅胶柱色谱分离方法2、得到大黄素精品 二、实验原理依据大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚极性差异分离。三、实验方法1、装柱方法：100~200目硅胶10g，用脱脂棉填柱子底端。要求：均匀，柱面平整紧密无气泡。干法装柱：小漏斗法，下端活塞打开，硅胶均匀地倒入柱中；湿法装柱：硅胶用洗脱剂拌均匀至无气泡，下端活塞打开，倒入柱中。2、加样方法要求：原始色带小，均匀。干法上样：样品用少量丙酮溶解后，加少许（半牛角匙）硅胶拌匀，将丙酮挥尽后上于柱顶端。湿法上样：样品用少量（<1ml）洗脱剂溶解，用吸管移入柱顶端。 3、洗脱收集：加洗脱剂洗脱，待色带冲下时，用瓶子分段收集。分段标准：（1）色带颜色 （2）10~15ml/瓶洗脱剂：Pet-EtOAc(7:3)4、合并浓缩：TLC跟踪检查，合并大黄素液，回收至5ml左右。5、放置析晶四、注意事项1、玻璃器皿干燥，无水；2、装柱时，下端活塞应打开；3、洗脱剂不能低于柱平面。五、思考题1、 比较湿法装柱与干法装柱的特点？2、 比较湿法上样与干法上样的特点？（5）鉴 定一、实验目的1、蒽醌类化合物的颜色反应2、大黄素熔点的测定二、实验内容1、熔点：大黄素（256~257℃）2、颜色反应：比较大黄素与茜草素的颜色区别 ( 纸片反应) 试剂：%NaOH，0.5% MgAc2三、思考题1、大黄素、茜草素定性反应后的颜色？结构与呈色的关系？2、其它鉴别方法