生物技术对环保影响的毕业论文

分子生物技术在微生物降解环境 污染物中的应用 [摘要〕介绍了与环境微生物关键降解酶基因的筛选、克隆及应用相关的分r生物技术，包括聚合酶链式反应技 术、基因重组技术、荧光原位杂交技术和生物信息学等技术，并对这些技术在污染物降解基因检测、筛选和克隆方 面的应用进行了阐述与探讨、 [关键词]分子生物技术;微生物;基因;环境污染物;降解 随着现代j:\地技术的发展，多环芳烃、含氯有 机物和硝基苯类化合物等人工合成井难以降解的 污染物大量排放，造成世界范围内的环境污染和生 态破坏，严重地威胁人类和其他生物的正常生存和 发展。利用微生物修复技术对受污染的水体及土 壤进行处理，凸显了其重要的意义和可行性。研究 人员发现并筛选到一些微生物，它们不仅对环境有 较高的适应性、对污染物有较高的耐受性，而且对 污染物有较强的降解效率和专一性。然而环境中 存在的大量微生物中仅有少于1%可通过传统的培 养方法进行培养、分离和纯化，绝大多数细菌需要 非常严格的营养条件川。因此，为了对修复环境有 所贡献却难以培养的微生物进行更全面了解，也为 了筛选到更多有利于降解环境污染物的微生物菌 种及其关键酶基因，分子生物技术和手段逐渐被广 泛应用到环境可降解污染物及降解机理方面的研 究中。 本文对近年来发展起来的聚合酶链式反应 (PCR)技术、基因重组技术、荧光原位杂交(FISH) 技术和生物信息学等多种分子生物技术进行了介 绍，并总结了它们在污染物降解基因检测、筛选和 克隆方面的应用。 1与环境污染物降解相关的分子生 物技术 1.1PCR及其相关技术 PCR是一种利用脱氧核糖核酸(DNA)半保留 复制原理，在体外扩增位于两段已知序列之间的 DNA区段从而得到大量拷贝的分子生物技术。根 据其模板、引物来源或扩增条件的不同，PcR技术 可分为以下几种:(l)反转录pCR(RT一PeR)技 术，将mRNA反转录为cDNA后再对其进行PCR 扩增，可用来构建cDNA文库，分析不同生长时期 的mRNA表达状况和相关性以及mRNA的定量测 定等;(2)巢式PCR技术，在扩增大片段目的DNA 时，先用非特意性引物扩增再用特意性引物对第一 次扩增产物进行第二次扩增，以获得可供分析的 DNA;(3)竞争PCR技术，是一种定量PCR，向PCR 反应体系中加人人工构建的带有突变的竞争模板， 通过控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度， 对目的模板作定量研究;(4)实时荧光定量PCR技 术，在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信 号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线 对未知模板进行定量分析，该法已广泛用于基因表 达研究、转基因研究等方面;(5)扩增的rDNA限制 酶切分析技术，根据原核生物rDNA序列的保守性， 将扩增的rDNA片段进行酶切，通过酶切图谱来分 析菌间的多样性;(6)RNA随机引导PCR技术，基 于任意寡核昔酸引物与RNA之间可能的配对，在 低严谨度条件下经聚合酶催化使链延伸，将细胞总 RNA或InRNA作为反转录反应的模板，此技术结 合单链构象多态性，用非变性胶分辨大小相同而构 象不同的片段，可用于诊断遗传突变及分析污染条 件下序列的多态性;(7)随机扩增多态DNA (RAPD)技术，是一种基于PCR检测PCR引物结合 位点序列改变的方法，通常以10bp的寡核昔酸序 列为引物，对基因组DNA随机扩增，电泳分离染色 扩‘增产物，再分析多态性。 1.2FISH技术 FISH技术利用荧光标记的探针在细胞内与特 异的互补核酸序列杂交，通过激发杂交探针的荧光 来检测信号。荧光探针比放射性探针更安全，具有 较好的分辨力，不需要额外的检测步骤。近年来， 由于FISH技术具有灵敏、便捷等优点，迅速发展完 善成为研究环境微生物的有力工具。此外，可用不 同激发和散射波长的荧光染料标记探针，在一步反 应中同时检测几个靶序列。该技术主要包括试样 固定、预处理、预杂交、探针和试样变性、杂交、漂洗 去除未结合的探针、检测杂交信号等步骤。由于 165rRNA具有遗传稳定性，因此成为FISH技术检 测最常用的靶序列。 1.3基因重组技术 基因重组技术是从供体生物的基因组中通过 酶切扩增等手段获取目的基因，与载体连接形成重 组DNA分子，再导入到受体细胞中，让外源基因得 以表达。在已经分离出的许多菌株中，与降解能力 有关的基因多在质粒体上。由于质粒很容易在细 菌的繁殖过程中遗失，对细菌降解能力的长期稳定 非常不利，可将其与污染物降解有关的酶基因重组 到大肠杆菌等微生物中进行表达，以此构建的各种 生物降解特性增强的重组菌可用于污染环境的治 理修复或发酵某些废弃物。 1.4生物信息学 20世纪后期，生物学的迅猛发展，从数量上和 质量上极大地丰富了基因组数据库、蛋白质数据 库、酶数据库和文献数据库等许多生物科学的数据 资源。已有多个国家和国际科研组织建立了生物 信息数据库，如欧洲分子生物学实验室(Eur叩ean MolecularBiologyLaboratory)核酸序列数据库和美 国国家生物技术情报中心(Nationaleente:fo:Bio- technologyInformation，NCBI)基因序列数据库等。 科学家利用计算机及生物信息分析软件分析这些 数据资源，确定大分子序列、结构、表达模式和生化 途径与生物数据之间的关系，区分生物个体间遗传 差异，揭示DNA多样性。例如，基本局部比对搜索 工具(BasieLoealAlignmentSearehTool，BLAST)， 是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似 性比较的分析工具。它基于Altschul等的方法「2〕， 在序列数据库中对查询序列进行同源性比对工作。 BLAST程序可对一条或多条、任何数量、任何形式的 序列在一个或多个核酸或蛋白序列库中进行比对，甚 至将有缺口的比对序列也考虑在内，利用比较结果中 的得分对序列进行相似性说明。基因的序列分析可 揭示出生物物种之间的关系，在污染治理研究中可用 于生物基因组特殊区域或特异基因的测序。 2分子生物技术在环境污染物降解 中的应用 2.1土壤试样总DNA的提取 用适当方法直接从土壤中提取DNA并纯化， 是从分子生物学角度对土壤微生物进行研究的前 提条件，而后可进行酶切、PCR扩增、核酸分子杂交 等分子生物学技术操作。从土壤中提取微生物 DNA主要分为汽接法和间接法}’{。直接法是在 ogram等的方法基础卜发展起来的，其主要包括2 个步骤:(l)原位细胞裂解;(2)DNA提取和纯化。 直接法提取的DNA超过细菌总DNA的60%且省 力，但提取的DNA常常有折断、腐殖酸污染、甚至 提取物中还夹杂有未知的胞外DNA和真核生物的 DNA。最先报道间接法的是Faegri等[‘〕，其主要包 括4个步骤:(l)分散土壤;(2)分离细胞与土壤; (3)细胞裂解;(4)DNA纯化。间接法提取DNA 产量低且费力，但纯度较高、DNA损伤小，提取的 大片段DNA可用来构建cos而d和细菌人工染色体 文库等。 2.2采用PCR及相关技术扩增分析DNA片段 可降解污染物的微生物必然能产生分解代谢 该污染物的酶。selvaratnam等L’l用编码苯酚单加 氧酶dmpN摹因的RT一PCR技术来检测序列间歇 式活性污泥反应器‘{一，降解酚的假单胞菌。检测结 果表明，RT一PCR技术不仅能检测微生物降解酚的 能力，还能测量dmpN基因的转录水平，从而确定假 单胞菌特殊的分解活性，发现了在转录水平下，酚 浓度与通气时间之问存在正相关关系。 将PCR技术和变性梯度凝胶电泳(DGGE)结 合起来，在变性条件适当的情况下能分辨一个碱基 对，分辨率较高。染色后的凝胶用成像系统进行分 析，可在一定程度l几反应试样的复杂性。条带的多 少能反应试样「 一 }1微生物组成的差异，条带的亮度能 反应试样中微生物的多少。基于以上优点，日前该 技术在微生物群落结构的分析和动态研究方面得 到了厂‘泛应用。DGGE可通过分析PCR扩增的基 因点突变来探索微生物的复杂性。徐玉泉等[“〕从 某废水中分离出一株能以苯酚为惟一碳源的菌株 PHEA一2，使用PCR一DGGE技术对该菌165 rDNA进行分析，发现该菌与醋酸钙不动杆菌同源。 M盯sh等r了)利用PcR一DGGE技术获得了活性污泥 中真核微生物的种群变化情况。王峰等下8〕采用 PCR一DGGE技术对城市污水化学生物絮凝处理中 活性污泥和生物膜微生物种群结构进行了分析，结 果表明活性污泥培养前后微生物种群结构发生r 很大改变。 RAPD技术也是一种应用比较广泛的以多态性 引物来扩增某些片段的技术。RAPD技术可用于检 测含有混合微生物种群的各种微生物反应器中微 生物的多样性。用RAPD技术分析检测实验室规 模的油脂淤泥培养料中的细菌菌群发现，用油脂淤 泥改良过的培养料比未改良的更适于不同的微生 物种群生长[9j。vainio等t’。〕从516种孤立的菌落 中提取出165rDNA，经PCR扩增后进行测序，检测 活性污泥中微生物种群的结构。这些组合技术的 应用显著增强r对微生物的检测和鉴定能力，为理 论研究工艺优化及提高生物处理效率提供了条件。 2.3基因重组 基因工程技术应用于环境保护起始于20世纪 80年代。其基本原理是通过基因分离和重组技术， 将目的基因片段，比如可编码降解某种污染物的 酶，转移到受体生物细胞中并表达，使受体生物具 有该目的基因表达显现的特殊性状，从而达到治理 污染的目的。找到特定污染的抗性基因，利用基因 重组技术转基因后也可获得其他抗性植株以及筛 选到可转化污染物的植物，还可开发超量积累植物 进行污染土壤的生物修复。 罗如新等L”〕用放射性同位素标记tfdc基因片 段作探针，Southemblot杂交定位Ll菌株的邻苯二 酚1，2一双加氧酶基因位于Pstl的I片段和BamH I的M、N片段，回收并将其直接克隆至表达载体 pKT230卜，获得的重组子能转化不具开环酶活性 的甲胺磷降解菌P2，得到高于天然宿主21倍的邻 苯二酚1，2一双加氧酶。stingley等{”〕通过构建基 因文库和重组质粒等基因工程方法证实了NidAB 双加氧酶是降解菲的关键酶类，并首次鉴定出此基 因通过磷苯二甲酸实现降解功能。chae等‘”}发现 不能降解苯酚的su如lobusso扣taricu、98/2菌株中 的儿茶酚2，3一双加氧酶基因与能降解苯酚的 sulfolo右u，，o如taricu、咫有[6J源区，分析得知它们 是山共同祖先进化而来。把儿茶酚2，3一双加氧酶 基因克隆到大肠杆菌中表达，可获得有较高降解活 性的双加氧酶。 重金属污染是环境污染的重要方面之一。随 着分子生物学技术的发展，越来越多的修复性蛋白 基因正被从植物、微生物和动物中陆续分离出来， 如汞离子还原酶基因、有机汞裂解酶基因、汞转运 蛋自基因、金属硫蛋白基因、植物络合素合成酶基 因、铁离子还原酶基因和锌转运蛋白基因L’‘〕。这些 基因通过基因工程的改造，重组到合适的受休细胞 中表达相应的蛋白质和酶，达到治理难以降解的有 毒有害污染物的目的。sorsa等〔”〕把MTS插人 LamB序列的153位点，在E.eoli中表达MTs，解决 r细胞内MTs对金属离子有限的吸附能力。综L 所述，基因重组技术具有快速、高效的特性，已逐渐 成为环境生物技术的研究热点。 2.4FISH技术 FISH技术利用核糖体内长度适中(约1500bp)、 高度保守的165:RNA序列作为理想的基因分类靶 序列，其中使用的165:RNA寡核普酸探针一般是 进行了荧光标记的20bp左右特异性核昔酸片段， 利用该报告分子(如生物素、地高辛)与荧光素标记 的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测系 统对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 FISH技术能提供处理过程中微生物的数量、空间分 布和原位生理学等信息。 硝化细菌是一类生理上非常特殊的化能自氧 菌，传统的研究方法要经过富集、分离、分类和鉴定 步骤，耗时长。HSH技术的引人解决了上述困难。 FlsH技术还被广泛用于活性污泥系统、硝化流化床 反应器和膜生物反应器等废水处理系统}’61。 基因工程微生物越来越多地被用于农业害虫 控制和环境污染的生物修复，对人类健康和环境的 影响引起广泛关注。1994年出现了一种新的标记 系统:绿色荧光蛋白(GFP)，由于GFP基因表达产 物对细胞没有毒害作用，且由GFP产生的荧光标记 检测卜分方便、简单。在某些被污染的环境中可分 离出降解该污染物的细菌，通过基因重组等手段使 用GFP分子标记，可更容易的分离检测被标记的 细胞叫。 Bastes等[’8]进行了苯酚降解菌染色体GFP基 因标记实验。通过PCR和Southemblot分析，证明 GFP基因已成功整合到宿主细胞的染色体中。对 标记菌与野生型的降解能力比较结果证明，GFP分 子标记的插人并不影响细胞的苯酚降解能力。 用G即标记Pseudomonasputida，研究活性淤 泥中细菌存活情况{’9飞。Pseudomonasputida被转到 活性淤泥2min后，观察到细胞在淤泥絮凝物间自 由游动;培养3d后，发现荧光细胞减少，大部分已 被合并到淤泥絮凝物中，以防止细菌被原生动物捕 食。用oFP标记石.eozi和Serraliamarceseern，考 察菌株附到絮凝物卜的过程{’()j。使用表面荧光显 微镜能将带有GFP标记的细胞从活性污泥中区分 开，井进行观察和记数。而聚焦激光扫描显微镜 (cLsM)可使GFP标记细菌产生三维轮廓，结合表 面荧光显微镜和CLSM观察GFP标记细胞，结果表 明，细胞表面疏水性在细菌附到絮凝物的过程中起 重要作用，两种细菌附在絮凝物上的模式有很大不 同，通过这种方法可更好地理解细菌赫附机理，有 助于提高废水处理效果。 3结语 分子生物技术的应用使研究人员可从微观的 角度更细致深人地了解微生物对污染物降解的具 体生理生化机制，在分子水平 _ _ [揭示生物体吸收、 迁移、积累有害物质最终被毒害，及适应、抗性等生 态问题，从而筛选到更多有利用价值的微生物。随 着越来越多微生物全部基因序列的解码，对各种细 菌体内可降解基因的分布和表达会有更深人的了 解，有关技术的发展和成熟必将对污染物的降解过 程有一个整体的、生态水平上的认识。 参考文献 l李凤，刘世贵 . 分子生物学技术在环境微生物研究中的 应用 . 世界科技研究与发展，2003，25(4):88一92 2AltsehulSF，GishW，MillerW，etal.Basieloealalign- mentsearehtool . 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开展青少年科技创新教育活动的实践与思考 中国网 | 时间： 2005-08-05 | 文章来源： 中国科协 海南省三亚市一中 韦迪兴中国青少年科技创新教育活动是由中国科协、教育部、国家环保总局等单位在全国倡导的一项大型青少年科普活动。它的实施，有利于激发学生热爱科学的兴趣，提高学生的科学文化水平，培养学生的创新能力和实践能力。笔者自1985年以来，积极策划组织和指导学生参与了活动，取得了一定的成效。共获科技创新大赛国家级一、二、三等奖26项，省级一、二、三等奖84项。下面谈谈一些具体的做法和体会。一、结合生物课堂教学内容指导学生开展课外科技活动1、按照初中生物课本教学要求，组织学生外出采集和制作动植物标本。我和科组老师先后指导学生制作出植物标本1800多件，昆虫标本900多件，海洋鱼类标本200多件。其中一部分存放在生物实验室，供教学和学生学习之用。2、按照高中生物“生物和环境”一章的教学要求，组织学生进行“调查学校附近的生态环境”活动。要求学生在外出调查的基础上，写出调查报告，并登记评分，作为测验成绩记入成绩单，从而激发学生的积极性。10多年来，先后有3000多名学生外出调查并写出了本地生物种类调查表、当地动植物资源保护情况、植树造林、环境污染现状等情况的实习调查报告3000多篇。二、利用第二课堂开展形式多样的课外科技活动为更好地实施素质教育，我校规定每天下午4:00—5:00为课外活动时间，利用这良好的契机，我组织学生开展形式多样的活动。①进行显微镜操作比赛、生物知识智力竞赛、环保知识智力竞赛、海洋环保知识竞赛、环保黑板报比赛、自栽一盆花比赛、植物标本和昆虫标本比赛。②观看环保录像、环保图片、野生动物标本展览室、生物进化史录像等。③配合科协有关部门，组织学生参观海洋水产养殖、野生动物驯化养殖场、淡水鱼立体养殖场等。④进行蚯蚓养殖、果蝇饲养研究等。⑤指导学生在生物园进行花卉扦插、压条等实践活动，并成功培育出一批花卉。⑥参加由中国野生动物保护协会、中国青少年科技辅导员协会主办的“野生动物集图”活动，有21位同学成绩突出，被主办单位授予“全国绿色小卫士”称号。⑦指导学生进行卫星搭载农作物干种子培育的试验活动。1992—2002年，利用中国科学院、遗传研究所和中国空间科学技术研究院提供的卫星搭载的种子，先后进行了番茄、白菜、长茄、青椒、黄瓜种子的对比种植活动。经过辛勤的培育、观察、记录，取得了丰硕的成果，为上级有关部门提供了一批详实的资料，写出的论文频频获全国奖。如1993年“卫星搭载番茄种子科学实验报告”获全国青少年“卫星搭载番茄种子科学实验”评比一等奖、省一等奖；1997年“卫星搭载白菜种子对比种植实验”获第四届全国青少年生物和环境科学实践活动优秀项目一等奖、省一等奖。1999年“高空气球搭载长茄种子科学实验”获全国第五届青少年生物和环境科学实践活动评比二等奖、省第一名；黄也同学获“环境科学活动论坛最佳提问奖”。2000年“太空青椒种子对比种植实验”获全国第15届创新大赛论文评比二等奖、省一等奖，学生方金华获教育部主办的“长江小小科学家提名奖”。另有1998年“卫星搭载白菜第二代种子对比种植实验”获全国青少年科学论文评比三等奖；⑧开展环保科技活动，进行专题环保调查、环保科学考察并撰写环保调查报告和环保科技小论文。1987年—1998年，笔者配合学校领导，先后7年7次组织学生参加市环保局、市科协组织的市环保夏令营，还自己带领学生到三亚市内、市外，实地观察、调查三亚市生态环境保护和破坏现状、动植物资源保护现状等，并指导学生撰写出环保论文调查报告。先后写出了700多篇环保科技小论文和调查报告。覃磊同学撰写的《红树林可创造三亚旅游文化》获全国环保小卫士征文比赛一等奖。王国英撰写的《关于三亚市水污染的调查与建议》获全国青少年科学论文评比二等奖、省第一名。唐南慧同学论文《甘什岭无翅坡垒资源保护的调查与建议》获全国青少年科学论文评比二等奖。郑远新的《三亚市垃圾污染的调查与建议》获第三届全国生物和环境科学活动评比三等奖、省一等奖。容旭岛写的《三亚市国家珊瑚礁自然保护区的调查》获全国青少年科学论文评比三等奖。吴清源的环保设计《三亚市红树林的恢复和种植设计方案》获2000年全国青少年环保活动设计评比优秀奖、省第一名。吴清源、覃磊、王国英同学的创新性建议还被市政府采纳，立项实施三亚河污染处理工程，三亚河红树林公园整治工程和补种三亚河红树林等工程项目。三、几点体会①通过10多年的实践，笔者深深体会到，在学生中开展青少年科技创新教育活动，能有效地提高学生的科学文化素质，从而提高教学质量，同时也提高学生的思想道德素质以及提高学生的综合素质。我校参加活动的学生，参加高中生物会考，绝大多数成绩为A，个别为B，全部考取了大中专院校。不少学生毕业后，成了生物科技科研、环境保护事业的骨干分子和领导。未考上大学的学生，许多从事水产养殖、作物栽培、环境保护等工作，有3位学生被评为市十杰青年，5位学生被评为省优秀团员、学生干部。②通过青少年科技创新教育活动，能使学生参与科学探究的过程，了解和学会科学探究的方法和途径，提高了实践能力、动手能力，同时也培养了创新能力，具备科学创新素质。③通过指导学生开展青少年科技创新教育活动，也能促进教师的思想、科学、文化等诸方面能力水平的提高，做出的成绩也能受到社会和学生的好评。笔者本人因此写出教研科研等论文在省以上刊物发表118篇，合著省劳技教育等书26本出版，独著《科技教育的实践与探索》一书由国家级出版社出版，宣传开展青少年科技教育的重要性和必要性以及方法和途径。呼吁社会各界和青少年对开展科技活动的重视，并积极参与。这些论文中有35篇获全国一、二、三等奖，9篇获国际优秀论文奖。《科技教育的实践与探索》2004年获 “中国教育学会奖”二等奖。本人亦获全国优秀科技工作者、全国先进科普工作者、全国教育系统劳动模范、全国十杰教师提名奖、全国<<生物学通报>>奖励基金奖、全国青少年优秀科技辅导员、海南省优秀专家等全国、省荣誉称号14个。④要指导好学生进行青少年科技活动，教师必须有强烈的活动和辅导意识，要有高尚的品德以及高度的意识和耐心。要认识到这也是完成教学任务所必须的，作为教师对搞好此项活动责无旁贷。⑤要指导学生开展青少年科技活动，教师要注意改变教育观念。由重视应试教育转为重视素质教育，要具有正确的培养全面发展人才的观念。在活动中，要做到重视培养学生的独立思考、独立操作能力，发挥学生在科技活动中的主动性和参与性。充分发挥学生的创造性和聪明才智，做到指导学生但不包办代替，最大限度地发挥学生的聪明才智。可以采用如下一些有效的措施：⑴活动前对学生进行培训，提高学生的意识，明确活动目的，提高对活动的兴趣，积极主动参与活动。⑵成立活动小组，选举活动小组长，由组长安排好各成员的工作。⑶指导学生选择好课题、项目，指导学生采用多种多样的研究手段，如独立开展、集体合作等。⑷指导学生精心设计研究方法、合理利用文献资料，善于观察和记录实验的过程、结果和现象，同时对实验结果进行科学的分析。最后要注意指导学生撰写出实验报告和科技小论文、调查报告等。