发布时间：
自己写吧，我给你举个栗子：发现问题】今天早晨，我去学校大操场打扫卫生。因为是初秋，不断地有梧桐树的叶子往下落。我无意中发现一个有趣的现象，那就是——落在地面上的梧桐树的叶子绝大部分都是背朝上？这是为什么呢？【提出猜想】我随手从地上捡起一片落叶，仔细地观察起来：只见叶面比较光滑，而叶背却很粗糙。我猜想：会不会是叶面密度大，叶背密度小的原因？因为地球引力的作用，树叶落地时，它密度大的一面先着地，叶背就朝上了。回家后我把这个发现告诉妈妈，妈妈说：“你的猜想有一些道理，但必须通过实验来验证。”在妈妈的帮助下，我开始行动起来，【实验过程】动手剪一剪我首先找来几张画画用的的厚素描纸，又问妈妈要了几张薄薄的彩纸，然后剪成一片片树叶的形状，再分别把一片厚的纸树叶和一片薄的纸树叶涂上胶水，并重叠着用粘贴在一起，就这样，一共做了20片双层纸树叶。上楼抛一抛我紧紧地握着这20片纸树叶爬上学校的三楼，妈妈站在楼下大声喊：“一、二、三，扔！”我立即松开手掌，把手中纸树叶向空中撒去，只见纸树叶像漂亮的大蝴蝶，轻盈地飘向大地，五彩缤纷，好看极了，惹来了一群看热闹的同学。认真数一数我跑下楼，开始认真数了数，我一共抛下20片纸树叶，其中有18片用厚素描纸剪的那一面都是朝上的。我兴奋极了！妈妈说：“一次实验并不能说明什么问题，同样的实验，至少做三次。”于是，我捡起地上的纸树叶，又一次跑上了三楼，开始了第二、第三轮实验。用笔记一记我把三次的实验结果记录了下来：实验次数 抛下的纸树叶片数 厚素描纸一面朝上的片数第一次 20 18第二次 20 19第三次 20 17动脑想一想根据三次的统计结果，每次抛下20片纸树叶，每次厚素描纸一面朝上的平均几率是18片。由此可见，我的猜测是有道理的，落叶的背面一定比正面轻。再次看一看教我们科学课的马老师对我的小研究很感兴趣，为了再一次验证我的想法，他主动借了一架显微镜给我，并指导我进一步观察落叶的组织构造。我通过显微镜观察发现：叶面的细胞呈长方形，排列规则；而背的细胞呈块状，排列不规则。上网查一查马上去带着我上网查阅了一下资料，资料上说：“叶面的细胞叫栅栏组织；叶背的细胞叫海绵组织。栅栏组织排列紧密，含有大量的叶绿素，他们主要用于接收光能，利用空气中的二氧化碳制造大量的有机物，密度较大；海面组织排列疏松，叶绿素较少，主要用于贮存植物内部产物和水，密度较小。因此不仅叶面的颜色通常比叶背鲜艳，它的重量也比较大。”【得出结论】哈哈，现在我终于明白了：植物的落叶大多数是叶背朝上，叶面朝下，这并不是秋风玩的把戏，而是由叶子的内部特殊结构造成的。【图片资料】清晨，我在校园里扫落叶，发现了一个奇怪的现象。为什么大多数落叶都是背朝上呢？我用厚素描纸和彩色薄纸做纸树叶数一数，一共做了20片我把20片树叶从楼上抛下来哇！奇迹发生了，绝大部分纸树叶都是厚素描纸的一面朝上。采集一片落叶作标本，我要仔细观察一下叶片的构造。哈哈，我终于看到了叶面细胞和叶背细胞的不同构造。
夏天，在路边、在草丛中，经常可以看到一种形体像蛇，身体有鳞片的四脚蛇。听人说，四脚蛇有毒，要是被它咬了，皮肤会红肿，继而腐烂。四脚蛇是不是真的有毒呢？为了探个究竟，我们兴趣小组进行了研究。首先，我们捉来一条四脚蛇，把它麻醉后，放在解剖盘上固定。然后用一次性针筒在它的嘴里吸取0.5ml唾液，倒入烧杯再加入3ml水，使唾液和水均匀混合，接着将一只小青蛙放入其中，一小时后，青蛙安然无恙。是不是时间太短？就让它呆一晚上吧。结果第二天早上，我们发现小青蛙还没死，自由自在地在水中游，挺惬意的。是不是浓度太低了呢？为了使我们的实验准确可靠，我们又到太田野里抓了四条四脚蛇，按昨天同样的方法进行了实验，结果，小青蛙还是没死。由此看来，四脚蛇对小青蛙没有致毒作用。那么四脚蛇对其他动物是否有影响呢？我们抓来一只花猫，把0.9ml唾液涂在猫的身上，观察是否有异常情况，结果，两天之后，我们发现猫毫发未伤。至此，我们开始对人们关于四脚蛇的危言有所放松，并进一步增加 对四脚蛇毒性研究的决心和信心。我们决定在自己身上做实验，研究四脚蛇对人是否用影响。我们从四脚蛇的嘴里吸取了0.5ml唾液涂在自己身上，刚开始觉得皮肤有点凉，但一会儿，就什么感觉也没有了，无不良反应。半小时后，皮肤仍旧无反应。由此说明，四脚蛇对我们人类皮肤没有致毒作用。通过以上实验与研究，我们明白了四脚蛇对人类并没有毒。经过查阅《小博士知识库》，我们还知道四脚蛇其实就是蜥蜴和石龙子，它们主要分布在我国广东、浙江等地，以食用蚊子、苍蝇、螳螂等害虫为主，是人类的好朋友，我们应该保护它们。[点评]：四脚蛇有毒，那时听别人说的，是否真是这样，小作者用自己的实际行动探了一个“究竟”，本文叙述的是自己“探”的过程。因为四脚蛇有无毒性不清楚，所以先选择在动物的身上实验，目的是为了确保实验者的安全，说明小作者的安全意识很强。也只有在动物的身上得出没有毒性的初步论断，才能在人的身上进行实验。对一系列的实验数据分析之后，最终得出的结论是四脚蛇对人类并没有毒。当然，“涂”并没有与血液接触，其结论是否成立还有待于进一步实验。实验后，小作者并没有结束探究活动，而是继续查阅资料，发现“夏天，在路边、在草丛中，经常可以看到一种形体像蛇，身体有鳞片的四脚蛇”其实就是蜥蜴和石龙子，它们是人类的好朋友，还呼吁我们应该保护它们。试想，文章的小作者如没有对人们的这一说法产生质疑、好奇，而是听之任之，他永远不会认识真相。科学的真实性需要我们像小作者一样，勇于实践。启示一；先对其他动物实验，再以身试“毒”，这是智慧加勇气的体现，可敬可佩！但以身试“毒”还是不提倡。启示二：《小博士知识库》等书籍是我们的好朋友，在这当中肯定还有“为什么四脚蛇形体像蛇，身体有鳞片等特点”的知识，小朋友想知道的话，你知道该怎么做了。
这个星期三下午第一节课是科学课，在课前科学唐老师让我与另外几个同学把她办公室里的显微镜全部搬进教室，当教室里的同学看见我拿着显微镜踏进教室便开始交流起来：“这次我们要用显微镜观察什么呢？”上课铃响了，唐老师示意大家安静，然后说：“进行今天的活动前先回顾一下上一节课的内容：显微镜分为哪几个部分？细胞是谁命名的？显微镜的发明者是谁？”还没等老师问完，大家就齐声说出了一连串的答案：“显微镜分为镜座，镜臂，目镜，物镜，转换器，载物台……”“嗯，答得不错。今天我们来用显微镜观察动物表皮细胞，观察后画在记录本上。”大家领到显微镜和切片后，我与同桌熟练地完成了对光调焦工作，动物表皮细胞出现在我的眼前：许多像细毛的线状物由中心向外发散，这样的小个体在我观察的区域中就有数十个，这些对动物起到了很好的保护作用。将观察结果认真地画在记录本上后，唐老师又发给大家一个彩色的切片，上面写着“植物茎秆切片”。刚拿到这个切片时，我心想：“植物茎秆切片与之前的两个切片又有什么不同之处呢？”把切片放到显微镜的载物台上，用压片压好，调整好目镜、物镜和准焦螺旋后定睛一看，直径一厘米左右的切片被淡色的线分成了三个主要部分，最外面的环形一共有三排小的管道，中间的环形有两排小的管道，最里面的环形有一排相对较粗的管道。原来就是这些小管道为植物输送着水分、养料，植物才能蓬勃地生长，枝繁叶茂。而这些“功臣”，平常用肉眼是根本看不见的。电子显微镜下的世界更加神奇美妙。将一根头发放大100倍左右就可以看见层叠的波纹。厨房的抹布放大后更像森林，彩色的细菌、真菌、酵母菌和霉菌组成了它。鹅的羽毛则更像活力无限的小草，细毛成了一片片叶子。一颗海盐是由一颗颗极小的方块颗粒组成的……这神奇无比的显微镜把微观世界放大了，让人们领略到一种别样的美丽。没有它们，精细的手术将无法完成，一些特殊的实验同样不能完成，它已经成为科学、医学等研究领域不可缺少的工具。
在动物世界里有许多奇怪的现象， 如兔子的眼睛为什么是红色的？鱼睡觉 为什么睁着眼？许多许多，但我觉得变 色龙会变色很神奇，所以我对它进行了 研究。 变色龙一般身长25—30厘米，舌头 比身子还长，它有一个特殊的本领那就 是会变色，这样它就可以很好地把自己 伪装起来，就好像穿了一件迷彩服一 样，既可以避免敌人的侵害，又可以迷 惑它要捕捉的食物，便于采取突然袭 击。 这是为什么呢？我上网查了一下， 原来它的皮肤内有许多不同的色素细 胞，有黑色素细胞.红色素细胞.金色素细 胞。这些色素细胞受神经和激素控制。 当环境中的光线.温度.湿度等发生变化 时，或是受到惊吓时，神经系统立即会 做出反应，引起各种色素细胞的收缩或 舒张的变化，产生不同的组合，像我们 绘画时用“三原色”可以调出许多种不同 颜色一样，变色龙的身体就呈现出不同 的颜色变化。 变色龙能随环境变化改变体色，长 期对自然环境适应的结果。有不少动物 都有这种本领，如海边的招潮蟹；有的 外形也可以随环境变化，如枯枝碟，颜 色与形状与一片枯叶几乎没有区别。动 物的这种对环境的适应性成为“拟态”。 知道了这个道理，我一点也不足为 奇了。 分享到：QQ空间 QQ好友 腾讯微博
你看下（微生物前沿）上的文献吧，
不需要。
图片格式要求用IIF或JPG格式。半栏图宽度小于3．5 cm，通栏图宽度小于11 cm。图序和图题用小五黑，图序与图题之间空1个字距。一般在图内空白处。
图注应在图题之后。组合图每幅分图的右下角标注分图的序号。显微镜病理图片应注明染色方法和放大倍数，染色方法和放大倍数之间，掌空1个字距。
写论文的要求：
1、题目。应能概括整个论文最重要的内容，言简意赅，引人注目，一般不宜超过20个字。论文摘要和关键词。
2、论文摘要应阐述学位论文的主要观点。说明本论文的目的、研究方法、成果和结论。尽可能保留原论文的基本信息，突出论文的创造性成果和新见解。而不应是各章节标题的简单罗列。摘要以500字左右为宜。关键词是能反映论文主旨最关键的词句，一般3-5个。
3、目录。既是论文的提纲，也是论文组成部分的小标题，应标注相应页码。
4、引言(或序言)。内容应包括本研究领域的国内外现状，本论文所要解决的问题及这项研究工作在经济建设、科技进步和社会发展等方面的理论意义与实用价值。
5、正文。是毕业论文的主体。
6、结论。论文结论要求明确、精炼、完整，应阐明自己的创造性成果或新见解，以及在本领域的意义。
7、参考文献和注释。按论文中所引用文献或注释编号的顺序列在论文正文之后，参考文献之前。图表或数据必须注明来源和出处。
图片格式要求用，IIF或JPG格式。半栏图宽度小于3．5 cm，通栏图宽度小于11 cm。图序和图题l 毒用小五黑，图序与图题之间空1个字距。图例一般在图内空白处。图注应在图题之后。组合图每幅分睾 i图的右下角标注分图的序号。显微镜病理图片应注明染色方法和放大倍数，染色方法和放大倍数之间Z 掌空1个字距，
不需要。
图片格式需要IIF或JPG格式。半条形图宽度小于3．5cm，普通条形图宽度小于11cm。在图表顺序和标题中使用小五个黑色，并在它们之间留一个空格。一般在图的空白处。
标题应该在标题之后。在每张构图的右下角，应标明每张构图的序号。显微镜病理图像应显示染色方法和放大倍数，染色方法和放大倍数之间，手掌之间有一个字间距。
扩展资料：
1、头衔，应能概括整篇论文最重要的内容，简洁、醒目，一般不超过20字，论文摘要及关键词。
2，论文摘要应阐述论文的主要观点，说明本文的研究目的、研究方法、研究结果和结论。尽量保留原稿的基本信息，突出原稿的创新成果和新思路。它不应该是一个简单的章节标题列表。用500字左右比较合适。关键词是反映论文主题的最重要的词语和句子，一般为3－5个。
3、目录，它不仅是论文的大纲，也是论文的副标题部分。应标记相应的页码。
4、引言（或前言），内容应包括国内外研究领域的现状、本文要解决的问题以及本研究工作在经济建设、科技进步和社会发展中的理论意义和实用价值。
5、正文，它是毕业论文的主体。
6、结论，论文结论应清晰、简明、完整。它应该阐明自己的创新成果或新思想，以及在这一领域的意义。
7、参考文献和注释。它是根据参考文献或注释编号的顺序列在论文正文之后和参考文献之前的。图表或数据必须指明源和源
显微镜的发展历史：最早的显微镜是16世纪末期在荷兰制造出来的。发明者是亚斯·詹森，荷兰眼镜商，或者另一位荷兰科学家汉斯·利珀希，他们用两片透镜制作了简易的显微镜，但并没有用这些仪器做过任何重要的观察。后来有两个人开始在科学上使用显微镜。第一个是意大利科学家伽利略。他通过显微镜观察到一种昆虫后，第一次对它的复眼进行了描述。第二个是荷兰亚麻织品商人列文虎克，他自己学会了磨制透镜。他第一次描述了许多肉眼所看不见的微小植物和动物。1931年，恩斯特·鲁斯卡通过研制电子显微镜，使生物学发生了一场革命。这使得科学家能观察到像百万分之一毫米那样小的物体。1986年他被授予诺贝尔奖。显微镜是人类20世纪最伟大的发明物之一。在它发明出来之前，人类关于周围世界的观念局限在用肉眼，或者靠手持透镜帮助肉眼所看到的东西。
高分辨率光学显微术在生命科学中的应用【摘要】 提高光学显微镜分辨率的研究主要集中在两个方面进行，一是利用经典方法提高各种条件下的空间分辨率，如用于厚样品研究的SPIM技术，用于快速测量的SHG技术以及用于活细胞研究的MPM技术等。二是将最新的非线性技术与高数值孔径测量技术（如STED和SSIM技术）相结合。生物科学研究离不开超高分辨率显微术的技术支撑，人们迫切需要更新显微术来适应时代发展的要求。近年来研究表明，光学显微镜的分辨率已经成功突破200nm横向分辨率和400nm轴向分辨率的衍射极限。高分辨率乃至超高分辨率光学显微术的发展不仅在于技术本身的进步，而且它将会极大促进生物样品的研究，为亚细胞级和分子水平的研究提供新的手段。【关键词】 光学显微镜；高分辨率；非线性技术；纳米水平在生物学发展的历程中显微镜技术的作用至关重要，尤其是早期显微术领域的某些重要发现，直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展。对固定样品和活体样品的生物结构和过程的观察，使得光学显微镜成为绝大多数生命科学研究的必备仪器。随着生命科学的研究由整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及鉴别精微细节的能力已经成为一个非常关键的技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。在400～760nm的可见光范围内，显微镜的分辨极限大约是光波的半个波长，约为200nm，而最新取得的研究成果所能达到的极限值为20～30nm。本文主要从高分辨率三维显微术和高分辨率表面显微术两个方面，综述高分辨率光学显微镜的各种技术原理以及近年来在突破光的衍射极限方面所取得的研究进展。1 传统光学显微镜的分辨率光学显微镜图像的大小主要取决于光线的波长和显微镜物镜的有限尺寸。类似点源的物体在像空间的亮度分布称为光学系统的点扩散函数(point spread function, PSF)。因为光学系统的特点和发射光的性质决定了光学显微镜不是真正意义上的线性移不变系统，所以PSF通常在垂直于光轴的x-y平面上呈径向对称分布，但沿z光轴方向具有明显的扩展。由Rayleigh判据可知，两点间能够分辨的最小间距大约等于PSF的宽度。根据Rayleigh判据，传统光学显微镜的分辨率极限由以下公式表示[1]：横向分辨率(x-y平面)：dx，y=■轴向分辨率(沿z光轴)：dz=■可见，光学显微镜分辨率的提高受到光波波长λ和显微镜的数值孔径N.A等因素的制约；PSF越窄，光学成像系统的分辨率就越高。为提高分辨率，可通过以下两个途径：（1）选择更短的波长；（2）为提高数值孔径, 用折射率很高的材料。Rayleigh判据是建立在传播波的假设上的，若能够探测非辐射场，就有可能突破Rayleigh判据关于衍射壁垒的限制。2 高分辨率三维显微术在提高光学显微镜分辨率的研究中，显微镜物镜的像差和色差校正具有非常重要的意义。从一般的透镜组合方式到利用光阑限制非近轴光线，从稳定消色差到复消色差再到超消色差，都明显提高了光学显微镜的成像质量。最近Kam等[2]和Booth等[3]应用自适应光学原理，在显微镜像差校正方面进行了相关研究。自适应光学系统由波前传感器、可变形透镜、计算机、控制硬件和特定的软件组成，用于连续测量显微镜系统的像差并进行自动校正。 一般可将现有的高分辨率三维显微术分为3类：共聚焦与去卷积显微术、干涉成像显微术和非线性显微术。2.1 共聚焦显微术与去卷积显微术 解决厚的生物样品显微成像较为成熟的方法是使用共聚焦显微术(confocal microscopy) [4]和三维去卷积显微术(three-dimensional deconvolution microscopy, 3-DDM) [5]，它们都能在无需制备样品物理切片的前提下，仅利用光学切片就获得样品的三维荧光显微图像。共聚焦显微术的主要特点是，通过应用探测针孔去除非共焦平面荧光目标产生的荧光来改善图像反差。共聚焦显微镜的PSF与常规显微镜的PSF呈平方关系，分辨率的改善约为■倍。为获得满意的图像，三维共聚焦技术常需使用高强度的激发光，从而导致染料漂白，对活生物样品产生光毒性。加之结构复杂、价格昂贵，从而使应用在一定程度上受到了限制。3-DDM采用软件方式处理整个光学切片序列，与共聚焦显微镜相比，该技术采用低强度激发光，减少了光漂白和光毒性，适合对活生物样品进行较长时间的研究。利用科学级冷却型CCD传感器同时探测焦平面与邻近离焦平面的光子，具有宽的动态范围和较长的可曝光时间，提高了光学效率和图像信噪比。3-DDM拓展了传统宽场荧光显微镜的应用领域受到生命科学领域的广泛关注[6]。2.2 选择性平面照明显微术 针对较大的活生物样品对光的吸收和散射特性，Huisken[7]等开发了选择性平面照明显微术(selective plane illumination microscopy，SPIM)。与通常需要将样品切割并固定在载玻片上的方式不同，SPIM能在一种近似自然的状态下观察2～3mm的较大活生物样品。SPIM通过柱面透镜和薄型光学窗口形成超薄层光，移动样品获得超薄层照明下切片图像，还可通过可旋转载物台对样品以不同的观察角度扫描成像，从而实现高质量的三维图像重建。因为使用超薄层光，SPIM降低了光线对活生物样品造成的损伤，使完整的样品可继续存活生长，这是目前其他光学显微术无法实现的。SPIM技术的出现为观察较大活样品的瞬间生物现象提供了合适的显微工具，对于发育生物学研究和观察细胞的三维结构具有特别意义。2.3 结构照明技术和干涉成像 当荧光显微镜以高数值孔径的物镜对较厚生物样品成像时，采用光学切片是一种获得高分辨3D数据的理想方法，包括共聚焦显微镜、3D去卷积显微镜和Nipkow 盘显微镜等。1997年由Neil等报道的基于结构照明的显微术，是一种利用常规荧光显微镜实现光学切片的新技术，并可获得与共聚焦显微镜一样的轴向分辨率。干涉成像技术在光学显微镜方面的应用1993年最早由Lanni等提出，随着I5M、HELM和4Pi显微镜技术的应用得到了进一步发展。与常规荧光显微镜所观察的荧光相比，干涉成像技术所记录的发射荧光携带了更高分辨率的信息。（1）结构照明技术：结合了特殊设计的硬件系统与软件系统，硬件包括内含栅格结构的滑板及其控制器，软件实现对硬件系统的控制和图像计算。为产生光学切片，利用CCD采集根据栅格线的不同位置所对应的原始投影图像，通过软件计算，获得不含非在焦平面杂散荧光的清晰图像，同时图像的反差和锐利度得到了明显改善。利用结构照明的光学切片技术，解决了2D和3D荧光成像中获得光学切片的非在焦平面杂散荧光的干扰、费时的重建以及长时间的计算等问题。结构照明技术的光学切片厚度可达0.01nm，轴向分辨率较常规荧光显微镜提高2倍，3D成像速度较共聚焦显微镜提高3倍。（2）4Pi 显微镜：基于干涉原理的4Pi显微镜是共聚焦/双光子显微镜技术的扩展。4Pi显微镜在标本的前、后方各设置1个具有公共焦点的物镜，通过3种方式获得高分辨率的成像：①样品由两个波前产生的干涉光照明；②探测器探测2个发射波前产生的干涉光；③照明和探测波前均为干涉光。4Pi显微镜利用激光作为共聚焦模式中的照明光源，可以给出小于100nm的空间横向分辨率，轴向分辨率比共聚焦荧光显微镜技术提高4~7倍。利用4Pi显微镜技术，能够实现活细胞的超高分辨率成像。Egner等[8，9]利用多束平行光束和1个双光子装置，观测活细胞体内的线粒体和高尔基体等细胞器的精微细节。Carl[10]首次应用4Pi显微镜对哺乳动物HEK293细胞的细胞膜上Kir2.1离子通道类别进行了测量。研究表明，4Pi显微镜可用于对细胞膜结构纳米级分辨率的形态学研究。（3）成像干涉显微镜(image interference microscopy, I2M)：使用2个高数值孔径的物镜以及光束分离器，收集相同焦平面上的荧光图像，并使它们在CCD平面上产生干涉。1996年Gustaffson等用这样的双物镜从两个侧面用非相干光源（如汞灯）照明样品，发明了I3M显微镜技术(incoherent, interference, illumination microscopy, I3M），并将它与I2M联合构成了I5M显微镜技术。测量过程中，通过逐层扫描共聚焦平面的样品获得一系列图像，再对数据适当去卷积，即可得到高分辨率的三维信息。I5M的分辨范围在100nm内。2.4 非线性高分辨率显微术 非线性现象可用于检测极少量的荧光甚至是无标记物的样品。虽有的技术还处在物理实验室阶段，但与现有的三维显微镜技术融合具有极大的发展空间。（1）多光子激发显微术：(multiphoton excitation microscope，MPEM)是一种结合了共聚焦显微镜与多光子激发荧光技术的显微术，不但能够产生样品的高分辨率三维图像，而且基本解决了光漂白和光毒性问题。在多光子激发过程中，吸收几率是非线性的[11]。荧光由同时吸收的两个甚至3个光子产生，荧光强度与激发光强度的平方成比例。对于聚焦光束产生的对角锥形激光分布，只有在标本的中心多光子激发才能进行，具有固有的三维成像能力。通过吸收有害的短波激发能量，明显地降低对周围细胞和组织的损害，这一特点使得MPEM成为厚生物样品成像的有力手段。MPEM轴向分辨率高于共聚焦显微镜和3D去卷积荧光显微镜。（2）受激发射损耗显微术：Westphal[12]最近实现了Hell等在1994年前提出的受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED）成像的有关概念。STED成像利用了荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系。STED技术通过2个脉冲激光以确保样品中发射荧光的体积非常小。第1个激光作为激发光激发荧光分子；第2个激光照明样品，其波长可使发光物质的分子被激发后立即返回到基态，焦点光斑上那些受STED光损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力，而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的光点。Hell等已获得了28nm的横向分辨率和33nm的轴向分辨率[12,13]，且完全分开相距62nm的2个同类的分子。近来将STED和4Pi显微镜互补性地结合，已获得最低为28nm的轴向分辨率,还首次证明了免疫荧光蛋白图像的轴向分辨率可以达到50nm[14]。（3）饱和结构照明显微术：Heintzmann等[15]提出了与STED概念相反的饱和结构照明显微镜的理论设想，最近由Gustafsson等[16]成功地进行了测试。当光强度增加时，这些体积会变得非常小，小于任何PSF的宽度。使用该技术，已经达到小于50nm的分辨率。（4）二次谐波 (second harmonic generation, SHG)成像利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源。SHG一般为非共振过程，光子在生物样品中只发生非线性散射不被吸收，故不会产生伴随的光化学过程，可减小对生物样品的损伤。SHG成像不需要进行染色,可避免使用染料带来的光毒性。因其对活生物样品无损测量或长时间动态观察显示出独特的应用价值，越来越受到生命科学研究领域的重视[17]。3 表面高分辨率显微术表面高分辨率显微术是指一些不能用于三维测量只适用于表面二维高分辨率测量的显微技术。主要包括近场扫描光学显微术、全内反射荧光显微术、表面等离子共振显微术等。3.1 近场扫描光学显微术 近场扫描学光显微术(near-field scanning optical microscope, NSOM)是一种具有亚波长分辨率的光学显微镜。由于光源与样品的间距接近到纳米水平，因此分辨率由光探针口径和探针与样品之间的间距决定，而与光源的波长无关。NSOM的横向分辨率小于100nm，Lewis[18]则通过控制在一定针尖振动频率上采样，获得了小于10nm的分辨率。NSOM具有非常高的图像信噪比，能够进行每秒100帧图像的快速测量[19]，NSOM已经在细胞膜上单个荧光团成像和波谱分析中获得应用。3.2 全内反射荧光显微术 绿色荧光蛋白及其衍生物被发现后，全内反射荧光(total internal reflection fluorescence，TIRF)技术获得了更多的重视和应用。TIRF采用特有的样品光学照明装置可提供高轴向分辨率。当样品附着在离棱镜很近的盖玻片上，伴随着全内反射现象的出现，避免了光对生物样品的直接照明。但因为波动效应，有小部分的能量仍然会穿过玻片与液体介质的界面而照明样品，这些光线的亮度足以在近玻片约100nm的薄层形成1个光的隐失区，并且激发这一浅层内的荧光分子[20]。激发的荧光由物镜获取从而得到接近100nm的高轴向分辨率。TIRF近来与干涉照明技术结合应用在分子马达步态的动力学研究领域, 分辨率达到8nm，时间分辨率达到100μs[21]。3.3 表面等离子共振 表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR) [22]是一种物理光学现象。当入射角以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将发生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光被耦合入表面等离子体内可引起电子发生共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面流过的液相的折射率而改变，折射率的改变又与结合在金属表面的生物分子质量成正比。表面折射率的细微变化可以通过测量涂层表面折射光线强度的改变而获得。1992年Fagerstan等用于生物特异相互作用分析以来，SPR技术在DNA-DNA生物特异相互作用分析检测、微生物细胞的监测、蛋白质折叠机制的研究，以及细菌毒素对糖脂受体亲和力和特异性的定量分析等方面已获得应用[23]。当SPR信息通过纳米级孔道[24]传递而提供一种卓越的光学性能时，将SPR技术与纳米结构设备相结合，该技术的深入研究将有可能发展出一种全新的成像原理显微镜。【参考文献】[1] 汤乐民,丁 斐.生物科学图像处理与分析[M].北京:科学出版社,2005：205.[2] Kam Z, Hanser B, Gustafsson MGL, et al.Computational adaptive optics for live three-dimensional biological imaging[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:3790-3795.[3] Booth MJ, Neil MAA, Juskaitis R, et al. Adaptive aberration correction in a confocal microscope[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2002, 99:5788-5792.[4] Goldman RD,Spector DL.Live cell imaging a laboratory manual[J].Gold Spring Harbor Laboratory Press,2005.[5] Monvel JB,Scarfone E,Calvez SL,et al.Image-adaptive deconvolution for three-dimensional deep biological imaging[J].Biophys,2003,85:3991-4001.[6] 李栋栋,郭学彬,瞿安连.以三维荧光反卷
20世纪30年代，电子显微镜的发明使神秘的病毒终于现出了真身，只是电子显微镜的原理决定了它无法用于活细胞的观察及获取生物活动的动态信息，而攻克致病病毒，需要深入了解病毒在活细胞内感染、复制及释放的动态过程。大部分高级光学显微镜及电子显微镜中都配置了相衬部件。相衬显微镜在细菌学、病理学等方面应用广泛，生物学研究因此有了极大突破(泽尼克因论证相衬法及发明相衬显微镜的贡献获1953年诺贝尔物理学奖)。1935年，奥地利的马克斯·海廷格(Max Haitinger)等人改进了生物组织标本的染色技术，用荧光色素染色来标记不能自发荧光的特定组织成分、细菌和其它病原体，标本的荧光亮度增强了，在荧光显微镜下可观察到生物组织的续发性荧光。20世纪50年代，随着荧光抗体标记方法及荧光显微镜装置的改进，荧光技术的应用逐渐推广。1958年，唐尼斯与亚瑟·肖洛(Arthur Schawlow)在《物理评论( Physical Review )》杂志上发表论文，阐述了研制激光器的可能性以及所需的条件，指出这种激光具有亮度极高、单色性好、方向性好的特点。1960年5月16日，梅曼在自己研制的红宝石激光器上成功获得了波长为694.3纳米的激光。7月7日，休斯公司正式宣布了这个消息。此后，不同工作物质的激光器陆续研制出来，如氦氖气体激光器、二氧化碳激光器等，激光在各领域的应用研究也迅速展开。1978年，德国的托马斯·克里默(Thomas Cremer) 和克里斯托夫·克里默(Christoph Cremer)兄弟首次提出了共聚焦激光扫描显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope，简称CLSM) 的设计方案：在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，用激光聚焦逐点扫描方式结合荧光标记生物样品的三维探测方法，通过计算机处理手段重构生成三维图像(与扫描电子显微镜类似)。
这个要看图片的用途和文章的专业。比如城市规划类的文章，鸟瞰图就不需要出处，自己画的施工图纸等等也不需要。但是引用的图片就需要给出明确的出处
图片格式要求用，IIF或JPG格式。半栏图宽度小于3．5 cm，通栏图宽度小于11 cm。图序和图题l毒用小五黑，图序与图题之间空1个字距。图例一般在图内空白处。图注应在图题之后。组合图每幅分睾i图的右下角标注分图的序号。显微镜病理图片应注明染色方法和放大倍数，染色方法和放大倍数之间Z掌空1个字距，
樊栓狮，王燕鸿，郎雪梅
樊栓狮（1965－），男，教授，主要从事水合物研究，E-mail:。
华南理工大学化学与化工学院，广州510640
摘要：水合物生长过程研究是水合物形成、利用的重要基础。本文利用显微镜对TBAB水合物的微观形貌及生长特性进行了研究，结果表明：在3℃时32％的TBAB溶液可同时形成四棱柱、六棱柱及八棱柱不同形貌的单晶；随着TBAB水合物单晶的生长，表面出现缺陷或相互碰撞，从而引起单晶生长为交叉晶体，继而簇状晶体。不同形貌的单晶其生长速度不同，四棱柱体比八棱柱体具有更高的平衡生长温度，和相同条件下更快的生长速度，四棱柱体比八棱柱体受浓度影响更多，对浓度变化更敏感。
关键词：四丁基溴化铵；水合物；微观形貌；生长动力学
Study of Hydrate Microscopy Morphology and Growth Kinetics
Fan Shuanshi,Wang Yanhong,Lang Xuemei
School of Chemistry and Chemical Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510641 ,China
Abstract:Research of hydrate growth process is the base of hydrate formation and utilization.TBAB hydrate morphology and growth properties were investigated by microscopy in this paper.The results showed that quadrangular,six-prism,eight-prism crystal wereformed in 32 wt%TBAB solution under 3℃.With the crystal increase,single crystal could grow to cross crystal and then cluster crystal due to defect on the surface or encountered.The crystal growth kinetic study found that the growth rate of various morphology crystal is different.Quadrangular crystal has higher growth temperature and grow faster than eight-prism.
Key words:tetra-n-butyl ammonium bromide (TBAB) ; clathrate hydrate;microscopy morphology;growth kinetic.
0 引言
天然气水合物是在高压低温条件下由水和天然气形成的笼状固态物，广泛分布于大陆边缘陆坡区海底和永久冻土带，是目前研究的一种极有前景的替代能源[1]。我国在南海北部神狐海域钻探取得最高饱和度达48％的均匀分散状可燃冰样品，引起国际社会关注。天然气水合物潜在的能源前景、巨大的储气能力以及在环境方面可能引起的危害等，使其成为当代科学界的一个前沿研究热点。
气体水合物生成过程研究是水合物理论体系中重要的组成部分，对其生成过程的认识和了解的程度直接关系到地层中甲烷水合物的利用以及其储气性质在油工业中的应用等。四丁基溴化铵（tetra-n-butyl ammonium bromide，简称TBAB）是一种季铵盐，它与水生成的水合物的结构和化学性质都与天然气水合物近似，它的存在能够显著降低气体水合物的生成条件[1]，在常温常压下能与水分子结合形成半包络水合物晶体[2]，目前作为添加剂被广泛用于气体水合物的研究。常见的TBAB水合物有2种类型：A型和B型，研究比较多的是B型TBAB水合物，Shimada等[3-4]指出在TBAB·38H2O晶包中有2个可容纳小分子的512孔穴，可用于储存CH4、H2分子，如图1所示。TBAB与H2形成水合物的理想分子式为2H2· TBAB·38H2O（每个512孔穴填充1个H2分子）或4H2·TBAB·38H2O（每个512孔穴填充2个H2分子）。
图1 TBAB水合物结构示意图
目前的研究大多集中于纯TBAB水合物和TBAB－气体水合物的平衡条件等热力学性能等方面：Shimada等[3-5]研究了TBAB水合物晶体的生长形态；Oyama等[6-7]也报道了TBAB水合物形态；但对TBAB水合物的生长特性及生长动力学研究较少。本文利用自行设计的显微及成像系统研究TBAB水合物生长特性及生长动力学，从微观角度探讨水合物生长机理。
1 实验部分
1.1 实验装置
实验装置如图2所示，本实验装置可以对TBAB水合物的生长过程进行动态观测及记录。实验装置包括四大部分，Carl Zeiss Axio Observer倒置显微镜为主体的用于水合物微观研究的显微及成像系统；低温恒温冷台（材料不锈钢，可视区域Φ50 mm×30 mm）；图像采集及处理系统，包括：数码摄像机（IMAGING Micro Publisher 5.0RTV），电脑终端及图像处理软件（Simple PIC）；温度控制系统，包括恒温水浴（Huber-ministat 240，控温范围：－40～40℃，控温精确：0.01℃）、数据采集仪（Agilent，采样频率：次/10秒）和自制热电偶（J型，测温精度0.1℃）。
图2 TBAB水合物微观生长实验平台
1.2 试剂
实验所用材料为广州化学公司提供99%TBAB和自制蒸馏水。
1.3 实验方法
将TBAB按32％的浓度配制待用溶液。在实验前用蒸馏水将冷台反复清洗3次，并用32%TBAB溶液冲洗2遍。打开控温系统，调节水浴温度，使冷台温度达到实验预设值3℃。用量筒量取10 m L 32%TBAB溶液加入冷台，观察TBAB水合物晶体生长情况，并随时记录。
2 实验结果
2.1 TBAB水合物晶体形状
图3为实验过程中观察到的TBAB水合物单晶形貌。从图中可以看到，TBAB水合物单晶出现了四棱柱（a、b），六棱柱（c）和八棱柱（d) 3种形态。对于四棱柱型单晶根据其端面不同又可分为凹面四棱柱（a）和凸面四棱柱（b)2种。其中以四棱柱和八棱柱最为常见，六棱柱数量极少。
图3 TBAB水合物单晶形貌
2.2 水合物生长特性
图4为生长过程中拍摄的TBAB水合物生长照片。从图中可以看到，在TBAB水合物生长的同一时刻，溶液中同时存在多种晶体形态，包括柱状的单晶，交叉晶体以及簇状晶体。在生长不同时刻观察发现（统计结果）：在生长早期，以柱状单晶为主，交叉晶体数量次之，簇状晶体最少；在生长中期，柱状晶体、交叉晶体以及簇状晶体数量接近；在生长晚期，以簇状晶体和交叉晶体为主，柱状单晶数量明显减少。说明在TBAB水合物晶体生长过程中，水合物晶体最初以单晶形式出现，随着溶液中单晶的生长和数量的增加，开始出现交叉晶体，最终发展为簇状晶体。
图4 TBAB水合物微观生长照片
在TBAB晶体生长过程中还发现，从单晶向交叉晶体或簇状晶体发展有2种情况：一是单晶在不断地长大过程中晶体表面出现缺陷，而后这些表面缺陷作为基面，诱导晶体继续生长，如图5所示，称为缺陷诱导生长；此诱因生长的晶体与母晶晶体形貌相同（同为四棱柱或八棱柱）。二是随着单晶不断出现，溶液中单晶数量不断增加，在单晶自由运动过程中单晶之间或单晶与晶簇间发生碰撞而联结继续生长，如图6所示，称为嫁接生长；此诱因生长的晶体形貌各异。通常情况下，在同一单晶或晶簇上缺陷诱导和嫁接生长同时存在。
图5 缺陷诱导生长示意图
图6 嫁接生长示意图
2.3 水合物生长动力学
TBAB水合物晶体的生长是各向异性的，轴向生长快，径向生长速度缓慢。对TBAB水合物晶体的生长过程进行原位拍摄，可实现对晶体生长过程的观察。图7为一组TBAB水合物生长前后的叠加照片，1、2、3分别标出了其中3个晶体生长前后的端面位置。从照片中可以明显看到TBAB水合物晶体沿轴向的生长。在生长的不同阶段，水合物晶体的生长速度也有所差异。记录不同时刻晶体的生长，可以得到在一定时间内TBAB晶体生长的长度，列于图8。
图7 TBAB水合物晶体生长前后叠加图
图8 TBAB水合物晶体长度
由于生成的六棱柱晶体极少，故其生长过程未拍摄到。因此，本文主要针对四棱和八棱晶体进行生长动力学分析。图8为拍摄时间内晶体的四棱、八棱晶体的生长长度，图中一条直线表示一个晶体长度随时间的变化，故每条直线的斜率则代表该晶体的生长速度。根据不同时间TBAB水合物晶体生长长度l可计算出晶体生长速度dl/dr，其中τ为时间。将拍摄时间内的晶体生长视为匀速，可获得晶体平均生长速度，见图9。
图9 TBAB水合物晶体生长速度
如图9所示，四棱和八棱晶体的生长速度随时间而减慢。水合物开始生长初期，四棱晶体最大生长速度为0.7893μm/s，八棱晶体的最大生长速度为0.7104 μm/s。随后，2种晶体生长速度呈线性降低的变化趋势，至300 min时，四棱、八棱晶体生长速度分别降低至0.0354 μm/s、0.0410μm/s。Shimada等[5]在其报道中指出TBAB晶体的生长速度与过冷度的关系为：
南海天然气水合物富集规律与开采基础研究专集
依据这一关系可知，本研究中晶体在10℃条件下的生长速度（0.0354μm/s～0.7893μm/s）明显小于通过式（1）计算所得的速度。显然，造成这种差别的原因主要是本研究中TBAB溶液浓度明显低于文献报道的溶液浓度。而且，晶体生长过程中，浓度会影响质量传递，从而会影响晶体生长的速度[8]，这也是造成生长速度变化的原因。
从图9通过线性拟合可得四棱、八棱TBAB水合物晶体的生长速度表达式（2），其中dlT/dt表示四棱晶体的生长速度，dlO/dt表示八棱晶体的生长速度。
南海天然气水合物富集规律与开采基础研究专集
式中：k为结晶速率常数，t为结晶时间，C是与水合物形成环境有关的常数，本研究中则主要受浓度影响，n为反应级数，c为溶液浓度。溶液浓度随时间变化。如图10所示。图10为不同时刻水合物生长过程中TBAB的浓度。溶液浓度c随着水合物生长时间t的增加而逐渐降低，拟合得到浓度随时间的变化关系为
南海天然气水合物富集规律与开采基础研究专集
图10 TBAB水合物生长过程溶液浓度变化
将式（3）代入（2）中，最终可得：
四棱柱晶体：
kT=23.1250,
CT=-0.6619,
nT=0.9251；
八棱柱晶体：
kO=17.0780,
Co=-0.6618,
nO=0.8686。
可见，四棱柱晶体的结晶速率常数大于八棱柱晶体，即kT> ko，通过反应动力学基本理论可知，四棱体比八棱体具有更高的平衡生长温度，且相同条件下具有更快的生长速度。由图9可知，随TBAB溶液浓度的降低，四棱晶体的生长速度比八棱晶体降低的快，这是受反应级数n影响。反应级数是反应浓度变化对反应速率影响程度的常数。显然，四棱晶体的反应级数大于八棱晶体，说明四棱晶体生长速率受浓度变化的影响更大，因此，当浓度降低时，四棱晶体的生长速度则降低的更快。依据式（2），本研究计算了浓度为40wt％时TBAB晶体的生长速度，与Shimada等[5]研究中提供的数据比较接近。
3 结论
1）本文利用显微经观察了32%TBAB溶液中水合物的形貌及其生长。TBAB水合物晶体出现四棱柱、六棱柱和八棱柱单晶。在水合物不同的生长阶段，不同形状的晶体共同存在，统计计算在生长初期以单晶为主，生长中期以交叉晶体居多，生长后期主要出现簇状晶体。根据水合物生长的成因可分为诱导生长和嫁接生长2种。
2）不同形貌的单晶其生长速度不同。四棱柱体比八棱柱体具有更高的平衡生长温度，和相同条件下更快的生长速度，四棱柱体比八棱柱体受浓度影响更多，对浓度变化更敏感。
参考文献
[1]Sun Z G,Jiang C M,Xie N L.Hydrate Equilibrium Conditions for Tetra-n-butyl Ammonium Bromide[J].Journal of Chemical and Engineering Data,2008,53:2375-2377.
[2]Arjmandi M,Chapoy A,Tohidi B.Equilibrium Data of Hydrogen,Methane,Nitrogen,Carbon Dioxide,and Natural Gas in Semi-Clathrate Hydrates of Tetrabutyl Ammonium Bromide[J].Journal of Chemical and Engineering Data,2007,52:2153-2158.
[3]Kamata Y,Yamakoshi Y,Ebinuma T,et al.Hydrogen Sulfide Separation Using Tetra-n-Butyl Ammonium Bromide Semi-Clathrate(TBAB)Hydrate[J].Energy&Fuels,2005,19(4):1717-1722.
[4]Shimada W,Shiro M,Kondo H,etal.Tetra-N-Butylammonium Bromide-Water (1/38)[J].Acta Crystallographica Section C-Crystal Structure Communications,2005,61:65-66.
[5]Shimada W,Ebinuma T,Oyama H,et al.Free-Growth Forms and Growth Kinetics of Tetra-N-Butyl Ammonium Bromide Semi-Clathrate Hydrate Crystals[J].Journal of Crystal Growth,200,274(1/2):246-250.
[6]Oyama H,Shimada W,Ebinuma T,et al.Phase Diagram,Latent Heat,and Specific Heat of TBAB Semiclathrate Hydrate Crystals[J].Fluid Phase Equilibria,2005,234(1/2):131-135.
[7]Koyama Y,Tanaka H,Koga K.On the Thermodynamic Stability and Structural Transition of Clathrate Hydrates[J].Journal of Chemical Physics,2005,122(7):074503
[8]Wang W,Hu W R.Concentration Distribution in Crystallization from Solution Under Microgravity[J].Journal of Crystal Growth,1996,160(3/4):398-405.
高分辨率光学显微术在生命科学中的应用【摘要】 提高光学显微镜分辨率的研究主要集中在两个方面进行，一是利用经典方法提高各种条件下的空间分辨率，如用于厚样品研究的SPIM技术，用于快速测量的SHG技术以及用于活细胞研究的MPM技术等。二是将最新的非线性技术与高数值孔径测量技术（如STED和SSIM技术）相结合。生物科学研究离不开超高分辨率显微术的技术支撑，人们迫切需要更新显微术来适应时代发展的要求。近年来研究表明，光学显微镜的分辨率已经成功突破200nm横向分辨率和400nm轴向分辨率的衍射极限。高分辨率乃至超高分辨率光学显微术的发展不仅在于技术本身的进步，而且它将会极大促进生物样品的研究，为亚细胞级和分子水平的研究提供新的手段。【关键词】 光学显微镜；高分辨率；非线性技术；纳米水平在生物学发展的历程中显微镜技术的作用至关重要，尤其是早期显微术领域的某些重要发现，直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展。对固定样品和活体样品的生物结构和过程的观察，使得光学显微镜成为绝大多数生命科学研究的必备仪器。随着生命科学的研究由整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及鉴别精微细节的能力已经成为一个非常关键的技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。在400～760nm的可见光范围内，显微镜的分辨极限大约是光波的半个波长，约为200nm，而最新取得的研究成果所能达到的极限值为20～30nm。本文主要从高分辨率三维显微术和高分辨率表面显微术两个方面，综述高分辨率光学显微镜的各种技术原理以及近年来在突破光的衍射极限方面所取得的研究进展。1 传统光学显微镜的分辨率光学显微镜图像的大小主要取决于光线的波长和显微镜物镜的有限尺寸。类似点源的物体在像空间的亮度分布称为光学系统的点扩散函数(point spread function, PSF)。因为光学系统的特点和发射光的性质决定了光学显微镜不是真正意义上的线性移不变系统，所以PSF通常在垂直于光轴的x-y平面上呈径向对称分布，但沿z光轴方向具有明显的扩展。由Rayleigh判据可知，两点间能够分辨的最小间距大约等于PSF的宽度。根据Rayleigh判据，传统光学显微镜的分辨率极限由以下公式表示[1]：横向分辨率(x-y平面)：dx，y=■轴向分辨率(沿z光轴)：dz=■可见，光学显微镜分辨率的提高受到光波波长λ和显微镜的数值孔径N.A等因素的制约；PSF越窄，光学成像系统的分辨率就越高。为提高分辨率，可通过以下两个途径：（1）选择更短的波长；（2）为提高数值孔径, 用折射率很高的材料。Rayleigh判据是建立在传播波的假设上的，若能够探测非辐射场，就有可能突破Rayleigh判据关于衍射壁垒的限制。2 高分辨率三维显微术在提高光学显微镜分辨率的研究中，显微镜物镜的像差和色差校正具有非常重要的意义。从一般的透镜组合方式到利用光阑限制非近轴光线，从稳定消色差到复消色差再到超消色差，都明显提高了光学显微镜的成像质量。最近Kam等[2]和Booth等[3]应用自适应光学原理，在显微镜像差校正方面进行了相关研究。自适应光学系统由波前传感器、可变形透镜、计算机、控制硬件和特定的软件组成，用于连续测量显微镜系统的像差并进行自动校正。 一般可将现有的高分辨率三维显微术分为3类：共聚焦与去卷积显微术、干涉成像显微术和非线性显微术。2.1 共聚焦显微术与去卷积显微术 解决厚的生物样品显微成像较为成熟的方法是使用共聚焦显微术(confocal microscopy) [4]和三维去卷积显微术(three-dimensional deconvolution microscopy, 3-DDM) [5]，它们都能在无需制备样品物理切片的前提下，仅利用光学切片就获得样品的三维荧光显微图像。共聚焦显微术的主要特点是，通过应用探测针孔去除非共焦平面荧光目标产生的荧光来改善图像反差。共聚焦显微镜的PSF与常规显微镜的PSF呈平方关系，分辨率的改善约为■倍。为获得满意的图像，三维共聚焦技术常需使用高强度的激发光，从而导致染料漂白，对活生物样品产生光毒性。加之结构复杂、价格昂贵，从而使应用在一定程度上受到了限制。3-DDM采用软件方式处理整个光学切片序列，与共聚焦显微镜相比，该技术采用低强度激发光，减少了光漂白和光毒性，适合对活生物样品进行较长时间的研究。利用科学级冷却型CCD传感器同时探测焦平面与邻近离焦平面的光子，具有宽的动态范围和较长的可曝光时间，提高了光学效率和图像信噪比。3-DDM拓展了传统宽场荧光显微镜的应用领域受到生命科学领域的广泛关注[6]。2.2 选择性平面照明显微术 针对较大的活生物样品对光的吸收和散射特性，Huisken[7]等开发了选择性平面照明显微术(selective plane illumination microscopy，SPIM)。与通常需要将样品切割并固定在载玻片上的方式不同，SPIM能在一种近似自然的状态下观察2～3mm的较大活生物样品。SPIM通过柱面透镜和薄型光学窗口形成超薄层光，移动样品获得超薄层照明下切片图像，还可通过可旋转载物台对样品以不同的观察角度扫描成像，从而实现高质量的三维图像重建。因为使用超薄层光，SPIM降低了光线对活生物样品造成的损伤，使完整的样品可继续存活生长，这是目前其他光学显微术无法实现的。SPIM技术的出现为观察较大活样品的瞬间生物现象提供了合适的显微工具，对于发育生物学研究和观察细胞的三维结构具有特别意义。2.3 结构照明技术和干涉成像 当荧光显微镜以高数值孔径的物镜对较厚生物样品成像时，采用光学切片是一种获得高分辨3D数据的理想方法，包括共聚焦显微镜、3D去卷积显微镜和Nipkow 盘显微镜等。1997年由Neil等报道的基于结构照明的显微术，是一种利用常规荧光显微镜实现光学切片的新技术，并可获得与共聚焦显微镜一样的轴向分辨率。干涉成像技术在光学显微镜方面的应用1993年最早由Lanni等提出，随着I5M、HELM和4Pi显微镜技术的应用得到了进一步发展。与常规荧光显微镜所观察的荧光相比，干涉成像技术所记录的发射荧光携带了更高分辨率的信息。（1）结构照明技术：结合了特殊设计的硬件系统与软件系统，硬件包括内含栅格结构的滑板及其控制器，软件实现对硬件系统的控制和图像计算。为产生光学切片，利用CCD采集根据栅格线的不同位置所对应的原始投影图像，通过软件计算，获得不含非在焦平面杂散荧光的清晰图像，同时图像的反差和锐利度得到了明显改善。利用结构照明的光学切片技术，解决了2D和3D荧光成像中获得光学切片的非在焦平面杂散荧光的干扰、费时的重建以及长时间的计算等问题。结构照明技术的光学切片厚度可达0.01nm，轴向分辨率较常规荧光显微镜提高2倍，3D成像速度较共聚焦显微镜提高3倍。（2）4Pi 显微镜：基于干涉原理的4Pi显微镜是共聚焦/双光子显微镜技术的扩展。4Pi显微镜在标本的前、后方各设置1个具有公共焦点的物镜，通过3种方式获得高分辨率的成像：①样品由两个波前产生的干涉光照明；②探测器探测2个发射波前产生的干涉光；③照明和探测波前均为干涉光。4Pi显微镜利用激光作为共聚焦模式中的照明光源，可以给出小于100nm的空间横向分辨率，轴向分辨率比共聚焦荧光显微镜技术提高4~7倍。利用4Pi显微镜技术，能够实现活细胞的超高分辨率成像。Egner等[8，9]利用多束平行光束和1个双光子装置，观测活细胞体内的线粒体和高尔基体等细胞器的精微细节。Carl[10]首次应用4Pi显微镜对哺乳动物HEK293细胞的细胞膜上Kir2.1离子通道类别进行了测量。研究表明，4Pi显微镜可用于对细胞膜结构纳米级分辨率的形态学研究。（3）成像干涉显微镜(image interference microscopy, I2M)：使用2个高数值孔径的物镜以及光束分离器，收集相同焦平面上的荧光图像，并使它们在CCD平面上产生干涉。1996年Gustaffson等用这样的双物镜从两个侧面用非相干光源（如汞灯）照明样品，发明了I3M显微镜技术(incoherent, interference, illumination microscopy, I3M），并将它与I2M联合构成了I5M显微镜技术。测量过程中，通过逐层扫描共聚焦平面的样品获得一系列图像，再对数据适当去卷积，即可得到高分辨率的三维信息。I5M的分辨范围在100nm内。2.4 非线性高分辨率显微术 非线性现象可用于检测极少量的荧光甚至是无标记物的样品。虽有的技术还处在物理实验室阶段，但与现有的三维显微镜技术融合具有极大的发展空间。（1）多光子激发显微术：(multiphoton excitation microscope，MPEM)是一种结合了共聚焦显微镜与多光子激发荧光技术的显微术，不但能够产生样品的高分辨率三维图像，而且基本解决了光漂白和光毒性问题。在多光子激发过程中，吸收几率是非线性的[11]。荧光由同时吸收的两个甚至3个光子产生，荧光强度与激发光强度的平方成比例。对于聚焦光束产生的对角锥形激光分布，只有在标本的中心多光子激发才能进行，具有固有的三维成像能力。通过吸收有害的短波激发能量，明显地降低对周围细胞和组织的损害，这一特点使得MPEM成为厚生物样品成像的有力手段。MPEM轴向分辨率高于共聚焦显微镜和3D去卷积荧光显微镜。（2）受激发射损耗显微术：Westphal[12]最近实现了Hell等在1994年前提出的受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED）成像的有关概念。STED成像利用了荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系。STED技术通过2个脉冲激光以确保样品中发射荧光的体积非常小。第1个激光作为激发光激发荧光分子；第2个激光照明样品，其波长可使发光物质的分子被激发后立即返回到基态，焦点光斑上那些受STED光损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力，而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的光点。Hell等已获得了28nm的横向分辨率和33nm的轴向分辨率[12,13]，且完全分开相距62nm的2个同类的分子。近来将STED和4Pi显微镜互补性地结合，已获得最低为28nm的轴向分辨率,还首次证明了免疫荧光蛋白图像的轴向分辨率可以达到50nm[14]。（3）饱和结构照明显微术：Heintzmann等[15]提出了与STED概念相反的饱和结构照明显微镜的理论设想，最近由Gustafsson等[16]成功地进行了测试。当光强度增加时，这些体积会变得非常小，小于任何PSF的宽度。使用该技术，已经达到小于50nm的分辨率。（4）二次谐波 (second harmonic generation, SHG)成像利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源。SHG一般为非共振过程，光子在生物样品中只发生非线性散射不被吸收，故不会产生伴随的光化学过程，可减小对生物样品的损伤。SHG成像不需要进行染色,可避免使用染料带来的光毒性。因其对活生物样品无损测量或长时间动态观察显示出独特的应用价值，越来越受到生命科学研究领域的重视[17]。3 表面高分辨率显微术表面高分辨率显微术是指一些不能用于三维测量只适用于表面二维高分辨率测量的显微技术。主要包括近场扫描光学显微术、全内反射荧光显微术、表面等离子共振显微术等。3.1 近场扫描光学显微术 近场扫描学光显微术(near-field scanning optical microscope, NSOM)是一种具有亚波长分辨率的光学显微镜。由于光源与样品的间距接近到纳米水平，因此分辨率由光探针口径和探针与样品之间的间距决定，而与光源的波长无关。NSOM的横向分辨率小于100nm，Lewis[18]则通过控制在一定针尖振动频率上采样，获得了小于10nm的分辨率。NSOM具有非常高的图像信噪比，能够进行每秒100帧图像的快速测量[19]，NSOM已经在细胞膜上单个荧光团成像和波谱分析中获得应用。3.2 全内反射荧光显微术 绿色荧光蛋白及其衍生物被发现后，全内反射荧光(total internal reflection fluorescence，TIRF)技术获得了更多的重视和应用。TIRF采用特有的样品光学照明装置可提供高轴向分辨率。当样品附着在离棱镜很近的盖玻片上，伴随着全内反射现象的出现，避免了光对生物样品的直接照明。但因为波动效应，有小部分的能量仍然会穿过玻片与液体介质的界面而照明样品，这些光线的亮度足以在近玻片约100nm的薄层形成1个光的隐失区，并且激发这一浅层内的荧光分子[20]。激发的荧光由物镜获取从而得到接近100nm的高轴向分辨率。TIRF近来与干涉照明技术结合应用在分子马达步态的动力学研究领域, 分辨率达到8nm，时间分辨率达到100μs[21]。3.3 表面等离子共振 表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR) [22]是一种物理光学现象。当入射角以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将发生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光被耦合入表面等离子体内可引起电子发生共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面流过的液相的折射率而改变，折射率的改变又与结合在金属表面的生物分子质量成正比。表面折射率的细微变化可以通过测量涂层表面折射光线强度的改变而获得。1992年Fagerstan等用于生物特异相互作用分析以来，SPR技术在DNA-DNA生物特异相互作用分析检测、微生物细胞的监测、蛋白质折叠机制的研究，以及细菌毒素对糖脂受体亲和力和特异性的定量分析等方面已获得应用[23]。当SPR信息通过纳米级孔道[24]传递而提供一种卓越的光学性能时，将SPR技术与纳米结构设备相结合，该技术的深入研究将有可能发展出一种全新的成像原理显微镜。【参考文献】[1] 汤乐民,丁 斐.生物科学图像处理与分析[M].北京:科学出版社,2005：205.[2] Kam Z, Hanser B, Gustafsson MGL, et al.Computational adaptive optics for live three-dimensional biological imaging[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:3790-3795.[3] Booth MJ, Neil MAA, Juskaitis R, et al. Adaptive aberration correction in a confocal microscope[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2002, 99:5788-5792.[4] Goldman RD,Spector DL.Live cell imaging a laboratory manual[J].Gold Spring Harbor Laboratory Press,2005.[5] Monvel JB,Scarfone E,Calvez SL,et al.Image-adaptive deconvolution for three-dimensional deep biological imaging[J].Biophys,2003,85:3991-4001.[6] 李栋栋,郭学彬,瞿安连.以三维荧光反卷
高分辨率光学显微术在生命科学中的应用【摘要】 提高光学显微镜分辨率的研究主要集中在两个方面进行，一是利用经典方法提高各种条件下的空间分辨率，如用于厚样品研究的SPIM技术，用于快速测量的SHG技术以及用于活细胞研究的MPM技术等。二是将最新的非线性技术与高数值孔径测量技术（如STED和SSIM技术）相结合。生物科学研究离不开超高分辨率显微术的技术支撑，人们迫切需要更新显微术来适应时代发展的要求。近年来研究表明，光学显微镜的分辨率已经成功突破200nm横向分辨率和400nm轴向分辨率的衍射极限。高分辨率乃至超高分辨率光学显微术的发展不仅在于技术本身的进步，而且它将会极大促进生物样品的研究，为亚细胞级和分子水平的研究提供新的手段。【关键词】 光学显微镜；高分辨率；非线性技术；纳米水平在生物学发展的历程中显微镜技术的作用至关重要，尤其是早期显微术领域的某些重要发现，直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展。对固定样品和活体样品的生物结构和过程的观察，使得光学显微镜成为绝大多数生命科学研究的必备仪器。随着生命科学的研究由整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及鉴别精微细节的能力已经成为一个非常关键的技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。在400～760nm的可见光范围内，显微镜的分辨极限大约是光波的半个波长，约为200nm，而最新取得的研究成果所能达到的极限值为20～30nm。本文主要从高分辨率三维显微术和高分辨率表面显微术两个方面，综述高分辨率光学显微镜的各种技术原理以及近年来在突破光的衍射极限方面所取得的研究进展。1 传统光学显微镜的分辨率光学显微镜图像的大小主要取决于光线的波长和显微镜物镜的有限尺寸。类似点源的物体在像空间的亮度分布称为光学系统的点扩散函数(point spread function, PSF)。因为光学系统的特点和发射光的性质决定了光学显微镜不是真正意义上的线性移不变系统，所以PSF通常在垂直于光轴的x-y平面上呈径向对称分布，但沿z光轴方向具有明显的扩展。由Rayleigh判据可知，两点间能够分辨的最小间距大约等于PSF的宽度。根据Rayleigh判据，传统光学显微镜的分辨率极限由以下公式表示[1]：横向分辨率(x-y平面)：dx，y=■轴向分辨率(沿z光轴)：dz=■可见，光学显微镜分辨率的提高受到光波波长λ和显微镜的数值孔径N.A等因素的制约；PSF越窄，光学成像系统的分辨率就越高。为提高分辨率，可通过以下两个途径：（1）选择更短的波长；（2）为提高数值孔径, 用折射率很高的材料。Rayleigh判据是建立在传播波的假设上的，若能够探测非辐射场，就有可能突破Rayleigh判据关于衍射壁垒的限制。2 高分辨率三维显微术在提高光学显微镜分辨率的研究中，显微镜物镜的像差和色差校正具有非常重要的意义。从一般的透镜组合方式到利用光阑限制非近轴光线，从稳定消色差到复消色差再到超消色差，都明显提高了光学显微镜的成像质量。最近Kam等[2]和Booth等[3]应用自适应光学原理，在显微镜像差校正方面进行了相关研究。自适应光学系统由波前传感器、可变形透镜、计算机、控制硬件和特定的软件组成，用于连续测量显微镜系统的像差并进行自动校正。 一般可将现有的高分辨率三维显微术分为3类：共聚焦与去卷积显微术、干涉成像显微术和非线性显微术。2.1 共聚焦显微术与去卷积显微术 解决厚的生物样品显微成像较为成熟的方法是使用共聚焦显微术(confocal microscopy) [4]和三维去卷积显微术(three-dimensional deconvolution microscopy, 3-DDM) [5]，它们都能在无需制备样品物理切片的前提下，仅利用光学切片就获得样品的三维荧光显微图像。共聚焦显微术的主要特点是，通过应用探测针孔去除非共焦平面荧光目标产生的荧光来改善图像反差。共聚焦显微镜的PSF与常规显微镜的PSF呈平方关系，分辨率的改善约为■倍。为获得满意的图像，三维共聚焦技术常需使用高强度的激发光，从而导致染料漂白，对活生物样品产生光毒性。加之结构复杂、价格昂贵，从而使应用在一定程度上受到了限制。3-DDM采用软件方式处理整个光学切片序列，与共聚焦显微镜相比，该技术采用低强度激发光，减少了光漂白和光毒性，适合对活生物样品进行较长时间的研究。利用科学级冷却型CCD传感器同时探测焦平面与邻近离焦平面的光子，具有宽的动态范围和较长的可曝光时间，提高了光学效率和图像信噪比。3-DDM拓展了传统宽场荧光显微镜的应用领域受到生命科学领域的广泛关注[6]。2.2 选择性平面照明显微术 针对较大的活生物样品对光的吸收和散射特性，Huisken[7]等开发了选择性平面照明显微术(selective plane illumination microscopy，SPIM)。与通常需要将样品切割并固定在载玻片上的方式不同，SPIM能在一种近似自然的状态下观察2～3mm的较大活生物样品。SPIM通过柱面透镜和薄型光学窗口形成超薄层光，移动样品获得超薄层照明下切片图像，还可通过可旋转载物台对样品以不同的观察角度扫描成像，从而实现高质量的三维图像重建。因为使用超薄层光，SPIM降低了光线对活生物样品造成的损伤，使完整的样品可继续存活生长，这是目前其他光学显微术无法实现的。SPIM技术的出现为观察较大活样品的瞬间生物现象提供了合适的显微工具，对于发育生物学研究和观察细胞的三维结构具有特别意义。2.3 结构照明技术和干涉成像 当荧光显微镜以高数值孔径的物镜对较厚生物样品成像时，采用光学切片是一种获得高分辨3D数据的理想方法，包括共聚焦显微镜、3D去卷积显微镜和Nipkow 盘显微镜等。1997年由Neil等报道的基于结构照明的显微术，是一种利用常规荧光显微镜实现光学切片的新技术，并可获得与共聚焦显微镜一样的轴向分辨率。干涉成像技术在光学显微镜方面的应用1993年最早由Lanni等提出，随着I5M、HELM和4Pi显微镜技术的应用得到了进一步发展。与常规荧光显微镜所观察的荧光相比，干涉成像技术所记录的发射荧光携带了更高分辨率的信息。（1）结构照明技术：结合了特殊设计的硬件系统与软件系统，硬件包括内含栅格结构的滑板及其控制器，软件实现对硬件系统的控制和图像计算。为产生光学切片，利用CCD采集根据栅格线的不同位置所对应的原始投影图像，通过软件计算，获得不含非在焦平面杂散荧光的清晰图像，同时图像的反差和锐利度得到了明显改善。利用结构照明的光学切片技术，解决了2D和3D荧光成像中获得光学切片的非在焦平面杂散荧光的干扰、费时的重建以及长时间的计算等问题。结构照明技术的光学切片厚度可达0.01nm，轴向分辨率较常规荧光显微镜提高2倍，3D成像速度较共聚焦显微镜提高3倍。（2）4Pi 显微镜：基于干涉原理的4Pi显微镜是共聚焦/双光子显微镜技术的扩展。4Pi显微镜在标本的前、后方各设置1个具有公共焦点的物镜，通过3种方式获得高分辨率的成像：①样品由两个波前产生的干涉光照明；②探测器探测2个发射波前产生的干涉光；③照明和探测波前均为干涉光。4Pi显微镜利用激光作为共聚焦模式中的照明光源，可以给出小于100nm的空间横向分辨率，轴向分辨率比共聚焦荧光显微镜技术提高4~7倍。利用4Pi显微镜技术，能够实现活细胞的超高分辨率成像。Egner等[8，9]利用多束平行光束和1个双光子装置，观测活细胞体内的线粒体和高尔基体等细胞器的精微细节。Carl[10]首次应用4Pi显微镜对哺乳动物HEK293细胞的细胞膜上Kir2.1离子通道类别进行了测量。研究表明，4Pi显微镜可用于对细胞膜结构纳米级分辨率的形态学研究。（3）成像干涉显微镜(image interference microscopy, I2M)：使用2个高数值孔径的物镜以及光束分离器，收集相同焦平面上的荧光图像，并使它们在CCD平面上产生干涉。1996年Gustaffson等用这样的双物镜从两个侧面用非相干光源（如汞灯）照明样品，发明了I3M显微镜技术(incoherent, interference, illumination microscopy, I3M），并将它与I2M联合构成了I5M显微镜技术。测量过程中，通过逐层扫描共聚焦平面的样品获得一系列图像，再对数据适当去卷积，即可得到高分辨率的三维信息。I5M的分辨范围在100nm内。2.4 非线性高分辨率显微术 非线性现象可用于检测极少量的荧光甚至是无标记物的样品。虽有的技术还处在物理实验室阶段，但与现有的三维显微镜技术融合具有极大的发展空间。（1）多光子激发显微术：(multiphoton excitation microscope，MPEM)是一种结合了共聚焦显微镜与多光子激发荧光技术的显微术，不但能够产生样品的高分辨率三维图像，而且基本解决了光漂白和光毒性问题。在多光子激发过程中，吸收几率是非线性的[11]。荧光由同时吸收的两个甚至3个光子产生，荧光强度与激发光强度的平方成比例。对于聚焦光束产生的对角锥形激光分布，只有在标本的中心多光子激发才能进行，具有固有的三维成像能力。通过吸收有害的短波激发能量，明显地降低对周围细胞和组织的损害，这一特点使得MPEM成为厚生物样品成像的有力手段。MPEM轴向分辨率高于共聚焦显微镜和3D去卷积荧光显微镜。（2）受激发射损耗显微术：Westphal[12]最近实现了Hell等在1994年前提出的受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED）成像的有关概念。STED成像利用了荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系。STED技术通过2个脉冲激光以确保样品中发射荧光的体积非常小。第1个激光作为激发光激发荧光分子；第2个激光照明样品，其波长可使发光物质的分子被激发后立即返回到基态，焦点光斑上那些受STED光损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力，而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的光点。Hell等已获得了28nm的横向分辨率和33nm的轴向分辨率[12,13]，且完全分开相距62nm的2个同类的分子。近来将STED和4Pi显微镜互补性地结合，已获得最低为28nm的轴向分辨率,还首次证明了免疫荧光蛋白图像的轴向分辨率可以达到50nm[14]。（3）饱和结构照明显微术：Heintzmann等[15]提出了与STED概念相反的饱和结构照明显微镜的理论设想，最近由Gustafsson等[16]成功地进行了测试。当光强度增加时，这些体积会变得非常小，小于任何PSF的宽度。使用该技术，已经达到小于50nm的分辨率。（4）二次谐波 (second harmonic generation, SHG)成像利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源。SHG一般为非共振过程，光子在生物样品中只发生非线性散射不被吸收，故不会产生伴随的光化学过程，可减小对生物样品的损伤。SHG成像不需要进行染色,可避免使用染料带来的光毒性。因其对活生物样品无损测量或长时间动态观察显示出独特的应用价值，越来越受到生命科学研究领域的重视[17]。3 表面高分辨率显微术表面高分辨率显微术是指一些不能用于三维测量只适用于表面二维高分辨率测量的显微技术。主要包括近场扫描光学显微术、全内反射荧光显微术、表面等离子共振显微术等。3.1 近场扫描光学显微术 近场扫描学光显微术(near-field scanning optical microscope, NSOM)是一种具有亚波长分辨率的光学显微镜。由于光源与样品的间距接近到纳米水平，因此分辨率由光探针口径和探针与样品之间的间距决定，而与光源的波长无关。NSOM的横向分辨率小于100nm，Lewis[18]则通过控制在一定针尖振动频率上采样，获得了小于10nm的分辨率。NSOM具有非常高的图像信噪比，能够进行每秒100帧图像的快速测量[19]，NSOM已经在细胞膜上单个荧光团成像和波谱分析中获得应用。3.2 全内反射荧光显微术 绿色荧光蛋白及其衍生物被发现后，全内反射荧光(total internal reflection fluorescence，TIRF)技术获得了更多的重视和应用。TIRF采用特有的样品光学照明装置可提供高轴向分辨率。当样品附着在离棱镜很近的盖玻片上，伴随着全内反射现象的出现，避免了光对生物样品的直接照明。但因为波动效应，有小部分的能量仍然会穿过玻片与液体介质的界面而照明样品，这些光线的亮度足以在近玻片约100nm的薄层形成1个光的隐失区，并且激发这一浅层内的荧光分子[20]。激发的荧光由物镜获取从而得到接近100nm的高轴向分辨率。TIRF近来与干涉照明技术结合应用在分子马达步态的动力学研究领域, 分辨率达到8nm，时间分辨率达到100μs[21]。3.3 表面等离子共振 表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR) [22]是一种物理光学现象。当入射角以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将发生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光被耦合入表面等离子体内可引起电子发生共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面流过的液相的折射率而改变，折射率的改变又与结合在金属表面的生物分子质量成正比。表面折射率的细微变化可以通过测量涂层表面折射光线强度的改变而获得。1992年Fagerstan等用于生物特异相互作用分析以来，SPR技术在DNA-DNA生物特异相互作用分析检测、微生物细胞的监测、蛋白质折叠机制的研究，以及细菌毒素对糖脂受体亲和力和特异性的定量分析等方面已获得应用[23]。当SPR信息通过纳米级孔道[24]传递而提供一种卓越的光学性能时，将SPR技术与纳米结构设备相结合，该技术的深入研究将有可能发展出一种全新的成像原理显微镜。【参考文献】[1] 汤乐民,丁 斐.生物科学图像处理与分析[M].北京:科学出版社,2005：205.[2] Kam Z, Hanser B, Gustafsson MGL, et al.Computational adaptive optics for live three-dimensional biological imaging[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:3790-3795.[3] Booth MJ, Neil MAA, Juskaitis R, et al. Adaptive aberration correction in a confocal microscope[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2002, 99:5788-5792.[4] Goldman RD,Spector DL.Live cell imaging a laboratory manual[J].Gold Spring Harbor Laboratory Press,2005.[5] Monvel JB,Scarfone E,Calvez SL,et al.Image-adaptive deconvolution for three-dimensional deep biological imaging[J].Biophys,2003,85:3991-4001.[6] 李栋栋,郭学彬,瞿安连.以三维荧光反卷
电子显微镜技术发展综述摘要：本文论述了电子显微镜的发展现状及历史，介绍了目前较为先进的数种电子显微镜的结构、原理以及其在生物学领域的应用情况，并对其在组织学研究中的应用进行探讨。 关键词：电子显微镜；组织学研究 引言：显微技术是一门对于物质微小区域进行化学成分分析、显微形貌观察、微观结构测定的一门专门的显微分析技术。20世纪30年代，透射电子显微镜（TEM）的发明标志着电子显微技术的诞生，人们可以进一步地研究物质的超微结构。电子显微技术在普通光学显微技术基础上进一步拓宽了人们的观测视野，在各个领域发挥了重要的作用，被广泛应用于科学领域。在生物学研究领域，电子显微技术推进了组织学，细胞生物学，分子生物学等学科的发展，因而具有不可替代的崇高地位。 一、电子显微镜技术 1.1电子显微镜的定义与组成 电子显微镜，简称电镜，是根据电子光学原理，用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器[1]电子显微镜由镜筒、真空装置和电源柜三部分组成。镜筒主要有电子源、电子透镜、样品架、荧光屏和探测器等部件，这些部件通常是自上而下地装配成一个柱体。①电子透镜：用来聚焦电子，是电子显微镜镜筒中最重要的部件。一般使用的是磁透镜，有时也有使用静电透镜的。它用一个对称于镜筒轴线的空间电场或磁场使电子轨迹向轴线弯曲形成聚焦，其作用与光学显微镜中的光学透镜（凸透镜）使光束聚焦的作用是一样的，所以称为电子透镜。光学透镜的焦点是固定的，而电子透镜的焦点可以被调节，因此电子显微镜不象光学显微镜那样有可以移动的透镜系统。现代电子显微镜大多采用电磁透镜，由很稳定的直流励磁电流通过带极靴的线圈产生的强磁场使电子聚焦。②电子源：是一个释放自由电子的阴极，栅极，一个环状加速电子的阳极构成的。阴极和阳极之间的电压差必须非常高，一般在数千伏到3百万伏之间。它能发射并形成速度均匀的电子束，所以加速电压的稳定度要求不低于万分之一。③样品架：样品可以稳定地放在样品架上。此外往往还有可以用来改变样品（如移动、转动、加热、降温、拉长等）的装置。④探测器：用来收集电子的信号或次级信号。 1.2基本原理 不同类型的电子显微镜成像原理各有差异，但均是利用电磁场来偏转、聚焦电子束，再依据电子与物质作用的原理来研究物质的构造。其中透射式电子显微镜产生的电子束经聚光镜会聚后均匀照射到试样上的待观察区域，入射电子与试样物质相互作用，由于试样很薄，绝大部分电子穿透试样，其强度分布与所观察试样区的形貌、组织、结构一一对应。投射出试样的电子经三级磁透镜放大投射在观察图形的荧光屏上，荧光屏将电子强度分布转化为人眼可见的光强分布，于是在荧光屏上显出与试样形貌、组织、结构相应的图像。扫描电子显微镜（SEM）是聚焦电子束在线圈驱动下对试样表面逐点栅网式扫描成像，成像信号为二次电子、背散射电子或吸收电子。二次电子信号被探测器收集转换成电讯号，经处理后得到反应试样表面形貌的二次电子像。背散射电子成像反映样品的元素分布，及不同相成分区域的轮廓。此外由于电子的德布罗意波长较短，分辨率比光学显微镜高的很多，可以达到0.1～0.2nm，放大倍数从几万到百万倍。 1.3技术发展史 世界上第一台电子显微镜（透射式电子显微镜（TEM））由德国科学家Ruska和Knoll于1931年研制成功。二战后，Ruska继续对TEM进行研究改进，并制造出了放大倍数在10万倍以上的显微镜，并因此获得了诺贝尔物理学奖。在TEM的基础上，英国工程师Charles于1952年发明了世界上第一台扫描电子显微镜（SEM）。扫描电镜主要是针对具有高低差较大、粗糙不平的厚块试样进行观察，因而在设计上突出了景深效果，一般用来分析断口以及未经人工处理的自然表面；而透射电镜则突出的是高分辨率，使用透射电镜观察样品能获得高分辨率的超微结构图像，在材料科学和生物学上应用较多，同时也是病理学上的诊断工具，该技术的关键是超薄切片的制备。在这以后场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）、场离子显微镜（FIM）、低能电子衍射（LEED）、俄歇谱仪（AES）、光电子能谱（ESCA）等相继诞生，在各科学领域的研究中起重要作用。 1981年G．Binnig和H．Rohrer成功研制了世界上第一台扫描隧道显微镜（STM），并因此获得诺贝尔物理奖．它的出现，使人类第一次能够实时地观察单个原子在物质表面的排列状态和与表面电子行为有关的物理、化学性质，被国际科学界公认为80年代世界十大科技成就之一。扫描隧道显微镜(STM)是利用导体针尖与样品之间的隧道电流，并用精密压电晶体控制导体针尖沿样品表面扫描，从而能以原子尺度记录样品表面形貌的新型仪器．其分辨率已达到1nm～2nm，用它可研究各种金属、半导体和生物样品的表面形貌，也可研究表面沉积、表面原子扩散、表面粒子的成核和生长，吸附和脱附等。 在STM出现以后，又陆续发展了一系列工作原理相似的新型显微技术，包括原子力显微镜（AFM）、横向力显微镜（LFM）等，这类基于探针对被测样品进行扫描成像的显微镜统称为扫描探针显微镜（SPM）。扫描探针显微镜是纳米测量学、纳米表征与测量方法中最重要最基本的手段。它能以原子级的探针和被测样品表面作为工作的主要元件，在X和y两个方向上完成探针与样品之间的扫描，同时在Z方向的升降来模拟样品表面的起伏。用探针与样品间的相互作用所产生的物理量的数值随样品表面起伏的变化来达到观察样品表面形貌的目的。这种仪器分辨率高，横向分辨率可达0．1nm，纵向分辨率可达0．01nm，可以直接观察测定样品的三维图像，可以在大气、真空甚至液体中，在高温或低温下进行观测。检测时可以不与样品接触，故不会损伤样品，也不需要电子束照射，因而不会对样品造成辐射损伤。二、我国电子显微镜技术的发展 1958年，我国成功地研制了第一台电子显微镜，1988年中国科学院白春礼和 姚俊恩研制出了我国的第一台STM。[2] 2000年,中国电子显微镜学会统计中国大陆保有量不到2000台,中国加入WTO后,经济大发展,科研教育以及产业构都在升级目前，我国电子显微镜市场每年以近百套的数量在增长，可以预期，在未来数年内中国电子显微镜市场容量将居世界首位。 中国市场的电子显微镜，日本电子的市场占有率超过50%，排在首位。紧随其后的是FEI（原飞利浦电镜部）、日本日立（天美代理）、德国Carl Zeiss（原德国LEO）和日本岛津。而在国产厂家方面，主要是中科科仪、南京江南光电和上海电子光学技术研究所，产品主要集中在低端的扫描电子显微镜市场。就市场总体情况而言，国产电镜国内市场占有率不足10%。由此可见我国国产电子显微镜还有较大幅度的提升空间。从种类上看扫描电镜占目前中国电子显微镜总保有量的63.61%，透射电镜则为36.39%，可见扫描电镜在我国有着更为广泛的用户基础。[3] 三、电子显微镜技术的未来发展趋势 3.1远程电子显微镜技术 自上世纪九十年代以来，随着计算机技术和网络技术的发展，远程电子显微镜逐渐出现，它可以将实验室现场获得的实时信息展现给远端用户，使其可以通过互联网实时观看样品图像，并远程操作仪器来完成实验。[4] 远程电子显微镜技术的关键在于图像的采集、压缩和传输。在图像采集方面，现在的电子显微镜已经有了长足的进步。老式的电子显微镜多采用数码相机和视频采集卡来采集图像，新式电子显微镜多采用VGA采集卡进行图像采集并已成为未来发展趋势。此外运用软件来采集图像的新方式也逐渐出现。早期，图像的压缩使用的是JPEG图像压缩法，即远端用户所见的是一系列独立的静态样品图像。现在，随着技术的发展，MPEG4和H.264等视频压缩算法被逐渐运用到了样品图像的压缩。现在，样品图像的传输主要通过TCP协议和UDP协议，但其占用带宽过大，传输效果并不理想。为了改善传输性能，专门的数据传输系统“金字塔”式网络传输模型以及专有传输网络正在研究之中，同时这也是现阶段远程电子显微镜的改进方向。 1990年，Carl Zmola等人实现了对SEM的样品图像网络传输，首次建立了远程电镜的样品图像实时传输系统。随后，美国各大学相继建立了各自的SEM远程系统。样品传输的效能也有了长足进步，最初，在800Mb的光纤网络中，样品图像的传输效能是每17秒传送1帧。到了2000年，在1~2Mb的网络中，样品图像的传输可以达到每秒传送5帧。在技术上尚有很大程度的提升空间。 在中国，尽管各大院校及研究机构中有数千台电子显微镜，但仍不能满足日益增长的应用需求，因此远程电子显微镜技术的研究对于中国是很有应用价值的。 3.2低温电子显微镜技术 低温电子显微镜技术是应用冷冻(物理)方法制备生物样品并进行观察的技术，因而在生物学组织学中的应用较为广泛。与常规电镜技术(化学方法)相比较，其可最大程度地维持样品在生活时的生理状态，可运用于生物大分子的动态过程研究以及细胞核组织的三维结构分析。 3.3低温电镜下的三维重构技术 电子显微镜的三维成像技术是电子显微和计算机完美结合的产物，它利用电子显微镜收集样品的二维投影图像，经过计算机处理重构出样品的三维空间结构。三维成像技术在生物学领域的应用十分广泛，尤其体现在对蛋白质的三维结构分析上。早期的三维成像技术主要使用重金属盐溶液对样品进行染