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引言 我们展示了一个利用高质量的绝缘体上锗 (GeO) 晶片通过晶片键合技术制造的阿格 / 非晶硅混合光子集成电路平台的概念验证演示。通过等离子体化学气相沉积形成的非晶硅被认为是传统硅无源波导的一种有前途的替代物。利用锗有源层的高晶体质量和非晶硅波导的易制造性，在锗硅晶片上成功地实现了与非晶硅无源波导单片集成的低暗电流锗波导 PIN 光电探测器。 介绍 近几十年来，硅光子学领域取得了重大进展。其中，将阿格薄膜引入硅基平台被证明是一种成功的方法，它不仅能够实现新的器件功能，更重要的是，能够在单个芯片上实现各种先进系统。锗具有许多优于硅的光学特性。它在 1.3 微米至 1.55 微米的波长下表现出很强的光吸收，使其成为光纤通信中光电探测器 (PDs) 的理想选择。在锗中也观察到了大的电吸收效应，使其成为实现高效光强度调制器的有前途的材料。虽然锗是一种类似于硅的间接带隙半导体，但它在γ谷的直接带隙仅比间接带隙高 0.14 电子伏。借助新兴的能带结构工程技术，甚至有可能制造实用的锗基光源。因此，通过实现锗有源光子器件和硅无源器件，锗和硅之间的集成为实现具有成本效益的高度功能化光子集成电路 (PIC) 平台提供了有希望的手段，适用于广泛的应用。 为了使锗与硅结合，传统的方法包括在硅上外延生长锗。然而，锗和硅之间 4.2% 的大晶格失配通常导致生长的锗层以及锗 / 硅界面中的高密度位错缺陷，这可能充当不期望的产生 / 复合中心，降低锗晶体质量并因此降低器件性能 [1] 。尽管已经进行了许多尝试来提高外延锗层的质量，包括诸如两步生长、使用分级硅锗缓冲层、纵横比俘获和退火技术的方法，但是仍然难以消除外延生长期间产生的所有缺陷并获得足够高质量的阿格薄膜。 除了工艺复杂、成本高的先进外延生长方法外，晶圆键合技术对于高质量锗硅集成也很有前景。通过将阿格薄膜从阿格大块晶片转移到硅衬底上，可以避免由于晶格失配引起的晶体缺陷。此前，我们已经报道了通过结合晶圆键合和智能剥离技术技术成功制造出高质量的绝缘体上锗 (GeOI) 晶圆。 实验 非晶硅无源波导 无定形硅以其工艺简单和集成光学设计灵活而闻名 [22–24] 。为了检验其替代传统硅波导用于在锗硅衬底上互连的能力，在 2 微米厚的二氧化硅覆盖的硅衬底上制造非晶硅波导，这也用于锗硅晶片制造。 为了便于测量，在非晶硅波导的两端设计了一对聚焦光栅耦合器，采用了与传统 SOI 光栅耦合器相似的设计方法 [25] 。假设 a-Si 的折射率值为 3.7 ，应用 560 nm 的光栅间距、 0.5 的填充因子、 9 的入射角和 70 nm 的蚀刻深度作为具有 220 nm 的 a-Si 层厚度的光栅耦合器的设计参数，目的是在 1550 nm 的中心波长实现。此外，光栅耦合器和硅波导也制作在 SOI 晶片上，该晶片包含 220 纳米厚的硅顶层和 2 微米厚的二氧化硅盒作为比较。 图 2(a) 显示了与聚焦光栅耦合器集成在一起的人工非晶硅波导的显微镜平面图。为了表征 aSi 波导的传输特性，来自商用可调谐激光器的光输入通过单模光纤 (SMF) 耦合到输入光栅耦合器。然后，输出光再次从输出光栅耦合器耦合到另一个 SMF ，透射功率由铟镓砷光电探测器测量。图 2(b) 显示了与一对光栅耦合器耦合的 1 微米宽 0.9 毫米长的非晶硅波导的典型透射光谱。 图。 2. 与聚焦光栅耦合器集成的非晶硅波导的显微镜平面图。插图显示了非晶硅光栅耦合器的放大图。与一对光栅耦合器耦合的非晶硅波导的典型透射光谱。 高质量 GeO 晶片上的 Ge 脊形波导 PDs高质量的锗层对于获得高性能的锗钯非常重要。为了获得高质量的锗硅晶片，通过结合晶片键合和智能剥离技术技术，将来自阿格大块晶片的阿格薄膜转移到硅衬底上 2μm 厚的二氧化硅层上。对化学机械抛光后的锗晶片进行优化的热退火工艺，进行表面平面化，进一步提高锗晶体质量。参考文献 [20] 中给出了 GeOI 晶圆制造的细节。霍尔测量显示，在所制造的 GeO 晶片上的锗层中，具有超过 2000 cm2/Vs 的高空穴迁移率和大约 1 1016 cm3 的低载流子密度，这对于各种基于锗的功能器件是理想的。为了进一步研究锗的晶体质量，对锗衬底进行了透射电子显微镜观察。 图 4 显示了制造的 GeO 晶片的横截面 TEM 图像。插图显示了靠近锗和二氧化硅盒界面的锗层的放大图。 结论 我们已经使用晶片键合的GeOI衬底对阿格/非晶硅混合PIC平台进行了概念验证演示。利用锗层的高晶体质量和强光学限制，在锗衬底上实现了具有低暗电流和高响应度的阿格脊形波导。我们还研究了非晶硅波导替代传统硅波导在锗硅晶片上进行无源互连 的能力。与传统的硅波导相比，所制备的非晶硅条形波导表现出良好的传输特性，表明非晶硅在锗硅晶片上应用于集成光学具有很大的潜力。通过在阿格台面上引入倾斜侧壁结构，实现了锗 / 非晶硅在锗硅晶片上的共形沉积，并在此基础上成功实现了非晶硅波导集成锗钯。此外，所提出的集成方案也适用于键合在二氧化硅 / 硅晶片上的 ⅲ- ⅴ 族层，实现了更大的功能和更多的可能性。因此，未来可以为先进的集成光子学开发一个有前途的锗 / ⅲ - 钒 / 非晶硅光子学平台。
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在仓储管理论文写作过程中，引用参考文献来论证自己的观点或者理念是十分必要的。下面是我带来的关于仓储管理论文参考文献的内容，欢迎阅读参考!
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Race: Large-scale reading comprehension dataset from examinations 该数据集来自中国12-18岁之间的初中和高中英语考试阅读理解，包含28,000个短文、接近100,000个问题。包含用于评估学生理解能力的多种多样的主题。该数据集中的问题中需要推理的比例比其他数据集更高，也就是说，精度更高、难度更大。 阅读理解任务中，该数据集的天花板是：95%，论文发表时，模型最好效果：43%，目前最好效果已达到90.9%（近两年进展神速） 1.词匹配 2.释义 3.单句推理 4.多句推理 5.不恰当的/有歧义的：问题无答案或者基于给定的短文，答案不唯一 各推理类型所占比例：（随机选择100个短文共500个问题，找人标注） 1.内容推理 2.全文理解 3.文章总结 4.态度分析 5.外部知识（world knowledge） 论文在RACE和其他数据集中进行了阅读理解任务的实验，可以看到，各个模型在RACE上的效果通常低于其他数据集，说明了该数据集的难度更大，更有挑战。 上图是部分模型在不同推理类型的问题上的效果 带有不同推理类型标签的数据好像没有开放 其他信息也可参考：
这就是：中文 随着植物抗病基因工程的发展,越来越多的抗病基因被人们所发现。2004年,Taler等从印度野生瓜的霜霉病抗性品种中克隆得到两个具有丝氨酸乙醛酸转氨酶(serineglyoxylate aminotransferase,SGT)活性的甜瓜霜霉病抗性基因At1和At2。Taler等发现At1和At2具有丝氨酸乙醛酸转氨酶活性与植物光呼吸途径相关,不属于任何一类已知R基因,对病原菌的抵抗没有种属专化性,并且它们的抗病作用与H_2O_2相关,基于此种现象,他们提出一种新的抗病机制“酶抗病性”,这是首次报道的通过改变酶的表达量而赋予植物抗病性。据推测At1和At2还可能对霜霉病以外的其它多种植物叶部病害具有抗性作用,是很有研究价值的抗病基因,并且,“酶抗病性”作用机制的提出还需要更多的基因证据和试验支持。据此本论文从光呼吸作用非常强的大豆中克隆At1和At2的同源基因GmSGT,对其进行序列分析、酶活性中心预测、原核表达分析,并将其转入受体植物中进行抗病性鉴定。现将本论文的主要研究结果及创新点总结如下: 1.利用大豆EST序列和5'-Race技术,首次从大豆霜霉病抗性品种中克隆了编码丝氨酸乙醛酸转氨酶的GmGGT1基因序列(已获得国家发明专利1项,专利号:ZL2005100887 83.4),同时从受SA诱导的大豆霜霉病感病品种黑农10号中克隆得到了两条GmSGT1的同源基因GmSGT2,GmSGT3。序列分析表明,GmSGT1与Taler等报道的甜瓜霜霉病抗病基因At1、At2氨基酸序列同源性达88.03%和87.78%;同时,GmSGT1与拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)、水稻(Oryzae sativa L.)、贝母(Fritillariaagrestis)、紫萍(Spirodela polyrrhiza)的丝氨酸乙醛酸转氨酶同源性达83.33%-85.79%。GmSGT1推导蛋白序列分析显示它具有一个5磷酸吡哆醛结合位点GSQKAL和一个强的过氧化物体定位信号SRI,表明该基因可能在植物的过氧化物体中通过光呼吸途径起作用。GmSGT2和GmSGT3与GmSGT1核苷酸序列同源性高达96.38%和99.17%,推导的氨基酸序列同源性为97.03%和99.25%。利用生物信息学方法对GmSGT1,GmSGT2,GmSGT3蛋白的酶学活性中心进行了分析,结果显示三个蛋白序列均具有丝氨酸乙醛酸转氨酶活性。 2.首次通过存大肠杆菌中模拟植物光呼吸途径的技术,证实了GmSGT1具有丝氨酸乙醛酸转氨酶活性。光呼吸途径中发生的反应:乙醇酸(?)H_2O_2+乙醛酸;乙醛酸(?)甘氦酸。因大肠杆菌中含有乙醇酸氧化酶(GOX),所以向原核表达菌株中加入乙醇酸,可完成上述反应,通过检测H_2O_2量的变化,可确定GmSGT1基因的丝氨酸乙醛酸转氨酶功能。本研究结果显示,只有表达GmSGT1蛋白的组分能诱导大量H_2O_2产生,对照组分无,因此,可以确定GmSGT1具有丝氨酸乙醛酸转氨酶活性。 3.分析了GmSGT蛋白与大豆不同品种的抗性相关性。Western杂交结果显示,抗霜霉病品种早丰5号和九农9号中可检测到有目的蛋白的表达,而感病品种黑农10号中无表达。SA诱导前、后半定量RT-PCR结果表明,感病品种黑农10号在SA诱导前未检测到表达,而SA诱导后有微量表达,大豆对霜酶病的抗病性也有大幅度提高。因此,我们推断,GmSGH的表达确实和SA诱导途径相关,并且随着GmSGT1表达水平的提高,大豆对霜霉病的抗病性也明显提高。 4.构建了GmSGT1植物表达载体,进行烟草转化,获得了转基因植株,并对其进行烟草赤星病,黑胫病,青枯病的抗性鉴定,结果表明转基因烟草显著提高了烟草对赤星病,黑胫病,青枯病的抗性。本研究为Taler等提出的植物“酶抗性基因”提供了新的实验证据。 5.利用抗病品种早丰5号探索了GmSGT1基因在大豆中的时空表达特性,该基因在大豆叶片中有表达,而根,茎中无表达,并且随着生育期的增强而表达增强,生殖生长期最强,然后随着细胞的老化而表达减弱,直至消失。这表明GmSGT1的变化趋势与植物光呼吸的变化趋势相符。同时检测了光呼吸途径中在丝氨酸乙醛酸转氨酶上游起作用的乙醇酸氧化酶(GOX)的表达特性,结果表明GOX的表达水平与GmSGT1表达水平的变化具有一致性,说明GmSGT1表达水平提高的同时,它的上游反应也增强,H_2O_2表达也提高。这与我们推测的GmSGT蛋白在植物光呼吸途径中起作用的结论相符。 6.研究确定了大豆遗传转化体系。建立了大豆早丰5号,黑农10号的胚芽尖组培体系,并利用农杆菌LBA4404介导法将构件好的植物表达载体pIM1.1-GmSGT-plus转化早丰5号,RNAi植物表达载体pIM1.1-GmSGT-plusF转化黑农10号,获得了再生植株。同时,对早丰5号的胚芽尖,子叶节,胚轴三种外植体在再生频率,再生时间,K筛选浓度,农杆菌不同侵染时间对重生芽再生频率的影响进行了研究,为早丰5号组培,转化体系的进一步优化提供了实验依据。英文With the development of plant disease resistance genes, more and more resistance genes are found in people. In 2004, Taler and other wild melon from India, downy mildew resistant varieties have cloned two serine glyoxylate aminotransferase (serineglyoxylate aminotransferase, SGT) activity Melon downy mildew resistance genes At1 and At2. Taler At1 and At2 is found with serine glyoxylate aminotransferase activity and plant photorespiration pathway, does not belong to any class of known R genes, resistance to the pathogen resistance without special species, and their role in disease resistance associated with H_2O_2 Based on this phenomenon, they proposed a new resistance mechanism "enzyme resistance", this is the first reported expression of the enzyme by changing the plant disease resistance conferred.It is speculated that At1 and At2 may also downy mildew than many other leaf diseases of plants resistant to the effect that the great research value of the resistance genes, and the "resistance enzyme" mechanism of the proposed need for more many genes to support evidence and testing. Pursuant to which the paper is very strong from the soybean photorespiration clone At1 and At2 in the homologous gene GmSGT, its sequence analysis, enzyme active site predicted prokaryotic expression analysis, and transferred to the receptor for disease resistance in plants identification.Now the paper's major findings and innovation are summarized as follows: 1. Using soybean EST sequences, and 5'-Race technology for the first time from downy mildew resistant varieties of soybean clone encoding serine glyoxylate aminotransferase gene sequences GmGGT1 (has received a national invention patent, patent number: ZL2005100887 83.4),Induced by SA from both downy mildew susceptible varieties of soybean, 10 black farmers have been two GmSGT1 cloned the homologous gene GmSGT2, GmSGT3. Sequence analysis revealed that, GmSGT1 and Taler other melon downy mildew resistance genes reported At1, At2 amino acid sequence homology of up to 88.03% and 87.78%; the same time, GmSGT1 and Arabidopsis (Arabidopsis thaliana L.), rice (Oryzae sativa L.), Fritillaria (Fritillariaagrestis), Spirodela (Spirodela polyrrhiza) serine glyoxylate aminotransferase homology 83.33% -85.79%.GmSGT1 deduced protein sequence analysis revealed that it has a 5-pyridoxal phosphate binding sites GSQKAL and a strong peroxisome targeting signal SRI, showed that the gene may be in the plant peroxisome photorespiration way to work through. GmSGT2 and GmSGT3 and GmSGT1 nucleotide sequence homology as high as 96.38% and 99.17%, the deduced amino acid sequence homology was 97.03% and 99.25%. By bioinformatics method GmSGT1, GmSGT2, GmSGT3 protein enzyme active sites were analyzed, the results show that the three protein sequences all have serine glyoxylate aminotransferase activity.2. For the first time through the simulation of plant survival in E. coli pathway of light breathing techniques, confirmed the GmSGT1 with serine glyoxylate aminotransferase activity. Photorespiratory pathway reaction occurs: glycolic acid (?) H_2O_2 + glyoxylic acid; glyoxylate (?) Gan helium acid. Because E. coli contains glycolic acid oxidase (GOX), so the original strain by adding acid expression, to be completed by the above-mentioned reaction, by detecting changes in the amount H_2O_2 can determine GmSGT1 serine glyoxylate aminotransferase gene function. The results showed that only the expression of GmSGT1 protein component can induce a large number of H_2O_2 production, control components not, therefore, can determine GmSGT1 glyoxylate aminotransferase activity with serine.3. Analysis of the GmSGT protein soybean varieties with resistance to relevance. Western blotting results showed that downy mildew resistant cultivars EARLY 5 and 9 farmers could be detected in 9 purposeful expression, while black farmers on the 10th susceptible and no expression. SA induction before and after the semi-quantitative RT-PCR results showed that the susceptible black farmers on the 10th in SA was not detected before the induction of expression, while SA induced the expression of a trace of soybean on the cream of the resistance enzymes have greatly improved . Therefore, we conclude, GmSGH SA induced the expression of true and relevant way, and with the expression level of GmSGT1 increased soybean downy mildew resistance was also improved significantly.4. Constructed GmSGT1 plant expression vector for tobacco transformation, we obtained the transgenic plants, and gain tobacco brown spot, black shank, bacterial wilt resistance identification, the results showed that the transgenic tobacco significantly increased the tobacco brown spot, black shank, bacterial wilt resistance. Taler, etc. This study proposed plant "enzyme resistance genes," provides a new experimental evidence. 5. Use of resistant varieties as early as 5 to explore the GmSGT1 Feng gene expression in the temporal and spatial characteristics of soybean, the gene expression in soybean leaves in, but the roots, stems and no expression, and increased with the growth period while the expression, most reproductive stage, and then with the decreased expression of cell aging, until the disappearance.This shows that the trend of plant GmSGT1 Photorespiration trend line. Simultaneous detection of the photorespiratory pathway of serine glyoxylate aminotransferase in the upper reaches of the role of glycolate oxidase (GOX) of the expression characteristics, the results show that the expression level of GOX GmSGT1 consistent changes in expression levels, indicating enhanced expression GmSGT1 At the same time, it also increased the upstream response, H_2O_2 expression also increased. We speculate that the GmSGT This plant photorespiratory pathway proteins play a role in the conclusion.6. Study identified the genetic transformation system. HSBC was established as early as 5, soybean, black farmers on the 10th of the embryonic tip tissue culture system, using Agrobacterium tumefaciens LBA4404 mediated plant expression vector will be a good member pIM1.1-GmSGT-plus conversion EARLY 5, RNAi plant expression vector pIM1.1-GmSGT-plusF transformed black farmers on the 10th, won the regeneration. Meanwhile, HSBC on the 5th of the embryo as early as sharp, cotyledonary node, hypocotyl explants of three in the regeneration frequency, regeneration time, K screening concentration, Agrobacterium infection time on the regeneration of different frequencies of shoot regeneration was studied for EARLY 5 tissue culture, transformation system provides an experimental basis for further optimization.
这也行？？？早知道当初我也百度提问了。费了我一周时间自己翻译5000字段英文文献。
生活教育论文参考文献 参考文献： [1]Tracey，T.J.&Sedlacck，W.E. (1984).Noncognitivevariables in predicting academic Success by race.Measurementand Evaluation in Guidance，16：171—178. [2]唐振宗，生活教育[M]，上海：上海联合发行所，1949. [3]王世友，课堂教学生活化[EB/OL].http：//blog.cer-sp.com/18892/791077/. [4]赵祥麟，杜威教育论著选[M]，王承绪，译，上海：华东师范大学出版社，1981：180. [5]邹桂芳，我国体育生活化构建策略探析[J]，成都体育学院学报，2009，(4)：26—28. [6]吴福元，等，大学生智力因素与非智力因素与学习成绩关系的研究[J]，教育研究，1987，(5)：17—18. [7]马加乐，等，关于中学生非智力因素量化的.探究[J]，与实践，1990，(6)：20—22.请继续阅读相关推荐： 毕业论文 应届生求职 毕业论文范文查看下载 查看的论文开题报告 查阅参考论文提纲 查阅更多的毕业论文致谢 相关毕业论文格式 查阅更多论文答辩 ;
微生物技术在城市生活垃圾处理中的应用 摘要：本文结合堆肥化、卫生填埋两种现行的城市生活垃圾处理工艺，主要介绍了城市生活垃圾生物处理过程中的微生物种群，以及通过分析开发出的新的微生物技术，指出了应用于城市生活垃圾处理的高效的微生物技术的研究方向。 关键词：城市生活垃圾 微生物 强化微生物处理技术 基因工程 ; 随着城市化进程在全球范围的加速，城市化带来的污染和人类聚居状况恶化等问题，已成为世界各国共同关心的问题。城市生活垃圾（Municipal solid waste, 简称MSW）是在城市日常生活及为城市生活提供服务的活动中产生的固体废弃物，是城市环境的主要污染物之一。目前，城市生活垃圾处理处置的方法主要包括卫生填埋（Sanitary landfill）、堆肥化(Composting)、焚烧(Incineration)三种，其中前两种处理方式均属于生物处理技术。具体来说，MSW生物处理技术就是城市生活垃圾中固有的或外添加的微生物，在一定控制条件下，进行一系列的生物化学反应，使得MSW中的不稳定的有机物代谢后释放能量或转化为新的细胞物质，从而MSW逐步达稳定化的一个生化过程。 1. 城市生活垃圾生物处理中主要的微生物。。。
分子生物技术在微生物降解环境 污染物中的应用 [摘要〕介绍了与环境微生物关键降解酶基因的筛选、克隆及应用相关的分r生物技术，包括聚合酶链式反应技 术、基因重组技术、荧光原位杂交技术和生物信息学等技术，并对这些技术在污染物降解基因检测、筛选和克隆方 面的应用进行了阐述与探讨、 [关键词]分子生物技术;微生物;基因;环境污染物;降解 随着现代j:\地技术的发展，多环芳烃、含氯有 机物和硝基苯类化合物等人工合成井难以降解的 污染物大量排放，造成世界范围内的环境污染和生 态破坏，严重地威胁人类和其他生物的正常生存和 发展。利用微生物修复技术对受污染的水体及土 壤进行处理，凸显了其重要的意义和可行性。研究 人员发现并筛选到一些微生物，它们不仅对环境有 较高的适应性、对污染物有较高的耐受性，而且对 污染物有较强的降解效率和专一性。然而环境中 存在的大量微生物中仅有少于1%可通过传统的培 养方法进行培养、分离和纯化，绝大多数细菌需要 非常严格的营养条件川。因此，为了对修复环境有 所贡献却难以培养的微生物进行更全面了解，也为 了筛选到更多有利于降解环境污染物的微生物菌 种及其关键酶基因，分子生物技术和手段逐渐被广 泛应用到环境可降解污染物及降解机理方面的研 究中。 本文对近年来发展起来的聚合酶链式反应 (PCR)技术、基因重组技术、荧光原位杂交(FISH) 技术和生物信息学等多种分子生物技术进行了介 绍，并总结了它们在污染物降解基因检测、筛选和 克隆方面的应用。 1与环境污染物降解相关的分子生 物技术 1.1PCR及其相关技术 PCR是一种利用脱氧核糖核酸(DNA)半保留 复制原理，在体外扩增位于两段已知序列之间的 DNA区段从而得到大量拷贝的分子生物技术。根 据其模板、引物来源或扩增条件的不同，PcR技术 可分为以下几种:(l)反转录pCR(RT一PeR)技 术，将mRNA反转录为cDNA后再对其进行PCR 扩增，可用来构建cDNA文库，分析不同生长时期 的mRNA表达状况和相关性以及mRNA的定量测 定等;(2)巢式PCR技术，在扩增大片段目的DNA 时，先用非特意性引物扩增再用特意性引物对第一 次扩增产物进行第二次扩增，以获得可供分析的 DNA;(3)竞争PCR技术，是一种定量PCR，向PCR 反应体系中加人人工构建的带有突变的竞争模板， 通过控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度， 对目的模板作定量研究;(4)实时荧光定量PCR技 术，在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信 号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线 对未知模板进行定量分析，该法已广泛用于基因表 达研究、转基因研究等方面;(5)扩增的rDNA限制 酶切分析技术，根据原核生物rDNA序列的保守性， 将扩增的rDNA片段进行酶切，通过酶切图谱来分 析菌间的多样性;(6)RNA随机引导PCR技术，基 于任意寡核昔酸引物与RNA之间可能的配对，在 低严谨度条件下经聚合酶催化使链延伸，将细胞总 RNA或InRNA作为反转录反应的模板，此技术结 合单链构象多态性，用非变性胶分辨大小相同而构 象不同的片段，可用于诊断遗传突变及分析污染条 件下序列的多态性;(7)随机扩增多态DNA (RAPD)技术，是一种基于PCR检测PCR引物结合 位点序列改变的方法，通常以10bp的寡核昔酸序 列为引物，对基因组DNA随机扩增，电泳分离染色 扩‘增产物，再分析多态性。 1.2FISH技术 FISH技术利用荧光标记的探针在细胞内与特 异的互补核酸序列杂交，通过激发杂交探针的荧光 来检测信号。荧光探针比放射性探针更安全，具有 较好的分辨力，不需要额外的检测步骤。近年来， 由于FISH技术具有灵敏、便捷等优点，迅速发展完 善成为研究环境微生物的有力工具。此外，可用不 同激发和散射波长的荧光染料标记探针，在一步反 应中同时检测几个靶序列。该技术主要包括试样 固定、预处理、预杂交、探针和试样变性、杂交、漂洗 去除未结合的探针、检测杂交信号等步骤。由于 165rRNA具有遗传稳定性，因此成为FISH技术检 测最常用的靶序列。 1.3基因重组技术 基因重组技术是从供体生物的基因组中通过 酶切扩增等手段获取目的基因，与载体连接形成重 组DNA分子，再导入到受体细胞中，让外源基因得 以表达。在已经分离出的许多菌株中，与降解能力 有关的基因多在质粒体上。由于质粒很容易在细 菌的繁殖过程中遗失，对细菌降解能力的长期稳定 非常不利，可将其与污染物降解有关的酶基因重组 到大肠杆菌等微生物中进行表达，以此构建的各种 生物降解特性增强的重组菌可用于污染环境的治 理修复或发酵某些废弃物。 1.4生物信息学 20世纪后期，生物学的迅猛发展，从数量上和 质量上极大地丰富了基因组数据库、蛋白质数据 库、酶数据库和文献数据库等许多生物科学的数据 资源。已有多个国家和国际科研组织建立了生物 信息数据库，如欧洲分子生物学实验室(Eur叩ean MolecularBiologyLaboratory)核酸序列数据库和美 国国家生物技术情报中心(Nationaleente:fo:Bio- technologyInformation，NCBI)基因序列数据库等。 科学家利用计算机及生物信息分析软件分析这些 数据资源，确定大分子序列、结构、表达模式和生化 途径与生物数据之间的关系，区分生物个体间遗传 差异，揭示DNA多样性。例如，基本局部比对搜索 工具(BasieLoealAlignmentSearehTool，BLAST)， 是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似 性比较的分析工具。它基于Altschul等的方法「2〕， 在序列数据库中对查询序列进行同源性比对工作。 BLAST程序可对一条或多条、任何数量、任何形式的 序列在一个或多个核酸或蛋白序列库中进行比对，甚 至将有缺口的比对序列也考虑在内，利用比较结果中 的得分对序列进行相似性说明。基因的序列分析可 揭示出生物物种之间的关系，在污染治理研究中可用 于生物基因组特殊区域或特异基因的测序。 2分子生物技术在环境污染物降解 中的应用 2.1土壤试样总DNA的提取 用适当方法直接从土壤中提取DNA并纯化， 是从分子生物学角度对土壤微生物进行研究的前 提条件，而后可进行酶切、PCR扩增、核酸分子杂交 等分子生物学技术操作。从土壤中提取微生物 DNA主要分为汽接法和间接法}’{。直接法是在 ogram等的方法基础卜发展起来的，其主要包括2 个步骤:(l)原位细胞裂解;(2)DNA提取和纯化。 直接法提取的DNA超过细菌总DNA的60%且省 力，但提取的DNA常常有折断、腐殖酸污染、甚至 提取物中还夹杂有未知的胞外DNA和真核生物的 DNA。最先报道间接法的是Faegri等[‘〕，其主要包 括4个步骤:(l)分散土壤;(2)分离细胞与土壤; (3)细胞裂解;(4)DNA纯化。间接法提取DNA 产量低且费力，但纯度较高、DNA损伤小，提取的 大片段DNA可用来构建cos而d和细菌人工染色体 文库等。 2.2采用PCR及相关技术扩增分析DNA片段 可降解污染物的微生物必然能产生分解代谢 该污染物的酶。selvaratnam等L’l用编码苯酚单加 氧酶dmpN摹因的RT一PCR技术来检测序列间歇 式活性污泥反应器‘{一，降解酚的假单胞菌。检测结 果表明，RT一PCR技术不仅能检测微生物降解酚的 能力，还能测量dmpN基因的转录水平，从而确定假 单胞菌特殊的分解活性，发现了在转录水平下，酚 浓度与通气时间之问存在正相关关系。 将PCR技术和变性梯度凝胶电泳(DGGE)结 合起来，在变性条件适当的情况下能分辨一个碱基 对，分辨率较高。染色后的凝胶用成像系统进行分 析，可在一定程度l几反应试样的复杂性。条带的多 少能反应试样「 一 }1微生物组成的差异，条带的亮度能 反应试样中微生物的多少。基于以上优点，日前该 技术在微生物群落结构的分析和动态研究方面得 到了厂‘泛应用。DGGE可通过分析PCR扩增的基 因点突变来探索微生物的复杂性。徐玉泉等[“〕从 某废水中分离出一株能以苯酚为惟一碳源的菌株 PHEA一2，使用PCR一DGGE技术对该菌165 rDNA进行分析，发现该菌与醋酸钙不动杆菌同源。 M盯sh等r了)利用PcR一DGGE技术获得了活性污泥 中真核微生物的种群变化情况。王峰等下8〕采用 PCR一DGGE技术对城市污水化学生物絮凝处理中 活性污泥和生物膜微生物种群结构进行了分析，结 果表明活性污泥培养前后微生物种群结构发生r 很大改变。 RAPD技术也是一种应用比较广泛的以多态性 引物来扩增某些片段的技术。RAPD技术可用于检 测含有混合微生物种群的各种微生物反应器中微 生物的多样性。用RAPD技术分析检测实验室规 模的油脂淤泥培养料中的细菌菌群发现，用油脂淤 泥改良过的培养料比未改良的更适于不同的微生 物种群生长[9j。vainio等t’。〕从516种孤立的菌落 中提取出165rDNA，经PCR扩增后进行测序，检测 活性污泥中微生物种群的结构。这些组合技术的 应用显著增强r对微生物的检测和鉴定能力，为理 论研究工艺优化及提高生物处理效率提供了条件。 2.3基因重组 基因工程技术应用于环境保护起始于20世纪 80年代。其基本原理是通过基因分离和重组技术， 将目的基因片段，比如可编码降解某种污染物的 酶，转移到受体生物细胞中并表达，使受体生物具 有该目的基因表达显现的特殊性状，从而达到治理 污染的目的。找到特定污染的抗性基因，利用基因 重组技术转基因后也可获得其他抗性植株以及筛 选到可转化污染物的植物，还可开发超量积累植物 进行污染土壤的生物修复。 罗如新等L”〕用放射性同位素标记tfdc基因片 段作探针，Southemblot杂交定位Ll菌株的邻苯二 酚1，2一双加氧酶基因位于Pstl的I片段和BamH I的M、N片段，回收并将其直接克隆至表达载体 pKT230卜，获得的重组子能转化不具开环酶活性 的甲胺磷降解菌P2，得到高于天然宿主21倍的邻 苯二酚1，2一双加氧酶。stingley等{”〕通过构建基 因文库和重组质粒等基因工程方法证实了NidAB 双加氧酶是降解菲的关键酶类，并首次鉴定出此基 因通过磷苯二甲酸实现降解功能。chae等‘”}发现 不能降解苯酚的su如lobusso扣taricu、98/2菌株中 的儿茶酚2，3一双加氧酶基因与能降解苯酚的 sulfolo右u，，o如taricu、咫有[6J源区，分析得知它们 是山共同祖先进化而来。把儿茶酚2，3一双加氧酶 基因克隆到大肠杆菌中表达，可获得有较高降解活 性的双加氧酶。 重金属污染是环境污染的重要方面之一。随 着分子生物学技术的发展，越来越多的修复性蛋白 基因正被从植物、微生物和动物中陆续分离出来， 如汞离子还原酶基因、有机汞裂解酶基因、汞转运 蛋自基因、金属硫蛋白基因、植物络合素合成酶基 因、铁离子还原酶基因和锌转运蛋白基因L’‘〕。这些 基因通过基因工程的改造，重组到合适的受休细胞 中表达相应的蛋白质和酶，达到治理难以降解的有 毒有害污染物的目的。sorsa等〔”〕把MTS插人 LamB序列的153位点，在E.eoli中表达MTs，解决 r细胞内MTs对金属离子有限的吸附能力。综L 所述，基因重组技术具有快速、高效的特性，已逐渐 成为环境生物技术的研究热点。 2.4FISH技术 FISH技术利用核糖体内长度适中(约1500bp)、 高度保守的165:RNA序列作为理想的基因分类靶 序列，其中使用的165:RNA寡核普酸探针一般是 进行了荧光标记的20bp左右特异性核昔酸片段， 利用该报告分子(如生物素、地高辛)与荧光素标记 的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测系 统对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 FISH技术能提供处理过程中微生物的数量、空间分 布和原位生理学等信息。 硝化细菌是一类生理上非常特殊的化能自氧 菌，传统的研究方法要经过富集、分离、分类和鉴定 步骤，耗时长。HSH技术的引人解决了上述困难。 FlsH技术还被广泛用于活性污泥系统、硝化流化床 反应器和膜生物反应器等废水处理系统}’61。 基因工程微生物越来越多地被用于农业害虫 控制和环境污染的生物修复，对人类健康和环境的 影响引起广泛关注。1994年出现了一种新的标记 系统:绿色荧光蛋白(GFP)，由于GFP基因表达产 物对细胞没有毒害作用，且由GFP产生的荧光标记 检测卜分方便、简单。在某些被污染的环境中可分 离出降解该污染物的细菌，通过基因重组等手段使 用GFP分子标记，可更容易的分离检测被标记的 细胞叫。 Bastes等[’8]进行了苯酚降解菌染色体GFP基 因标记实验。通过PCR和Southemblot分析，证明 GFP基因已成功整合到宿主细胞的染色体中。对 标记菌与野生型的降解能力比较结果证明，GFP分 子标记的插人并不影响细胞的苯酚降解能力。 用G即标记Pseudomonasputida，研究活性淤 泥中细菌存活情况{’9飞。Pseudomonasputida被转到 活性淤泥2min后，观察到细胞在淤泥絮凝物间自 由游动;培养3d后，发现荧光细胞减少，大部分已 被合并到淤泥絮凝物中，以防止细菌被原生动物捕 食。用oFP标记石.eozi和Serraliamarceseern，考 察菌株附到絮凝物卜的过程{’()j。使用表面荧光显 微镜能将带有GFP标记的细胞从活性污泥中区分 开，井进行观察和记数。而聚焦激光扫描显微镜 (cLsM)可使GFP标记细菌产生三维轮廓，结合表 面荧光显微镜和CLSM观察GFP标记细胞，结果表 明，细胞表面疏水性在细菌附到絮凝物的过程中起 重要作用，两种细菌附在絮凝物上的模式有很大不 同，通过这种方法可更好地理解细菌赫附机理，有 助于提高废水处理效果。 3结语 分子生物技术的应用使研究人员可从微观的 角度更细致深人地了解微生物对污染物降解的具 体生理生化机制，在分子水平 _ _ [揭示生物体吸收、 迁移、积累有害物质最终被毒害，及适应、抗性等生 态问题，从而筛选到更多有利用价值的微生物。随 着越来越多微生物全部基因序列的解码，对各种细 菌体内可降解基因的分布和表达会有更深人的了 解，有关技术的发展和成熟必将对污染物的降解过 程有一个整体的、生态水平上的认识。 参考文献 l李凤，刘世贵 . 分子生物学技术在环境微生物研究中的 应用 . 世界科技研究与发展，2003，25(4):88一92 2AltsehulSF，GishW，MillerW，etal.Basieloealalign- mentsearehtool . 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