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细胞工程论文
细胞工程是生物工程的一个重要方面。总的来说，它是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。下面是我为大家整理的细胞工程论文，欢迎阅读。
【摘要】 目的制作去细胞肌肉组织工程支架，并检测其与人羊膜上皮细胞的生物相容性。方法 采用TNT和十二烷基磺酸钠结合的化学萃取方法制作去细胞肌肉组织工程支架，冰冻切片观察其结构。将人羊膜上皮细胞种入支架培养7 d后，用免疫组化检测羊膜上皮细胞的增殖活性、NT3及BDNF的表达,扫描电子显微镜观察其超微结构。结果 支架中细胞去除完全，其主要结构为平行排列的管状结构。细胞外基质的主要成分弹性纤维和胶原纤维保持完好。羊膜上皮细胞在支架里有增殖活性，并呈现NT3、BDNF免疫反应阳性。扫描电镜显示，羊膜上皮细胞在支架中分布均匀，生长良好。结论 成功的制作了去细胞肌肉组织工程支架，其与人羊膜上皮细胞有良好的相容性。
【关键词】 去细胞肌肉;人羊膜上皮细胞;生物相容性
近年来组织工程研究的重要进展之一就是采用自体或异体移植物制作天然生物降解材料的组织工程支架。其中去细胞移植物与机体有良好的生物相容性。去细胞肌肉支架可作为生物工程支架支持神经细胞轴突再生。Mligiliche等〔1〕把去细胞肌肉移植入大鼠坐骨神经缺损处,4 w后发现有大量神经轴突长入去细胞肌肉支架中。由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限，去细胞肌肉支架要发挥更大的作用往往需要向支架中植入种子细胞〔2，3〕。研究表明羊膜上皮细胞可分泌多种神经因子〔4，5〕，促进神经元轴突的生长，是一种良好的治疗神经系统疾病的种子细胞。本研究利用化学去细胞的方法制成去细胞肌肉支架，并把羊膜上皮细胞种入去细胞肌肉支架内，探究两者的相容性，为开展组织工程治疗神经系统方面的疾病提供新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 Wistar 大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。
1.1.2 试剂 IMDM培养基及小牛血清由Hyclone 公司提供。5′溴尿嘧啶核苷(BrdU) 及BrdU 单克隆抗体购自Neomarker公司;神经营养素(NT)3,脑源性神经营养因子(BDNF)兔抗人多克隆抗体购自武汉博士德公司，SABC免疫组化试剂盒购自福州迈新生物公司。人羊膜上皮细胞株为本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 去细胞肌肉支架的制备 参考 Brown等〔6〕去细胞膀胱的制作方法制备去细胞肌肉支架，简述如下：取Wistar大鼠腹锯肌，放入蒸馏水中，在摇床中以37℃、50 r/min摇48 h后,转入3%的TritonX100溶液,摇床中37℃、50 r/min摇48 h。然后放入蒸馏水中，摇床37℃、50 r/min摇48 h。换成1% SDS溶液，摇床37℃，50 r/min摇48 h。PBS洗24 h。PBS中4℃保存备用。
1.2.2 支架形态结构的观察及成分鉴定 肉眼观察去细胞肌肉的形态。去细胞肌肉用4%多聚甲醛PBS固定1 h，5%蔗糖90 min，15%蔗糖90 min，30%蔗糖过夜以梯度脱水，OCT包埋，冷丙酮速冻，之后放入-70℃冰箱保存。恒冷箱切片机切片，HE 染色，观察其内部结构。此外对切片进行Van Gienson(VG)染色和 Weigert染色(VG+ET染色)检测支架的细胞外基质成分。
1.2.3 人羊膜上皮细胞的培养 人羊膜上皮细胞在DMEM培养液中(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 mg/ml链霉素，200 μg/ml的谷氨酰胺)，37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，待单层培养细胞生长至80%汇合后，传代培养。
1.2.4 人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架相容性的鉴定
1.2.4.1 取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合，弃去培养液，0.25%胰蛋白酶消化，当胞体回缩，细胞间隙变宽时，用血清终止消化，反复轻吹瓶壁细胞，制成单细胞悬液于离心管中，1 000 r/min，离心3 min。用DMEM重悬细胞。用1 ml注射器吸入细胞悬液，以2×106/ml 密度注入去细胞肌肉支架中分装至24孔板中，在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，培养1 w。掺入Brdu(终浓度为10 mg/L)，继续培养1 d后，恒冷箱切片机切片(方法同前)。切片经PBS 洗后，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶10 min，血清封闭20 min;一抗用BrdU(1∶1 000稀释)单克隆抗体，BDNF和NT3多克隆抗体(1∶100稀释)4℃孵育过夜，PBS 洗后，二抗37℃孵育30 min，PBS 洗后，SABC37℃孵育30 min，DAB显色。光镜下观察。
1.2.4.2 扫描电子显微镜鉴定羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架上的生长情况 取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合时，用上述方法消化下来后，把羊膜上皮细胞种植到去细胞肌肉支架中，放在24孔板中，在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养7 d后，用2%戊二醛固定后，梯度乙醇脱水，CO2临界点干燥，镀膜，采用扫描电子显微镜观察并拍照。
2 结 果
2.1 支架的组织结构与成分 去细胞肌肉外观呈乳白色,半透明,质地柔软。从大体上看，肌肉去细胞前后整体大小与形状无显著变化。支架纵切面的HE染色观察可见骨骼肌细胞成分消失,而纤维网架结构保持完整，支架内主要为平行管道。VG+ET染色证明支架成分主要为胶原纤维和弹力纤维等细胞外基质成分，胶原纤维为红色波浪状结构，弹性纤维为蓝色丝状结构，见图1。
2.2 羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架的兼容性 见图2，HE染色显示人羊膜上皮细胞在支架中生长良好，分布均匀(图
图1 去细胞肌肉支架大体与组织切片染色
图2 去细胞肌肉支架的病理图片2A)。免疫组化染色显示，BrdU阳性细胞数目多，提示支架中的人羊膜上皮细胞有增殖能力(图2B)。抗NT3和BDNF染色显示，支架中的人羊膜上皮细胞含有NT3、BDNF阳性颗粒，呈棕褐色分布在细胞质中(图2C，2D)。JSM5600LV扫描电子显微镜显示，在支架内部分布有大量细胞，细胞在支架中分布比较均匀，生长状态良好(图2E)。
3 讨 论
理想的支架材料应与细胞外基质类似，与活体细胞有良好的生物相容性〔7，8〕。去细胞肌肉作为治疗神经损伤的生物工程支架材料有如下优势：(1)去细胞肌肉的细胞外基质成分对组织细胞的'迁移、黏附、生长代谢都有重要作用，研究表明再生的轴突可以很好的黏附在去细胞肌肉支架上〔9〕。(2)去细胞肌肉的排列结构与神经膜管类似,仅在直径上略大于神经膜管〔10〕，它们提供了轴突可生长穿过的足够空间〔9〕，该结构对于诱导神经轴突再生是十分重要的。 Fansa等比较了接种施万细胞的不同去细胞生物材料(肌肉，静脉，神经外膜)桥接缺损的外周神经的结果，发现缺乏神经膜管样结构的去细胞肌肉支架(静脉和神经外膜支架)中的再生轴突是无序和排列混乱的，而有神经膜管样结构的去细胞肌肉支架中的再生轴突是有序排列的〔11〕。这种轴突再生的有序性对神经损伤的轴突再生同样也是十分重要的。(3)去细胞肌肉引起的免疫排斥反应较小〔9，12〕。这些优势都说明去细胞肌肉可作为治疗神经损伤的理想的材料。本研究采用的制作去细胞肌肉的方法主要用来减少异种移植材料的免疫排斥反应。该方法能有效的去除脂膜和膜相关抗原以及可溶性蛋白，并能有效的保留细胞外基质成分的原始空间结构。肌细胞正常呈平行分布，其细胞外基质成分也是平行分布的，从支架纵切面的结果看支架的纤维成分也是平行排布的，VG+ET染色结果显示细胞外基质的主要成分胶原纤维和弹性纤维保持完好。这些结果进一步证实此方法可成功制备去细胞肌肉支架。
由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限〔13〕，去细胞肌肉的生物相容性也有待验证。本研究用人羊膜上皮细胞作为种子细胞种入去细胞肌肉支架以探讨其相容性。研究表明，羊膜上皮细胞中含有多种生物活性因子，包括黏蛋白、转移生长因子、前列腺素E、表皮生长因子样物质,IL1，IL8 等因子，另外，还可分泌BDNF和NT3等重要的神经营养因子〔4〕。其中层黏蛋白、BDNF和NT3等生物活性因子对神经损伤的治疗具有十分重要的作用。羊膜上皮细胞可作为一种较理想的种子细胞，与去细胞肌肉支架结合可能成为治疗神经系统疾病的一个理想的组织工程材料。本实验观察到人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中分布均匀，抗BrdU、BDNF及NT3免疫组化显示去细胞肌肉支架中羊膜上皮细胞有良好的增殖能力，并能表达BDNF和NT3，说明羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中保持了良好的生物学活性。以上结果一方面证明了本研究制作的去细胞肌肉支架有良好的生物相容性，另一方面为应用羊膜上皮细胞和去细胞肌肉支架结合治疗神经系统疾病提供了理论和实验基础。
总之 ，本研究成功制备了去细胞肌肉支架，并证实人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中能分泌重要的神经营养因子，人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体为神经缺损再生提供了基底膜、神经营养因子等种种有利因素，构成了良好的神经再生微环境，有利于使神经缺损得到较好地修复，为进一步研究羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体治疗神经损伤奠定了一定的实验基础。
【参考文献】
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11 Fansa H，Keilhoff G.Comparison of different biogenic matrices seeded with cultured Schwann cells for bridging peripheral nerve defects〔J〕. Neurol Res,2004;26(2):16773.
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字数可能有点超,你自己截取吧~~ 分子生物学(molecular biology) 在分子水平上研究生命现象的科学。研究生物大分子(核酸、蛋白质)的结 构、功能和生物合成等方面来阐明各种生命现象的本质。研究内容包括各种生命过程如光合作用、发育的分子机制、神经活动的机理、癌的发生等。 从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学。自20世纪50年代以来，分子生物学是生物学的前沿与生长点，其主要研究领域包括蛋白质体系、蛋白质-核酸体系 (中心是分子遗传学)和蛋白质-脂质体系（即生物膜）。 生物大分子，特别是蛋白质和核酸结构功能的研究，是分子生物学的基础。现代化学和物理学理论、技术和方法的应用推动了生物大分子结构功能的研究，从而出现了近30年来分子生物学的蓬勃发展。分子生物学和生物化学及生物物理学关系十分密切，它们之间的主要区别在于：①生物化学和生物物理学是用化学的和物理学的方法研究在分子水平，细胞水平，整体水平乃至群体水平等不同层次上的生物学问题。而分子生物学则着重在分子（包括多分子体系）水平上研究生命活动的普遍规律；②在分子水平上，分子生物学着重研究的是大分子，主要是蛋白质，核酸，脂质体系以及部分多糖及其复合体系。而一些小分子物质在生物体内的转化则属生物化学的范围；③分子生物学研究的主要目的是在分子水平上阐明整个生物界所共同具有的基本特征，即生命现象的本质；而研究某一特定生物体或某一种生物体内的某一特定器官的物理、化学现象或变化，则属于生物物理学或生物化学的范畴。 发展简史 结构分析和遗传物质的研究在分子生物学的发展中作出了重要的贡献。结构分析的中心内容是通过阐明生物分子的三维结构来解释细胞的生理功能。1912年英国 W.H.布喇格和W.L.布喇格建立了X射线晶体学，成功地测定了一些相当复杂的分子以及蛋白质的结构。以后布喇格的学生W.T.阿斯特伯里和J.D.贝尔纳又分别对毛发、肌肉等纤维蛋白以及胃蛋白酶、烟草花叶病毒等进行了初步的结构分析。他们的工作为后来生物大分子结晶学的形成和发展奠定了基础。50年代是分子生物学作为一门独立的分支学科脱颖而出并迅速发展的年代。首先是在蛋白质结构分析方面，1951年L.C.波林等提出了 α-螺旋结构，描述了蛋白质分子中肽链的一种构象。1955年F.桑格完成了胰岛素的氨基酸序列的测定。接着 J.C.肯德鲁和M.F.佩鲁茨在X射线分析中应用重原子同晶置换技术和计算机技术分别于1957和1959年阐明了鲸肌红蛋白和马血红蛋白的立体结构。1965年中国科学家合成了有生物活性的胰岛素，首先实现了蛋白质的人工合成。 另一方面，M.德尔布吕克小组从1938年起选择噬菌体为对象开始探索基因之谜。噬菌体感染寄主后半小时内就复制出几百个同样的子代噬菌体颗粒，因此是研究生物体自我复制的理想材料。1940年G.W.比德尔和E.L.塔特姆提出了“一个基因，一个酶”的假设，即基因的功能在于决定酶的结构，且一个基因仅决定一个酶的结构。但在当时基因的本质并不清楚。1944年O.T.埃弗里等研究细菌中的转化现象，证明了DNA是遗传物质。1953年J.D.沃森和F.H.C.克里克提出了DNA的双螺旋结构，开创了分子生物学的新纪元。在此基础上提出的中心法则，描述了遗传信息从基因到蛋白质结构的流动。遗传密码的阐明则揭示了生物体内遗传信息的贮存方式。1961年F.雅各布和J.莫诺提出了操纵子的概念，解释了原核基因表达的调控。到20世纪60年代中期，关于DNA自我复制和转录生成RNA的一般性质已基本清楚，基因的奥秘也随之而开始解开了。 仅仅30年左右的时间，分子生物学经历了从大胆的科学假说，到经过大量的实验研究，从而建立了本学科的理论基础。进入70年代，由于重组DNA研究的突破，基因工程已经在实际应用中开花结果，根据人的意愿改造蛋白质结构的蛋白质工程也已经成为现实。 基本内容 蛋白质体系 蛋白质的结构单位是α-氨基酸。常见的氨基酸共20种。它们以不同的顺序排列可以为生命世界提供天文数字的各种各样的蛋白质。 蛋白质分子结构的组织形式可分为 4个主要的层次。一级结构，也叫化学结构，是分子中氨基酸的排列顺序。首尾相连的氨基酸通过氨基与羧基的缩合形成链状结构，称为肽链。肽链主链原子的局部空间排列为二级结构。二级结构在空间的各种盘绕和卷曲为三级结构。有些蛋白质分子是由相同的或不同的亚单位组装成的，亚单位间的相互关系叫四级结构。 蛋白质的特殊性质和生理功能与其分子的特定结构有着密切的关系，这是形形色色的蛋白质所以能表现出丰富多彩的生命活动的分子基础。研究蛋白质的结构与功能的关系是分子生物学研究的一个重要内容。 随着结构分析技术的发展，现在已有几千个蛋白质的化学结构和几百个蛋白质的立体结构得到了阐明。70年代末以来，采用测定互补DNA顺序反推蛋白质化学结构的方法，不仅提高了分析效率，而且使一些氨基酸序列分析条件不易得到满足的蛋白质化学结构分析得以实现。 发现和鉴定具有新功能的蛋白质，仍是蛋白质研究的内容。例如与基因调控和高级神经活动有关的蛋白质的研究现在很受重视。 蛋白质－核酸体系 生物体的遗传特征主要由核酸决定。绝大多数生物的基因都由 DNA构成。简单的病毒，如λ噬菌体的基因组是由 46000个核苷酸按一定顺序组成的一条双股DNA（由于是双股DNA，通常以碱基对计算其长度）。细菌，如大肠杆菌的基因组，含4×106碱基对。人体细胞染色体上所含DNA为3×109碱基对。 遗传信息要在子代的生命活动中表现出来，需要通过复制、转录和转译。复制是以亲代 DNA为模板合成子代 DNA分子。转录是根据DNA的核苷酸序列决定一类RNA分子中的核苷酸序列；后者又进一步决定蛋白质分子中氨基酸的序列，就是转译。因为这一类RNA起着信息传递作用，故称信使核糖核酸(mRNA)。由于构成RNA的核苷酸是4种，而蛋白质中却有20种氨基酸，它们的对应关系是由mRNA分子中以一定顺序相连的 3个核苷酸来决定一种氨基酸，这就是三联体遗传密码。 基因在表达其性状的过程中贯串着核酸与核酸、核酸与蛋白质的相互作用。DNA复制时，双股螺旋在解旋酶的作用下被拆开，然后DNA聚合酶以亲代DNA链为模板，复制出子代 DNA链。转录是在 RNA聚合酶的催化下完成的。转译的场所核糖核蛋白体是核酸和蛋白质的复合体，根据mRNA的编码，在酶的催化下，把氨基酸连接成完整的肽链。基因表达的调节控制也是通过生物大分子的相互作用而实现的。如大肠杆菌乳糖操纵子上的操纵基因通过与阻遏蛋白的相互作用控制基因的开关。真核细胞染色质所含的非组蛋白在转录的调控中具有特殊作用。正常情况下，真核细胞中仅2～15％基因被表达。这种选择性的转录与转译是细胞分化的基础。 蛋白质－脂质体系 生物体内普遍存在的膜结构，统称为生物膜。它包括细胞外周膜和细胞内具有各种特定功能的细胞器膜。从化学组成看，生物膜是由脂质和蛋白质通过非共价键构成的体系。很多膜还含少量糖类，以糖蛋白或糖脂形式存在。 1972年提出的流动镶嵌模型概括了生物膜的基本特征：其基本骨架是脂双层结构。膜蛋白分为表在蛋白质和嵌入蛋白质。膜脂和膜蛋白均处于不停的运动状态。 生物膜在结构与功能上都具有两侧不对称性。以物质传送为例，某些物质能以很高速度通过膜，另一些则不能。象海带能从海水中把碘浓缩 3万倍。生物膜的选择性通透使细胞内pH和离子组成相对稳定，保持了产生神经、肌肉兴奋所必需的离子梯度，保证了细胞浓缩营养物和排除废物的功能。 生物体的能量转换主要在膜上进行。生物体取得能量的方式，或是像植物那样利用太阳能在叶绿体膜上进行光合磷酸化反应；或是像动物那样利用食物在线粒体膜上进行氧化磷酸化反应。这二者能量来源虽不同，但基本过程非常相似，最后都合成腺苷三磷酸。对于这两种能量转换的机制，P.米切尔提出的化学渗透学说得到了越来越多的证据。生物体利用食物氧化所释放能量的效率可达70％左右，而从煤或石油的燃烧获取能量的效率通常为20～40％，所以生物力能学的研究很受重视。对生物膜能量转换的深入了解和模拟将会对人类更有效地利用能量作出贡献。 生物膜的另一重要功能是细胞间或细胞膜内外的信息传递。在细胞表面，广泛地存在着一类称为受体的蛋白质。激素和药物的作用都需通过与受体分子的特异性结合而实现。癌变细胞表面受体物质的分布有明显变化。细胞膜的表面性质还对细胞分裂繁殖有重要的调节作用。 对细胞表面性质的研究带动了糖类的研究。糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂等生物大分子结构与功能的研究越来越受到重视。从发展趋势看，寡糖与蛋白质或脂质形成的体系将成为分子生物学研究的一个新的重要的领域。 理论意义和应用 分子生物学的成就说明：生命活动的根本规律在形形色色的生物体中都是统一的。例如，不论在何种生物体中，都由同样的氨基酸和核苷酸分别组成其蛋白质和核酸。遗传物质，除某些病毒外，都是DNA，并且在所有的细胞中都以同样的生化机制进行复制。分子遗传学的中心法则和遗传密码，除个别例外，在绝大多数情况下也都是通用的。 物理学的成就证明，一切物质的原子都由为数不多的基本粒子根据相同的规律所组成，说明了物质世界结构上的高度一致，揭示了物质世界的本质，从而带动了整个物理学科的发展。分子生物学则在分子水平上揭示了生命世界的基本结构和生命活动的根本规律的高度一致，揭示了生命现象的本质。和过去基本粒子的研究带动物理学的发展一样，分子生物学的概念和观点也已经渗入到基础和应用生物学的每一个分支领域，带动了整个生物学的发展，使之提高到一个崭新的水平。 过去生物进化的研究，主要依靠对不同种属间形态和解剖方面的比较来决定亲缘关系。随着蛋白质和核酸结构测定方法的进展，比较不同种属的蛋白质或核酸的化学结构，即可根据差异的程度，来断定它们的亲缘关系。由此得出的系统进化树，与用经典方法得到的是基本符合的。采用分子生物学的方法研究分类与进化有特别的优越性。首先，构成生物体的基本生物大分子的结构反映了生命活动中更为本质的方面。其次，根据结构上的差异程度可以对亲缘关系给出一个定量的，因而也是更准确的概念。第三，对于形态结构非常简单的微生物的进化，则只有用这种方法才能得到可靠结果。 高等动物的高级神经活动是极其复杂的生命现象，过去多是在细胞乃至整体水平上研究，近年来深入到分子水平研究的结果充分说明高级神经活动也同样是以生物大分子的活动为基础的。例如，在高等动物学习与记忆的过程中，大脑中RNA和蛋白质的组成发生明显的变化，并且一些影响生物体合成蛋白质的药物也显著地影响学习与记忆的能力。又如，“生物钟”是一种熟知的生物现象。用鸡进行的实验发现，有一种重要的神经传递介质（5-羟色胺）和一种激素（褪黑激素）以及控制它们变化的一种酶，在鸡脑中的含量呈24小时的周期性变化。正是这种变化构成了鸡的“生物钟”的物质基础。 在应用方面，生物膜能量转换原理的阐明，将有助于解决全球性的能源问题。了解酶的催化原理就能更有针对性地进行酶的人工模拟，设计出化学工业上广泛使用的新催化剂，从而给化学工业带来一场革命。 分子生物学在生物工程技术中也起了巨大的作用，1973年重组DNA技术的成功，为基因工程的发展铺平了道路。80年代以来，已经采用基因工程技术，把高等动物的一些基因引入单细胞生物，用发酵方法生产干扰素、多种多肽激素和疫苗等。基因工程的进一步发展将为定向培育动、植物和微生物良种以及有效地控制和治疗一些人类遗传性疾病提供根本性的解决途径。 从基因调控的角度研究细胞癌变也已经取得不少进展。分子生物学将为人类最终征服癌症做出重要的贡献。 [编辑本段]分子生物学的应用 1，亲子鉴定 近几年来，人类基因组研究的进展日新月异，而分子生物学技术也不断完善，随着基因组研究向各学科的不断渗透，这些学科的进展达到了前所未有的高度。在法医学上，STR位点和单核苷酸（SNP）位点检测分别是第二代、第三代DNA分析技术的核心，是继RFLPs（限制性片段长度多态性）VNTRs（可变数量串联重复序列多态性）研究而发展起来的检测技术。作为最前沿的刑事生物技术，DNA分析为法医物证检验提供了科学、可靠和快捷的手段，使物证鉴定从个体排除过渡到了可以作同一认定的水平，DNA检验能直接认定犯罪、为凶杀案、强奸杀人案、碎尸案、强奸致孕案等重大疑难案件的侦破提供准确可靠的依据。随着DNA技术的发展和应用，DNA标志系统的检测将成为破案的重要手段和途径。此方法作为亲子鉴定已经是非常成熟的，也是国际上公认的最好的一种方法。参考资料：蛋白质质谱分析研究进展 摘 要： 随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要综述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点、方法及蛋白质质谱分析的原理、方式和应用，并对其发展前景作出展望。 关键词： 蛋白质，质谱分析，应用 前言： 蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上， 作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。 自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一[1]。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位[2]。 1．质谱分析的特点 质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。 2．质谱分析的方法 近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：1)电喷雾电离质谱；2)基质辅助激光解吸电离质谱；3)快原子轰击质谱；4)离子喷雾电离质谱；5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广泛[3]。 3．蛋白质的质谱分析 蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。 3.1蛋白质的质谱分析原理 以往质谱(MS)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。 3.2蛋白质和肽的序列分析 现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的N末端氨基酸苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又称PTH法)，测序速度较慢(50个氨基酸残基/天)；样品用量较大(nmol级或几十pmol级)；对样品纯度要求很高；对于修饰氨基酸残基往往会错误识别，而对N末端保护的肽链则无法测序[4]。C末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列分析比蛋白容易许多，许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离质谱(electrospray ionisation，ESI)及基质辅助激光解吸质谱(matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善，极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da，目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI TOF MS)已成为测定生物大分子尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具，也是当今生命科学领域中重大课题——蛋白质组研究所必不可缺的关键技术之一 [5] 。目前在欧洲分子生物实验室(EMBL)及美国、瑞士等国的一些高校已建立了MALDI TOF MS蛋白质一级结构(序列)谱库，能为解析FAST谱图提供极大的帮助，并为确证分析结果提供可靠的依据[6]。 蛋白质质谱分析研究进展 来自: 免费论文网 3.3蛋白质的质谱分析方式 质谱用于肽和蛋白质的序列测定主要可以分为三种方法：一种方法叫蛋白图谱(proteinmapping)，即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽分子量，将所得到的肽谱数据输入数据库，搜索与之相对应的已知蛋白，从而获取待测蛋白序列。将蛋白质绘制“肽图”是一重要测列方法。第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基，其中亚稳离子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用诱导碎裂.第三种方法与Edman法有相似之处，即用化学探针或酶解使蛋白或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽，名为梯状测序(laddersequencing)，经质谱检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸残基。 3.3.1蛋白消化 蛋白的基团越大，质谱检测的准确率越低。因此，在质谱检测之前，须将蛋白消化成小分子的多肽，以提高质谱检测的准确率。一般而言，6-20个氨基酸的多肽最适合质谱仪的检测。现今最常用的酶为胰蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的赖氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)处将其切断。因此，同一蛋白经胰蛋白酶消化后，会产生相同的多肽。 3.3.2基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法(MALDI-TOF MS) [7] 简而言之，基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量仪是将多肽成分转换成离子信号，并依据质量/电荷之比(mass/charge，m/z)来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学基质(matrix)混合，此样品混合物随即滴于一平板或载玻片上进行挥发，样品混合物残余水份和溶剂的挥发使样品整合于格状晶体中，样品然后置于激光离子发生器(lasersource)。激光作用于样品混合物，使化学基质吸收光子而被激活。此激活产生的能量作用于多肽，使之由固态样品混合物变成气态。由于多肽分子倾向于吸收单一光子，故多肽离子带单一电荷.这些形成的多肽离子直接进入飞行时间质量分析仪(TOFmassanalyzer)。飞行时间质量分析仪用于测量多肽离子由分析仪的一端飞抵另一端探测器所需要的时间。而此飞行时间同多肽离子的质量/电荷的比值成反比，即质量/电荷之比越高，飞行时间越短。最后，由电脑软件将探测器录得的多肽质量/电荷比值同数据库中不同蛋白经蛋白酶消化后所形成的特定多肽的质量/电荷比值进行比较，以鉴定该多肽源自何种蛋白.此法称为多肽质量指纹分析(peptidemassfin-gerprinting)。基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法操作简便，敏感度高，同许多蛋白分离方法相匹配，而且，现有数据库中有充足的关于多肽质量/电荷比值的数据，因此成为许多实验室的首选蛋白质谱鉴定方法。 3.3.3电子喷雾电离质谱测量法(electrosprayion-izationmassspectrometry,ESI-MS)[8 ] 同基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法在固态下完成不同，电子喷雾电离质谱测量法是在液态下完成，而且多肽离子带有多个电荷，由高效液相层析等方法分离的液体多肽混合物，在高压下经过一细针孔。当样本由针孔射出时，喷射成雾状的细小液滴，这些细小液滴包含多肽离子及水份等其他杂质成分。去除这些杂质成分后，多肽离子进入连续质量分析仪(tan- demmassanalyzer)，连续质量分析仪选取某一特定质量/电荷比值的多肽离子，并以碰撞解离的方式将多肽离子碎裂成不同电离或非电离片段。随后，依质量/电荷比值对电离片段进行分析并汇集成离子谱(ionspectrum)，通过数据库检索，由这些离子谱得到该多肽的氨基酸序列。依据氨基酸序列进行的蛋白鉴定较依据多肽质量指纹进行的蛋白鉴定更准确、可靠。而且，氨基酸序列信息即可通过蛋白氨基酸序列数据库检索，也可通过核糖核酸数据库检索来进行蛋白鉴定。 蛋白质质谱分析研究进展 来自: 免费论文网 4．蛋白质质谱分析的应用 1981年首先采用FAB双聚焦质谱测定肽分子量，分析十一肽(Mr=1318)，质谱中出现准分子离子[M+1]+=1319强峰。分子量小于6kDa肽或小蛋白质合适用FAB质谱分析，更大分子量的多肽和蛋自质可用MALDI质谱或ESI质谱分析。用MALDI-TOF质谱分析蛋自质最早一例是Hillen Kramp等[9]于1988年提出用紫外激光以烟酸为基质在TOF谱仪上测出质量数高达60kDa蛋白质，精确度开始只有0.5%，后改进到0.1-0.2%。质谱技术主要用于检测双向凝胶电泳或“双向”高效柱层析分离所得的蛋白质及酶解所得的多肽的质量，也可用于蛋白质高级结构及蛋白质间相互作用等方面的研究[10,11],三条肽段的精确质量数便可鉴定蛋白质。近年来，串联质谱分析仪发展迅猛，其数据采集方面的自动化程度、检测的敏感性及效率都大大提高，大规模数据库和一些分析软件(如:SEQUEST)的应用使得串联质谱分析仪可以进行更大规模的测序工作。目前，利用2D电泳及MS技术对整个酵母细胞裂解产物进行分析，已经鉴定出1484种蛋白质，包括完整的膜蛋白和低丰度的蛋白质[12]；分析肝细胞癌患者血清蛋白质组成分[13]，并利用质谱进行鉴定磷酸化蛋白研究工作[14]及采用质谱技术研究许旺细胞源神经营养蛋白(SDNP)的分子结构[15]等。 结束语： 在蛋白质的质谱分析中，质谱的准确性(accuracy)对测定结果有很大影响，因此质谱测序现在仍很难被应用于未知蛋白的序列测定。肽和蛋白的质谱序列测定方法具有快速、用量少、易操作等优点，这些都非常适合于现在科学研究的需要。我们相信，随着各种衍生化方法和酶解方法的不断改进，蛋白双向电泳的应用[16]以及质谱技术的不断完善，质谱将会成为多肽和蛋白质分析最有威力的工具之一。
细胞工程论文
细胞工程是生物工程的一个重要方面。总的来说，它是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。下面是我为大家整理的细胞工程论文，欢迎阅读。
【摘要】 目的制作去细胞肌肉组织工程支架，并检测其与人羊膜上皮细胞的生物相容性。方法 采用TNT和十二烷基磺酸钠结合的化学萃取方法制作去细胞肌肉组织工程支架，冰冻切片观察其结构。将人羊膜上皮细胞种入支架培养7 d后，用免疫组化检测羊膜上皮细胞的增殖活性、NT3及BDNF的表达,扫描电子显微镜观察其超微结构。结果 支架中细胞去除完全，其主要结构为平行排列的管状结构。细胞外基质的主要成分弹性纤维和胶原纤维保持完好。羊膜上皮细胞在支架里有增殖活性，并呈现NT3、BDNF免疫反应阳性。扫描电镜显示，羊膜上皮细胞在支架中分布均匀，生长良好。结论 成功的制作了去细胞肌肉组织工程支架，其与人羊膜上皮细胞有良好的相容性。
【关键词】 去细胞肌肉;人羊膜上皮细胞;生物相容性
近年来组织工程研究的重要进展之一就是采用自体或异体移植物制作天然生物降解材料的组织工程支架。其中去细胞移植物与机体有良好的生物相容性。去细胞肌肉支架可作为生物工程支架支持神经细胞轴突再生。Mligiliche等〔1〕把去细胞肌肉移植入大鼠坐骨神经缺损处,4 w后发现有大量神经轴突长入去细胞肌肉支架中。由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限，去细胞肌肉支架要发挥更大的作用往往需要向支架中植入种子细胞〔2，3〕。研究表明羊膜上皮细胞可分泌多种神经因子〔4，5〕，促进神经元轴突的生长，是一种良好的治疗神经系统疾病的种子细胞。本研究利用化学去细胞的方法制成去细胞肌肉支架，并把羊膜上皮细胞种入去细胞肌肉支架内，探究两者的相容性，为开展组织工程治疗神经系统方面的疾病提供新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 Wistar 大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。
1.1.2 试剂 IMDM培养基及小牛血清由Hyclone 公司提供。5′溴尿嘧啶核苷(BrdU) 及BrdU 单克隆抗体购自Neomarker公司;神经营养素(NT)3,脑源性神经营养因子(BDNF)兔抗人多克隆抗体购自武汉博士德公司，SABC免疫组化试剂盒购自福州迈新生物公司。人羊膜上皮细胞株为本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 去细胞肌肉支架的制备 参考 Brown等〔6〕去细胞膀胱的制作方法制备去细胞肌肉支架，简述如下：取Wistar大鼠腹锯肌，放入蒸馏水中，在摇床中以37℃、50 r/min摇48 h后,转入3%的TritonX100溶液,摇床中37℃、50 r/min摇48 h。然后放入蒸馏水中，摇床37℃、50 r/min摇48 h。换成1% SDS溶液，摇床37℃，50 r/min摇48 h。PBS洗24 h。PBS中4℃保存备用。
1.2.2 支架形态结构的观察及成分鉴定 肉眼观察去细胞肌肉的形态。去细胞肌肉用4%多聚甲醛PBS固定1 h，5%蔗糖90 min，15%蔗糖90 min，30%蔗糖过夜以梯度脱水，OCT包埋，冷丙酮速冻，之后放入-70℃冰箱保存。恒冷箱切片机切片，HE 染色，观察其内部结构。此外对切片进行Van Gienson(VG)染色和 Weigert染色(VG+ET染色)检测支架的细胞外基质成分。
1.2.3 人羊膜上皮细胞的培养 人羊膜上皮细胞在DMEM培养液中(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 mg/ml链霉素，200 μg/ml的谷氨酰胺)，37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，待单层培养细胞生长至80%汇合后，传代培养。
1.2.4 人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架相容性的鉴定
1.2.4.1 取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合，弃去培养液，0.25%胰蛋白酶消化，当胞体回缩，细胞间隙变宽时，用血清终止消化，反复轻吹瓶壁细胞，制成单细胞悬液于离心管中，1 000 r/min，离心3 min。用DMEM重悬细胞。用1 ml注射器吸入细胞悬液，以2×106/ml 密度注入去细胞肌肉支架中分装至24孔板中，在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，培养1 w。掺入Brdu(终浓度为10 mg/L)，继续培养1 d后，恒冷箱切片机切片(方法同前)。切片经PBS 洗后，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶10 min，血清封闭20 min;一抗用BrdU(1∶1 000稀释)单克隆抗体，BDNF和NT3多克隆抗体(1∶100稀释)4℃孵育过夜，PBS 洗后，二抗37℃孵育30 min，PBS 洗后，SABC37℃孵育30 min，DAB显色。光镜下观察。
1.2.4.2 扫描电子显微镜鉴定羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架上的生长情况 取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合时，用上述方法消化下来后，把羊膜上皮细胞种植到去细胞肌肉支架中，放在24孔板中，在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养7 d后，用2%戊二醛固定后，梯度乙醇脱水，CO2临界点干燥，镀膜，采用扫描电子显微镜观察并拍照。
2 结 果
2.1 支架的组织结构与成分 去细胞肌肉外观呈乳白色,半透明,质地柔软。从大体上看，肌肉去细胞前后整体大小与形状无显著变化。支架纵切面的HE染色观察可见骨骼肌细胞成分消失,而纤维网架结构保持完整，支架内主要为平行管道。VG+ET染色证明支架成分主要为胶原纤维和弹力纤维等细胞外基质成分，胶原纤维为红色波浪状结构，弹性纤维为蓝色丝状结构，见图1。
2.2 羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架的兼容性 见图2，HE染色显示人羊膜上皮细胞在支架中生长良好，分布均匀(图
图1 去细胞肌肉支架大体与组织切片染色
图2 去细胞肌肉支架的病理图片2A)。免疫组化染色显示，BrdU阳性细胞数目多，提示支架中的人羊膜上皮细胞有增殖能力(图2B)。抗NT3和BDNF染色显示，支架中的人羊膜上皮细胞含有NT3、BDNF阳性颗粒，呈棕褐色分布在细胞质中(图2C，2D)。JSM5600LV扫描电子显微镜显示，在支架内部分布有大量细胞，细胞在支架中分布比较均匀，生长状态良好(图2E)。
3 讨 论
理想的支架材料应与细胞外基质类似，与活体细胞有良好的生物相容性〔7，8〕。去细胞肌肉作为治疗神经损伤的生物工程支架材料有如下优势：(1)去细胞肌肉的细胞外基质成分对组织细胞的'迁移、黏附、生长代谢都有重要作用，研究表明再生的轴突可以很好的黏附在去细胞肌肉支架上〔9〕。(2)去细胞肌肉的排列结构与神经膜管类似,仅在直径上略大于神经膜管〔10〕，它们提供了轴突可生长穿过的足够空间〔9〕，该结构对于诱导神经轴突再生是十分重要的。 Fansa等比较了接种施万细胞的不同去细胞生物材料(肌肉，静脉，神经外膜)桥接缺损的外周神经的结果，发现缺乏神经膜管样结构的去细胞肌肉支架(静脉和神经外膜支架)中的再生轴突是无序和排列混乱的，而有神经膜管样结构的去细胞肌肉支架中的再生轴突是有序排列的〔11〕。这种轴突再生的有序性对神经损伤的轴突再生同样也是十分重要的。(3)去细胞肌肉引起的免疫排斥反应较小〔9，12〕。这些优势都说明去细胞肌肉可作为治疗神经损伤的理想的材料。本研究采用的制作去细胞肌肉的方法主要用来减少异种移植材料的免疫排斥反应。该方法能有效的去除脂膜和膜相关抗原以及可溶性蛋白，并能有效的保留细胞外基质成分的原始空间结构。肌细胞正常呈平行分布，其细胞外基质成分也是平行分布的，从支架纵切面的结果看支架的纤维成分也是平行排布的，VG+ET染色结果显示细胞外基质的主要成分胶原纤维和弹性纤维保持完好。这些结果进一步证实此方法可成功制备去细胞肌肉支架。
由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限〔13〕，去细胞肌肉的生物相容性也有待验证。本研究用人羊膜上皮细胞作为种子细胞种入去细胞肌肉支架以探讨其相容性。研究表明，羊膜上皮细胞中含有多种生物活性因子，包括黏蛋白、转移生长因子、前列腺素E、表皮生长因子样物质,IL1，IL8 等因子，另外，还可分泌BDNF和NT3等重要的神经营养因子〔4〕。其中层黏蛋白、BDNF和NT3等生物活性因子对神经损伤的治疗具有十分重要的作用。羊膜上皮细胞可作为一种较理想的种子细胞，与去细胞肌肉支架结合可能成为治疗神经系统疾病的一个理想的组织工程材料。本实验观察到人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中分布均匀，抗BrdU、BDNF及NT3免疫组化显示去细胞肌肉支架中羊膜上皮细胞有良好的增殖能力，并能表达BDNF和NT3，说明羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中保持了良好的生物学活性。以上结果一方面证明了本研究制作的去细胞肌肉支架有良好的生物相容性，另一方面为应用羊膜上皮细胞和去细胞肌肉支架结合治疗神经系统疾病提供了理论和实验基础。
总之 ，本研究成功制备了去细胞肌肉支架，并证实人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中能分泌重要的神经营养因子，人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体为神经缺损再生提供了基底膜、神经营养因子等种种有利因素，构成了良好的神经再生微环境，有利于使神经缺损得到较好地修复，为进一步研究羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体治疗神经损伤奠定了一定的实验基础。
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1 引 言 磁性纳米粒子是近年来发展起来的一种新型材料，因其具有独特的磁学特性，如超顺磁性和高矫顽力，在生物分离和检测领域展现了广阔的应用前景[1]。同时，因磁性氧化铁纳米粒子具有小尺寸效应、良好的磁导向性、生物相容性、生物降解性和活性功能基团等特点[2～4]， 在核磁共振成像、靶向药物、酶的固定、免疫测定等生物医学领域表现出潜在的应用前景[5～7]。但由于其较高的比表面积，强烈的聚集倾向，所以通常对其表面进行修饰，降低粒子的表面，能得到分散性好、多功能的磁性纳米粒子。对磁性纳米粒子的表面进行特定修饰，如果在修饰后的粒子上引入靶向剂、药物分子、抗体、荧光素等多种生物分子，可以改善其分散稳定性和生物相容性， 以实现特定的生物医学应用。此外，适当的表面修饰或表面功能化还可以调节磁性纳米粒子表面的反应活性[8]，从而使其应用在细胞分离、蛋白质纯化、核酸分离和生物检测等领域。本文介绍了磁性氧化铁纳米粒子的制备方法， 比较了各种制备方法的优缺点，并对其在生物分离及检测中应用的最新进展进行了评述。2 磁性氧化铁纳米粒子的合成方法 磁性纳米粒子的制备是其应用的基础。目前已发展了多种合成和制备方法，如共沉淀法、水热合成法、溶胶凝胶法和微乳液法等，上述方法均可制备高分散、粒度分布均匀的纳米粒子，并能方便地对其表面进行化学修饰，这些方法的优点和缺点见表1。 在这些合成方法当中，共沉淀法是水相合成氧化铁纳米粒子最常用的方法。该方法制备的磁性纳米颗粒具有粒径小，分散均匀，高度生物相容性等优点，但制得的颗粒存在形状不规则，结晶差等缺点。通过在反应体系中加入柠檬酸，可得到形状规则、分散性好的纳米粒子。利用这种方法合成的磁性纳米材料被广泛应用在生物化学及生物医学等领域[9]。微乳液法制备纳米粒子，产物均匀、单分散，可长期保持稳定，通过控制胶束、结构、极性等，可望从分子规模来控制粒子的大小、结构、特异性等。微乳液合成的磁性纳米粒子仅溶于有机溶剂，其应用受到限制。通常需要在磁性纳米粒子的表面修饰上亲水分子，使其溶于水，从而能应用于生物、医学等领域。 热分解法是有机相合成氧化铁纳米粒子最多也是最稳定的方法。利用热分解法制备的纳米Fe3O4颗粒产物具有好的单分散性，且呈疏水性，可以长期稳定地分散于非极性有机溶剂中。该方法合成的氧化铁纳米粒子虽然具有粒径均一的特点，但必须在其表面偶联亲水性及生物相容性好的生物分子或制备成核壳结构，才可用于生物医学领域。表1 磁性氧化铁纳米粒子的制备方法（略）此外，绿色化学和生物方法合成氧化铁纳米粒子也备受关注[28,29]。磁性氧化铁纳米粒子除具有的表面效应、小尺寸效应、量子效应、宏观量子隧道效应等纳米粒子基本特性外，它同时还具有超顺磁特性、类酶催化特性和生物相容性等特殊性质，因此在医学和生物技术领域中的应用引起了人们的广泛兴趣。 3 磁性氧化铁纳米材料在生物分离与生物检测的应用3.1 磁性氧化铁纳米材料在生物分离的应用 磁性氧化铁纳米粒子可以通过外界磁场来控制纳米粒子的磁性能，从而达到分离的目的，如细胞分离[30，31]、蛋白分离[32] 和核酸分离[33]等。此外磁性氧化铁纳米粒子由于兼有纳米、磁学和类酶催化活性等性能，不仅能够实现被检测物的分离和富集，而且能够使检测信号放大，在生物分析领域也都具有很好的应用前景[34，35]。磁性纳米粒子（MNP）能够应用于这些领域主要基于它的表面化学修饰，包括非聚合物有机固定、聚合物有机固定、无机分子固定及靶向配体修饰等[36]（图1）。纳米粒子表面功能化修饰是目前研究的热点。3.1.1 磁性氧化铁纳米材料在细胞分离方面的应用 细胞分离技术的目的是快速获得所需目标细胞。传统细胞分离技术主要根据细胞的大小、形态以及密度的差异进行分离，如采用微滤、超滤以及超离心等方法。这些方法操作简单，但是特异性差，而且存在纯度不高、制备量偏小、影响细胞活性等缺点，因此未能被广泛地用于细胞的纯化研究[37]。近年来，随着对磁性纳米粒子研究的深入，人们开始利用磁性纳米粒子来分离细胞[38,39]。如磁性氧化铁纳米粒子在其表面接上具有生物活性的吸附剂或配体（如抗体、荧光物质、外源凝结素等），利用它们与目标细胞的特异性结合，在外加磁场的作用下将细胞分离、分类以及对其种类、数量分布进行研究。张春明等[40]运用化学连接方法将单克隆抗体CD133连接到SiO2/Fe3O4复合粒子的表面得到免疫磁性Fe3O4纳米粒子，利用它分离出单核细胞和CD133细胞。经培养后可以看出，分离出来的CD133细胞与单核细胞一样，具有很好的活性，能够正常增殖形成集落，并且在整个分离过程中对细胞的形态以及活性没有明显的毒副作用，这与Kuhara等[30]]报道的采用磁分离技术分离CD19+和CD20+细胞的结果一致。Chatterjee等[39]采用外源凝结素分别修饰聚苯乙烯包被的磁性Fe3O4微球和白蛋白磁性微球，利用凝结素与红细胞良好的结合能力，快速、高效的分离了红细胞。此外，磁性粒子在分离癌细胞和正常细胞方面的动物实验也已获得成功。3.1.2 磁性氧化铁纳米材料在蛋白质和核酸分离中的应用 利用传统的生物学技术（如溶剂萃取技术等）来分离蛋白质和核酸程序非常繁杂，而磁分离技术是分离蛋白、核酸及其他生物分子便捷而有效的方法。目前在外磁场作用下，超顺磁性氧化铁纳米粒子已广泛应用于蛋白质和核酸的分离。 Liu等[41]利用聚乙烯醇等表面活性剂存在下制备出共聚磁性高分子微球，表面用乙二胺修饰后用于分离鼠腹水抗体，得到很好的分离效果。Xu等[42]在磁性氧化铁纳米粒子表面偶联多巴胺分子，用于多种蛋白质的分离纯化。多巴胺分子具有二齿烯二醇配体，它可以与氧化铁纳米粒子表面配位不饱和的Fe原子配位，形成纳米颗粒多巴胺复合物，此复合物可以进一步偶联次氨基三乙酸分子（NTA），NTA分子可特异螯合Ni＋，对于具有6×His标签的蛋白质的分离纯化方面表现出很高的专一性。Liu等[43]用硅烷偶联剂（AEAPS）对核壳结构的SiO2/Fe2O3复合粒子的表面进行处理，研究复合磁性粒子对牛血清白蛋白（BSA）的吸附情况，结果表明BSA与磁性复合粒子之间是通过化学键作用被吸附的，复合粒子对BSA的最大吸附量达86 mg/g，显示出在白蛋白的分离和固定上有很大的应用潜力。Herdt等[44]利用羧基修饰的吸附/解离速度快的核壳型（Fe3O4/PAA）磁性纳米颗粒与Cu2+亚氨基二乙酸（IDA）共价交联，通过Cu2+与组氨酸较强的亲和能力实现了组氨酸标记蛋白的选择性分离，分离过程如图2所示。 磁性纳米粒子也是核酸分子分离的理想载体[45]。DNA/mRNA含有单一碱基错位，它们的富集和分离在人类疾病诊断学、基因表达研究方面有着至关重要的作用。Zhao等[46]合成了一种磁性纳米基因捕获器，用于富集、分离、检测痕量的DNA/mRNA分子。这种材料以磁性纳米粒子为核，包覆一层具有生物相容性的SiO2保护层，表面再偶联抗生素蛋白维生素H分子作为DNA分子的探针，可以将10－15 mol/L DNA/mRNA有效地富集，并能实时监控产物。Tayor等[47]用硅酸钠水解法、正硅酸乙酯水解法制备SiO2/Fe2O3磁性纳米粒子并对DNA进行了分离。结果表明，SiO2功能化的Fe2O3磁性纳米粒子对DNA的吸附分离效果明显好于单独Fe2O3磁性纳米粒子的分离效果，但是其吸附机理有待进一步研究。3.2 磁性氧化铁纳米材料在生物检测中的应用3.2.1 基于磁学性能的生物检测磁性氧化铁纳米粒子因其特有的磁导向性、小尺寸效应及其偶联基团的活性，兼有分离和富集地作用，使其在生物检测领域有广泛的应用。当检测目标为低含量的蛋白分子时，不能通过聚合酶链反应（PCR）对其信号进行放大，而磁微球与有机染料或量子点荧光微球结合可以对某些特异性蛋白、细胞因子、抗原和核酸等进行多元化检测，实现信号放大的作用。Yang等[48]采用一对分子探针分别连接荧光光学条码（彩色）和磁珠（棕色），对DNA（顶端镶板）和蛋白质（底截镶板）生物分子进行目标分析（图3）。如果目标DNA序列或蛋白存在，它将与两个磁珠结合一起，形成了一个三明治结构，经过磁选，光学条码可以在单磁珠识别目标水平下，通过分光光度计或是在流式细胞仪读出。通过此方法检测目标分子是基于数百万个荧光基团组成的微米尺寸光学条码信号的扩增而检测出来，其基因和蛋白的检出限可达到amol/L量级，甚至更低。 Nam等［49］利用多孔微粒法（每个微粒可填充大量条形码DNA）和金纳米微粒为基础的比色法生物条形码检测技术检测了人白细胞介素2（IL2），检出限可达到30 amol/L，比普通的酶联免疫分析技术的灵敏度高3个数量级。Oh等 [50]利用荧光为基础的生物条形码放大方法检测了前列腺特异性抗原（PSA）的水平，其检出限也低于300 amol/L，而且实现了快速检测。 在免疫检测中，磁性纳米粒子作为抗体的固相载体，粒子上的抗体与特性抗原结合，形成抗原抗体复合物，在磁力作用下，使特异性抗原与其它物质分离，克服了放免和酶联免疫测定方法的缺点。这种分离具有灵敏度高、检测速度快、特异性高、重复性好等优点。Yang等[51]通过反相微乳液法制备了粒径很小的SiO2包覆的Fe3O4磁性纳米粒子，生物分子通过诱导这些高单分散的磁性纳米粒子可用于酶的固定和免疫检测。Lange等[52]采用直接或三明治固相免疫法（生物素基化抗IgG抗体和共轭连接链霉素的磁性纳米粒子组成三明治结构）和超导量子干涉法（SQUID），研究它们在确定抗原、抗体相互作用免疫检测中的应用，结果表明特异性键合的磁性纳米颗粒的驰豫信号大小依赖于抗原（人免疫球蛋白G，IgG）的用量，这种磁弛豫(Magnetic relaxation)免疫检测方法得到的结果与广泛使用的ELISA方法的结果相当。 因磁性纳米粒子独特的性能，在生物传感器上也有潜在的应用前景。Fan等［53］在磁珠上偶联被检测物的一级抗体，在金纳米颗粒上连接二级抗体，两者反应后，利用HClNaClBr2将Au氧化为Au3+，催化发光胺（Luminol）化学发光，人免疫球蛋白G（IgG）的检出限可达2 × 10－10 mol/L ，实现了磁性纳米颗粒化学发光免疫结合的方法对IgG进行生物传感分析（图4）。3.2.2 类酶催化特性在生物检测中的应用 Cao等[54]发现Fe3O4磁性纳米粒子能够催化H2O2氧化3,3',5,5'四甲基联苯胺（TMB）、3,3'二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）和邻苯二胺（OPD），使其发生显色反应，具有类辣根过氧化物酶（HRP）活性（图5），而且其催化活性比相同浓度的辣根过氧化物酶高40倍。并且Fe3O4磁性纳米粒子可以运用磁分离手段进行重复性利用，显著降低了生物检测的实验成本，利用此特性可进行多种生物分子的检测。 利用葡萄糖氧化酶（GOx）与Fe3O4磁性纳米粒子催化葡萄糖的反应(见式（1）和(2))，通过比色法检测葡萄糖，其检测的灵敏度达到5×10－5 ～ 1×10－3 mol/L 。由于Fe3O4磁性纳米粒子制备简单、稳定性好、活性高，成本低，因而比普通酶更有竞争优势，这也为葡萄糖的检测提供了高灵敏度和选择性的分析方法，在生物传感领域的应用上展现了巨大的潜能，为糖尿病人疾病的诊断提供了快速、灵敏的检测方法。然而要提高检测灵敏度，合成催化效率高的Fe3O4磁性纳米粒子及多功能磁性纳米粒子是关键。Peng等[56]用电化学方法比较了不同尺寸Fe3O4纳米粒子的催化活性发现，随着尺寸的变小，磁性纳米粒子的催化活性变高。Wang等[57]制备的单分散哑铃型PtFe3O4纳米粒子，由于本身尺寸和结构特点，可更大限度地提高催化活性。本研究组已经合成了分散性好和磁性高的氧化铁纳米粒子并对其进行了表征，利用其磁学和催化特性，已开展了葡萄糖等生物分子的检测，该方法的检出限达到1 μmol/L，具有灵敏度高、操作简便和成本低等优点[58]。总之，Fe3O4磁性氧化铁纳米粒子不但具有显著的超顺磁性，而且具有类辣根过氧化物酶催化特性，可通过使用过氧化物敏感染料，设计了一系列（如乙肝病毒表面抗原等）的免疫检测模型[59]，因此超顺磁性纳米粒子在生物分离和免疫检测领域具有广阔的应用前景。4 结 语 随着纳米技术的迅速发展，磁性氧化铁纳米粒子的开发及其在生物医学、生物分析、生物检测等领域的潜在应用已经越来越受到重视，但同时也面临很多挑战和问题。（1）构建并制备尺寸小、粒径均一、分散性和生物相容性好及催化性能高的多功能磁性纳米粒子；（2）根据被检测生物分子的特点设计多功能磁性氧化铁纳米粒子，实现高灵敏度、特异性检测；（3）利用纳米氧化铁颗粒作为分子探针进行实时、在线、原位、活体和细胞内生物分子的检测。这些问题不仅是纳米材料在生物分子检测领域应用需要解决的难点，也是目前其进行生物分子检测研究的热点和重点。【参考文献】 1 Perez J M, Simeone F J, Saeki, Y, Josephson L, Weissleder R. 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可以，但是存在道德问题，各国都有法律禁止克隆人。
可以，但现在没人敢开先河。
1．克隆人研究的风险性 目前的动物体细胞克隆技术存在着难以预测和消除的技术风险，这已经成为人们在伦理学层面反对克隆人的一个重要科学依据。 克隆人将存在着较多的风险性 无论是科学家还是普通公众，始终都是从动物克隆技术发展的现况来类比克隆人研究的发展前景，并作为进一步推论的逻辑基础。也即是，目前的动物克隆实验仍然处于初始阶段，克隆技术还很不成熟。在动物克隆实验中出现的高失败率、高风险、使用了大量的重组卵细胞、大量畸形后代以及发生排斥现象等问题，将会出现在克隆人研究中。如果仅仅通过某项动物克隆的成功个案来判断克隆技术的普遍可行性是错误的，至少是不严谨的。科学家认为，要将动物（如绵羊）克隆实验得出的技术经验，应用到人类个体身上并非是一件容易的事情。当这种不成熟的技术“硬要”作用于人体时，克隆人的过程将充满各式各样的危险。例如，英国胚胎学家威尔莫特认为，有很多理由可以考虑到，由扎沃斯和安蒂诺里等人宣布的克隆人实验将会有同样高的失败率，正如试图进行动物克隆时那样。并且，现在或者在可以预见的未来，没有可行的技术方法去检查动物胚胎所有基因组的发育状态。因而，人们无法保证最后植入子宫内的胚胎是否能够发育正常，而不至于生下畸形儿或使代孕母体安全受到严重威胁。 另外，在上海召开的2002年国际人类基因组大会上，中国科学院副院长陈竺院士指出，最早站出来反对克隆人的正是培育出克隆羊的英国科学家，因为专家们最清楚，目前的技术离克隆人还远得很。……克隆羊“多莉”的成功，经历了277头克隆羊实验失败的波折，怪胎、畸形层出不穷，这一幕如果在克隆人时重演，谁来为277条生命的夭折负责？还有，克隆动物被发现存在早衰现象，尚无法解释。不顾这一切而匆忙进行克隆人，很可能酿成大错。从陈竺院士的言论来看，他也是以动物克隆的情况来类比未来克隆人的情况。中外科学家反复以“多莉”羊的情况来观照克隆技术的发展，这说明在此领域中没有更多的经验证据来说明问题的实质和技术风险的大小。 2．克隆人行为违背了社会伦理 对于来自社会的对克隆人行为在伦理层面的指责，科学界不可能无动于衷。受此影响的科学家就发表了类似观点，如世界医学协会主席恩里克•阿科尔西在2001年8月8日发表声明指出，把克隆技术用于人类自己“有悖于人类价值、伦理和道德原则”。他代表世界医学协会坚决反对克隆人实验计划。〔5〕从另外一个角度，威尔莫特对媒体说：“试想我的妻子与我和一个复制的‘我’三人生活在一起，那就会产生一个极不寻常的关系，对我们三个人中的每个人，尤其那个复制的‘我’都将十分尴尬。因此，必须坚决反对克隆人。”〔6〕 当然，科学家不是伦理学家、社会学家和法学家，他们不可能从伦理学、社会学和法学等层面对克隆人问题展开系统的、溯根求源式的学理分析。但是，他们作为现实的社会成员，他们在“克隆人”问题上就必然有着与其他社会成员相似的感觉。这样，科学界从社会伦理层面来反对克隆人研究就很正常了。 3．克隆人行为违背了科学道德 （1）科学道德与科技工作者的社会职责 道德属于一种社会意识，它是在一定社会条件下调整人们之间行为的规范和准则的总和。恩格斯曾经指出：“每个阶段，甚至每个行业，都各有各的道德。”〔7〕我们知道，古老的“希波克拉底誓言”（the Hippocratic Oath）作为医师团体的职业誓约书就要求从业者：应尽自己的知识与能力医治病人，不得有越分的医疗行为，并坚守品性与道德规范。那么，在科学技术的研究、开发和应用过程中，同样要求人们遵守一定的道德原则。 现代科学技术的社会功能越来越强大，对社会的渗透越来越广泛，也就越有可能引起更多的社会、伦理和法律等问题。科技工作者的社会责任比以前显得更加突出和重要。“为科学而科学”、“科学不考虑效用或利益” 等说法已经不合时宜，科技工作者必须对“应该追求何种知识”、“所追求的知识应置于何种地位”以及“如何应用这些知识”等一系列问题做出理性的分析和判断。这些问题早就引起科学界的重视了。在1955年7月15日，包括玻恩、海森堡和居里夫人在内的52位诺贝尔奖获得者在《迈瑙宣言》中，针对科学技术的社会价值反思说：“我们愉快地贡献我们的一切为科学服务。我们相信科学是通向人类幸福之路。但是，我们怀着惊恐的心情看到：也正是这个科学向人类提供了自杀的手段。”〔8〕 科技工作者有创新的自由和权利。但是，科学研究的自由永远不意味着为所欲为、肆意行事，科技工作者应对这种创新担负起相应的社会责任。科技工作者不能只关心自己的研究兴趣，更要关心科学技术的社会功能和社会影响。这既是现代社会对科技工作者的一种强烈要求，也是科技工作者应该担负的一项历史使命。其实，在1997年“多莉”羊出生之后，两大著名学术期刊Nature和Science除了报道与克隆技术研究有关的科学论文外，还连续发表大量出自科学家之手的评论文章，如“克隆：人将成为下一个”、“不要克隆人”、“风险与不确定性”、“‘多莉’的考证”以及“什么是克隆？并非你所想的那样”等。这充分表现出科学界对克隆技术发展所引起的社会风险问题的关注。今天，关心人类前途的科学家应该关注与克隆有关的伦理、法律和社会问题，保证克隆知识和技术服务于社会，而不是伤害人类社会。正如诺贝尔奖获得者、著名分子生物学家J. D. 沃森所说：“可以期待，许多生物学家，特别是那些从事无性繁殖研究的科学家，将会严肃地考虑它的含意，并展开科学讨论，用以教育世界人民。”〔9〕 在科学界已经形成如下一个规范：当一项技术在社会上有争议时，科技工作者要把社会利益放在首位来评价这项技术。还要求科技工作者在从事科学研究时要更多地考虑选题的社会价值，而不能仅仅在某种好奇心或兴趣的作用下随心所欲地从事研究，更不能从事旨在“哗众取宠”或“怪异”的研究目标，如为了“复活”死人而去克隆人或进行“人畜细胞融合”等。在2002年，威尔莫特强调指出，自从进行动物克隆试验之后，他从未考虑过进行克隆人试验，克隆人试验不仅会使被试验者冒着很大的风险，而且这种实验结果没有什么科学意义，不管从伦理道德上还是从医学上讲，都没有理由这样做。〔10〕 （2）盲目进行生物学实验是一种不负责任的行为 人们经常谈及的一个与科技工作者社会责任相关的生物技术研究案例是：在20世纪70年代初，美国斯坦福大学的伯格教授人工构成了第一个重组DNA杂交分子。不久，他的科学同行提醒他要注意重组DNA分子可能具有致癌性，带有重组分子的细菌大量增殖也有可能成为传播人类肿瘤的媒介，会在社会产生严重的不良后果。伯格教授就接受了同行建议，停止了自己的基因重组研究。他还在Nature上向全世界的科学家发出呼吁：在重组DNA分子潜在危害尚未弄清或在找到适当的防护措施之前，应自动停止有可能致癌的基因扩增实验。这些讨论导致美国政府在1976年颁布了“关于重组DNA分子研究的准则”，对转基因技术的研究、应用进行严格管制。后续的科学实践证明，伯格等人对转基因技术的危险性估计过高。只要人们在研究和实验过程中严加控制，妥善管理，认真对待，采取严密的防范措施，这些潜在危害是完全可以避免的。因此，美国政府在1979年就恢复了基因重组研究。〔11〕这种涉及生物技术社会利益与风险的科学争论具有深远的现实意义。这既是科技工作者社会责任感的自觉体现，也开创了一种应对新技术未知风险的合理程序。为避免新技术可能引起的祸害，应该制定出必要的管理计划与伦理规范，以暂时阻止那些后果尚未得到确切了解的实验。这种从人类社会整体利益出发选择科研课题的主张，既是一种科学选择，更是一种道德选择。 不少科学家认为，为了某种正当目的而进行生物学实验是没有过错的，但安蒂诺里等人的克隆人行为是不负责任的。只要体细胞核移植技术的安全性还不确定，只要人们还未充分探讨与克隆人体相关的道德问题以及不育夫妇是否还能够找到其它妊娠的方法，在明知会对当事人造成某种“伤害”和“风险”的情况下，而执意去从事这类技术活动，就是一种不负责任的行为，甚至是一种犯罪行为。 （3）与严谨的科学精神不符 人们应该如何看待克隆人研究以及有关报道呢？很多科学家批评说，安蒂诺里等人的研究，不仅无视目前动物克隆研究中出现的各种风险，没有提供令人信服的证据，也没有解释其所用的具体技术是什么，以供科学界评议。安蒂诺里等人的克隆人言行只是通过大众传媒来宣布，这与严谨、求实的科学精神是不相符的，却给人以“作秀”的感觉。美国《医学伦理通报》的编辑理查德•尼科尔森说：“我认为安蒂诺里从来没有考虑过后代的利益，他的所作所为只是为了赢得个人的声望，是为了出名才一意孤行要进行这项极有争议的实验的。”〔12〕一些科学家强烈要求安蒂诺里等人对有关消息是否属实给予切实的澄清。 事实上，在科学界有不少人对克隆人运动提出严重质疑。例如，从逻辑上讲，美国宾夕法尼亚大学的阿瑟•卡普兰教授说：“那些科学家们声称有200多对夫妻排着队，等候被带到某个偏僻的地方用克隆细胞进行人工受孕，然后他们会照料每一个成功怀孕的妇女，这一切听起来根本就不可信。”从技术上讲，纽约一家医疗中心生殖内分泌学主任马克•索尔曾针对希德要克隆人一事说道：“很难想象在门诊所那样的条件下做这件事，除了引起轰动效应还能有什么别的。”〔13〕对于最近的“克隆人”新闻而言，身为“克隆援助”公司的“首席科学家”，布瓦瑟利耶却没有医学和生物学方面的学术背景，也从来没有发表过与克隆技术相关的研究论文。此种情况下，她又该如何开展克隆人研究呢？试问，他们发布的“克隆人”出生消息的可信度又在哪里呢？〔14〕在此，我们赞同我国知名学者周国平先生说过的一席话：“我对一切太喧嚣的事业和一切太张扬的感情都心存怀疑，它们总是使我想起莎士比亚对生命的嘲讽：‘充满了声音和狂热，里面空无一物’”。〔15〕科学研究不应只是一种外表非常热闹的事业，它更需要的是寂寞、孤独和宁静。 （4）反对以克隆人牟利 克隆人运动的一个重要动力，也就是一些人想象的有关克隆人的商业化企图和潜在的巨额利润空间。目前，我们不排除那些从事克隆人实验者试图从中谋利的可能。正如世界医学协会主席阿科尔西针对安蒂诺里宣称的克隆人计划所指，现在世界上准备实验的克隆人计划涉及到许多“经济利益”，这些计划企图将克隆技术变成“大笔交易”，通过实验追求“简单的商品成果”。因此，对于打算以违背科学道德的克隆人行为作为牟利的手段，则应该予以坚决反对。 因为再好的科隆技术也会有可能失败，这也是科学研究者公认的。而进行科隆人的技术就是对这种失败可能性的放任，如果失败了，就是对科隆人的伤害，而科学研究者就是过于自信的过失，要负刑事责任。 1965年诺贝尔物理学奖获得者，美国的科学家理查德·费恩曼说过，科学是一把能够打开天堂的钥匙，但是它同样也会将地狱打开。 主要观点：克隆人具有自然人的法律主体资格 克隆人给社会带来法律主体上的混乱 克隆人研究行为是违法行为 克隆人研究者涉嫌故意杀人及伤害罪 克隆人的受监护权被抚养权得不到保护 克隆人的生命健康权和人格权结婚权得不到保护 克隆人研究是对于进一步犯罪的引诱 克隆人的研究违背人类不变的伦理道德并且也是人类的陷阱 最近世界上一邪教组织头目甩出一个令世人惊讶的消息，公开宣称他们已经制造出了克隆人。此外2001年5月30日《南方周末》报科学版登载了一篇关于克隆人的文章，文中表达了我国的某些科学界人士支持克隆人的言论，近一年来，克隆人成为社会各界的热门话题。在众说纷纭的时候，我想由于知识所限或者是其他的原因。他们并不了解克隆人的产生在法律方面存在着什么顽疾。时到今日，长期沉积在我思索之中关于克隆人的看法，一刻也不能沉默。我想如果不以法律的名义向克隆人说不，也许好多人还会对克隆人报有迷茫、幼稚甚至无知的幻想，成为别有用心的科学狂人的被欺对象。就象《指环王》中魔鬼就要复活一样，当恐怖即将袭来时，村民们却在忘怀地喧闹和狂欢。这使我感到不安，因为从法律角度看，支持克隆人研究就是一个走向危险的方向，法律反对克隆人！ 本文所述是从法律角度剖析克隆人研究行为的违法性、犯罪性，以及克隆人如果出现的话，其主体性质、民事法律地位是如何的状态。由于学识浅薄，未免有疏漏不足之处，但我希望以此来唤醒那些为克隆人研究摇旗呐喊的“无知”知识分子的灵魂，望广大法律界同行为此深思，为此与我共同做出抵制克隆人研究的有益努力。 克隆人是人不是物 人们愿意乐观的看待克隆人研究，很大的因素是因为有些人会把克隆人研究的基因提取对象，以及把制造产生的个体当成物的客体或是说无人权的实验体。当每一个从事克隆人研究的人对克隆人主体性质的认识轻松略过不加理会时，这种项目的研究就会显得如同在动物身上研究鼠疫疫苗一样积极。克隆人是不是人呢？我想克隆人当然是人。因为，克隆人研究只是突破了人类有性繁殖的传统，使用了无性繁殖的手段，这种研究本身是攻克无形繁殖这一手段，其目的就是创造出与人一样有智能的生命，即使其胚胎生成方式不同，但克隆人生理机能完全与人无本质差异。因此无论从一般视角还是法律视角，克隆人就是人。我们知道，即使是一个没有知觉的植物人或神志不清的精神病人，他们都是自然人主体。人的主体资格权利能力不因是否具有完整的行为能力而受到限制或剥夺，人的自然权利、社会权利、法律权利都是平等的。基于这一点，所以说克隆人都应具有象自然人同样的公民权利。即他们应当有生命权，健康权，财产权，有性不受侵犯权，工作权，受教育权，甚至应有选举权和结婚权等等。 也许会有极端者要说，克隆人不是人只是一个物种，就是幻想片中的机器人，就象美国片中的终结者一样。这种回答是极为残忍的，这会使人想起日本的七三一部队，他们不是把人称做是实验品吗。把人当作实验品，杀人不叫杀人而是叫做实验，这是魔鬼逻辑。如果这样，克隆人的命运与动物在人类手中的命运还会有什么区别？克隆人将因此没有生命权、健康权。克隆人会不经法律允许被擅夺生命。克隆人将成为一种基因产品被任意交易。试想，如果这样，人类社会岂不要倒退到比奴隶社会还要残忍的境界，全人类都会陷入残杀和掠夺，电影中的可怕世界也必然会成为现实。因为，没有人会区别出克隆人与自然人的不同。只要有一个你是克隆人的借口，其随之遭受的命运就可以和被宰杀的牲畜一样可怕。 克隆人给社会带来法律主体上的混乱 法律所调整的主体有真实主体和虚拟主体之分，虚拟主体有若干个如国家、国际组织、企业法人、政党等都是，而真实主体只有一个，那就是自然人或者说公民。在只有一个真实主体类型的世界中，错综复杂的不公平不公正现象已经是层出不穷，试想如果出现了克隆人，这就意味着世界上出现了另一个真实主体，两个真实主体类型的世界，世界必将导致更为混乱。 克隆人研究目的无益于人类 克隆人的研究不会带来人类价值上的进步。人的价值不在于他的身体条件、肤色、身材，培养人的价值在于如何教育。一个自然人如果在后天的社会教育上不成功那么他必然不会有很高的社会价值。既然决定人类命运的是道德和社会的教育，那么的克隆人研究又有什么意义呢？ 克隆人研究的逻辑矛盾 克隆人不能因其胚胎方式的不同而降低或否定他不具有人的法律地位。但这样就陷入一个矛盾，不把克隆人视为人是错误的，如果把克隆人视为人，那么在克隆人的研究中，在作为一个技术手段的进步过程中，研究者必然就要残害克隆人的生命，毫无疑问这就不是研究而是犯罪。 任何一个理性的人会支持一项以杀人为主要代价的研究吗，更可怕的是这种研究的结果会给人类带来更大的犯罪和灾难，这就是一种让人类走向灭亡的技术进步！ 克隆人研究违法 克隆人的过程对于克隆人的生命健康存在着情节严重的伤害行为，这是违背宪法、刑法精神的行为。就我国而言，国家实行计划生育，人类自然生产都在限制之列，为什么还要进行另一种人口生产的实验。何况，我国人口的自然繁衍生育能力很强，绝对没有必要通过克隆方式创造人口。因此，在我国克隆人的研究是违背《计划生育法》的做法。 克隆人研究过程的危害性 从动物克隆的实验来看，克隆物种的成活率很低。在多莉羊的克隆实验中，277个胚胎融合仅仅成活了多莉一个，成功率只有0.36%。许多有幸降生的克隆小牛，有很多很快死于心脏异常、尿毒症或呼吸困难。出生后的克隆动物部分个体表现出生理或免疫缺陷。血液的含氧量和生长因子的浓度低于正常；胸腺、脾、淋巴腺发育不正常等。 现在可以看出来，同正常生殖相比，通过克隆方式产生的生命大多存在着残疾、夭折。可以想象，在制造克隆人的过程中必定会出现各种各样的残疾的人类，或是残疾的胚胎或是残疾的婴儿。这时，疯狂的科学家难道会承担起养育这些人类生命的责任吗，恐怕任何人也不会相信。 克隆人研究者的犯罪责任 科学家创造克隆人的行为具有故意杀人罪和故意伤害罪行为的犯罪特征。故意犯罪分直接故意和间接故意。直接故意是指明知行为结果的必然并积极追求。间接故意是指明知行为可能发生危害社会的结果，行为上放任这种结果的发生。 克隆人的研究存在着致人死亡或残疾的可能性后果，并且几乎是一种必然性。行为人在主观明知的情况下从事这种研究，由于其行为必然或极可能导致克隆人生命致死甚至致残，因此，这就是一种故意杀人和故意伤害罪，只不过是一种特殊类型。从主观心态和对后果的预见性上看，进行克隆人研究的科学家至少是具有犯罪间接故意的。杀人犯罪的方式有多种。比如有即时持刀毙人死命的犯罪，也有通过长期的药物毒害达到杀人目的的犯罪。对于一个正常生育下来的残疾儿来讲，这种人体上的残疾不可能被归咎于某个人的犯罪行为，因为，正常的生育出现残疾儿是无法预见的。但对于研究克隆人的科学家来讲，正是因为其明知并使用了一种特别的行为方式而导致了新生儿的死亡或伤残夭折，因此其应当承担相同于故意杀人和故意伤害罪的刑事责任。 克隆人给民事法律关系带来混乱 一、克隆人没有监护人 自然人正常降生后，一般有父母作为合法的监护人。当其父母逃避监护和抚养责任时，这不仅要受到道德的谴责，还应受到民事责任的追究。作为克隆人，谁是他们的父母，这是一个非常重要的问题。最初的克隆技术基本是有性繁殖的继续，有精子供体和卵子供体，理论上是存在父母的。但现在提供体细胞核的克隆技术已经出现，无性生殖基本成熟。克隆人基本是体细胞核提供者的基因翻版，但提供体细胞核者有可能与其年龄相当的人，因此从伦理上应当做父亲的体细胞提供者在年龄和行为能力上也许并不可以。 实质上无论是那一种技术，克隆人几乎都是找不到他们的父母。也许他们的父母根本不认识，他们只是研究者的一个“研究成果”。 克隆人还有另一种可能会是被某个母体代孕后降生的。克隆人的代孕母亲是否有义务成为其监护人，这也很难。因为代孕母亲所生的孩子也许与自己并无一点血缘关系，既然没有血缘关系，也不能要求代孕者承担监护抚养义务。由于克隆技术已经到了单性繁殖的水平，因此，克隆人甚至享受不了非婚生子的待遇，降生之后就是一个彻底的孤儿。 让我们想象，一个从身体机能上存在缺陷的人，同时在社会地位上同样存在缺陷，这不是一种残忍吗。谁来看护他，谁来教育他，他又能如何被塑造成一个有益于社会的人呢。也许，克隆人的生命还不如真正的动物幸运。动物和小鸟出生都有母亲来哺育，喂养，而克隆人从来到世界上就是一个牺牲品，实验品。相信，克隆人的感知力与人类是一致的，他们同样惧怕疼痛，惧怕孤独，惧怕流血，惧怕死亡；他们需要亲情，需要友情，需要爱情，但这一切他们又怎能得到呢。 由于没有监护人，代孕人与研究人之间完全可以是一种商业合同关系。生完了孩子，养育到一定时间，即可交“货”。这时研究者如何利用这些生命，他们可能是为委托人生产下一代，或者是复制品；但他们也完全可以为他们自身的犯罪目的或委托人的犯罪目的而自由地处置这些人类。这所有的一切将因克隆人没有父母监护显得更为随便。 二、克隆人的人格权和荣誉权 人都是社会性的，作为克隆人同样是。那些希望有一个克隆儿的父母毫无疑问也想有一个自立于社会的孩子。可是，由于克隆人的特殊背景，他的健康无法保证。由于健康及免疫力的先天问题，克隆人容易患有传染病、精神病，这一切使他的健康自生来就受到侵害，而这种侵害完全也是人为的。由于有疾病，周围的普通人自然很难接受克隆人，一个无法融入社会的克隆人又怎能实现一个正常人的价值呢。研究出来的克隆人如果连普通人应该享有的幸福都没有，连普通人被社会认可的水平都达不到，这种研究又有什么价值呢？这样的孩子难道不更是让父母担忧和痛苦吗？一个得不到社会认可的克隆人他的人格权、荣誉权又如何得到尊重呢？
克隆技术不成熟
克隆是英文clone的音译，简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与无性繁殖是不同的。无性繁殖是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合、只由一个生物体产生后代的生殖方式，常见的有孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖。由植物的根、茎、叶等经过压条或嫁接等方式产生新个体也叫无性繁殖。绵羊、猴子和牛等动物没有人工操作是不能进行无性繁殖的。科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术。 克隆的基本过程是先将含有遗传物质的供体细胞的核移植到去除了细胞核的卵细胞中，利用微电流刺激等使两者融合为一体，然后促使这一新细胞分裂繁殖发育成胚胎，当胚胎发育到一定程度后，再被植入动物子宫中使动物怀孕，便可产下与提供细胞者基因相同的动物。这一过程中如果对供体细胞进行基因改造，那么无性繁殖的动物后代基因就会发生相同的变化。 克隆技术不需要雌雄交配，不需要精子和卵子的结合，只需从动物身上提取一个单细胞，用人工的方法将其培养成胚胎，再将胚胎植入雌性动物体内，就可孕育出新的个体。这种以单细胞培养出来的克隆动物，具有与单细胞供体完全相同的特征，是单细胞供体的“复制品”。英国英格兰科学家和美国俄勒冈科学家先后培养出了“克隆羊”和“克隆猴”。克隆技术的成功，被人们称为“历史性的事件，科学的创举”。有人甚至认为，克隆技术可以同当年原子弹的问世相提并论。 克隆技术可以用来生产“克隆人”，可以用来“复制”人，因而引起了全世界的广泛关注。对人类来说，克隆技术是悲是喜，是祸是福？唯物辩证法认为，世界上的任何事物都是矛盾的统一体，都是一分为二的。克隆技术也是这样。如果克隆技术被用于“复制”像希特勒之类的战争狂人，那会给人类社会带来什么呢？即使是用于“复制”普通的人，也会带来一系列的伦理道德问题。如果把克隆技术应用于畜牧业生产，将会使优良牲畜品种的培育与繁殖发生根本性的变革。若将克隆技术用于基因治疗的研究，就极有可能攻克那些危及人类生命健康的癌症、艾滋病等顽疾。克隆技术犹如原子能技术，是一把双刃剑，剑柄掌握在人类手中。人类应该采取联合行动，避免“克隆人”的出现，使克隆技术造福于人类社会。 克隆技术研究现状 一、克隆的早期研究 克隆一词是英文单词clone的音译，作为名词，c1one通常被意译为无性繁殖系。同一克隆内所有成员的遗传构成是完全相同的，例外仅见于有突变发生时。自然界早已存在天然植物、动物和微生物的克隆，例如：同卵双胞胎实际上就是一种克隆。然而，天然的哺乳动物克隆的发生率极低，成员数目太少（一般为两个），且缺乏目的性，所以很少能够被用来为人类造福，因此，人们开始探索用人工的方法来生产高等动物克隆。这样，克隆一词就开始被用作动词，指人工培育克隆动物这一动作。 目前，生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。克隆羊“多莉”，以及其后各国科学家培育的各种克隆动物，采用的都是细胞核移植技术。所谓细胞核移植，是指将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核，经显微手术和细胞融合方法移植到去核卵母细胞中，重新组成胚胎并使之发育成熟的过程。与胚胎分割技术不同，细胞核移植技术，特别是细胞核连续移植技术可以产生无限个遗传相同的个体。由于细胞核移植是产生克隆动物的有效方法，故人们往往把它称为动物克隆技术。 采用细胞核移植技术克隆动物的设想，最初由汉斯·施佩曼在1938年提出，他称之为“奇异的实验”，即从发育到后期的胚胎（成熟或未成熟的胚胎均可）中取出细胞核，将其移植到一个卵子中。这一设想是现在克隆动物的基本途径。 从1952年起，科学家们首先采用青蛙开展细胞核移植克隆实验，先后获得了蝌蚪和成体蛙。1963年，我国童第周教授领导的科研组，首先以金鱼等为材料，研究了鱼类胚胎细胞核移植技术，获得成功。 哺乳动物胚胎细胞核移植研究的最初成果在1981年取得——卡尔·伊尔门泽和彼得·霍佩用鼠胚胎细胞培育出发育正常的小鼠。1984年，施特恩·维拉德森用取自羊的未成熟胚胎细胞克隆出一只活产羊，其他人后来利用牛、猪、山羊、兔和猕猴等各种动物对他采用的实验方法进行了重复实验。1989年，维拉德森获得连续移核二代的克隆牛。1994年，尼尔·菲尔斯特用发育到至少有120个细胞的晚期胚胎克隆牛。到1995年，在主要的哺乳动物中，胚胎细胞核移植都获得成功，包括冷冻和体外生产的胚胎；对胚胎干细胞或成体干细胞的核移植实验，也都做了尝试。但到1995年为止，成体动物已分化细胞核移植一直未能取得成功。 二、克隆羊“多莉”的意义和引起的反响 以上事实说明，在1997年2月英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展。实际上，“多莉”的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但这并不能减低“多莉”的重大意义，因为它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性，在分化过程中细胞核中的遗传物质没有不可逆变化；在实践上证明了，利用体细胞进行动物克隆的技术是可行的，将有无数相同的细胞可用来作为供体进行核移植，并且在与卵细胞相融合前可对这些供体细胞进行一系列复杂的遗传操作，从而为大规模复制动物优良品种和生产转基因动物提供了有效方法。 在理论上，利用同样方法，人可以复制“克隆人”，这意味着以往科幻小说中的独裁狂人克隆自己的想法是完全可以实现的。因此，“多莉”的诞生在世界各国科学界、政界乃至宗教界都引起了强烈反响，并引发了一场由克隆人所衍生的道德问题的讨论。各国政府有关人士、民间纷纷作出反应：克隆人类有悖于伦理道德。尽管如此，克隆技术的巨大理论意义和实用价值促使科学家们加快了研究的步伐，从而使动物克隆技术的研究与开发进入一个高潮。 三、近3年来克隆研究的重要成果 克隆羊“多莉”的诞生在全世界掀起了克隆研究热潮，随后，有关克隆动物的报道接连不断。1997年3月，即“多莉”诞生后1个月，美国、中国台湾和澳大利亚科学家分别发表了他们成功克隆猴子、猪和牛的消息。不过，他们都是采用胚胎细胞进行克隆，其意义不能与“多莉”相比。同年7月，罗斯林研究所和PPL公司宣布用基因改造过的胎儿成纤维细胞克隆出世界上第一头带有人类基因的转基因绵羊“波莉”（Polly）。这一成果显示了克隆技术在培育转基因动物方面的巨大应用价值。 1998年7月，美国夏威夷大学Wakayama等报道，由小鼠卵丘细胞克隆了27只成活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代，这是继“多莉”以后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。此外，Wakayama等人采用了与“多莉”不同的、新的、相对简单的且成功率较高的克隆技术，这一技术以该大学所在地而命名为“檀香山技术”。 此后，美国、法国、荷兰和韩国等国科学家也相继报道了体细胞克隆牛成功的消息；日本科学家的研究热情尤为惊人，1998年7月至1999年4月，东京农业大学、近畿大学、家畜改良事业团、地方（石川县、大分县和鹿儿岛县等）家畜试验场以及民间企业（如日本最大的奶商品公司雪印乳业等）纷纷报道了，他们采用牛耳部、臀部肌肉、卵丘细胞以及初乳中提取的乳腺细胞克隆牛的成果。至1999年底，全世界已有6种类型细胞——胎儿成纤维细胞、乳腺细胞、卵丘细胞、输卵管／子宫上皮细胞、肌肉细胞和耳部皮肤细胞的体细胞克隆后代成功诞生。 2000年6月，中国西北农林科技大学利用成年山羊体细胞克隆出两只“克隆羊”，但其中一只因呼吸系统发育不良而早夭。据介绍，所采用的克隆技术为该研究组自己研究所得，与克隆“多莉”的技术完全不同，这表明我国科学家也掌握了体细胞克隆的尖端技术。 在不同种间进行细胞核移植实验也取得了一些可喜成果，1998年1月，美国威斯康星一麦迪逊大学的科学家们以牛的卵子为受体，成功克隆出猪、牛、羊、鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎，这一研究结果表明，某个物种的未受精卵可以同取自多种动物的成熟细胞核相结合。虽然这些胚胎都流产了，但它对异种克隆的可能性作了有益的尝试。1999年，美国科学家用牛卵子克隆出珍稀动物盘羊的胚胎；我国科学家也用兔卵子克隆了大熊猫的早期胚胎，这些成果说明克隆技术有可能成为保护和拯救濒危动物的一条新途径。 四、克隆技术的应用前景 克隆技术已展示出广阔的应用前景，概括起来大致有以下四个方面：（1）培育优良畜种和生产实验动物；（2）生产转基因动物；（3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；（4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。以下就生产转基因动物和胚胎干细胞作简要说明。 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但目前转基因动物的实际应用并不多，除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外，转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长，已进行了10多年，但目前在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验，5～6个药品进入2期临床试验；而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和标记基因（如LagZ基因和新霉素抗生基因）的融合基因导入培养的体细胞中，再通过标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆，然后把此阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中，最后生产出的动物在理论上应是100％的阳性转基因动物。采用此法，Schnieke等（Bio Report，1997）已成功获得6只转基因绵羊，其中3只带有人凝血因子IX基因和标记基因（新霉素抗性基因），3只带有标记基因，目的外源基因整合率高达50％。Cibelli（Science，1997）同样利用核移植法获得3头转基因牛，证实了该法的有效性。由此可以看出，当今动物克隆技术最重要的应用方向之一，就是高附加值转基因克隆动物的研究开发。 胚胎干细胞（ES）是具有形成所有成年细胞类型潜力的全能干细胞。科学家们一直试图诱导各种干细胞定向分化为特定的组织类型，来替代那些受损的体内组织，比如把产生胰岛素的细胞植入糖尿病患者体内。科学家们已经能够使猪ES细胞转变为跳动的心肌细胞，使人ES细胞生成神经细胞和间充质细胞和使小鼠ES细胞分化为内胚层细胞。这些结果为细胞和组织替代疗法开辟了道路。目前，科学家已成功分离到人ES细胞（Thomson等1998，Science），而体细胞克隆技术为生产患者自身的ES细胞提供了可能。把患者体细胞移植到去核卵母细胞中形成重组胚，把重组胚体外培养到囊胚，然后从囊胚内分离出ES细胞，获得的ES细胞使之定向分化为所需的特定细胞类型(如神经细胞，肌肉细胞和血细胞），用于替代疗法。这种核移植法的最终目的是用于干细胞治疗，而非得到克隆个体，科学家们称之为“治疗克隆”。 克隆技术在基础研究中的应用也是很有意义的，它为研究配子和胚胎发生，细胞和组织分化，基因表达调控，核质互作等机理提供了工具。 五、克隆技术存在的问题 尽管克隆技术有着广泛的应用前景，但离产业化尚有很大距离。因为作为一个新兴的研究领域，克隆技术在理论和技术上都还很不成熟，在理论上，分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚；克隆动物是否会记住供体细胞的年龄，克隆动物的连续后代是否会累积突变基因，以及在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。 在实践中，克隆动物的成功率还很低，维尔穆特研究组在培育“多莉“的实验中，融合了277枚移植核的卵细胞，仅获得了“多莉”这一只成活羔羊，成功率只有0.36％，同时进行的胎儿成纤维细胞和胚胎细胞的克隆实验的成功率也分别只有1.7％和1.1％，即使是使用“檀香山”技术，以分化程度较低的卵丘细胞为核供体，其成功率也只有百分之几。 此外，生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。以克隆牛为例，日本、法国等国培育的许多克隆牛在降生后两个月内死去；到2000年2月，日本全国已共有121头体细胞克隆牛诞生，但存活的只有64头。观察结果表明，部分犊牛胎盘功能不完善，其血液中含氧量及生长因子的浓度都低于正常水平；有些牛犊的胸腺、脾和淋巴腺未得到正常发育；克隆动物胎儿普遍存在比一般动物发育快的倾向，这些都可能是死亡的原因。 即使是正常发育的“多莉”，也被发现有早衰迹象。染色体的未端被称为端粒，它决定着细胞能够分裂的次数：每一次分裂端粒都会缩短，而当端粒耗尽后细胞就失去了分裂能力。1998年，科学家发现“多莉”的细胞端粒比正常的要短，即其细胞处于更衰老的状态。当时认为，这可能是用成年绵羊的细胞克隆“多莉”造成的，使其细胞具有成年细胞的印记，但这一解释目前受到了挑战，美国马萨诸塞州的医生罗伯特·兰扎等用培养的衰老细胞克隆牛，得到6头小牛，出生5～10个月后发现这些克隆牛的端粒比普通同龄小牛要长，有的甚至比普通新生小牛的端粒还长。现在还不清楚这一现象的原因，也不清楚为何与“多莉“的情况有巨大差别。但这一实验说明，在一些情况下克隆过程能改变成熟细胞的分子钟，使其“恢复青春”，关于这种变化对克隆动物寿命的影响，还有待于进一步观察。 除了以上的理论和技术障碍外，克隆技术（尤其是在人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应用。但几年来克隆技术的发展表明，世界各科技大国都不甘落后，谁也没有放弃克隆技术研究。这一点上英国政府的态度非常具有代表性，在1997年2月底宣布中止对“多莉”研究小组投资后不到1个月，英国科技委员会就对克隆技术发表专题报告，表明英国政府将重新考虑这一决定，认为盲目禁止这方面的研究并不是明智之举，关键在于建立一定的规范利用它为人类造福。
我从课外书上获知，现在已经有了克隆技术。人只要在植物或动物、人类的身上取下一个细胞，就能克隆出一个和他（它）一模一样的人或物来。我想，假如我成了克隆专家，我一定要克隆出许许多多对人类有益的东西。 假如我会克隆，我一定要将大地上的树木克隆得越来越多。我要让每个山村、每座城市，还有那无边无际的沙漠都被绿色覆盖。而且我克隆出的这种树是速生树，这种树能在半年内长成大树，使大地绿树成荫，四处开满鲜花，四季不败，使大地永远一片生机勃勃的景象。这时，我相信我们的地球一定会变得更加美丽、可爱。 假如我会克隆，我就要克隆出许许多多珍稀动物。如大熊猫、东北虎、朱鹮、扬子鳄等。除了珍稀动物，我还要克隆出许多珍稀植物，比如银杏、水杉、人参等。不仅让它们生长在祖国的各个角落，而且遍布地球的其他各个地方，让“珍稀动植物”这个词语自动消失。到那时，地球村该是多么美丽啊！ 假如我会克隆，我要把那些知识渊博、心地善良却已不在人世的人都克隆出来，让他们和以前一模一样。 但是，要想让这一切变成现实，我必须踏踏实实地学好本领，为这一理想的实现而努力奋斗。
克隆作为新兴的技术在中国早期取得一下成果如下：
1、1963年，中国科学家童第周在1963年通过将一只雄性鲤鱼的遗传物质注入雌性鲤鱼的卵中从而成功克隆了一只雌性鲤鱼。但由于相关论文是发表在一本中文科学期刊，并没有翻译成英文，所以并不为国际上所知晓。
2、2000年6月16日，由西北农林科技大学动物胚胎工程专家张涌教授培育的世界首例成年体细胞克隆山羊“元元”在该校种羊场顺利诞生。“元元”由于肺部发育缺陷，只存活了36小时。同年6月22日，第二只体细胞山羊“阳阳”又在西北农林科技大学出生。2001年8月8日，“阳阳”在西北农林科技大学产下一对“龙凤胎”，表明第一代克隆羊有正常的繁育能力。
据介绍，2003年2月26日，克隆羊“阳阳”的女儿“庆庆”产下千金“甜甜”，2004年2月6日“甜甜”顺利产下女儿“笑笑”。“阳阳”家族实现四代同堂。这不仅表明第一代克隆羊具有生育能力，其后代仍具有正常的生育能力。目前，“阳阳”与她的女儿“庆庆”、外孙女“甜甜”和曾孙女“笑笑”无忧无虑地生活在一起。据介绍，截止2004年5月底，前来参观的各人士已超过100万人次
3、不久前，在河北农业大学与山东农业科学院生物技术研究中心联合攻关下，中国的科技人员通过名为“家畜原始生殖细胞胚胎干细胞分离与克隆的研究”实验课题，成功克隆出两只小白兔——“鲁星”和“鲁月”。这项实验表明中国已经成功地掌握了胚胎克隆，虽然在技术上还没有达到体细胞克隆羊“多利”的水平，但它为中国的克隆技术进步奠定了基础。
之后，中国广西大学动物繁殖研究所成功繁殖体形比普通的兔子大的克隆兔。因为兔子与人类的生理更加接近，克隆兔的成功诞生，有助于人类医学研究。
4、2002年5月27日，中国农业大学与北京基因达科技有限公司和河北芦台农场合作，通过体细胞克隆技术，成功克隆了国内第一头优质黄牛——红系冀南牛。这头名为“波娃”的体细胞克隆黄牛经权威部门鉴定，部分克隆技术指标达到国际水平。冀南牛是我国特有的优良地方黄牛品种，分布在我国河北，主要特点是耐寒、肉多脂少。但目前数量急剧减少，已濒临灭绝。此次成功克隆，对保护我国濒危物种具有深远影响。
5、2002年10月16日中午，中国第一头利用玻璃化冷冻技术培育出的体细胞克隆牛在山东省梁山县诞生。
这头克隆牛的核供体来自于一头年产鲜奶10吨以上的优质黑白花奶牛的耳皮肤成纤维细胞。克隆胚胎经过玻璃化冷冻后移植到一头鲁西黄牛体内，经过281天后于2002年10月16日11点52分产出一头健康的黑白花奶牛。这头克隆牛诞生时体重40公斤，身高80厘米，体长72厘米，胸围80厘米，管围11.5厘米。当天14点20分初乳，14点30分开始站立，当晚能叫、能卧、能蹦，与正常出生的奶牛体征无异。这是中国首例利用玻璃化冷冻技术培育出的第一头体细胞克隆牛。在此之前，中国一直沿用的是鲜胚移植技术，尚未有利用冷冻技术克隆成功的先例。
6、2017年12月27日世界上首个体细胞克隆猴“中中”诞生； 12月5日第二个克隆猴“华华”诞生。该成果标志中国率先开启了以体细胞克隆猴作为实验动物模型的新时代，实现了我国在非人灵长类研究领域由国际“并跑”到“领跑”的转变。生物学顶尖学术期刊“细胞”（Cell）将以封面文章在1月25日在线发表此项成果。
综上所述：克隆在中国早期已经完成山羊、小白兔、黄牛、奶牛、鲤鱼等非灵长类动物，在2017完成灵长类猴子的克隆！
首先克隆一个完整的生物有违伦理。但如果是克隆一个器官，可以造福千万家。七仔看来这种事其实挺可怕的，证明科学进步的同时，也是在跟接近道德底线。
有人说是人生病了克隆一个，然后换了那个克隆人的器官，这是最可怕的。克隆不符合伦理道德，克隆的产品属于自己的兄弟还是子女？总的来说是自己身上的细胞产生的个体，这和为了治病，杀死自己的兄弟或者子女有多大的区别？国家怎么界定克隆人的身份？是人还是动物？是人，医学专家就无权利取他的器官给主体更换，是动物，合理吗？怎么解释？坚决反对克隆，不可以打开潘多拉魔盒！
其次克隆成功了，我想问利用一些其它领域技术是不是已经能实现人类永生不死的梦想了？比如某人克隆自己给自己捐器官，或者把大脑移植到新克隆体里实现永生？反观国外，不是没能力克隆，而是根本不允许克隆。
总而言之，人工干预生老病死，会打破世道轮回，更会产生一批长生不老的有钱有权人，而底层人的生活又变得惊悚了！利用好了是福利，利用坏了那就是负利了！不过有总归比没有好，要用到该用的地方！
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本品口服吸收迅速，达峰浓度时间（tmax）约1h，消除半衰期约6h，蛋白结合率较低（52%～59%），在体内代谢广泛，主要代谢产物为(S)-佐匹克隆-N-氧化物和（S)-N-去甲基佐匹克隆，后者与GABA受体的结合力比艾司佐匹克隆弱，前者与GABA受体无结合力。研究表明，CYP3A4和 CYP2E1酶参与本品的代谢。约10%的艾司佐匹克隆以原形从尿中排泄。食物不影响本品的吸收。
按需服用艾司佐匹克隆等催眠药有利于身体健康。国家支持药房合法按需销售艾司佐匹克隆等催眠药以利于健康。艾司佐匹克隆正作用大，艾司佐匹克隆安全可靠，是普通处方药。艾司佐匹克隆（eszopiclone）为非苯二氮卓类催眠药，(商品名为Lunesta 鲁尼斯塔®， LUNESTA®）是佐匹克隆的立体异构体(S)-zopi- clone,曾用名Estorra。由美国马萨诸塞州Sepracor制药公司生产，2004年12月16日美国 FDA批准用于临床。