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这是报警信号l为低于正常值，h为高于正常值。血液细胞分析仪报告：参数参考范围wbc白细胞数目淋巴细胞数目－中间细胞数目中性粒细胞数目淋巴细胞百分比20-40mid%中间细胞百分比中性粒细胞百分比50-70rbc红细胞数目血红蛋白110-160hct红细胞压积平均红细胞体积80-99mch平均红细胞血红蛋白平均红细胞血红蛋白浓度320-360rdw-cv红细胞分布宽度变异系数红细胞分布宽度标准差血小板数目100－300mpv平均血小板体积分布宽度压积
白细胞有五种，按照体积从小到大是：淋巴细胞，嗜碱粒细胞，中性粒细胞，单核细胞和嗜酸细胞。白细胞计数增多见于急性感染、尿毒症、严重烧伤急性出血、组织损伤、大手术后白血病等。白细胞计数减少见于伤寒及副伤寒、疟疾、再生障碍性贫血急性粒细胞缺乏症、脾功能亢进，X线放射性核素照射，使用某些抗癌药物等。(1) 中性粒细胞：增多和减少的临床意义与白细胞计数相同。(2) 嗜酸性粒细胞：增多见于变态反应，寄生虫病、某些皮肤病、创伤等；减少见于伤寒、副伤寒、使用肾上腺皮质激素后。(3) 嗜碱性粒细胞：增多见于慢性粒细胞性白血病、何杰金氏病、癌转移、铅铋中毒等。(4) 淋巴细胞：增多见于百日咳、传染性单核细胞增多症，慢性淋巴细胞性白血病，麻疹、腮腺炎、结核、传染性肝炎；减少多见于传染急性期、放射病、细胞免疫缺陷等。(5) 单核细胞：增多见于结核、伤寒、疟疾、黑热病、急性传染病恢复期，单核细胞性白血病、亚急性感染性心内膜炎等；减少无意义。1) WBC-白细胞计数WBC增多:生理性增多 饱食,情绪激动,剧烈运动,高温,高寒病理性增多 感染性疾病,严重组织损伤,急性出血,急性中毒,白血病WBC减少: 感染性疾病(流感、风疹等),血液系统疾病(再生障碍贫血,粒细胞减少症, 粒细胞缺乏症),物理及化学因素(放射线,化学物品和化学药物等)2) NEU-中性粒细胞(NEUT%-中性细胞比率,NEUT#-中性细胞数, NEU-b-中性杆状核粒细胞,NEU-s-中性分叶核粒细胞)数量变化:生理变异 剧烈运动、高温或严寒中性粒细胞增多:细菌感染,真菌、寄生虫及病毒感染,白血病中性粒细胞减少:免疫性中性粒细胞减少症,物理化学因素,病毒感染,血液病.3) EO-嗜酸性粒细胞(EO%-嗜酸性粒细胞比率,EO#-嗜酸性粒细胞数)嗜酸性粒细胞增多:过敏性疾病,寄生虫感染,皮肤病,…嗜酸性粒细胞减少:急性感染,…,长期应用肾上腺皮质激素后,均可见减少.4) BASO-嗜碱性粒细胞(BASO%-嗜碱性粒细胞比率,BASO#-嗜碱性粒细胞数)正常人血液中的比例极低,当>2%,绝对计数>×109/L时有临床意义:慢性粒细胞白血病,嗜碱性粒细胞白血病,5) LYM-淋巴细胞(LYMPH%-淋巴细胞比率,LYMPH-淋巴细胞数)淋巴细胞来源于造血干细胞,又分为T细胞、B细胞和NK细胞3个亚群.人体中大约有1012个淋巴细胞,仅有约2%存在于血液中.数量变化:生理变化(年龄、日间变化和体力活动影响)淋巴细胞增多:感染性疾病,淋巴细胞白血病,急性传染病的恢复期淋巴细胞减少:肾上腺皮质激素、抗淋巴细胞球蛋白等治疗后6) MON-单核细胞(MONO%-单核细胞比率,MONO#-单核细胞数)生理性增多:婴幼儿稍高于成人病理性增多:某些恶性血液病,急性传染病或急性感染的恢复期单核细胞减少:意义不大.红细胞压积的测定有助于了解红细胞的增多与减少，当各种原因所致的红细胞绝对值增高时，红细胞压积也会有相应的增加。血液浓缩时红细胞压积可达50%以上，临床上常用于了解脱水病人的血液浓缩程度，作为计算补液量的参考。红细胞压积降低于各种贫血有关，因红细胞体积大小的不同，红细胞压积的改变并不与红细胞数量平行，需同时测定红细胞数量和血红蛋白浓度，并用于计算红细胞各项平均值才有参考价值。红细胞增多症（polycythemia）以红细胞数目、血红蛋白、红细胞压积和血液总容量显著地超过正常水平为特点。血小板平均体积增多：见于血小板破坏过多而骨髓代偿功能良好者，是造血功能抑制排除后首先反映造血功能恢复的指标。血小板平均体积减少：见于骨髓造血功能不良，血小板生成减少。1)PLT-血小板计数血小板减少:生成减少,如再障、急性白血病 ,破坏过多,如原发性血小板减少性紫癜.消耗过多.见于弥散性血管内凝血,血栓性血小板减少紫癜.血小板分布异常导致的血小板减少,如脾大时,血液中可达90%以上的血小板储存在脾脏,导致血液中血小板轻至中度减少.注意:静脉血计数血小板结果稳定,干扰因素少.末梢采血易导致血小板活化、聚集等.2)MPV-平均血小板体积血小板血小板减少症的鉴别:脊髓造血功能受损时,MPV和PLT均减低:血小板破坏增多如ITP,MPV可增大;若脾切除,MPV和PLT均可升高.骨髓造血功能评价:造血功能抑制时, MPV和PLT呈持续减低趋势,功能抑制严重, MPV越小;造血功能恢复时, MPV增高先于PLT升高.MPV增大:巨血小板综合症…反应性血小板增多,如感染、手术…等,MPV正常.3)PCT-血小板比容 凡是PLT和(或)MPV增高,均可导致PCT增大,如原发性与继发性血小板增多症.4)PDW-血小板体积分布宽度 增大有意义,血小板体积大小越是不均一,PDW越大.临床意义待进一步研究.
目的 探讨影响血液细胞分析仪测定血小板(PLT)的因素，排除假性增高和假性降低情况，及时准确地为临床提供可靠的诊治依据。 方法 使用血液细胞分析仪（Sysmex Kx-21）及目视显微镜法同时对160余例血小板数与直方图不符标本进行计数，对比分析。 结果 血小板聚集、小红细胞数量、试剂的质量、抗凝剂的种类及比例、标本放置时间和反复混匀次数、血小板体积异常等均可影响血细胞分析仪准确计数PLT。 结论 血液细胞分析仪并不能完全代替显微镜计数，对PLT计数与直方图不符标本，应分析原因，用显微镜计数或重新采血。【关键词】 血液细胞分析仪；血小板；直方图 血小板（PLT）检测是研究止血与凝血障碍的重要指标之一，也是其他血小板参数可靠性的基础，其检测结果的可靠性至关重要。血小板由于体积小，特别是容易发生粘附、聚集和变性破坏，故常难以准确计数。血液细胞分析仪的普及，大大提高了工作效率，但对血小板检测，其结果往往不很稳定。使用血细胞分析仪检测血小板的影响因素很多，现探讨如下。1 材料与方法 仪器 血液细胞分析仪（Sysmex Kx-21），为日本Sysmex公司产品。 试剂 全部配套试剂和质控液。 检测方法 对日常标本进行分析，并对其中160余例血小板数量与直方图不符标本同时进行目视显微镜计数。2 结果 正常与异常图形PLT镜检结果 见表1。从表1中可以看出，正常图形的标本，两种方法检测血小板的结果，在统计学上，差异无显著性。而异常图形的标本，两种方法检测血小板的结果，差异有显著性。表1 正常与异常图形PLT镜检结果(略) 不同MCV值血细胞分析仪与镜检法PLT结果比较 见表2。在MCV＞70fl时，血细胞分析仪法与显微镜法相比，差异无显著性。在MCV＜70fl时，血细胞分析仪法与显微镜法相比差异有显著性。表2 不同MCV值血细胞分析仪与镜检法PLT结果的比较(略)3 讨论采血过程中因操作缓慢、穿刺不顺、组织液混入，混匀不及时等均可促成血小板（PLT）聚集，导致计数结果偏低。在PLT直方图上提示有大颗粒存在，PLT聚集是影响PLT计数的主要原因。对此种情况进行了显微镜镜检，并与正常图形进行对比，由表1可看出，此种异常图形的出现，绝大部分是由PLT聚集所引起，结果极不可靠，须重新采血。由于血小板（PLT）和红细胞（RBC）是在同一个检测系统中通过颗粒大小来加以鉴别的，大量小红细胞的存在可引起PLT上限区域的改变。在平均红细胞容积（MCV）大于70fl时，仪器一般无PLT上限区域干扰报警，血细胞分析仪法与显微镜法相比，差异无显著性。在MCV小于70fl时，仪器往往提示上限区域有干扰，红细胞直方图上显示有小红细胞存在，如表2所示。研究发现，MCV值越小，小红细胞数量越多，被记录的PLT数就越多，血小板计数值就越高，仪器法与镜检法相比差异越显著。此种现象可用流式细胞技术或二维激光散射技术避免［1］。实际工作中采用手工法亦可获得可靠的血小板计数值。血细胞的检测结果，尤其是血小板（PLT）的结果，直接反映试剂的质量。原则上强调使用与仪器检测原理相匹配的试剂［2］。溶血剂是血细胞分析仪试剂中的主要试剂，能将红细胞溶解，并能使白细胞的体积发生规律性变化。理论上讲PLT计数时的脉冲大小只与稀释液的性能和仪器的设置有关，与溶血剂的性能无关。但实际工作发现，若溶血不完全，由于红细胞碎片冲洗不彻底将引起PLT假性增高。此外，稀释液的渗透压、离子强度等亦可影响检测结果。特别注意的事，试剂应避免污染，否则，杂质微粒会使本底增高，导致最后计数结果偏高。抗凝剂的种类对检测结果影响较大，国际化学标准化委员会（ICSH）推荐用EDTA二钾抗凝。另外，血液和抗凝剂比例也会影响检测质量。血液比例过高时，由于抗凝剂相对不足，血浆中出现微血块的可能性增加。微凝块可能堵塞仪器影响检测结果。如果血少，抗凝剂的浓度增高，血小板会肿胀、崩解、产生正常PLT大小的碎片，从而无法得出正确的结果［3］。齐天蕊等［4］的研究表明，标本放置时间太长，易产生巨大血小板，这种巨大血小板分布于红细胞直方图的100～250fl处，引起血小板计数偏低，平均红细胞容积偏高。此外，全血标本需不断混匀，2h内完成测定。在正常情况下，血细胞分析仪对血细胞体积的识别有明显的体积界限：PLT2～30fl。根据Coulter原理，仪器只识别颗粒大小而不能识别颗粒的性质。当其体积异常超过该仪器设定的阈值，往往会造成误判。从表1来看，大PLT引起仪器计数结果偏低。一般来说，PLT体积异常小的情况极少见，故不作讨论。此外，在血小板（PLT）体积分布图上，2～3fl粒子过高时，图形左移甚至缩窄呈“尖峰”样，此种情况除血小板体积偏小外，常有红细胞碎片、冷凝球蛋白、红细胞夹杂物等引起，一起致计数结果增高［5］。有报道认为，白血病细胞、皮下脂肪滴污染及标本的细菌污染等，亦能引起PLT测定值偏高，有待进一步探讨。由此可见，PLT计数是否准确，应结合直方图进行判断，必要时进行显微镜计数或重新采血。【参考文献】1 朱忠勇.准确计数血小板方法学研究进展.国外医学·临床生物化学与检验学分册，2002，23(3)： 朱芸.不同血液分析仪试剂使用的比较.河北医药，2000，22(11)： 刘健.抗凝剂对血小板及其参数检测结果的影响分析.国际医药卫生导报，2004；10(8)： 齐天蕊.血小板计数误差与标本放置时间关系的探讨.医学文选，2003，22(4)： 李兴武.全自动血细胞分析仪计数血小板影响因素分析及纠正.中国误诊学杂志，2002，2(3)：387-389.作者单位： 201318 上海，上海市南汇区周浦医院检验科
WS/T 4062012 lín chuáng xuè yè xué jiǎn yàn cháng guī xiàng mù fēn xī zhì liàng yào qiú
Analytical quality specifications for routine tests in clinical hematology
ICS 11. 100
C 50
中华人民共和国卫生行业标准
WS/T 4062012 临床血液学检验常规项目分析质量要求
Analytical quality specifications for routine tests in clinical hematology
《临床血液学检验常规项目分析质量要求》由中华人民共和国卫生部于2012年12月25日发布，自2013年8月1日起实施。
临床血液学检验常规项目分析质量要求
本标准按照GB/T 给出的规则起草。
本标准由卫生部临床检验标准专业委员会提出。
本标准起草单位：卫生部临床检验中心、四川大学华西医院、北京协和医院。
本标准起草人：彭明婷、周文宾、谷小林、李臣宾、吴际、陆红、江虹、李建英。
临床血液学检验常规项目分析质量要求
本标准规定了临床血液学检验常规项目（全血细胞计数和凝血试验）的分析质量要求及验证方法。
本标准适用于使用血液分析仪和血凝仪的临床实验室、室间质量评价机构或体外诊断企业的内部质量控制、外部质量评价及检测系统的性能验证。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
WS/T 407 医疗机构内定量检验结果的可比性验证指南
WS/T 408 临床化学设备线性评价指南
CLSI EP9A2 用患者样本进行方法学比对及偏倚评估：批准指南～第二版（Method parison and bias estimation using patient samples: roved guidelineSecond edition）
下列术语和定义适用于本文件。
血液分析仪 hematology *** yzer
血细胞分析仪
主要用于检测血液样本，能对血液中的有形成分进行定性、定量分析，并提供相关信息的仪器。
血凝仪 coagulation *** yzer
血液凝固分析仪
检测凝血功能相关参数的分析仪器。
验证 verification
提供客观证据以认定规定要求得到满足。
携带污染 carryover
由测量系统将一个检测样品反应携带到另一个检测样品反应的分析物不连续的量，由此错误地影响了另一个检测样品的表现量。
精密度 precision
在规定的条件下，独立检测结果间的一致程度，精密度的度量通常以不精密度表示。
不精密度 imprecision
同一实验室用同种方法在多次独立检测中分析同一样品所得结果的离散程度。
批内精密度 withinrun precision
在相同的检测条件下，对同一被测物进行连续测量所得结果间的一致程度。
注：批内精密度又称为重短性。
日间精密度 interday precision
在不同天内对同一被测物进行重复测量所得结果间的一致程度。
线性 linearity
检测样本时，在一定范围内可以直接按比例关系得出分析物含量的能力。
正确度 trueness
一系列检测结果的均值与靶值之间的一致程度，以偏倚表示。
偏倚 bias
同一实验室用同种方法在多次独立检测中分析同一样品所得结果的均值与靶值之间的差异。
注1：靶值可以是参考方法测定值、有证标准物质定值或其他适当定值，如室间质量评价计划的统计值。
注2：偏倚一般通过分析有证标准物质及其他适当参考物质、与参考方法或已知准确度的其他方法（如公认的指定比对方法）比对而获得。
注3：偏倚可用绝对值或相对值表示。
注4：偏倚有方向性，即可能是正偏倚或负偏倚。
准确度 accuracy
单次检测结果与参考值间的一致程度，以误差表示。
总误差 total error
实验室用某方法在多次独立检测中分析某样品所得各个结果值与靶值之差在一定置信区间内的最大允许范围。
可比性 parability
使用不同的检测程序测定某种分析物获得的检测结果间的一致性。结果间的差异不超过规定的可接受标准时，可认为结果具有可比性。
下列缩略语适用于本文件。
APTT 活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time）
CLSI 美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute）
Fib 纤维蛋白原测定（fibrinogen）
Hb 血红蛋白测定（hemoglobin）
Hct 血细胞比容测定（hematocrit）
MCV 平均红细胞容积（mean corpuscular volume）
MCH 平均红细胞血红蛋白含量（mean corpuScular hemoglobin）
MCHC 平均红细胞血红蛋白浓度（mean corpuscular hemogolobin concentration）
Plt 血小板计数（platelet）
PT 凝血酶原时间（prothrormbin time）
RBC 红细胞计数（red blood cell count）
WBC 白细胞计数（white blood cell count）
血液分析仪本底计数各参数的结果应符合表1的要求。
表1 血液分析仪本底计数的检测要求
用稀释液作为样本在分析仪上连续检测3次，3次检测结果的最大值应在允许范围内。
血液分析仪的携带污染率应符合表2的要求。
表2 血液分析仪携带污染检测要求
分别针对不同检测项目，取一份高浓度的临床样本（EDTAK2或EDTAK3抗凝静脉血），混合均匀后连续测定3次；再取一份低浓度的临床样本，混合均匀后连续测定3次。按式（l）计算携带污染率。
式中：
CR 携带污染率；
L1 低浓度临床样本的第1次测定值；
L3——低浓度临麻样本的第3次测定值；
H3——高浓度临床样本的第3次测定值。
不同检测项目所选高、低浓度样本的浓度水平应符合表3的要求。
表3 携带污染率验证样本的浓度要求
批内精密度以连续检测结果的变异系数为评价指标，批内精密度应达到厂家说明书的要求，检测正常浓度水平新鲜血的批内精密度至少应符合表4的要求。
表4 批内精密度检测要求
取一份浓度水平在上述检测范围内的临床样本，按常规方法重复检测11次，计算后10次检测结果的算术平均值和标准差，按照式（2）计算变异系数。
式中：
CV变异系数；
s——标准差；
——算数平均值。
日间精密度以室内质控在控结果的变异系数为评价指标，日间精密度应符合表5的要求。
表5 日间精密度检测要求
至少使用两个浓度水平（包含正常和异常水平）的质控品，在检测当天至少进行一次室内质控，剔除失控数据（失控结果已得到纠正）后按批号或者月份计算在控数据的变异系数。
线性回归方程的斜率在1±0. 05范围内，相关系数r≥或r2≥。WBC、RBC、Hb和Plt项目满足要求的线性范围在厂家说明书规定的范围内。
验证方法按照WS/T 408的要求进行。
正确度验证以偏倚为评价指标，偏倚应符合表6的要求。
表6 正确度验证的允许偏倚
至少使用10份检测结果在参考区间内的新鲜血样本，每份样本检测两次，计算20次以上检测结果的均值，以校准实验室的定值或临床实验室内部规范操作检测系统（如使用配套试剂、用配套校准物定期进行仪器校准、仪器性能良好、规范地开展室内质量控制、参加室间质量评价成绩优良、检测程序规范、人员经过良好培训的检测系统）的测定均值为标准，计算偏倚。
使用不同吸样模式检测样本并报告结果时。
同一台血液分析仪不同吸样模式的结果可比性应符合表7的要求。
表7 血液分析仪不同吸样模式的结果可比性要求
每次校准后，取5份临床样本分别使用不同模式进行检测，每份样本各检测两次，分别计算两种模式下检测结果均值间的相对差异，结果应符合表7的要求。
实验室内的结果可比性以相对偏差为评价指标，相对偏差应符合表8的要求。
新仪器使用前，配套检测系统至少使用20份临床样本（浓度要求见表8），每份样本分别使用临床实验室内部规范操作检测系统和被比对仪器进行检测，以内部规范操作检测系统的测定结果为标准，计算相对偏差，每个检测项目的相对偏差符合表8要求的比例应≥80%。
新仪器使用前，非配套检测系统按CLSI颁布的EP9A9文件与配套检测系统进行比对，至少使用40份临床样本（浓度要求见表8），计算相对偏差，每个检测项目的相对偏差符合表8要求的比例应≥80%。然后再按的方法进行验证。
常规检测仪器使用过程中，至少使用20份临床样本（血细胞计数项目所选标本的浓度水平应符合表8的要求，其他检测项目所选标本应含正常、异常浓度水平各占50%;比对可分次进行）定期（至少半年）进行一次结果比对，每个检测项目的相对偏差符合表8要求的比例应≥80%。
以下情况，可按WS/T 407的方法和要求进行比对：
a） 室内质控结果有漂移趋势时；
b） 室间质评结果不合格，采取纠正措施后；
c） 更换试剂批号（必要时）；
d） 更换重要部件或重大维修后；
e） 软件程序变更后；
f） 临床医生对结果的可比性有疑问时；
g） 患者投诉对结果可比性有疑问（需要确认时）；
h） 需要提高周期性比对频率时（如每季度或每月一次）。
表8 可比性验证的允许偏差及比对样本的浓度要求
WBC
×109 /L
表8（续）
RBC
×1012 /L
Hb
g/L
Plt
×109 /L
准确度验证以总误差为评价指标，用相对偏差表示，相对偏差应符合表9的要求。
表9 准确度验证的允许偏差
至少使用5份质评物或定值临床样本分别进行单次检测，计算每份样本检测结果与靶值（公议值或参考值）的相对偏差，每个检测项目的相对偏差符合表9要求的比例应≥80%。
批内精密度以连续检测结果的变异系数为评价指标，凝血试验的批内精密度应符合表10的要求。
表10 凝血试验批内精密度检测要求
a 异常样本的浓度水平要求大于仪器检测结果参考区间中位值的2倍。
b Fib异常样本的浓度要求大于6 g／L或小于 g/L 。
取3个浓度水平（包含位于正常、中度异常和高度异常）的临床样本（枸橼酸钠抗凝血浆）或质控品各一支，每支样本按常规方法重复检测11次，计算后10次检测结果的算术平均值和标准差，按照式（2）计算变异系数。
日间精密度以室内质控在控结果的变异系数为评价指标，日间精密度应符合表11的要求。
表11 凝血试验的日间精密度检测要求
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至少使用两个浓度水平（包含正常和异常水平）的质控品，在检测当天至少进行一次室内质控，剔除失控数据后（失控结果已得到纠正）按批号或者月份计算在控数据的变异系数。
线性回归方程的斜率在1±0. 05范围内，相关系数r≥或r2≥。Fib 项目满足要求的线性范围在厂家说明书规定的范围内。
验证方法按照WS/T 408的要求进行。
正确度验证结果以偏倚为评价指标，Fib的偏倚应≤10%.
至少使用10份检测结果在参考区问范围内的临床样本，每份样本检测两次，计算20次以上检测结果的均值，以校准实验室的定值或临床实验室内部规范操作检测系统（Clauss法）的测定均值为标准，计算偏倚。
准确度验证以总误差为评价指标，用相对偏差表示，相对偏差应符合表12的要求。
表12 准确度验证的允许偏差
至少使用5份质评物或定值临床样本分别进行单次检测，计算每份样本检测结果与靶值（公议值或参考值）的相对偏差，每个检测项目的相对偏差符合表12要求的比例应≥80%。
[1] CLSI: H26A2 Validation,Verification,and Quality Assurance of Automated Hermatology. Analyzers ; roved StandardSecond Edition. CLSI document. Wayne, Pa. : Clinical and Laboratory Standards Institute; 2010.
[2] CLSI: H57A Protocol for the Evaluation, Validation, and Implementation of Coagulometers, roved Guideline, CLSI document. Wayne, Pa.: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2008.
血细胞分析仪检测血小板影响因素影响策略论文
在当前医疗技术的发展与促进作用之下，血细胞分析仪被广泛应用于基层医院的检验科室当中。实践经验显示：血细胞分析仪作用于检验，具有操作简单，响应迅速、重复性好、以及数据精确度高在内的多方面确切优势[1-2]。但受到自身检测原理的限制性影响，导致在临床对血细胞分析仪进行应用的过程当中，会受到大量内外部因素的影响。特别是对血小板的检测而言，计数结果会受多种因素影响而出现偏差，成为了临床中反应较多的问题之一。从这一角度上来说，如何明确血细胞分析仪在检测血小板过程当中的影响因素，落实相应的纠正与控制方法，这一问题备受医务工作者的关注与重视。本文选取2014年1-3月，健康体检对象共计50例作为研究对象，应用血细胞分析仪对其血小板计数结果进行分析，具体总结如下。
1 资料与方法
一般资料
选取自2014年1-3月，健康体检对象共计50例作为研究对象。对所有入选对象的一般资料进行回顾分析：男27例，女23例，年龄1～72岁，平均(±)岁。
方法
使用希森美KX-21型全自动血细胞分析仪，对所有入选对象进行血小板计数检测工作。由希森美公司提供溶血剂以及稀释液。在空腹状态下，分别实施静脉抽血(血样剂量为2 ml)以及末梢采血(血样剂量为120 μl)，使用 mg单位EDTA抗凝管储存分析。分别实施仪器法以及手工法两种检测方案。计数作业分别进行3次，取平均值作为最终计数结果。
观察指标
对仪器法以及手工法下，不同时间状态下所对应的血小板计数情况进行观察对比，同时对静脉血以及末梢血下的血小板计数检测结果进行对比。
统计学处理
采用SPSS 软件对所得数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，比较采用t检验;P<为差异有统计学意义。
2 结果
在分别应用仪器法以及手工法进行血小板计数的过程当中，即刻测定状态下，仪器法检出数据明显低于手工法检出数据，对比差异有统计学意义(P<);静置10 p="">);静置8 h后，仪器法检出数据明显低于对照组，对比差异有统计学意(P<)，见表1。在不同采血区域进行血小板计数的过程当中，采集静脉血血小板计数为(±)×109 p="">)。
3 讨论
血浆中血小板体积小，无色，且黏附性高。当血液自血管破损位置流出后，血小板一旦与破损血管的内皮细胞或组织成分发生接触反应，则势必会迅速粘附于血管壁之上。再加上在应用血细胞分析仪对血小板进行检测的过程当中，血浆标本需要与抗凝管表面发生接触反应，故而最终导致血小板大量粘附于抗凝管内壁并发生聚集反应，造成血小板计数上的偏差问题[3]。从这一角度上来说，无论是在仪器法还是手工法作用下，所采集血小板数均较实际数据更低。同时，本次研究中数据显示：采集末梢血与静脉血进行对比中，两者所对应的血小板计数结果差异无统计学意义(P>)。但需要注意的是：相较于静脉血而言，末梢血采集中潜在大量的影响因素(包括扎针深度、取血速度等等在内)，都将对最终所生成的血小板计数结果产生影响。因此，在条件允许的情况下，推荐采集静脉血样完成血细胞分析工作。若必须以末梢血进行分析，则要求满足扎针3 mm深度，且血样应当自然流出，以保障血小板检出数据的精确性。
同时，有关研究报道中显示：对于抗凝剂而言，在应用血细胞分析仪对血小板展开检测作业的过程当中，检测结果很大程度上会受到抗凝剂类型的影响[4]。当前，国际化学标准委员会所推荐的抗凝剂为EDTA二钾抗凝，应用该推荐抗凝剂，可最大限度的保障检测结果的`精确性。同时，血液与抗凝剂之间的比例关系也会对检测质量产生相当重大的影响。有关临床研究中指出：在受检血液比例过高的情况下，由于抗凝剂无法与之形成匹配关系，进而可能导致待检测血浆样本当中出现微血块。而微血块的产生势必会导致血细胞分析仪被堵塞，造成检测结果上的偏差。反过来说，在受检血液比例过低的情况下，抗凝剂同样无法与之形成匹配关系，主要表现为浓度的提升，带动血浆样本当中血小板的肿胀与崩解反应，产生大量与血小板大小基本一致的碎片，导致计数过程当中容易发生偏差[5-6]。
同时，本次研究数据中显示：在分别应用仪器法以及手工法进行血小板计数的过程当中，即刻测定数据以及放置8 h后的测定数据组间对比差异有统计学意义(P<)。这一研究数据提示：一方面，在抗凝剂对血小板黏附性以及聚集性进行一致的同时，会导致血小板形态自双凹模式转变为球形模式，体积明显增大，即刻上机测试下，导致血小板测定数据明显较低。而在放置10 p="">)。同时，随着放置时间的延长，血小板计数有一定的下降趋势，且在8 h开始呈现出显著差异，提示测定时间同样是造成血小板计数偏差的关键影响因素之一。
结合相关研究数据而言，无论是对于光散法还是对于阻抗法而言，在应用血细胞分析仪对血小板进行计数的过程当中，结果基本可靠且稳定。但对于存在血小板形态异常以及明显降低的对象而言，不同方法下的计数结果往往会产生较大的差异。因此，在病理因素影响下，血浆中会产生大量的非血小板颗粒，最终导致计数结果假性增多。当前相关报道当中认为能够确保血小板计数准确的方法有两种类型：第一类是建立在免疫学基础之上的计数方法，即使用荧光对血浆样本中的抗血小板抗体进行标记;第二类是建立在激光散射基础之上的测定方法，在激光散射计数干预下，分离非血小板颗粒以及血小板，从而确保计数的准确性[7-8]。但以上两种方法成本较高，普及性较差。故而当前所选取的复查方式主要以手工计数法为主。针对本方法计数精确性上的却是可以增加一项在血涂片上间接计数血小板的方法作为补充，使用抗凝血液推血片，在瑞氏蚺蛇处理下计数1000个红细胞及对应的血小板，根据两者之间的比值，按照血小板计数/红细胞计数×红细胞计数的方式，求得最终数据[9-10]。根据以上措施的落实，配合与临床医师之间的密切联系，能够达到消除血小板计数误差，提高血细胞分析精度的目的。
综上所述，实践工作中需要重视对抗凝剂类型、采血区域、放置时间等影响因素的分析与控制，必要时进行涂片以及直接计数复查，配合与临床医师之间的密切联系，能够达到消除血小板计数误差，提高血细胞分析精度的目的。
参考文献
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这是报警信号l为低于正常值，h为高于正常值。血液细胞分析仪报告：参数参考范围wbc白细胞数目淋巴细胞数目－中间细胞数目中性粒细胞数目淋巴细胞百分比20-40mid%中间细胞百分比中性粒细胞百分比50-70rbc红细胞数目血红蛋白110-160hct红细胞压积平均红细胞体积80-99mch平均红细胞血红蛋白平均红细胞血红蛋白浓度320-360rdw-cv红细胞分布宽度变异系数红细胞分布宽度标准差血小板数目100－300mpv平均血小板体积分布宽度压积
白细胞有五种，按照体积从小到大是：淋巴细胞，嗜碱粒细胞，中性粒细胞，单核细胞和嗜酸细胞。白细胞计数增多见于急性感染、尿毒症、严重烧伤急性出血、组织损伤、大手术后白血病等。白细胞计数减少见于伤寒及副伤寒、疟疾、再生障碍性贫血急性粒细胞缺乏症、脾功能亢进，X线放射性核素照射，使用某些抗癌药物等。(1) 中性粒细胞：增多和减少的临床意义与白细胞计数相同。(2) 嗜酸性粒细胞：增多见于变态反应，寄生虫病、某些皮肤病、创伤等；减少见于伤寒、副伤寒、使用肾上腺皮质激素后。(3) 嗜碱性粒细胞：增多见于慢性粒细胞性白血病、何杰金氏病、癌转移、铅铋中毒等。(4) 淋巴细胞：增多见于百日咳、传染性单核细胞增多症，慢性淋巴细胞性白血病，麻疹、腮腺炎、结核、传染性肝炎；减少多见于传染急性期、放射病、细胞免疫缺陷等。(5) 单核细胞：增多见于结核、伤寒、疟疾、黑热病、急性传染病恢复期，单核细胞性白血病、亚急性感染性心内膜炎等；减少无意义。1) WBC-白细胞计数WBC增多:生理性增多 饱食,情绪激动,剧烈运动,高温,高寒病理性增多 感染性疾病,严重组织损伤,急性出血,急性中毒,白血病WBC减少: 感染性疾病(流感、风疹等),血液系统疾病(再生障碍贫血,粒细胞减少症, 粒细胞缺乏症),物理及化学因素(放射线,化学物品和化学药物等)2) NEU-中性粒细胞(NEUT%-中性细胞比率,NEUT#-中性细胞数, NEU-b-中性杆状核粒细胞,NEU-s-中性分叶核粒细胞)数量变化:生理变异 剧烈运动、高温或严寒中性粒细胞增多:细菌感染,真菌、寄生虫及病毒感染,白血病中性粒细胞减少:免疫性中性粒细胞减少症,物理化学因素,病毒感染,血液病.3) EO-嗜酸性粒细胞(EO%-嗜酸性粒细胞比率,EO#-嗜酸性粒细胞数)嗜酸性粒细胞增多:过敏性疾病,寄生虫感染,皮肤病,…嗜酸性粒细胞减少:急性感染,…,长期应用肾上腺皮质激素后,均可见减少.4) BASO-嗜碱性粒细胞(BASO%-嗜碱性粒细胞比率,BASO#-嗜碱性粒细胞数)正常人血液中的比例极低,当>2%,绝对计数>×109/L时有临床意义:慢性粒细胞白血病,嗜碱性粒细胞白血病,5) LYM-淋巴细胞(LYMPH%-淋巴细胞比率,LYMPH-淋巴细胞数)淋巴细胞来源于造血干细胞,又分为T细胞、B细胞和NK细胞3个亚群.人体中大约有1012个淋巴细胞,仅有约2%存在于血液中.数量变化:生理变化(年龄、日间变化和体力活动影响)淋巴细胞增多:感染性疾病,淋巴细胞白血病,急性传染病的恢复期淋巴细胞减少:肾上腺皮质激素、抗淋巴细胞球蛋白等治疗后6) MON-单核细胞(MONO%-单核细胞比率,MONO#-单核细胞数)生理性增多:婴幼儿稍高于成人病理性增多:某些恶性血液病,急性传染病或急性感染的恢复期单核细胞减少:意义不大.红细胞压积的测定有助于了解红细胞的增多与减少，当各种原因所致的红细胞绝对值增高时，红细胞压积也会有相应的增加。血液浓缩时红细胞压积可达50%以上，临床上常用于了解脱水病人的血液浓缩程度，作为计算补液量的参考。红细胞压积降低于各种贫血有关，因红细胞体积大小的不同，红细胞压积的改变并不与红细胞数量平行，需同时测定红细胞数量和血红蛋白浓度，并用于计算红细胞各项平均值才有参考价值。红细胞增多症（polycythemia）以红细胞数目、血红蛋白、红细胞压积和血液总容量显著地超过正常水平为特点。血小板平均体积增多：见于血小板破坏过多而骨髓代偿功能良好者，是造血功能抑制排除后首先反映造血功能恢复的指标。血小板平均体积减少：见于骨髓造血功能不良，血小板生成减少。1)PLT-血小板计数血小板减少:生成减少,如再障、急性白血病 ,破坏过多,如原发性血小板减少性紫癜.消耗过多.见于弥散性血管内凝血,血栓性血小板减少紫癜.血小板分布异常导致的血小板减少,如脾大时,血液中可达90%以上的血小板储存在脾脏,导致血液中血小板轻至中度减少.注意:静脉血计数血小板结果稳定,干扰因素少.末梢采血易导致血小板活化、聚集等.2)MPV-平均血小板体积血小板血小板减少症的鉴别:脊髓造血功能受损时,MPV和PLT均减低:血小板破坏增多如ITP,MPV可增大;若脾切除,MPV和PLT均可升高.骨髓造血功能评价:造血功能抑制时, MPV和PLT呈持续减低趋势,功能抑制严重, MPV越小;造血功能恢复时, MPV增高先于PLT升高.MPV增大:巨血小板综合症…反应性血小板增多,如感染、手术…等,MPV正常.3)PCT-血小板比容 凡是PLT和(或)MPV增高,均可导致PCT增大,如原发性与继发性血小板增多症.4)PDW-血小板体积分布宽度 增大有意义,血小板体积大小越是不均一,PDW越大.临床意义待进一步研究.
这是报警信号L为低于正常值，H为高于正常值。血液细胞分析仪报告：参数 参考范围WBC白细胞数目 淋巴细胞数目 －中间细胞数目 中性粒细胞数目 淋巴细胞百分比 20-40Mid%中间细胞百分比 中性粒细胞百分比 50-70RBC红细胞数目 血红蛋白 110-160HCT红细胞压积 平均红细胞体积 80-99MCH平均红细胞血红蛋白 平均红细胞血红蛋白浓度 320-360RDW-CV红细胞分布宽度变异系数 红细胞分布宽度标准差 血小板数目 100－300MPV平均血小板体积 分布宽度 压积 L
《激光扫描共聚焦显微镜系统及其在细胞生物学中的应用》摘要激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学图象分析仪器，现已广泛应用于荧光定量测量、共焦图象分析、三维图象重建、活细胞动力学参数监测和胞间通讯研究等方面。其性能为普遍光学显微镜质的飞跃，是电子显微镜的一个补充。本文以美国Meridian公司的ACASULTIMA312为例简要介绍了激光扫描共聚显微镜系统的结构，功能和生物学应用前景。关键词激光；共聚焦显微镜；粘附细胞分析与筛选（ACAS）TheLaserScanningConfocalMicroscopySystemanditsBiologicalApplicationsChenYaowen,LinJielong,LaiXiaoying,MeiPinchao()AhstractTheLaserScanningConfocalMicroscopyisanewmedicalimageanalysisinstrument,(MeridianCo,USA)istakenasanexampletointroducetheprincipleofconfocalmicroscopy,(ACSA)激光扫描共聚焦显微镜（LaserscanningConfocalMicroscopy，简称LSCM）是近代生物医学图象仪器的最重要发展之一，它是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。已广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经生物学等领域[1、2、3]，对生物样品进行定性、定量、定时和定位研究具有很大的优越性，为这些领域新一代强有力的研究工具。创建于1983年的美国Meridian公司，在90年代推出的“激光扫描共聚焦显微镜”这一项具有划时代的义意的高科技产品，曾获得美国“政府新产品奖”和两次“高科技领先技术奖”，它能达到每秒120幅画面的高速扫描激光共聚焦观察，可提供实时，真彩色的激光共聚焦原色图象。我院最近引起的ACASuLTIMA312是Meridian公司最新的高科技产品，为同类仪器中档次最高、功能最全的精密仪器。现以该仪器为例介绍激光扫描共聚焦显微镜系统及其在细胞生物学中的应用。1、激光扫描共聚焦显微镜成像原理及组成有关共聚焦显微镜的某些技术原理，早在1957年就已提出，二十年后由Brandengoff在高数值孔径透镜装置上改装成功具有高清晰度的共聚焦显微镜[5]，1985年WijnaendtsVanResandt发表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生物学中应用的文章，到了1987年，才发展成现在通常意义上的第一代激光扫描共聚焦显微镜。激光扫描共聚焦显微镜成像原理如图1所示，激光器发出的激光束经过扩束透镜和光束整形镜，变成一束直径较大的平行光束，长通分色反射镜使光束偏转90度，经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品中的荧光物质在激光的激发下发射沿各个方向的荧光，一部分荧光经过物镜、长通分色反射镜、聚焦透镜、会聚在聚焦物镜的焦点处，再通过焦点处的针孔，由检测器接收。从图1中可以看出，只有在物镜的焦平面上发出的荧光才够到达检测器，其它位置发出的光均不能过针孔。由于物镜和会聚透镜的焦点在同一光轴上，因而称这种方式成像的显微镜为共聚焦显微镜为共聚显微镜。在成像过程中针孔起着关键作用，针孔直径的大小不仅决定是以共聚焦扫描方式成像还是以普遍学显微镜扫描方式成像，而且对图像的对比度和分辨率有重要的影响。ACASULTIMa312采用快速镜扫描或台阶扫描对样品逐点扫描成像，由于样品中不同的扫描点始终在物镜和会聚透镜的光轴上，因而它以相同的信噪比扫描整个样品，扫描精度达μm，扫描面积最大的为10cm×8cm，当激光逐点扫描样品时，针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，并将之转化为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚聚焦图像。一个微动步进马达控制栽物台的升降，使焦平面依次位于标本的不同层面上，可以逐层获得标本相应的光学横断面的图像。这称为“光学切片”。再利用计算机的图像处理及三维重建软件。可以得到高清晰度来表现标本的外形剖面，十分灵活、直观地进行形态学观察。2、激光扫描共聚焦显微镜硬件和软件系统硬件及参数指标 激光光源：氩离子激光（50mW的紫外光、999mW的可见光），能同时/顺序/分别输出紫外光和可见光，激发波长为351-364nm；488nm；514nm。 计算机系统：80586/133MHzPCI/80MBRAM/2000MBSCSI硬盘/150MBBernoulli盘驱动器/17’’大屏幕显示器。 共聚焦系统：计算机自动控制光路准调节；计算机控制孔径校准；计算机调节孔径大小；自动Z轴调节（最小μm）。 光学探测系统：3个测窗式PMT采集荧光；1个CCD系统；12位的高速A/D转换器。 图像分辨率：图像大小1535×1535；像素最小距离：μm；灰度为4096级。 扫描方式：快速镜扫描DualScan台阶扫描；扫描精度μm；扫描面积最大为10cm×8cm；扫描平面：XY和XZ和独特点、线、面扫描。激光扫描共聚焦显微镜软件系统ACASULTIMa312系统采用独特设计的软件将激光细胞仪与先进的计算机技术结合，产生快速、高效、灵活的操作系统，完备的数据采集、分析与管理功能。基于生物医学研究有如下的软件。ImageAnalyze—对于单色、比色和三色标记的二维荧光图像的定量分析，可产生透射光图像重叠，同时AutoImage可多个区域的自动扫描和荧光定量，以及相同区域的时间顺序扫描。 RatioAnalysis和Kinetics—测定细胞内的离子变化，可有点扫描、线扫描及图像扫描三种测定形式，以监测各种速率的生物反应。 Cell–CellCommunicationandFRAP-相邻细胞的FRAP分析。该软件首先用可光淬灭特异的细胞荧光，然后在多个时间点扫描，此扫描可对单一区域或细胞的多个选择区域，可产生透射光图像并与其它图像重叠。 CellList—储存被选择细胞的位置，即可自动对较大样品进行扫描，又可产生较小样品特异部位的网络位置表，以进行自动的测量、筛选和重复测定。 CellSorting—ACAS具备如下四种分选方式： AblationSort:预选定义一个荧光阈值，然后对特定细胞杀伤。②CookieCutterSort在用户定义的中心点四周切割Cookies。③QuickSort：对已定义的细胞表列，用Ablation或CookieCutter作分选。④ManualSort：直接使用鼠标控制载物台位置及激光脉冲，并杀灭和分选细胞，进行细胞显微外科，染色体切割和光隐阱等操作。 ConfocalImaging—共聚焦分析，可实现Z轴定量，三维立体图像分析（包括SFP模拟荧光处理法，DP深度投影法和SP文体投影法），以及视点移动动画。3激光扫描共聚焦显微镜在细胞生物学中的应用定量荧光测量ACAS可进行重复性极佳的低光探测及活细胞荧光定量分析。利用这一功能既可对单个细胞或细胞群的溶酶体，线粒体、DNA、RNA和受体分子含量、成份及分布进行定性及定量测定，还可测定诸如膜电位和配体结合等生化反应程度。此外，还适用于高灵敏度快速的免疫荧光测定，这种定量可以准确监测抗原表达，细胞结合和杀伤及定量的形态学特性，以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的准确定位及定量信息。定量共聚焦图像分析借助于ACAS激光共焦系统，可以获得生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图像。可得到完整活的或固定的细胞及组织的系列及光切片，从而得到各层面的信息，三维重建后可以揭示亚细胞结构的空间关系。能测定细胞光学切片的物理、生物化学特性的变化，如DNA含量、RNA含量、分子扩散、胞内离子等，亦可以对这些动态变化进行准确的定性、定量、定时及定位分析。三维重组分析生物结构ACAS使用SFP进行三维图像重组，SFP将各光学切片的数据组合成一个真实的三维图像，并可从任意角度观察，也可以借助改变照明角度来突出其特征，产生更生动逼真的三维效果。动态荧光测定Ca2+、pH及其它细胞内离子测定，利用ACAS能迅速对样品的点，线或二维图像扫描，测量单次、多次单色、双发射和三发射光比率，使用诸如Indo-1、BCECF、Fluo-3等多种荧光探针对各种离子作定量分析。可以直接得到大分子的扩散速率，能定量测定细胞溶液中Ca2+对肿瘤启动因子、生长因子及各种激素等刺激的反应，以及使用双荧光探针Fluo-3和CNARF进行Ca2+和pH的同时测定。荧光光漂白恢复（FRAP）--活细胞的动力学参数荧光光漂白恢复技术借助高强度脉冲式激光照射细胞某一区域，从而造成该区域荧光分子的光淬灭，该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散，可通过低强度激光扫描探测此扩散速率。通过ACAS可直接测量分子扩散率、恢复速度，并由此而揭示细胞结构及相关的机制。胞间通讯研究动物细胞中由缝隙连接介导的胞间通讯被认为在细胞增殖和分化中起非常重要的作用。ACAS可用于测定相邻植物和动物细胞之间细胞间通讯，测量由细胞缝隙连接介导的分子转移，研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用，以及胞内Ca2+,PH和cAMP水平对缝隙连接的调节作用。细胞膜流动性测定ACAS设计了专用的软件用于对细胞膜流动性进行定量和定性分析。荧光膜探针受到极化光线激发后，其发射光极性依赖于荧光分子的旋转，而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性，因此极性测量间接反映细胞膜流动性。这种膜流动性测定在膜的磷脂酸组成分析、药物效应和作用位点，温度反应测定和物种比较等方面有重要作用。笼锁—解笼锁测定许多重要的生活物质都有其笼锁化合物，在处于笼锁状态时，其功能被封闭，而一旦被特异波长的瞬间光照射后，光活化解笼锁，使其恢复原有活性和功能，在细胞的增值、分化等生物代谢过程中发挥功能。利用ACAS可以人为控制这种瞬间光的照射波长和时间，从而达到人为控制多种生物活性产物和其它化合物在生物代谢中发挥功能的时间和空间作用。粘附细胞分选ACAS是目前唯一能对粘附细胞进行分离筛选的分析细胞学仪器，它对培养皿底的粘附细胞有两种分选方法：（1）Coolie-CutterTM法，它是Meidian公司专利技术，首先将细胞贴壁培养在特制培养皿上，然后用高能量激光的欲选细胞四周切割成八角形几何形状，而非选择细胞则因在八角形之外而被去除，该分选方式特别适用于选择数量较少诸如突变细胞、转移细胞和杂交瘤细胞，即使百万分之一机率的也非常理想。（2）激光消除法，该方法亦基于细胞形态及荧光特性，用高能量激光自动杀灭不需要的细胞，留下完整活细胞亚群继续培养，此方法特别适于对数量较多细胞的选择。细胞激光显微外科及光陷阱技术借助ACAS可将激光当作“光子刀”使用，借此来完成诸如细胞膜瞬间穿孔、切除线粒体、溶酶体等细胞器、染色体切割、神经元突起切除等一系列细胞外科手术。通过ACAS光陷阱操作来移动细胞的微小颗粒和结构，该新技术广泛用于染色体、细胞器及细胞骨架的移动。4、结语激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学图像分析仪器，与传统的光学显微镜相比，大大地提高了分辨率，能得到真正具有三维清晰度的原色图象。并可探测某些低对比度或弱荧光样品，通过目镜直接观察各种生物样品的弱自发荧光。能动态测量Ca2+、pH值，Na1+、Mg2+等影响细胞代谢的各种生理指标[9]，对细胞动力学研究有着重要的意义。同时激光扫描共聚显微镜可以处理活的标本，不会对标本造成物理化学特性的破坏，更接近细胞生活状态参数测定。可见激光扫描共聚焦显微镜是普遍显微镜上的质的飞跃，是电子显微镜的一个补充，现已广泛用于荧光定量测量，共焦图像分析，三维图像重建、活细胞动力学参数分析和胞间通讯研究等方面，在整个细胞生物学研究领域有着广阔的应用前景。ReferencesKingRG,DelancyPM,Confocalmicrodcopyinpharmacologica;Rescsrch,TrendsinPharmacol,Sci,1994,15:(8):(3\4):71-79(inChinese)PloemJs,(3):191-198(inChinese)YuLifang,3-Dimecsionalrestructionofhumanglomerularcellswithlaserscanningconfocalmicroscopy,CHNESEJOURNALOFMEDICAL,TEST,1995:18(4):229-231MinskyM,
植物细胞工程技术以及应用论文
1 植物细胞工程基础研究
植物细胞工程是建立在工程技术与现代生物科学基础上的科学技术。它的发展依赖于植物学、分子生物学、植物生理学、遗传学、环境工程学、植物营养学等学科共同的发展和进步的，可为研究生物科学提供非常重要的技术。植物发育的生物学是当代植物科学研究的主要内容。离体培养的器官与培养体细胞胚及调控这种步骤已经建立了良好的实验体系，极大地将植物生物学的内容丰富了，而且还加速了发展。植物的薄层细胞培养已经成为了在离体条件下研究生理生化、植株再生、遗传转化的关键技术。并且应用离体培养的技术来探究花器官的发育，已经在多种植物上实现了开花和结实。原生质体培养为研究单细胞提供了较为良好的技术体系，已应用在植物激素的作用机理、植物细胞的分裂、细胞壁生物学、基因表达、物质跨膜运输等多个研究领域。
2 植物细胞工程技术及其应用
2. 1 加倍单倍体技术及应用
利用植物的组织来培养单倍体的植物材料从而获得单倍体植物，然后再通过自然方法或者人工加倍的方法从而获得双倍体植株的技术，被称为加倍单倍体技术。在这种技术中以使用花药和花粉来进行培养的应用最为广泛。利用这种技术来进行花药和花粉培养获得植株，目前已经在 250 多种植物上实验成功。目前，我国在培养花药和单倍体育种这两方面总体已经处于世界的前列，由多名研究者研制的 N6 培养基已经被大量应用在禾本科植物的花药和花粉培养上，现已被当做是国内外花培使用的通用培养基。而且利用花培技术，我国在多种农作物上都培养出了许多新的品种，例如水稻的中花系列的品种、小麦中的京花系列的品种、油菜中的华油一号等这些已经培育成功的品种的'推广，现已在社会和经济方面都取得了很好的效益。
在遗传上面，我们采用花培技术已获得染色体代的换系和附加系的方法，现在也被大量应用在小麦、大麦和一些茄科植物的身上，这种方法对远缘杂交育种的效率有着极大的提高。
植物存在的一种自然现象就是雌核发育。雌核发育就在离体的条件下通过培养一些没有受精过的子房和胚珠以产生单倍体植株，或者是在活体的条件下用不同种类的花粉或者是被物理方法处理过花粉授予其中，以诱导雌核的发育。目前这种培育方法已经在不下 10 种的植物上获得了成功。在离体条件下，诱导孤雌生殖来获得加倍单倍体的这一技术发展的时间很短，不过现在已经开始使用在构建遗传分析、作物的改良与转基因的受体材料。
2. 2 原生质体培养和体细胞杂交
植物细胞工程的核心技术是原生质体培养和体细胞杂交。
为了不出现植物远缘杂交不亲和性，新的种质资源不断创新，为了实现植物遗传转化和进行细胞学的基础研究提供了重要的科学研究基础。粮食作物、蔬菜、果树、花卉、林木等是获得的原生质体再生植株。农作物和经济作物主要是以原生质体培养，从一年生向多年生、从草本向木本、从高等向低等是近年来的植物发展趋势。原生质体培养、体细胞杂交、体细胞杂质种子评价和利用等是我国大量研究方面。世界前列的是第一次获得的原生质体植株种类数量，先进的成果适用主要是在原生质体培养体系的建立和完善、体细胞杂质种子鉴定、新种质的创制等方面。在植物细胞生理和遗传学、基因组学、蛋白质组学研究中的应用主要是以原生质体培养的技术。
2. 3 加强植物细胞工程基础研究
基础科学的进步与发展是植物细胞工程的发展主要平台。转基因植物、植物生物反应器的研究和应用的推进方面是加强研究基础植物代谢工程、植物细胞工程与植物基因工程的快速有机整合，结合分子标记辅助育种技术等。
3 结语
现代生物技术的发展是需要植物细胞工程的研究与应用来推动的。植物细胞工程作为一个很独立的学科和技术研究，为现代农业化高效率、优质性、可持续发展性做出了重大贡献。生命科学技术和工程技术的进步有力推动了植物细胞技术的发展，也大大有效地推进了现代生命科学技术的进一步发展。
加大对植物细胞工程的基础研究创新 ,将为植物细胞工程的进步提供更为广阔的发展平台，为社会主义现代农业科学技术的发展做出更大的贡献。
动物细胞和植物细胞工程制药探讨论文
在日复一日的学习、工作生活中，大家都跟论文打过交道吧，借助论文可以有效训练我们运用理论和技能解决实际问题的的能力。那么你知道一篇好的论文该怎么写吗？下面是我为大家整理的动物细胞和植物细胞工程制药探讨论文，欢迎阅读与收藏。
摘要：
细胞工程是生物制药工业中的关键技术，其在医药领域的应用使得生物制药行业得到了极大的发展，细胞工程制药前景广阔。通过对相关文献和数据的整理和分析，概述了细胞工程制药领域相关技术及其在生物制药工业中应用的意义与展望。
关键词:
细胞工程;生物制药;动物细胞工程;植物细胞工程;转基因;反应器;
1、生物制药及细胞工程概述
生物制药是生物技术的综合利用，从生物体、生物组织、细胞和体液中分离出有效成分，制备用于预防、治疗和诊断的产品[1]。天然的生物材料赋予了生物制药安全性高、副作用小、营养价值较高的特点，这些显着的优势使生物药物越来越受人们的青睐，这也是生物药物市场不断扩大的重要原因之一。
细胞工程是以细胞为研究对象，按照需求利用细胞和分子生物学的理论设计和操作，使细胞在遗传学上的特性发生变化，达到改良或创造新品种的目的，在大规模地培养和繁殖后，最终提取出对人类有利的产品。在工业上，主要包括上游工程(包括细胞培养、遗传操作和保存)和下游工程(包括转化细胞在生物制品生产中的应用)[2]。如今，细胞工程在生物制药工业发挥着不可替代的作用。
2、动物细胞工程制药
、动物细胞工程制药的概述及早期发展
动物细胞工程制药最早能够追溯到20世纪50年代，用动物细胞生产病毒，也就是在生物反应器中培养动物细胞，进行大规模培养后，再接种减毒或灭活的病毒来生产疫苗[3]。常见的动物细胞培养技术流程，一般是先将动物组织分散成单个细胞、细胞群(团)后，接种于培养基中进行原代培养，再经过10～50代的传代培养，就初步得到了需要的细胞系。然而，由于自然界的细胞普遍表达水平低，通过这种方法生产的产品不仅产量低，而且成本高，因此，早期动物细胞培养并没有得到充分的重视。
、杂交瘤技术
杂交瘤技术在20世纪70年代的创建，是动物细胞技术发展新的里程碑。随着杂交瘤技术在工业领域的应用，各种新产物相继出现，在生产用于疾病诊断和治疗的生物制品中具有重要意义[3]。1984年的诺贝尔生理学或医学奖颁给了创立抗原选择抗体学说以及发明单克隆抗体技术的3位科学家。他们提出将能够分泌特异性抗体的B淋巴细胞与能够无限增殖的骨髓瘤细胞融合筛选，形成能产生特定抗体的杂交瘤细胞。这种方法得到的融合细胞可以稳定生产特异性强、效价高的单克隆抗体。
、动物细胞大规模生产技术
动物细胞大规模生产指在人工条件下，在细胞生物反应器内大量培养有用的动物细胞，是生产药品的技术，也是制药业的关键技术。由于动物细胞对外界环境变化高度敏感，细胞培养放大工艺需要从实验室规模逐级放大到生产规模，各个反应器中工艺的差别成为目前放大过程的一大技术挑战[4]。通过动物细胞生产生物制品已成为全球生物产业的主要支柱，目前通过动物细胞培养获得较多的生物制剂是蛋白和抗体。
、动物生物反应器
动物生物反应器可以从转基因动物体内源源不断地获得人类需要的某种蛋白，并进行工业化生产蛋白质。依据产生蛋白部位的不同，可分为多种类型的生物反应器，如血液生物反应器、唾液腺生物反应器等。科学家发现，由于雌性动物的乳腺能够高效表达重组蛋白并进行一定的修饰，乳腺生物反应器成为最被看好的生物反应器发展方向。随着技术的发展，乳腺生物反应器的产物已经扩大到了抗凝血酶、凝血因子、人蛋白，还有各种溶菌酶、超氧化物歧化酶、干扰素等许多具有极高医用价值的酶或细胞因子。作为一种全新的生物生产模式，由于其在生产天然产物时的高产量、低成本的优势[5]，乳腺生物反应器在生物医药行业将得到更广泛的应用。
、动物细胞核移植
动物细胞核移植在细胞工程中同样具有良好的前景。将动物的供体细胞核取出，注入另一个去核并且处于减数分裂中期的卵母细胞，改变细胞的遗传特性，以产生新产品，再将其进行体外培养、繁殖、纯化、提取，最终用于疾病治疗。我国对鱼类的核移植研究最早，“中国克隆之父”童第周在20世纪60年代就完成了世界上第一例鱼类细胞核移植。后来，我国学者又尝试在其他多种品系鱼类之间进行核质融合实验，并利用模式动物斑马鱼，揭示鱼类核移植后再程序化的分子机制，取得了巨大的研究成果，推动了鱼类核移植技术及其他相关领域的快速发展[6]。如今，动物细胞工程在生物制药领域意义重大。由于动物细胞结构的复杂性和分工的明确[7]，动物细胞工程具有巨大的优势。
3、植物细胞工程制药
、植物细胞工程制药的概述及早期发展
将植物直接入药或者从植物体中提取有效成分是一种生产药物的传统方法。随着技术的成熟，处理和提取过程越来越简便，目前多种中药都是这样生产的。但是，这样的方法只适合容易栽培、繁殖速度快的植物，对于那些生长周期长、提取难度大的植物并不适合，所以受到了诸多限制。比如拥有抗癌成分的红豆杉曾因为人们的大规模砍伐，遭受了毁灭性的破坏[8]。
植物细胞工程制药，是将植物细胞作为基本研究单位，对植物细胞进行一系列操作，改变植物细胞生物特性，最终达到改良或培育新品种的目的[9]。应用植物细胞及组织培养，具有杂质少、提取简单、有效成分含量高和培养周期短的优势。植物细胞工程制药目前主要体现在组织及细胞培养、遗传特性改造以及转基因植物等方面。
、植物细胞工程大规模培养
最早提出应用植物大规模提取天然药物的是20世纪50年代美国的科学家，他们从多升发酵罐中得到了大量药用成分呋喃色酮。我国作为植物药用历史最悠久的国家之一，应用细胞培养技术能够帮助我国传统中药材发挥更大的价值。
丹参是具有活血化瘀、通经止痛功效的一味中药，其中的'主要成分——酚酸类和二萜类，药理作用主要表现在对心血管系统疾病的治疗。目前，由于丹参有效成分含量低、生长缓慢，野生丹参资源遭到大规模破坏，加上各地培育出的品种质量良莠不齐等原因，其在数量以及质量上都难以满足市场的供给需求[10]。经过实验研究发现，用一种10L规模的特殊植物组织反应器培养丹参发根，仅用50天，鲜重增殖倍数高达240倍，各种有效成分含量也得到大幅度提升。这是一种非常适合丹参发根生长及产物积累的方法，而且避免了农药等物质的污染。
、植物转基因技术
转基因植物与转基因动物相比有独特的优势，一方面植物细胞具有全能性，细胞培养条件简单且易于成活；另一方面进入植物体的外源基因，可以在与其他植物杂交的过程中积累有益基因优化表达。利用转基因植物也能生产疫苗，以植物作为生物反应器，将携带抗原基因的载体导入受体细胞，在植物体内表达和修饰这类特定抗原，成为具有免疫活性的蛋白质。香蕉、胡萝卜、土豆等都可以作为受体植物。一些转化编码基因的植物疫苗，如HBsAg、LTB、诺沃克病毒等，已被用于预防和治疗乙型肝炎及细菌性腹泻。在生物和临床试验中，均展示了良好的免疫应答，相较于传统疫苗，具有生产成本低、成功率高、易形成规模化生产等优势。尽管植物转基因疫苗的研究还处于起步阶段，但我国报道的转基因植物生物试验已经取得了一些成果[11]，成为我国制药业的重要进步。
、植物生物反应器
植物生物反应器，又名“植物基因药厂”。这种技术拓宽了药用蛋白及疫苗的来源，在降低成本的同时，扩大了生物制药产业规模，并产生了巨大的商业价值。植物生物反应器的研发，对于在全球范围内抢占生物经济制高点有着重要的意义，许多发达国家都已把植物生物反应器的研发列入了国家重点生物技术研究的战略性计划[12]。我国开发植物作为反应器始于20世纪90年代，目前对于植物生物反应器的研发和投入与发达国家还存在一定的差距。在我国“九五”计划对这一项目进行政策扶持后，目前已经取得了大幅度进展[13]。
4、细胞工程制药的意义与展望
研究细胞工程制药的研究进展和前景，对于制药业的发展有重要意义。据统计，世界上50%的医药产品来自细胞工程制药，其中，植物细胞提取物和动物细胞提取物大约各占1/2。细胞工程在生物制药工业中占据重要地位，为新药开发提供了技术操作基础，在治疗免疫性疾病、提升治病疗效、创新医药品等方面都有广泛的应用[8]，细胞工程制药的研究在不断取得突破，其影响和前景也日渐得到展现。如今，生物制药与细胞工程已经紧密联系在一起，随着细胞工程技术在生物制药生产中的普遍应用，生物制药行业发展迅速，取得了巨大的经济效益[14]。
伴随着更多新兴技术的出现和更新，在未来细胞工程制药研发过程中，可以充分利用各种技术平台寻找最佳研究方案。与其他相关领域的结合，也将更好地推动我国生物制药领域的发展。近半个世纪以来，细胞工程制药发展迅猛，并且已在医药领域取得了众多的研究成果。所以，在“十四五”规划期间，应更加重视战略性新兴产业，进一步加快和壮大新一代生物技术的发展。
参考文献
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1、生态学报 2、应用生态学报 3、生物多样性 4、生物工程学报 5、遗传6、生物化学与生物物理进展 7、微生物学报 8、中国生物化学与分子生物学报9、水生生物学报 10、中国生物工程杂志 11、中国科学.C 辑,生命科学 12、生态学杂志 13、微生物学通报 14、应用与环境生物学报 15、生物物理学报16、古脊椎动物学报 17、古生物学报 18、微体古生物学报 19、生物数学学报20、生物技术 21、生命的化学 22、实验生物学报（改名为：分子细胞生物学报）23、生物技术通报 24、生命科学 25、生物学通报
期刊名 molecular biology of the cell 出版周期: 半月刊 中科院杂志分区 细胞生物学分类下的 3 区期刊 ,该杂志由于刊文量越来越大， 影响力大大降低，由开始的7分以上一路下滑 近四年影响因子:2013年度 2012年度 2011年度 2010年度 出版社或管理机构 杂志由 AMER SOC CELL BIOLOGY 出版或管理。 ISSN号：1059-1524 杂志简介/稿件收录要求 Molecular Biology of the Cell, the journal owned and published by The American Society for Cell Biology, publishes papers that describe and interpret results of original research concerning the molecular aspects of cell structure and function. Studies whose scope bridges several areas of biology are particularly encouraged, for example cell biology and genetics. The aim of the Journal is to publish papers describing substantial research
论文解读！新方法首次详细揭示核孔复合物的组装过程doi:在一项新的研究中，来自瑞士苏黎世联邦理工学院和挪威卑尔根大学的研究人员开发出一种方法，使得他们能够首次详细研究大型蛋白复合物的组装过程。作为他们的案例研究，他们选择了最大的细胞复合物之一：酵母细胞中的核孔复合物。相关研究结果近期发表在Cell期刊上，论文标题为“Maturation Kinetics of a Multiprotein Complex Revealed by Metabolic Labeling”。论文通讯作者为苏黎世联邦理工学院的Karsten Weis和Evgeny Onischenko。这些研究人员将他们的新方法称为KARMA（kinetic analysis of incorporation rates in macromolecular assemblies, 高分子组装中掺入速率的动力学分析），该方法是基于研究代谢过程的方法构建出来的。研究代谢的科学家们长期以来一直在他们的研究工作中使用放射性碳，例如，标记葡萄糖分子，然后细胞吸收并代谢放射性碳。这种放射性标记使得人们能够追踪葡萄糖分子或其代谢物出现的位置和时间点。论文详解！挑战常规！染色质既不是固体也不是液体，而是更像一种凝胶doi:基因组生物学中一个自DNA发现以来一直困扰着科学家们的基本问题：在我们的细胞核内, DNA和蛋白的复杂包裹物（即染色质）是固体还是液体?在一项新的研究中，来自加拿大阿尔伯塔大学和美国科罗拉多州立大学的研究人员找到了这个问题的答案。他们发现染色质既不是固体也不是液体，而是更像一种凝胶。相关研究结果近期发表在Cell期刊上，论文标题为“Condensed Chromatin Behaves like a Solid on the Mesoscale In Vitro and in Living Cells”。论文通讯作者为阿尔伯塔大学肿瘤学系教授Michael Hendzel和科罗拉多州立大学的Jeffrey Hansen。Hendzel说，以前，生物化学等领域是在染色质和细胞核的其他组分以液体状态运行的假设下进行的。这种对染色质物理特性的新理解挑战了这种观点法，并可能导致对基因组如何编码和解码的更准确理解。：淋巴结受一种独特的具有免疫调节潜能的感觉神经元支配doi:长期以来，神经系统和免疫系统一直被认为是身体中的独立实体，但是一项新的研究发现了这两者之间的直接细胞相互作用。来自哈佛医学院、布罗德研究所和拉根研究所的研究人员发现，痛觉神经元围绕在小鼠淋巴结周围，可以调节这些淋巴结的活动，而淋巴结是免疫系统的关键部分。相关研究结果近期发表在Cell期刊上，论文标题为“Lymph nodes are innervated by a unique population of sensory neurons with immunomodulatory potential”。这项新研究揭示了介导神经系统和免疫系统之间交谈的细胞。它还为更多关于神经系统如何调节免疫反应的研究铺平了道路。重磅解读！肥胖损伤免疫细胞功能并加速肿瘤生长的分子机制！doi:肥胖与十几种不同类型的癌症风险增加有关，同时也与患者的预后和生存率下降直接相关。多年来，科学家们已经识别出驱动肿瘤生长的肥胖相关的过程，比如代谢改变和慢性炎症等，但他们并未详细阐明肥胖和癌症之间的具体相互作用。近日，一项刊登在国际杂志Cell上题为“Obesity Shapes Metabolism in the Tumor Microenvironment to Suppress Anti-Tumor Immunity”的研究报告中，来自哈佛医学院等机构的科学家们通过研究揭开了这一谜题，研究者发现，肥胖会促进癌细胞在争夺能量的战斗中战胜杀死肿瘤的免疫细胞。研究者表示，高脂肪饮食会降低肿瘤中的CD8+ T细胞的数量和抗肿瘤活性，之所以出现这种情况，是因为癌细胞为了应对脂肪供应的增加而重编程自身的代谢，从而更好地吞噬富含能量的脂肪分子，并剥夺了T细胞的燃料，并能加速肿瘤的生长。研究者Marcia Haigis说道，将相同的肿瘤放在肥胖和非肥胖的环境中，就能够揭示癌细胞会应对高脂肪饮食而对其细胞代谢重新布线；相关研究结果表明，在某种环境中可能有效的疗法或许在另一种环境中不那么有效，鉴于目前肥胖在人群中的流行，或许就需要科学家们进一步研究理解了。阻断脂肪相关的代谢重编程或能明显减少高脂肪饮食的小鼠机体的肿瘤体积，由于CD8+ T细胞是免疫疗法激活宿主机体免疫系统抵御癌症的主要武器，本文研究中，研究人员提出了改进此类疗法的新型策略。癌症免疫疗法能给癌症患者的生活产生巨大影响，但并非每名患者都能获益。如今研究人员知道随着肥胖改变，T细胞和肿瘤细胞之间存在着新陈代谢的拉锯战， 本文研究或许就提供了探索这种相互作用的路线图，这或能帮助我们开始以新的方式思考癌症免疫疗法和联合疗法的作用机制。
molecular biology of the cell是关于细胞生理、分子生物学的杂志。该杂志 在 CELL BIOLOGY (细胞生物学) 同类期刊中的影响因子排名第 51 位。期刊详情：NLM ID：9201390 出版国家：United States 出版地：Bethesda, MD 出版商：American Society for Cell Biology 出版周期：月刊 创刊年份：1992 语言：英语 SCI收录：YES ISSN：1059-1524 (印刷版)1939-4586 (电子版) 1059-1524 (ISSNLinking) 目前收录于：IM PubMed收录：YES 研究领域：细胞生理、分子生物学