人鼠嵌合抗体研究论文

随着分子生物学技术的迅猛发展，为克服鼠源性单抗的异源性反应，人工改造鼠源性单克隆抗体成为现实。1984年出现了嵌合重组抗体技术，1994年美国批准第一个嵌合抗体药物上市，至今嵌合抗体药物总数已有多个，包括Abciximab，Basiliximab，Pdtmximab，Cetuximab等。 基本概念 人-鼠嵌合抗体：利用DNA重组技术将鼠源单抗的轻链、重链可变区插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞进行表达所产生的单克隆抗体(图1)。人-鼠嵌合抗体的人源化程度可达到70%，完整的保留了鼠源单抗的可变区，最大限度的保留了亲本活性，人抗体恒定区的引入则大大降低了免疫原性。 图1：利妥昔单抗：人CD20特异的嵌合单克隆抗体。 IgG抗体分子由2个重链和2个通过二硫键连接的轻链组成。 基本原理 人鼠嵌合抗体基本原理是从分泌某种鼠单抗的杂交瘤细胞基因组中分离并鉴定出重排的功能性鼠VL(轻链可变区)和VH(重链可变区)，经过基因重组分别与人的CL(轻链恒定区)和CH(重链恒定区)区基因按照一定的方式相拼接，克隆到表达载体中构建鼠/人轻重链基因表达载体，并转入适当的宿主细胞表达来制备特异性嵌合抗体(图2)。 图2， 人鼠嵌合抗体制备过程 对于其他类型的人源化抗体，其优势在于，技术路线简单，易于操作;抗体完整性好，在体内滞留时间长;鼠源抗体的亲和力和特异性都得到保留，在临床上得到了良好的反应。 构建人鼠嵌合抗体主要包括：克隆鼠抗体可变区基因，钓取人抗体恒定区基因，拼接鼠抗体可变区基因与人抗体恒定区基因以及构建载体和宿主细胞。详细内容见文章《嵌合抗体的构建》 嵌合抗体的分类 嵌合抗体主要有三种类型： 1、嵌合IgG抗体 目前嵌合抗体的研究主要集中在嵌合IgG(Immunoglobulin G)抗体。其构建基本原理是从生产某种鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞中得到目的抗体V区(variable region)基因，再与人类的C区(constant region)基因重组并克隆到合适载体中，然后转入受体细胞表达(如图1)。 在构建嵌合抗体时应根据不同目的选择不同的C片段。这是因为不同类型的人抗体C区与补体和Fc(fragment crystallizable,Fc)相互作用的能力以及引发细胞溶解的功能不尽相同。在体内免疫系统中，抗体的Fc段和效应细胞相互作用，发挥特异的生物学功能。例如IgE(Immunoglobulin E)可介导炎症反应等，IgM活化补体的能力最强，IgG1的补体活化能力比IgG3强得多，且在ADCC作用(antibody dependent cell mediated cytotoxicity)触发能力上也比IgG3强得多。在与Fc受体的结合能力上IgG1和IgG3最强，IgG4次之，而IgG2几乎检测不到。 2、嵌合Fab和F(ab’)2抗体 嵌合Fab(antigen-binding fragment, Fab)和F(ab’)2(具有两个抗原结合表位的片段)抗体的最大优势就是渗透力强。Fab嵌合抗体制备原理为：将功能性抗体L,H链的V区基因与人的轻链k和H链CH1进行重组，克隆到表达载体中，在转入宿主细胞表达。不过对于大多数该类型的抗体来说，由于亲和力较低，分子量小，很容易被肾小球过滤而从血液中消失，因此大多数不适合单独使用于临床治疗。 为了改善效果，人们把Fab抗体改造成嵌合F(ab’)2抗体，提高了其分子量，其药代动力学也有所改善，取得了一定的治疗效果。 图3，嵌合Fab和F(ab’)2抗体 结语 鼠单抗因为在体内可以引起HAMA(Human anti-mouse antibodies)反应，临床上的应用受到了极大的限制。随着基因重组技术的发展，人们可以对鼠源单克隆抗体进行改造，研究者们便发现了人鼠嵌合抗体—这一最早诞生的基因工程抗体。其有显著的优势：保留亲本的高特异性和高亲和力，在体内有较长半衰期，易于操作等。但是嵌合抗体虽然可以部分解决异种蛋白的排斥问题，但由于其还含有鼠源V区，依然有可能会诱发HAMA反应，干扰抗体疗效，诱发超敏反应，在临床上其应用会受到一定限制。所以随着基因工程技术，细胞工程技术等生物技术的飞速发展，研究者们又相继改造出了人源化抗体和全人源抗体。相信在相关技术的驱动下，单抗会更快更好的适用于临床，从而造福于人类。

1、通过质谱法/RT-PCR/RAC等方法对可变区的进行序列分析，获得重轻链可变区基因序列。2、通过基因合成/RACE/RT-PCR等技术手段，获得重轻链的可变区DNA序列，并将可变区DNA序列亚克隆至含有人抗体恒定区的表达载体上，通过酶切、测序等验证手段，验证质粒构建的准确性。3、制备去内毒素质粒，瞬时转染二氢叶酸还原酶(dhfr)缺陷型CHO细胞系，纯化少量抗体，检测其特异性及亲和力指数SPR。4、经客户确认，建立稳转体系，加压筛选获得稳定表达的细胞株。5、优化表达条件，加压筛选表达效率最高的的细胞株，获得基因工程抗体表达细胞株，建立稳定细胞系。

(1)浆细胞不能无限增殖(2)在体外大量繁殖；产生特异性抗体(3)动物细胞融合；动物细胞培养(4)如图 (5)动物血清(6)胰蛋白酶(7)特异性强、灵敏度高(8)蛋白质工程；嵌合抗体功能；嵌合抗体的结构；基因(9)对人体的不良反应(或过敏反应等副作用)减少