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《包头医学院学报》由内蒙古教育厅主管，由包头医学院主办，《包头医学院学报》编辑部出版，1984年创刊，季刊，2007年改为双月刊，大16开，国内外公开发行。

质谱技术在蛋白质组学中的应用王海龙杨静祁振国岳秀兰(包头医学院生物化学与分子生物学教研室，内蒙古包头014010；赤峰市第一医院’)中图分类号(}so3 文献标识码A 文章编号1006—740X(2006)02—0231一o3蛋白质组学是后基因组时代的一个新领域，它通过在蛋白质水平上对细胞或机体基因表达的整体蛋白质的定量研究，来揭示生命的过程和解释基因表达控制的机理⋯ 。蛋白质组学分为表达蛋白质组学(Ex·pression Proteomies)和细胞图谱蛋白质组学(Cell MapPmteomies)，前者指细胞和组织表达的蛋白质的定量图谱，它依赖二维凝胶电泳图谱和图像分析，它能在整体蛋白质水平上研究细胞的通路，以及疾病、药物和其它生物刺激所引起的紊乱，因此它可能发现疾病标志和阐明生物通路；后者是指通过纯化细胞器或蛋白质复合物，用质谱鉴定蛋白质组分，确定蛋白质和蛋白质相互作用的亚细胞位置 】。9O年代以来随着人类基因组计划的实施，引发了生物信息学(Bioinformaties)的发展，使蛋白质分析发生了革命性的变化。现在将高分辨2一维电泳、高灵敏度的生物质谱和快速增长的蛋白质和DNA数据库三者结合起来，为高通量的蛋白质组学(High throughout Proteomies)铺平了道路 。这里主要介绍质谱技术在蛋白质组学中的应用。收稿日期：2006-03-02作者简介：王海龙(1951一)，男。大学，副教授。l 质谱技术的发展历史1．1 质谱的开发历史要追溯到2O世纪初，Thomson创制的抛物线质谱装置，1919年Aston制成了第一台速度聚焦型质谱仪，成为了质谱发展史上的里程碑。最初的质谱仪主要用来测定元素或同位素的原子量，随着离子光学理论的发展，质谱仪不断改进，其应用范围也在不断扩大，到2O世纪5O年代后期已广泛地应用于无机化合物和有机化合物的测定。现今质谱分析的足迹已遍布各个学科的技术领域，在固体物理、冶金、电子、航天、原子能、地球和宇宙化学、生物化学及生命科学等领域均有着广阔的应用。质谱技术在生命科学领域的应用更为质谱的发展注入了新的活力，形成了独特的生物质谱技术。1．2 基本原理质谱(Mass Spectrometry)是带电原子、分子或分子碎片按质量的大小顺序排列的图像。质谱仪是一类能使物质离化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质量比分离，并检测强度后进行物质分析的仪器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组成 。用于分析的样品分子在离子源中离化成具有不同质量的单电荷分子和碎片离子，这些单电荷离子在加1 J 1 J 1"J 1掩JrL rL r L r L维普资讯 包头医学院学报 第22卷速电场中获得相同动能并形成一束离子，进入由电场和磁场组成的分析器，离子束中速度较慢的离子通过电场后偏转大，速度快的偏转小；在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依然偏转大，速度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们的轨道便相交于一点。与此同时，在磁场中还能发生质量的分离，这样就使具有同一质量比而速度不同的离子聚焦在同一点上，不同质量比的离子聚焦在不同的点上，其焦面接近于平面，在此处用检测系统进行检测即可得到不同质量比的谱线，即质谱。通过质谱分析，我们可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位素构成和分子结构等多方面的信息 J。2 质谱技术种类2．1 电喷雾质谱技术(Electrospray ionization MassSpectrometry，ESI—MS) 是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相⋯ 。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用 j。2．2 基质辅助激光解吸附质谱技术(Matrix AssistedLaser Desorption／Ionization，MALDI) 基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。MALDI产生的离子常用飞行时间检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此质谱很合适对蛋白质、多肽、核酸和多糖等大分子的研究。2．3 快原子轰击质谱技术(Fast Atom BomebardmentMass Spectrometry，FABMS) 一种软电离技术，是用快速隋性原子射击存在于底物中的样品，使样品离子溅出进入分析器，这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析，特别适于多肽和蛋白质的分析研究。FABMS只能提供有关离子的精确质量，从而可以确定样品的元素组成和分子式。而FABMS—MS串联技术的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息，从而使其在生物医学分析中迅速发展起来 ]。2．4 同位素质谱技术是一种开发和应用比较早的技术，被广泛地应用于各个领域，但它在医学领域的应用只是近近几年的事。由于某些病原菌具有分解特定化合物的能力，该化合物又易于用同位素标示，人们就想到用同位素质谱的方法检测其代谢物中同位素的含量以达到检测该病原菌的目的，同时也为同位素质谱在医学领域的应用开辟了一条思路。3 电泳分离后凝胶上蛋白质的质谱鉴定电泳分离后凝胶上的蛋白质，先用适当的蛋白内切酶酶切成肽段，再用质谱鉴定。现有四种制样方法：3．1 凝胶内酶切凝胶内酶切的灵敏度高，是当前广泛采用的样品制备方法。最常用的蛋白内切酶是胰蛋白酶。它在蛋白质主链精氨酸和赖氨酸的C一端进行切割。文献中有多种凝胶内酶切的方法，这里介绍改进后的Wilm的方法。将电泳后凝胶上的蛋白质斑点以最小的体积切下，并将凝胶块切成约lmm 小颗粒，转入小离心管内，加入约5O 的lOOmmol／L碳酸氢铵溶液洗胶粒5min，弃去碳酸氢铵液，加入50pJ乙腈使凝胶脱水1O一15min。若胶粒未完全脱水再用乙腈脱水～次，弃去乙腈液。将离心管置入真空离心蒸发浓缩器内，微加热15rain使胶粒完全干燥。将50pJ新鲜配制的10mmoVL DTY韵100mmol／L碳酸氢铵溶液加入离心管内，使胶粒水化。在56℃加热30rain还原样品，弃去DTr溶液，加入乙腈放置15min，再在Speed Vac微加热干燥15rain，加入5O l 55mmol／L碘乙酰胺的100mmol／L碳酸氢铵溶液，烷基化半胱氨酸残基上的巯基。室温暗室中放置20 min，弃去上清夜，加入50pJ乙腈放置15min，在Speed Vac内干燥。加入2O l胰蛋白酶溶液在4℃放置45—60min使胶粒再水化，加入1O一2o 碳酸氢铵溶液覆盖胶粒，37cI=保温1小时后，放置过夜，所得溶液供质谱分析用。3．2 电洗脱后在溶液中酶解 电洗脱是电泳后从凝胶上回收蛋白质的经典方法。通常蛋白质量多于0．O01 mmol。将含SDS的凝胶与MALDI TOF MS分析结合，可分析亚mmol的蛋白质。Schuh macher等用无SDS pH2．5的乙酸铵作洗脱缓冲液，电洗脱系统的极性相反，蛋白质SDS复合物在原位解离，游离的蛋白质迁移至阴极，用标准蛋白样品实验，回收率达25％～ 56％ [引。3．3 膜上酶切膜上酶切的方法已不常用于质谱分析，因为它的灵敏度低于凝胶内酶切。电转移时不是维普资讯 第2期 王海龙，等．质谱技术在蛋白质组学中的应用 233所有的蛋白质都能有效转移，而且在印迹过程中蛋白质可能丢失。另外从PVDF膜上提取酶切后多肽时效率不高，提取时加Triton 100可以增加多肽的提取效率，但去污剂干扰质谱鉴定 J。3．4 印迹过程中酶切 1999年Bins等报道将固定有胰蛋白酶的膜，置于凝胶和PVDF膜之间在印迹过程中使蛋白质样品发生酶切，为了蛋白质完全酶切，印迹过程需要特殊设计。印迹后的膜用基体溶液浸透后可用MALDI TOF MS直接分析。该法的主要特点是印迹过程中平行进行酶切，其灵敏度不如标准方法 J。4 用肽质量指纹谱鉴定蛋白质蛋白质组学中最有意义的突破是用生物质谱鉴定电泳后凝胶上的蛋白质。质谱技术已取代了生物化学中经典的Edman降解技术¨。。，这是由于质谱技术能进行高通量的分析，能分析蛋白质混合物，而且灵敏。肽质量指纹谱方法最初由Henzel及其同事提出¨ ，很快成为高通量蛋白质鉴定的选用方法。分析时用MALDI TOF MS测定凝胶内酶切后多肽混合物的质量，获得肽质量指纹图谱。蛋白质酶切后生成多肽混合物，可以在蛋白质序列数据库内进行理论预测，并对质谱实测多肽混合物与理论预测的数据进行比较，质谱实测到足够肽段的质量与数据库中一个蛋白质理论预测肽段质量匹配，蛋白质可明确鉴定_1 。随着科学技术的进步，质谱也得到了快速发展，特别是与生物技术的结合，开创了质谱应用的新领域。质谱已成为生命科学研究中非常重要的工具。其研究成果也将大大推动人类基因组的研究，并将使人类对生命的本质，其发生发展过程的认识达到一个前所未有新高度。参考文献[1] 钱小红，盛龙生．生物质谱技术与方法[M]．北京：科学出版社，2003：17．[2] B．N帕拉马克尼．电喷雾质谱应用技术[M]．北京：化学工业出版社，2005：215．[3] 利布来尔．蛋白质组学导论[M]．北京：科学出版社。2005：163．[4] 桑志红．电喷雾电离质谱及其在蛋白质化学研究中的应用[J]．国外医学．药学分册，2000，27(1)：38．[5] Miller GM，Byrd SE，Kuznieky RI．Nature Insight：FunetionalGenomies[J]．Nature，2000，405：819．[6] 张学敏，魏开华，杨松成．生物质谱和蛋白质组技术的应用策略[J]．分析测试学报，2002，21(增)：9．[7] Weaver RF．Molecular Biology[M]．Columbus：McGraw—Hil1．2001：231．[8] 魏开华，杨松成．转印到膜上的蛋白质的质谱分析[J]．质谱学报，2004：20(3)：89．[9] 夏家辉．医学遗传学[M]．北京：人民卫生出版社，2004：241．[10] Benfey PN，Protopapas AD．Genomies[M]．New Jersey：Prenties Hall。2004：202．[11] 冯作化．医学分子生物学[M]．北京：人民卫生出版社，2001：189．[12] 查锡良．医学分子生物学[M]。北京：人民卫生出版社，2003：263．

拥有13个硕士学位授权点。在校全日制本、专科生及硕士研究生为1864人；在校各类成人教育本、专科生885余人。 建筑面积20万平方米。其中教学楼面积25100平方米，有83个教室，可容纳9000余名学生同时上课;图书馆面积21400平方米，有18个阅览室、自习室，同时可供2000人阅览学习，馆藏图书64万余册(种)，电子图书29万余种(册);实验室面积33660平方米，一次性可供4000名学生做实验。公共服务体系日臻完善，建成了现代化的校园计算机网络。现有教职工(含附院、职院)2335名，其中正高职称191名，副高职称467名。有硕士研究生导师191人， 6人获自治区有突出贡献专家称号，17人享受政府特殊津贴。主办的《包头医学院学报》为省级公开发行刊物，2007年获第二届北方优秀期刊奖。形成了一支阵容整齐、结构趋于合理的专业师资队伍，具有培养多层次高级医学专门人才、开展医学科研的实力和优势。现有自治区重点学科1个，院级重点学科5个；有4个研究所和5个研究室，这些研究机构都有较高的学术水平和较好的教学、科研条件。近几年，承担科研课题64项，多次获得研究成果，其中有33项成果获得省、市级奖励。学院图书馆藏书万册，外文图书万册，期刊杂志735种，拥有“中国生物医学文献光盘数据库”和“中文生物医学期刊数据库存”。有供外语学习的现代化的外语语音室和调频发射台；学院设有设备较先进的计算机网络中心；办有《包头医学院学报》、《包头医学院院刊》。 学院重视师资队伍建设，制定并认真实施了教师队伍建设规划，成效明显。学院现有专任教师379名，其中具有硕士及以上学位的教师占，生师比为: 1，医学门类生师比为: 1，有高级专业技术职务的教师占, 45岁以下教师占，有外校学缘的教师占，形成一支职称、学位、年龄、学缘等结构较为合理的师资队伍。根据教学需要积极扩大师资队伍的同时，始终关注师资队伍的建设水平，重视改善师资队伍的职称、学位、年龄和学缘结构。近三年，共选派130人赴国内外院校深造学习，已有22人通过在职学习获得硕士及以上学位，有36人在职攻读硕士、博士学位；引进优秀人才118人，其中具有正高职称的5人，副高职称的2人，具有硕士及以上学位的109人。学院在编的具有教师专业技术职务的人员有338人，其中教授、副教授148人，占师资总数的；具有硕士及以上学位的教师有184人，占师资总数的；45岁以下的教师有 261 人，占师资总数的 %；具有外校学缘的教师有222人，占师资总数的。师资队伍的职称结构、学位结构、年龄结构、学缘结构逐渐优化，发展趋势良好，符合教育部对高等学校师资队伍职称结构的基本要求。始终坚持以学科建设为龙头，出台了加强学科专业师资队伍建设的一系列规章制度，努力营造有利于高层次人才引进和成长的环境。现有各级各类学科带头人17名，硕士研究生导师163人，自治区有突出贡献的中青年专家6人，享受政府特殊津贴者17人，入选国家“新世纪百千万人才工程”人才 1人，入选自治区“新世纪321人才工程”二层次人才7人，入选自治区高等教育“111人才工程”二层次人才1人。学院十分重视青年教师的成长，关心他们的工作、学习和生活。通过青年教师岗前培训、举行青年教师讲课比赛、资助青年教师提升学历层次、为青年教师配备指导教师等措施，促进青年教师迅速成长。“十一五”期间，学院在增加教师数量的基础上，将进一步采取有效措施，以培养学科带头人、中青年骨干教师为重点，全面提高教师队伍的整体素质。随着学生人数的增加，专任教师数量也同步增加，确保生师比控制在16:1以内，专任教师中具有硕士及以上学位的比例达到60%以上。为此，学院将采取如下措施：加大人才引进和师资队伍补充力度，对引进的高层次人才提供安家费、科研启动费等；加大对教师攻读学位的资助和奖励力度，鼓励教师以各种形式攻读学位，对高学历优秀人才在出国进修等方面予以支持；积极组织教师申报国家留学基金，支持教师到国内外高水平大学进修学习、合作研究或参加培训；遴选校级学科带头人和学术骨干，对学科带头人、学术骨干在出国进修、申报科研项目等方面给予倾斜，并积极推荐他们参加国家和自治区各种高层次人才的评选和培养. 1998年1、临界高血压左心室肥厚及舒张功能与动态血压的关系；2、无创性心功能检测的基础理论研究及临床应用。 1999年1、神经外科手术入路的研究；2、用自创足蹬复位法治疗髋关节前后脱位的临床研究；3、指掌侧固有 神经的纤维解剖分支分布关系及临床应用；4、眼球挫伤与血清锌、铜的关系研究；5、20%甘露醇颈动脉推注抢救脑血管病后天幕疝形成观察研究。 2000年1、用足蹬复位法治疗髋关节前后脱位的临床研究；2、指掌侧固有神经的纤维解剖分支分布关系及临床应用；3、反流性食管炎病理机制及治疗的研究；4、包头市区小学生单纯性肥胖症易患因素及对健康影响的研究；5、功能性消化不良的胃电图研究。 2001年1、动态血压及偶测血压与高血压预后的关系；2、中国北方七群体红细胞血痕ADA、AK1、EAP的遗传多态性研究；3、丙咪嗪、尼莫地平及两者联合应用抗抑郁作用的实验药理学研究；4、脊髓空洞症的外科治疗；5、心率变异谱分析的基础理论研究及临床应用。 2002年1、内蒙地区TT病毒流行情况及可能临床意义的研究；2、包头市老年人心理状况分析及生活质量评价；3、上皮性卵巢癌G－CSF受体的研究；4、老年单纯收缩期高血压左心室收缩功能的评价；5、 解脲支原体感染与不孕症的关系。 2003年1、知识分子代谢综合征及相关疾病和因素研究；2、利用复合菌种多次发酵制作马奶制品；3、乙型肝炎病毒C区基因变异与干扰素疗效的关系；4、 半导体激光对颅脑损伤患者血浆中NO SOD影响的研究。 2004年1、黄芪及不同蛋白饮食对肾病综合征大鼠代谢及疗效作用观察；2、经内镜以点带面内外引流治疗胆道梗阻研究；3、《基础医学课程实验指导》；4、教学评估指标体系的设计研究与应用；5、新型肝炎相关病毒TTV分子流行病学及临床意义的研究。 2005年1、溃疡性结肠炎病例对照的研究；2、包头市交通道路事故流行病学特征分析及趋势预测；3、《基础医学课程实践指导》；4、促红细胞生成素对血透患者一氧化氮、内皮素、血管紧张素Ⅱ影响研究；5、贺普丁治疗慢性乙肝过程中病毒基因变异的研究。 2006年1、幽门螺杆菌和自由基（No）与胃粘膜病理改变的关系；2、ACE基因多态性与蒙古族原发性高血压关系的研究；3、ACE基因多态性与脑血管疾病关系的研究；4、慢性肾功能衰竭与慢性炎症反应状态；5、T淋巴细胞亚群在自身免疫性甲状腺疾病合并2型糖尿病中的临床实验研究。 2007年1、促红细胞生成素对血透患者一氧化氮内皮素血管紧张素Ⅱ影响的研究；2、ACE基因多态性与脑血管疾病关系的研究；3、肽网支架自体骨移植颅骨缺损再造成形术；4、内蒙古汉族IgA肾病患者TNFß基因多态性与临床特征和病理类型关系的研究；5、血管紧张素Ⅱ-Ⅰ型受体（AT1R）基因多态性在脑血管疾病中的意义。