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液相色谱法测定猪和牛脂肪中孕酮残留量 下载带有 Google 工具栏的 Firefox， 上网冲浪更惬意 作者; 姜维，方晓明，唐毅锋，庞国芳 【摘要】 目的 建立脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮残留量的测定方法。方法 色谱柱：Kromasil C18（250mm×，5μm）；流动相：乙腈-水（65:35）；流速：；柱温：35℃；检测波长：292nm；进样量：40μl。结果 样品的室内加标平均回收率为％～％，室内相对标准偏差为％～％，室间加标平均回收率为％～％，室间相对标准偏差％～％，定量测定低限（LOQ）为10μg/kg。结论 本方法简便，准确，可用于脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮残留含量的测定。 【关键词】 高效液相色谱法;脂肪;醋酸美仑孕酮;醋酸甲地孕酮;醋酸氯地孕酮 Determination of progestones in fat of beef and pork by HPLC 【Abstract】 Objective To establish the determination method of melengestrol acetate，chlormadinone acetate and megestrol acetate in fat of beef and Chromatographic separation was carried out on a C18column（250mm×，5μm）and acetonitrile-water (65:35) as the mobile flow rate was ; the column temperature was 35℃; the detection wavelength was 292nm; the injection volume was 40μ The intra-laboratory average recoveries ranged from ％～％ and RSD of ％～％.The inter-laboratory average recoveries added to standard ranged from ％～％ and RSD of ％～％.The lowest limit of quantitation (LOQ) is 10μg/ The method is simple and is suitable for the determination of melengestrol acetate，chlormadinone acetate and megestrol acetate in fat of beef and pork. 【Key words】 HPLC; fat; melengestrol acetate; chlormadinone acetate; megestrol acetate 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮为合成的孕激素类药物，有明显的孕激素和抗雄激素作用，可抑制排卵。孕激素对垂体促性腺激素的释放有一定的抑制作用，动物实验表明有死胎率增加和致畸作用，副作用有：(1)恶心、头晕、倦怠；(2)突破性出血；(3)孕期服用，会增加女性后代的男性化作用。孕激素类药物能增强体内物质沉积和改善生产性能，可以很快产生显著和直接的经济效益，因此，对生产者有很大的吸引力。畜牧业中使用孕激素类药物(非治疗用途)已有很长的历史，但人类长期食用含有激素的肉制食品，即使含量甚微，亦会明显影响机体的激素平衡，而且有致癌危险，对幼儿造成发育异常等危害。因此，开发一种能检测孕酮残留量的方法是十分必要的。 检测孕激素类药物的方法有很多，如液相色谱/质谱法（LC/MS）〔1〕、气相色谱/质谱法（GC/MS）〔2，3〕和液相色谱法〔4～6〕等。本文采用高效液相色谱法对牛和猪脂肪样品中的孕酮进行检测。 1 试剂与仪器 试剂 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准品（Sigama公司），乙腈（HPLC级），甲醇（HPLC级），乙酸乙酯（HPLC级），其他试剂为分析纯。水由Milli-Q净化系统（Millipore公司）制得。 （1）标准储备液：1000μg/ml，分别准确称取醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准品于50ml容量瓶中，用甲醇定容。于4℃保存，可使用一年。 （2）混合中间溶液I：100μg/ml，分别吸取醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准储备液于100ml容量瓶中，用甲醇定容。于4℃保存，可使用一年。 （3）混合中间溶液II：μg/ml，取混合中间溶液I于100ml容量瓶中，用甲醇定容。于4℃保存，可使用半年。 （4）混合标准工作液：分别吸取10、20、40、80、100μl混合中间溶液II添加到980、970、950、910、890μl的乙腈-水（65:35）中，再加入10μl 盐酸溶液，混匀，得到浓度为μg/ml、μg/ml、μg/ml、μg/ml和μg/ml混合标准工作液，供液相色谱测定，当日使用。 仪器 Waters液相色谱系统，510泵体，486紫外-可见光检测器，Emprower pro色谱软件。氮气吹干仪（Organomation Associates，Jnc.公司）；固相萃取装置（Supelco公司）；低温离心机（德国Eppendorf公司）；涡旋混匀器（XW-80A型，上海医大仪器厂）；CN固相萃取柱（3ml，Waters公司）。 2 测定步骤 试样的制备与保存 试样的制备 把大约5g的猪或牛脂肪组织切成小块，然后放入底部塞有玻璃棉的漏斗中，放入150ml的烧杯中，将烧杯置于微波炉内。根据所熬制脂肪量，使用最大功率，加热30～60s，如果脂肪没有融化，可在间隔30～60s以后重复加热30～60s，直到有液体脂肪流出，通过漏斗滴入烧杯中。把熬制好的脂肪油放入样品瓶中，密封，并做上标记。 样品的保存 把熬制好的脂肪油样品置于-18℃中，冷冻保存。 提取 称取熬制好的脂肪油±，置于50ml具塞离心管中，加入5ml乙腈，于60℃水浴中保温3min以使固体脂肪溶化，涡旋振摇1min，在-5℃下离心7min（离心力1160g），吸取上清液至15ml带塞聚丙烯离心管，再在沉淀物中加入5ml乙腈重复提取一次，合并上清液。在合并的乙腈提取液中加入2×2ml正己烷，涡旋振摇1min，于-5℃中离心5min（离心力1160g），弃去正己烷层。乙腈提取液于60℃中用氮气吹干仪吹干，残渣待皂化。 皂化 在残渣（项）中依次加入4ml正己烷、1ml 氢氧化钠溶液和氯化镁溶液，于涡旋混匀器上快速混匀10s，在60℃水浴中保温15min，于-5℃中离心5min（离心力1160g），吸取上清液至15ml玻璃试管。在沉淀物中再加入4ml正己烷混匀后，在60℃水浴中加热15min后，在-5℃中离心5min（离心力1160g），合并上清液。于60℃中用氮气吹干仪吹干，用正己烷溶解残渣，待净化。 净化 将皂化后的样液（项）倒入经5ml乙酸乙酯和6ml正己烷预处理过的CN柱中，用2×1ml正己烷润洗玻璃试管，洗液倒入到CN柱中。待样液流过后，依次用5ml正己烷和6ml 5%乙酸乙酯的正己烷溶液淋洗柱子，随后打开真空泵将小柱中液体抽干，保持抽气2min。最后用 20%乙酸乙酯的正己烷溶液洗脱，洗脱液收集于15ml玻璃试管中，于60℃中用氮气吹干仪吹干。残余物用990μl乙腈-水（65:35）涡旋溶解，静止15min后，加入10μl 盐酸溶液，混匀，供液相色谱测定。 测定 液相色谱条件 色谱柱：Kromasil C18柱（250mm×，5μm）；预柱：C18柱（×，5μm）；流动相：乙腈-水（65:35）；流速：；柱温：35℃；检测波长：292nm；进样量：40μl。 液相色谱测定 根据样液中3种孕酮的含量情况，选定浓度相近的标准工作液，标准工作液和样液中3种孕酮的响应值均应在仪器检测的线性范围内。标准工作液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，标准品的色谱图见图1。 图1 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮的色谱图（100ng/ml）1-醋酸甲地孕酮，2-醋酸氯地孕酮，3-醋酸美仑孕酮 液相色谱法测定猪和牛脂肪中孕酮残留量 来自: 免费论文网 3 结果与讨论 线性范围 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮浓度在～μg/ml范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系，其相关系数（γ2）均大于。 回收率、精密度和定量检测限 本实验以2种脂肪（牛脂肪和猪脂肪）作为样本。取适量标准品加入到样品中，使添加量相当于10、20和50μg/kg，每个添加水平各取24份试样（每种脂肪各12份）。图2为空白脂肪样品和添加样品（10μg/kg）的色谱图。表1为醋酸美仑孕酮，醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮外标法测得的室内回收率和精确度。表2为8家实验室的室间回收率和精确度结果。根据回收率试验，能可靠测得的最低浓度确定定量检测限（LOQ），LOQ为10μg/kg，满足残留限量的检测要求。 （A） （B） （C） （D） 图2 空白脂肪样品和添加样品（10g/kg）的色谱图A：牛脂肪空白样；B：猪脂肪空白样；C:牛脂肪添加样；D:猪脂肪添加样 表1 室内回收率和精确度的结果 (每一添加量，n=24) 表2 8家实验室室间回收率和精确度的结果 (每一添加量，n=32) 【参考文献】 1 Hooijerink H，van Bennekom EO，Nielen for gestagens in kidney fat using accelerated solvent extraction and liquid chromatography-electrospray tandem mass Chim Acta，2003，483(1-2): 51-59. 2 Neidert EE，Gedir RG，Milward LJ，et and qualitative confirmation of melengestrol acetate residues in beef fat by electron-capture gas chromatography and gas-chromatographic chemical-ionization mass Agric Food Chem，1990，38(4): 979-981. 3 Impens S，Courtheyn D，de Wasch K，et analysis of anabolic steroids in kidney fat by downscaling the sample size and using gas chromatography-tandem mass Chim Acta，2003，483(1-2): 269-280. 4 Gaver RC，Movahhed HS，Farmen RH，et procedure for the quantitative analysis of megestrol acetate in human Pharm Sci，1985，74(6): 664-667. 5 Overdiek JWPM，Hermens WAJJ，Merkus of the serum concentration of spironolactone and its metabolites by high-performance liquid Chromatogr B，1985，42(2): 279-285. 6 Campbell HM，Sauve determination of melengestrol acetate in AOAC Int，1993，76(6): 1163-1167. 液相色谱法测定猪和牛脂肪中孕酮残留量 来自: 思想汇报网参考资料：

驳论是就一定的事件和问题发表议论，揭露和驳斥错误的、反动的见解或主张。驳斥错误的、反动的论点有三种形式：①直接驳斥对方的论点。先举出对方的荒谬论点，然后用正确的道理和确凿的事实直接加以驳斥，揭示出谎言同事实、谬论与真理之间的矛盾。有的文章，首先证明与论敌的论点相对立的论点是正确的，以此来证明论敌的论点是错误的。②通过批驳对方的论据来驳倒对方的论点。论据是论点的根据，是证明论点的。错误和反动的论点，往往是建立在虚假的论据之上的，论据驳倒了，论点也就站不住脚了。③通过批驳对方的论证过程的谬误（驳其论证）来驳倒对方的论点。驳倒了它的论证中关键问题，也就把谬论驳倒了。驳论文的驳法有三种：反驳论点、反驳论据、反驳论证。反驳论证相对于前两者更高了一个层次。议论虽有立论、驳论两种方式，但两者不是完全分开的。驳和立是辨证的统一。在立论性的文章中，有时也要批驳错误论点；在驳论性的文章中，一般也要在批驳错误论点的同时，阐明正确的观点。因此，立论和驳论在议论文中常常是结合起来使用的。直接驳和间接驳的差别①如果直接以论点出发，那就算是直接驳论②如果通过各种论据来反驳论点的算间接驳论③如果从始至终都通过论点论据来论证中心的，就是典型的驳论文，如鲁迅先生的《友邦惊诧论》就是典型的驳论文章。总之，写驳论性的文章，还应注意以下几点：①要对准靶子。写驳论性的文章，首先要摆出对方的谬论或反动观点，树起靶子。怎样树起靶子呢？通常有两种方式。一是概述。即用概括的语言，将所批驳的敌论复述一下。并且还要强调出敌论的弊端。概述时，可适当引用一些原词句，但要有重点，倾向性要鲜明。二是摘引。即把反面材料的关键部分或有关部分，摘录下来，然后对准靶子，进行驳斥。可以引用一些较为典型的事例，和古典名句。更加强有力的证明自己的观点。②要抓住要害。鲁迅说：“正对‘论敌’之要害，仅以一击给予致命的重伤。”对谬论，一定要抓住其反动本质，深入地进行揭露和批判。③要注意分寸。对于敌人的反革命谬论和人民内部存在的错误思想，必须加以区别。对敌人，要无情揭露，痛加批驳，给以致命打击；对于人民内部的错误思想，就要本着“团结——批评——团结”的原则，决不可相提并论。古典文学常见论文一词，谓交谈辞章或交流思想。当代，论文常用来指进行科学研究和描述科研成果的文章，简称之为论文。它既是探讨问题进行科学研究的一种手段，又是描述科研成果进行学术交流的一种工具。它包括学年论文、毕业论文、学位论文、科技论文、成果论文等，总称为论文。论文一般由 题名、 作者、 摘要、 关键词、 正文、 参考文献和附录等部分组成，其中部分组成（例如 附录）可有可无。论文题目要求准确、简练、醒目、新颖。目录目录是论文中主要段落的简表。（短篇论文不必列目录）内容提要是 文章主要内容的摘录，要求短、精、完整。1、先确立一个论点。全文围绕这一论点展开论证。对“开卷有益”这种说法，既不能全盘否定，写驳论文；也不宜全盘肯定，写成立论文。因为这种说法既有它正确的一面。又有它不够全面的地方，所以对这个看法要采取“一分为二”的方法进行分析，肯定其有益的一面，否定其有害的一面，从中总结出正确的论点来。只有这样才能对这一说法作出合乎事实的评价，最终达到以理服人的目的。2、运用“一分为二”的方法进行分析，要防止出这样一个毛病：自相矛盾。一会儿说开卷有益，一会儿说开卷有害，令人不知所云。为了避免这种现象，文章中还要将二者的联系点明，才算把道理真正说透。3、从论证方法看，如果所读的书是坏书，则开卷未必有益，这里可以采取例证法，并辅之以引证法和喻证法，用前几年社会上黄书泛滥成灾毒害青少年作为事实论据，用名人名言作为理论论据，充分论证黄书的害处和读好书的益处。在此基础上，再把这两者辩正地统一起来。说明我们中学生既要多读书，又要慎重地加以选择、读好书。这样从正反两方面进行论证，就将问题说得比较全面而深刻，文章也就具有了不可辩驳的逻辑力量。导思：这是一篇给材料作文。该题虽然规定了作文题目，但仍给学生思维留下了很大的空间，从文体来看，写议论文是最好的选择。学生可以从是非观、处世态度、治学精神等方面谈自己的看法，阐述自己的见解和主张。要写好议论文，必须做好以下三点：1、确定论点。根据命题提供的材料，可从不同角度提炼出诸多观点，但短短600字的文章不可能面面俱到。因此，一定要选准一个论点充分论证。2、选好论据。论据能起到充分证明论点的作用，论据选择要遵循两个原则：①真实确凿，不能有虚假成分；②具有典型性，有说服力，才能发挥更大的作用。3、组织好论证结构。最常用的结构一般为“提出问题（引论）——分析问题（本论）——解决问题（结论）”。