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0引言脆性X综合征（fragile X syndrome, FXS）是一种最常见的遗传性智力发育不全综合征，有超过99%的FXS是由脆性X智障基因1（fragile X mental retardation, FMR1）中5′端非编码区CGG三核苷酸重复序列不稳定扩增及其CpG岛异常甲基化导致. FMR1基因的表达产物FMRP的缺乏导致FXS的发生［1-2］. 本实验对编码基因存在于3号染色体［3］，能与FMR1 基因5′ d (CGG)n3′重复序列特异性结合的蛋白CGGBP1进行原核表达，并对其DNA结合活性进行研究.1材料和方法1.1材料大肠杆菌DH5α, BL21（ DE3）和表达载体pRSET A均为本实验室保存. 质粒提取试剂盒购自Sigma公司； 限制性内切酶BamH I和KpnI购自宝生物工程公司；T4 DNA连接酶购自Promega公司； Ni2+NTA金属螯合蛋白质纯化系统购自Qiagen公司；链酶亲和素磁珠购自Dynal公司；低分子质量蛋白标准购自上海西巴斯生物技术有限公司. 1.2方法 1.2.1表达载体的构建根据CGGBP1基因起始密码子和终止子邻近序列设计PCR引物：CGGBP1F CGC GGA TCC GAG CGA TTG TAG TAA CAG CA，CGGBP1R GGG GTA CCT CAA CAA TCT TGT GAG TTG AG. 其上游及下游引物分别加入BamHI和KpnI酶切识别位点序列(引物序列下划线部分). PCR反应以人淋巴细胞cDNA文库为模板，扩增编码CGGBP1的基因序列. 设计PCR扩增体系25 μL，灭菌去离子水10 μL，10×反应缓冲液2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，DMSO 2.5 μL，4× dNTP混合物（每种2.5 mmol/L）2 μL，CGGBP1F和CGGBP1R各10 pmol，模板3.5 μL（50 ng/μL）， Taq DNA（5 μ/μL）聚合酶0.5 μL. 扩增条件：95℃预变性5 min，再94℃ 30 s， 53℃ 1 min，72℃ 1 min循环40次，最后72℃终末延伸产物10 min. PCR产物经琼脂糖电泳分离，用胶回试剂盒回收目的基因. 用BamHI和KpnI酶切PCR产物和pRSET A，酶切产物电泳后回收，在T4连接酶作用下，目的片段定向克隆至pRSET A的BamHI和KpnI克隆位点. 将重组质粒转入大肠杆菌DH5α，接种到含氨苄青霉素的LB培养基平板并挑取单菌落.1.2.2融合蛋白的诱导表达将测序正确的重组质粒转入BL21（ DE3）. 挑取携带目标质粒的单菌落接种于含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基中， 37℃振荡培养12 h， 按10 mL/L比例转接于新鲜培养基，37℃振荡培养至对数生长期时，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，32℃诱导振荡培养4 h，离心收集菌体，SDSPAGE分析重组蛋白的表达.1.2.3蛋白表达形式的分析取5 mL菌液离心，用500 μL的裂解液（10 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L磷酸二氢钠 pH 8.0）重悬，加溶菌酶至终浓度为1 mg/mL，冰浴30 min，超声波裂菌，离心后分别将上清和沉淀进行SDSPAGE分析.1.2.4融合蛋白的纯化将1 mL 500 mL/L Ni2+NTA悬液和4 mL细菌裂解上清液轻轻混匀4℃放置60 min，直接过柱. 过柱结束后，用4 mL漂洗液（20 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH 8.0），洗脱未和Ni珠结合的杂蛋白. 经过2次漂洗后再用0.5 mL洗脱液(250 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH 8.0) 3次洗脱特异结合的目的蛋白，分步收集. 取收集液，进行SDSPAGE分析.1.2.5CGGBP1与（CGG）29重复序列双链DNA结合实验取10 μL磁珠用1 mL的无RNA酶的三蒸水清洗磁珠2次，除去防腐剂. 1×生物素亲和素结合缓冲液（10 mmol/L TrisHCl，2 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 g/L Tween 20）15 μL重悬磁珠，各5 μL分3组实验. 其中一组加入25 μL（100 ng/μL）生物素化的（CGG）29重复序列双链DNA，另外两组分别加入25 μL（100 ng/μL）非生物素化的（CGG）29重复序列双链DNA和25 μL三蒸水做对照；三组分别再加入2×生物素亲和素结合缓冲液30 μL，25℃轻摇1 h. 经磁力吸附后，弃上清. 重复上述步骤3次；加入纯化后CGGBP1（500 μg/mL）15 μL 和2×核酸蛋白结合缓冲液（20 mmol/L HEPES，100 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L DTT，100 g/L甘油）20 μL，室温下静置30 min；经磁力吸附后，弃上清；用1×核酸蛋白结合缓冲液清洗磁珠2次；加三蒸水10 μL，沸水煮10 min，进行SDSPAGE分析.2结果2.1原核表达载体的构建及鉴定扩增产物在15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，可观察到一条约504 bp的条带（图1）； 重组质粒pRSET A/CGGBP1及质粒pRSET A分别用BamHI和KpnI酶切，pRSET A/CGGBP1分为两个片段，分别为2.9 ku和504 bp（图2），均与预计结果相同.2.2CGGBP1的表达用BamHI和KpnI双酶切pRSET A/CGGBP1表达质粒，筛选阳性重组质粒. 携带有pRSET A/CGGBP1质粒的E.coli BL21(DE3)菌株，经IPTG诱导后，在Mr 约25 000处出现1条表达条带；而未经IPTG诱导的菌体则无此条带. 诱导后的菌体经溶菌酶及超声波裂解，离心后分为上清和沉淀两部分. 经SDSPAGE分析表明，CGGBP1部分存在于细菌裂解液的上清中，为可溶性蛋白，上清液中的目标蛋白相对较少（图3）. 2.3CGGBP1蛋白纯化在表达质粒pRSET A多克隆酶切位点的上游， 插入有连续6个组氨酸的序列 —(His )6 tag. 重组质粒经诱导表达后，(His )6 tag可以和外源插入片段共同表达. 利用(His )6 tag 和金属Ni2+的螯合所设计的固定化金属配体亲和柱层析方法，是纯化目的蛋白的一种高效而简单的方法. SDSPAGE显示，CGGBP1得到较高程度的纯化（图4）.2.4CGGBP1与5′d（CGG）293′重复序列双链DNA结合实验生物素化的5′d（CGG）29 3′重复序列双链DNA被固定到链酶亲和素磁珠上，非生物素化的5′d（CGG）293′重复序列双链DNA因无法固定到链酶亲和素磁珠上而被洗脱掉. 同理，加入CGGBP1后，未和5′d (CGG）293′重复序列双链DNA结合的蛋白也被洗脱（图5）.3讨论关于微卫星的产生机制，普遍认为是DNA复制过程中DNA聚合酶的滑动［4］，或DNA复制和修复时滑动链与互补链碱基错配，导致一个或几个重复单位的插入或缺失. 已发现微卫星可能是一种非常活跃的碱基序列，通常各种简单的重复序列成簇地聚集在一个染色体区域，这个染色体区形成特异染色体结构的能力将会增强. 这些区域在核糖体RNA基因中非常复杂，同时这些重复序列所折叠形成的结构还能与特异的蛋白质相结合，成为“染色质折叠密码”［5-6］，参与遗传物质的结构改变，基因调控及细胞分化等过程. 脆性X综合征是Igarashi等［7］研究报道的与三核苷酸重复片段扩增突变有关的7种神经变性疾病其中的一种. 该蛋白只和（CGG）n重复序列发生特异性结合，而与其它类型的三核苷酸重复序列不结合［8］. 因此，对该蛋白功能的研究具有重要的理论研究意义. 本实验成功地构建了含CGGBP1的重组质粒，以可溶性蛋白形式获得较高表达. 通过Ni2+NTA柱纯化，获得纯化的目标融合蛋白质，同时证明了该蛋白能和人FMR1基因5′d (CGG)293′重复序列双链DNA特异性结合. 这将为进一步开展真核生物蛋白CGGBP1功能的研究和阐释CGG三核苷酸动态突变的致病机理奠定基础.
随着医学技术的进步，各高校也开始开设兽医专业，兽医的主要任务是研究和实施家畜家禽疾病的诊疗、防治、检疫及畜产品卫生检验等。下文是我为大家整理的关于畜牧兽医 毕业 论文的内容，希望能对大家有所帮助，欢迎大家阅读参考!
浅析鸡大肠杆菌病病因分析和预防治疗
在近十几年的肉鸡生产中，养殖户为了控制大肠杆菌及某些细菌感染，在使用饲料添加剂及治疗中盲目应用一些抗菌药物，从而导致耐药菌株越来越多，并日趋严重。事实上，因为大肠杆菌可通过菌毛将其抗药性质粒传递给其他大肠杆菌，所以，大肠杆菌的抗药性形成较快，环境中大肠杆菌耐药性菌株越来越多。
近几年来，地区实验室曾多次无菌采取疑似大肠杆菌病的本地病鸡、死鸡的心血、肝、脾、肾等病料，进行病原菌的分离、生化鉴定和药敏试验。生化鉴定结果显示，引起试验鸡只发病的病原为大肠杆菌，药物敏感性试验结果表明，本地区大肠杆菌对硫酸安普霉素、阿米卡星高度敏感，对新霉素、庆大霉素中度敏感，对环丙沙星、氟苯尼考耐药。曾经对致病性大肠杆菌敏感的药物出现了不敏感和不同程度的耐药，提示在以后的肉鸡生产中应慎用抗生素，在使用药物治疗大肠杆菌病时，要充分利用药敏试验，为鸡大肠杆菌病的防治提供科学的理论依据，并需注意交替用药，按疗程投药才能收到较好的治疗效果。
1、病因分析
1.1免疫抑制
主要是由鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、支原体等病原体的感染继发造成。往往会先破坏呼吸道和消化道的黏膜屏障系统的完整性，致使被感染鸡只不同程度地出现免疫抑制等，从而为大肠杆菌的入侵打开了门户。
1.2免疫应激
某些应激反应可引发大肠杆菌病的发生。如接种疫苗时鸡群产生的应激反应以及免疫程序设计不当都会引起鸡群抵抗力下降或呼吸道症状，从而造成大肠杆菌感染和继发感染。
1.3有害环境
有害的环境因素也是引起大肠杆菌感染主要原因之一。 饲养 管理差，环境污染严重，应激因素长期存在，都能促进该病的发生和流行。如气候突变、寒冷、闷热、通风换气不良、氨味过浓等应激因素，使鸡群抗病力减弱，大肠杆菌乘机侵入，引起机体发病。卫生条件差，粪便、污水、病死鸡等不能无害化处理，从而造成了鸡场环境污染严重，细菌、病毒大量存在。对消毒工作不重视或不严格，饲养密度过大，潮湿的环境又为大肠杆菌及其他致病性微生物的滋生创造了条件。
1.4饮饲及营养状况
日常生产中，饲养方式、饮水等会直接影响到鸡群营养状况的好坏，日粮营养水平的高低以及不同营养成分之间的平衡状况等都是引发大肠杆菌感染的重要因素。如饲料营养缺乏(维生素等含量不足)、饲料霉变等，会导致鸡抵抗力下降，对大肠杆菌易感性增加，引起大肠杆菌病的发生。
2、预防与治疗
对本病的防控应坚持预防为主的原则，治疗要坚持尽早发现、尽快投药治疗的原则。
2.1预防 措施
2.1.1加强饲养管理。对饲料进行合理搭配，保持饲料、饮水清洁，及时清除粪便等。饲养密度过大的鸡群，要适度调整，保持良好通风换气，保持适宜的温度和湿度，避免骤冷骤热，以减少各种应激等诱发因素。
2.1.2加强消毒。定期对场地、器具等进行彻底消毒，注重带鸡消毒。污染严重或常发病鸡场，要根据情况适当缩短消毒间隔时间，一般5～7d要进行一次彻底消毒。
2.1.3疫苗接种预防。接种大肠杆菌疫苗可在一定程度上控制该病的发生，但因大肠杆菌血清型较多，其效果并不十分理想。对有条件的已发生污染的鸡场建议用本场分离的大肠杆菌菌株制作灭活菌苗进行免疫接种，效果可靠。
2.1.4加强种蛋管理，建立健康的种鸡群。大肠杆菌可因种蛋带菌而垂直传播，因此，必须做好种鸡群大肠杆菌病的净化工作。
对病鸡不能留作种用，一律淘汰。另外，种蛋本身不带菌，但由于捡拾不及时或者产蛋箱卫生状况不良，使种蛋与粪便接触而受到污染。因此，孵化场还须作好对种蛋的消毒，以减少种蛋污染。在种蛋入孵前必须做好药物消毒工作。如果有条件，种蛋产出后2h内应用药物熏蒸消毒或用0.3%的过氧乙酸进行带鸡喷雾消毒，确保种蛋有最高的孵化率和健雏率。
2.1.5实行全进全出制。全进全出的饲养 方法 是预防该病的有效方法，可有效避免不同日龄、不同批次鸡群间的交叉感染。同时，鸡群尽可能采用封闭式管理，这样可减少或杜绝鸡群与大肠杆菌的污染物接触，防止本病发生。
2.1.6加强饲料饮水的兽医卫生监测。饲料的采购、贮存和加工等环节要加强卫生管理，防止发霉、变质，减少大肠杆菌的污染。对水井、水塔和水箱等储水设施以及输水管道要经常清理、定时消毒。
2.1.7药物预防。在饮水或饲料中按预防剂量投喂抗生素可对该病的发生起到预防作用。
2.1.8有效控制其他疾病。在基层服务中发现，很多其他疾病导致大肠杆菌病的继发或混合感染，如鸡沙门氏菌病、霉形体病、传染性鼻炎、传染性支气管、喉气管炎、新城疫等。对于这些疾病，目前都有较好的疫苗或药物进行预防。因此应制定适合本场的防疫程序并认真实施，尽可能防止其他疾病的发生，这样也就间接的起到预防和减少大肠杆菌病的发生。
2.2治疗
(1)首先，病鸡隔离，及时治疗。对急性经过的不及救治的病死鸡做好焚烧掩埋及消毒工作。(2)加强饲养管理，消除诱因，加强卫生消毒。(3)合理使用抗菌药。通过药敏试验，选择高敏药物，克服盲目用药，根据药敏实验结果，合理选择和交替使用抗菌素。(4)使用中药。一般情况下，单纯因大肠杆菌感染而发病者较少，大部分都是继发或混合感染，辩症施治，合理搭配中药可以取得良好的疗效。方剂：黄连50g、黄芩60g、紫花地丁40g、赤芍30g、栀子30g、地榆60g、大黄40g、木香30g、白头翁50g、知母30g、秦皮50g、甘草30g，烘干粉碎后，按500g拌饲料100kg自由采食，连喂3d，可较好的控制病情。(5)综合措施。根据用药史及病情，全面分析药理并通过药敏实验筛选，采用中西药结合的方式综合治疗，并在饲料中2倍量投服维生素C保健粉，同时饮用电解多维，可取得较好的治疗效果。
大肠杆菌是条件性致病菌，防制该病的关键在于加强饲养管理，做好各个环节的卫生消毒，减少各种诱发因素，严格执行卫生防疫措施，创造一个良好的饲养环境。有效控制容易并发和继发该病的病原是防止本病发生的有效措施。由于各地大肠杆菌的血清型，特别是优势血清型存在差异，有效而通用的菌苗尚未出现，因此筛选地区性免疫原性优良的大肠杆菌菌株制作菌苗，乃是防制鸡大肠杆菌病及有效进行免疫预防的基础。建议有条件的鸡场，最好采用自家灭活苗，这样效果可靠，更适用于血清型复杂的地区。
参考文献：
[1]郭万柱，吴彤，陈瑶先.动物微生物学[M].四川成都：四川科学技术出版社，1997.
[2]丁红雷，王豪举，杨红军.鸡大肠杆菌病病原的分离鉴定[J].动物医学进展，2005，(8)：111-113.
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浅谈鸭曲霉菌性肺炎的临床症状、剖解和治疗
鸭曲霉菌病，又称鸭曲霉菌性肺炎，主要是由烟曲霉等真菌引起的鸭呼吸道传染病。其特征是在呼吸器官组织中发生炎症，尤其是在肺和气囊出现灰黄色的结节，胸腹部气囊也可能有霉菌斑。此病主要发生于雏鸭，多呈急性经过，发病率高，可造成大批死亡，成年鸭多为散发。2013年5月罗山县某鸭场饲养的肉鸭发生了一起以肺和气囊出现灰黄的结节为主要特征的传染病，根据发病情况、临床症状、尸体剖检及实验室检查，初步确定为鸭曲霉菌病，并结合病情，给予药物治疗，基本控制了病情。
1、发病情况
该鸭场饲养的5 000只樱桃谷肉鸭，在16～18日龄起开始发病，最初每天发病10～20只，后每日发病达30～50只，每日有15～20只鸭死亡，全程共发病约1 800只，死亡516只，发病率36%，病死率28.6%。在发病初期，养殖户认为是大肠杆菌病，并使用抗生素治疗，但不见效果。
2、临床症状
患鸭病初精神不振，眼半闭，羽毛松乱无光，食欲减退或废绝。随病情发展，病鸭气喘、呼吸困难、加快，胸膜部明显煽动，渴欲增加，嗜睡，常呆立或伏卧在地，气喘，口腔和鼻腔流出浆液性分泌物，粪便稀薄，呈白色或绿色，急剧消瘦，出现死亡。
3、剖检变化
主要病变在肺和气囊，肺充血、切面流出红色泡沫液，肺实质中有大量大头针帽或小米粒大小的灰黄色结节，有的在胸部气囊也可见，病程稍长的鸭肺部结节融合成更大的黄白干酪样结节，结节切面呈明显的层状结构，气囊增厚、混浊，肝脏轻度肿大，肠粘膜充血，有的可见腹膜炎。
4、实验室诊断
取肺病灶的霉菌结节或霉菌斑少许，涂于载玻片上，加10%氢氧化钾溶液1～2滴，混匀透明后，加盖玻片，在高倍镜下观察，可见有分枝和横隔的曲霉菌菌丝及孢子。
5、治疗
立即更换新鲜的饲料，更换垫料，并把垫料下的土铲去一层，同时，配合中草药治疗。
方组：升桔梗260 g、蒲公英500 g、苏叶500 g、枇杷叶15 g、知母20 g、金银花30 g。上药共煎汤得1 000 ml(1 000羽雏鸭1 d用量)，拌料内服，3次/d，另外在饮水中加0.1%高锰酸钾。同时，对病重雏鸭进行特殊护理，用滴管滴服上述药液，2次/d，0.5 ml/次。鸭群按以上方法治疗5 d后症状逐渐消失，7 d后停止用药，但是仍有个别病重鸭死亡。
6、体会
曲霉菌在自然界广泛分布，一般最常见而且致病性最强的为烟曲霉菌，其孢子在自然界分布较广泛，常污染垫草及饲料，除此之外，其他曲霉菌也可引起感染，如黄曲霉、黑曲霉及构巢曲霉等。曲霉菌对外界具有显著的抵抗力，干热120℃经1 h、煮沸5 min，方可杀死。消毒剂，如，2.5%福尔马林、水杨酸、碘酊等需经1～3 h，方可灭活。霉菌孢子可随空气传播，健康鸭通过吸入含有霉菌孢子的空气或采食染菌饲料，经呼吸道或消化道感染。在种蛋孵化过程中，霉菌还可穿透蛋壳而使初生鸭感染。因此，防控曲霉菌病的综合措施：(1)加强饲养管理。此病目前还没特效治疗办法，重在预防，特别要注意鸭舍的通风和防潮湿。(2)搞好环境卫生，及时清理鸭粪，更换垫料，不垫发霉的垫料。(3)加强饲料贮存和保管工作，不喂已霉变的饲料。(4)鸭舍、饲槽、饮水器等器具要定期消毒。(5)喂料时要少喂勤添，避免料槽中饲料积压。(6)如果鸭群已被污染发病，病鸭要及时隔离，清除垫料和更换饲料，鸭舍要彻底消毒。
试谈犬皮肤病的诊断
1发病情况
犬的皮肤病病因复杂，种类繁多，防治难度较大，其中一些还可传染给人。凡能惹起犬皮肤瘙痒、脱毛、结痂和皮肤异常变化的疾病统称为皮肤病。如何进步治愈率，缩短治疗周期，降低复发率，是宽广宠物医护人员十分关注的问题。犬皮肤病一年四季均可发作，但以夏、秋季多发，冰冷的冬季少发。经过对109例皮肤病犬的 总结 ，发现犬皮肤病主要为螨病(62例，占56.8%)和真菌性皮肤病(32例，占29.4%)，且大多数还是螨虫和真菌的混合感染性皮肤病。
螨病中常见的螨虫有蠕形螨、疥螨和耳痒螨，真菌性皮肤病主要为小孢子菌、石膏样小孢子菌和须毛癣菌感染;此外，犬皮肤病中尚有过敏性皮肤病(5例，占4.6%)、营养缺乏性皮肤病(4例，占3.7%)等。犬皮肤病是临床常见病，病因复杂，种类繁多，防治难度较大，一些还是人兽共患。2012年以来，笔者曾先后接诊犬皮肤病75例。犬皮肤病一年四季均可发作，但以夏季、秋季多发，冰冷的冬季少发。47例皮肤病中，螨病28例，占59.6%，真菌性皮肤病19例，占40.4%。大多数是二者混合感染。螨病中，常见蠕形螨、疥螨和耳痒螨，真菌性皮肤病主要为小孢子菌、石膏样小孢子菌和须毛癣菌感染。
2病症
病原为耳痒螨，主要寄生于犬耳道内，有时也爬到身体其他部位惹起局部损伤，有高度传染性。临床表现为耳道发炎、充血、耳道内有多量红褐色或灰白色分泌物，并有腥臭味，耳壳内侧潮红糜烂，犬不时抓耳挠腮，或用头磨蹭空中或笼壁，体表散布拇指盖大血痂并构成脱毛区。犬皮肤病普通临床表现为剧痒、脱毛、结痂、皮肤肥厚以及患部呈现红斑、丘疹等，病症相似。要做好鉴别诊断。
2.1蠕形螨病
由犬蠕形螨寄生于犬皮肤的毛囊和皮脂腺内惹起。正常情况下，犬体表也有少量蠕形螨存在。当机体应激或抵御力降落时，大量繁衍，引发疾病。患犬病初表现颜面两侧皮肤潮红、充血。
继之脱毛并构成许多皱褶，然后扩散到额部、背部、胸腹下以致全身。病部有1～5个小的和周围界限明白的红斑状病变，痒感不剧烈。严重时，身体大面积脱毛，浮肿，呈现红斑、皮脂溢出和脓性皮炎，瘙痒。
2.2疥螨病
本病病原体为犬疥螨，传染性较强。主要经过接触感染，过度拥堵、暗淡、潮湿等较差的卫生条件会加剧疾病的发作和展开，人接触病犬也可感染。检查发现，虫体主要寄生于耳尖外侧、尾根、脚爪、口周围及眼圈等皮薄毛稀的部位，病变也多发作于此，严重者可扩散至全身。表现剧痒，不时抓挠啃咬，患部脱毛、结痂，耳壳边缘、尾根、脚爪处皮肤增厚，密布糠麸样厚痂。
根据病史和奇痒、脱毛、结痂等临床病症可树立初步诊断。确诊用皮肤病诊断液，方法同蠕形螨病。犬疥螨呈宽卵圆形，雌虫平均大小约为380μ×270μ，半透明，白色，体表覆以相互对等的细毛;雄虫平均大小约为220μ×170μ，其外形同雌虫相似。
2.3耳痒螨病
根据病史和临床病症可树立初步诊断。确诊也可用皮肤病诊断液，方法如下：用掏耳勺刮取耳道分泌物，置于载玻片上，滴加诊断液2～3滴，混匀后加盖玻片，压薄后镜检。若被感染，则虫体和虫卵明晰可见。痒螨呈椭圆形，足体凸出。雄虫第4对足不兴隆，不能伸出体边缘，比第3对足短3倍：雌虫第3、4对足无吸盘。
2.4皮肤癣菌病
又称癣，是由皮肤癣菌侵袭毛发、爪和皮肤等角质组织惹起的真菌性皮肤病，病原体主要有犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须毛癣菌等。潮湿、暖和的气候，拥堵、不洁的环境以及缺乏阳光映照等是惹起本病的主要诱因。患犬大面积严重脱毛、瘙痒，体表散布红色丘疹，脱毛区掩盖油性厚痂，刮去痂皮暴露潮红或溃烂的表皮，严重者构成溃疡。随着病程延长，患部呈现色素冷静，毛根易脱，毛干易断。
2.5过敏性皮肤病
如湿疹、荨麻疹等。湿疹是表皮和乳头层由致敏物质所惹起毛细血管扩张和渗透性增高的一种过敏性炎症反响，临床上以患病皮肤发作红斑、丘疹、水疱、脓疱、糜烂、结痂及鳞屑等皮损，并伴有热、痛、痒病症为特性。荨麻疹是皮肤乳头层和棘状层血管渗出液增加的一种过敏性疾病，临床以患病皮肤突然发作许多圆形或扁平的疹块和疾速消散，并伴有皮肤瘙痒为特性。惹起犬过敏的要素有昆虫的叮咬、暗淡潮湿的环境、烈日暴晒、刺激性药物、营养失调、代谢紊乱以及机体内在的一些过敏因子等。
2.6营养缺乏性皮肤病
本病有一定群发性，多由饲养管理不当、消化吸收障碍招致某些维生素、微量元素缺乏而惹起。如犬食物单一，或长期饲喂高蛋白、高脂肪食物，或饲喂蜕变食物等可构成维生素C、维生素B以及硒、钙等缺乏。患病犬被毛干枯，毛易断易脱，皮肤表面有豆粒大或拇指盖大小的出血斑，皮屑增加，痒感不明显。
2.7其他
包括由葡萄球菌等惹起的细菌感染，由犬瘟热病毒感染呈现的硬脚垫病，角质层下脓疱性皮肤病，维生素A过多症，毛细血管扩张症，溢脂性皮炎，中毒性皮炎，自体免疫性皮肤病等。
3治疗
根据皮肤病盛行特性，采取“彻底检查，洗浴去痂、重复用药、辨证施治、消弭病因、消毒环境”等综合性防治准绳，中止平面式用药(体内、体表、环境)，根据病情不同，采用“轻则治其标，重则治其本”的方法，治疗务须彻底，以防复发。
3.11%伊维菌素注射液
该药为广谱驱外寄生虫药，临床上主要用来治疗疥螨、蠕形螨、耳痒螨惹起的传染性皮肤病，对虱子、跳蚤和蜱也有防治作用。犬按0.05～0.1 ml/kg体重量·次，皮下注射，1次/周。
3.2癣螨净擦剂
该药为纯中药配方，无毒反作用，具有杀螨、抗菌、止痒以及除虱、灭蚤等作用。临床上主要用来治疗疥螨病、耳痒螨病、蠕形螨病、真菌性皮肤病、过敏性皮炎、湿疹等惹起的皮肤病。该药外用，于患部涂擦，1～2次/d。耳痒螨病、中耳炎时，应向耳道内滴入药液3～5滴，再清算干净，1次/3d。
3.3癣螨净浴液
该药也系纯中药配方，无毒反作用。临床上主要用来治疗晚期全身性、顽固性皮肤病，如疥螨病、蠕形螨与真菌混合感染性皮肤病、真菌性皮炎、脓皮病、过敏性皮炎、湿疹、脱毛症及自咬症等。该药外用，用前先用温水稀释100～200倍，将患犬药浴8～10 min。另外该药还可用于环境、宠物用具的消毒。
3.4癣螨净注射液
药具有杀螨抑菌功用强、作用耐久等特性。临床上主要用于治疗各种螨虫、真菌惹起的传染性皮肤病。特别对蠕形螨、真菌混合感染的顽固性皮肤病、脓皮病有特效。剂量：005～0.1 ml/ kg体重量·次，皮下注射，1次/7d。
3.51%益康唑霜
该药为广谱抗真菌药，对皮肤真菌有杀菌作用，临床上主要用来治疗犬的皮肤、毛发、爪的真菌病。该药外用，于患病涂擦，2次/d。
3.6灰黄霉素
其能有效抑止小孢子菌、毛癣菌等真菌，临床用来治疗由真菌惹起的皮肤病。剂量：20 mg/ kg体重量·次口服，连用30 d。
3.7H1受体阻断药
本类药物主要有盐酸苯海拉明、盐酸异丙嗪、扑尔敏、扑敏灵等，能选择性地对立H1受体所致的血管扩张作用，临床上主要用来治疗各种皮肤、粘膜的过敏反响，如湿疹、荨麻疹等。另外，维生素C、糖皮质激素类(如地塞米松)、钙制剂、麻黄碱等也有抗过敏作用，是防治皮肤病常用的辅助药物。苯海拉明，剂量：0.5～1 mg/kg体重，肌肉注射。内服：30～60 mg/次。
Y. Q. Liu, Y. Z. Zhang and P. J. Gao. Novel Concentration-Killing Curve Method for Estimation of Bactericidal Potency of Antibiotics in an In Vitro Dynamic Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2004. 48(10): 3884-3891.Liu Yu-qing, Yu-zhong Zhang, Cai-yun Sun and Pei-ji Gao. A Novel Approach for Accurate Estimation of Antibacterial Potency of Chinese Traditional Medicine Using a Concentration-killing Curve Method. The American Journal of Chinese Medicine, 2005. 33(4): 671-682.ZHANG Huaiqiang,LIU Yuqing, GAO Peiji. A novel approach for estimating growth phases and parameters of bacterial population in batch culture. Science in China，Series C: Life Sciences，2006, 49(2):130-140.张怀强，刘玉庆，高培基. 分批培养条件下细菌群体生长阶段的区分及生长参数的确定. 中国科学C辑: 生命科学, 2005. 35 (6): 502-512.LIU YuQing,ZHANG HuaiQiang, SHEN JianZhong, GAO PeiJi. Effect of Physiological Heterogeneity of E.coli Population on Antibiotic Susceptivity Test. Science in China，Series C: Life Sciences，2007, 50(6): 808-813.刘玉庆, 张怀强, 沈建忠, 高培基. 大肠杆菌群体的生理异质性对药敏试验的影响. 中国科学C 辑: 生命科学, 2007, 37(6): 524-529.ZHANG Huaiqiang, LU Yili, Yan Xuelan, GAO Peiji. Effect of Bacterial Population Heterogeneity on Growth Dynamic Progress and Its Estimation. Science in China Series C-Life Sciences, 2007, 50(4):535-547张怀强, 卢丽丽, 阎雪岚, 高培基. 细菌群体异质性对生长动态过程的影响及其表征. 中国科C辑:生命科学, 2007, 37(2):246-256.Li-Ning Xia, Lin Li, Cong-Ming Wu, Yu-Qing Liu, Xiao-Qi Tao, Lei Dai, Yong-Hua Qi, Li-Ming Lu, Jian-Zhong Shen. A Survey of Plasmid-Mediated Fluoroquinolone Resistance Genes from Escherichia coli Isolates and Their Dissemination in Shandong, China.Foodborne Pathogens and Disease. 2010, 7(2): 207-215.Hua Bai, Wen-zheng Su, Xiao-ling Zhu, Ming Huand Yu-qing Liu. Effect of enrofloxacin on gene expression profiles of Escherichia coli. Annals of Microbiology，2010，60:653–660Hua Bai, Xiao-ling Zhu, Ming Huand Yu-qing Liu. Analysis of mechanisms of resistance and tolerance of Escherichia coli to enrofloxacin，Ann. Microbiol. 2012,62:293-298Liu Y Q, Li J R, Du J F, et al. Accurate assessment of antibiotic susceptibility and screening resistant strains of a bacterial population by linear gradient plate. Sci China Life Sci, 2011, 54: 953–960刘玉庆, 李靖冉, 杜加法, 胡明, 白华, 齐静, 高超, 魏甜甜, 苏红,金健玲, 高培基.用线性梯度平板准确测定药物敏感性和分离抗药性菌株. 中国科学C辑: 生命科学，2011，41（9）: 748-755.刘玉庆，张怀强，胡明，赵越，白华，金建玲，高培基. 药敏试验方法的局限性及改进的建议. 山东大学学报（医学版）2011,49（2）：129-132.高超，胡明, 白华, 齐静, 朱小玲, 刘昌彬, 单虎, 刘玉庆，高培基. 铜绿假单胞菌对环丙沙星的抗药性和耐药性机制研究. 山东大学学报（医学版）2011,49（6）：38-45.白华，蔡亚娜，胡明，杜加法，刘玉庆. 芽孢杆菌发酵五味子提取液对肉鸡肝损伤的影响. 中兽医医药杂志，录用蔡亚娜, 胡明, 魏甜甜, 白华, 高超, 刘玉庆. 鸡咽部混合菌群16S rDNA序列分析方法的建立. 中国畜牧兽医，录用白华，胡明，朱小玲，杜加法，蔡亚娜，刘玉庆. 3种中药复方提取液对肉鸡生理、免疫指标的影响. 中国农学通报，2010,26（9）：1-7白华，齐静，朱小玲，王庆艳，杜加法，刘玉庆. 恩诺沙星对大肠杆菌全基因组表达谱的影响. 畜牧兽医学报，2009，40（10）：1537-1544.刘玉庆. 兽用抗生素及其抗药性，中国抗生素杂志，2009,34(增刊):134-140.朱小玲, 沈建忠, 刘玉庆. 多重抗药大肠杆菌中Ⅰ型整合子的分布与抗药关系. 中国人兽共患病学报, 2009, 25(2):135-138.朱小玲, 齐静，白华，胡明，孙作为，沈建忠, 吴聪明，刘玉庆.山东省动物源大肠杆菌多重抗药性及其遗传稳定性研究，中国卫生检疫杂志，2009，19(7):1473-1476.杜加法, 孙作为,白华,朱小玲,刘玉庆，李文平.大通量药敏检测盒测定中药对多抗菌株的抑制效果，中国卫生检验杂志，2009,19(10):2243-2245.白华, 杜加法, 朱小玲, 孙作为, 胡明, 刘玉庆. 中药对病原体杀灭及对肉鸡生产性能影响研究，中兽医医药杂志2009，28(6) 10-15.王庆艳, 朱小玲, 白华, 张庆宁, 杜加法，刘玉庆，王述柏. 大通量的抗生素药敏检测盒的设计及应用. 中国畜牧兽医, 2009, 36(7):6-71张庆宁，胡明，朱荣生，武英，刘玉庆. 生态养猪模式中发酵床优势细菌的微生物学性质及其应用研究. 山东农业科学，2009, 4: 99-105.李云, 蔡亚娜, 张士栋, 王庆艳, 杜加法, 刘玉庆, 赵淑梅. 不同宿主大肠杆菌对15种抗生素抗药性差异研究. 山东农业科学，2009, 4: 95-98.胡明，刘玉庆，武英，张秀美，卢雪梅，高培基. 噬纤维菌和生孢噬纤维菌作为饲用蛋白质的综合评价. 中国农业大学学报，2009 ,14 (3) :89-93齐静, 杜以军, 朱小玲, 胡北侠, 孙守礼, 张秀美, 刘玉庆. 鸡γ-干扰素的克隆、原核表达与抗病毒作用研究. 微生物学报, 2009, 1:85-91.白华，张金强，于美芳，刘玉庆，吴家强. 斑点杂交法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒. 中国动物检疫, 2009, 26(3):51-53.马俊孝, 张景燕, 刘玉庆. 体外法评价饲用木聚糖酶的研究. 饲料工业, 2009, 30(4): 21-23.马俊孝，张景燕，孙作为，刘玉庆. 木聚糖酶、甘露聚糖酶体外酶解数据库的研究. 饲料工业，2009, 30(18):9-11.马俊孝, 刘玉庆, 马向东, 张景燕. 饲用酶的体外评定技术. 饲料工业，2009，30（24）：17-19.刘玉庆, 张秀美, 武英, 孙彩云, 尹建忠, 毕伟民. 大豆乳清粉的营养价值及在肉鸡饲料中的饲养试验. 饲料工业, 2007, 28(5):41-42.黄艳艳, 胡北侠, 张秀美, 沈志勇, 刘玉庆, 黄庆华. 检测新城疫抗体的Dot-EL ISA方法的建立及其与H I方法的比较研究. 西南农业学报, 2007, 20(5):1117-1120.黄艳艳, 胡北侠, 张秀美, 刘玉庆, 卢新存, 李俊. 应用RT-PCR 和病毒学方法诊断山东省鸡新城疫感染的比较研究. 家畜生态学报, 2007, 28(2):82-85.刘玉庆, 王海, 孟庆贺. 液态植酸酶后喷涂工艺及其均匀度测定. 饲料工业，2007，15：12-14.崔江,刘玉庆, 侯渌恰, 孙彩云. 单复方中草药定量测定及其对大肠杆菌敏感性试验. 山东农业科学, 2006,3: 73-74.孟甄, 金建玲, 高培基, 刘玉庆. 细菌耐药性的诱导与消除. 中国药理学通报, 2003, 19 (9) :1047-51.刘玉庆, 郭林.从简约性看中医“阴阳五行”的生物学意义. 自然杂志, 2003, 25(5):296-298.刘玉庆, 张玉忠, 刘胜贵, 金建玲, 高培基. 中药三黄汤、小檗碱对E. coli生长抑制作用与庆大霉素的比较. 应用与环境生物学报, 2003, 9(3): 302-306.刘玉庆, 颜世敢, 毛泽春, 张玉忠, 高培基. 组合天然药物对急性人工感染大肠杆菌病的防治作用及其Cox 回归分析. 中国预防兽医学报, 2003, 25(4): 284-288.刘玉庆, 张玉忠, 颜世敢, 车程川, 李晔, 高培基. 大肠杆菌和益生菌对抗生素和化学药物的敏感性试验. 山东农业大学学报, 2003, 34(2): 181-184.刘玉庆, 李晔, 车程川, 张玉忠, 高培基, 颜世敢. 大肠杆菌对中草药敏感性试验及其方法研究. 中兽医医药杂志, 2003, 22(1): 3-5.刘玉庆, 张玉忠, 高培基, 孙振钧. 从有机食品生产看我国畜牧业发展对策. 饲料工业, 2003, 24(1):2-4.刘玉庆, 张玉忠, 钟鲁, 高培基. 生态营养（Eco-nutrition）理论与无公害养殖. 饲料工业，2002, 23(12): 1-4.刘玉庆, 夏东, 李如治, 徐魁梧, 张宁芳. 荷斯坦牛红细胞钾含量分布的研究. 南京农业大学学报, 1997, 20(1):55-59.刘玉庆. 红细胞钾的研究进展. 家畜生态, 1997, 18(3):46-47孙振军, 刘玉庆, 李文立. 温度、湿度和酸碱度对蚯蚓生长与繁殖的影响. 莱阳农学院学报,1993, 10(4):297-300.
希望这篇文章有点帮助，你要的东西很少会有正式发布的文章，大多是一些protocol而已。
大肠埃希菌201株耐药性分析胆盐抑制冷冻保存大肠杆菌生长的研究分子生物学中常用的大肠杆菌菌株大肠杆菌高效表达重组蛋白策略
生物学是一门能打通很多跨界知识的学科。相比物理学等自然科学，生物学更深刻地揭示了世界的底层规律，其思想放之四海而皆准。下面我给大家带来生物类专业的论文题目及选题方向，希望能帮助到大家!
生物技术 毕业 论文选题
[1]生物技术本科拔尖创新型人才培养模式的探索与实践
[2]禽源HSP70、HSP40和RPL4基因的克隆和表达
[3]中间锦鸡儿CiNAC038启动子的克隆及对激素响应分析
[4]H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测 方法 的建立
[5]单细胞测序相关技术及其在生物医学研究中的应用
[6]动物细胞工程在动物生物技术中的应用
[7]现代生物化工中酶工程技术研究与应用
[8]GIS在生物技术方面的应用概述
[9]现代生物技术中酶工程技术的研究与应用
[10]两种非洲猪瘟病毒检测试剂盒获批
[11]基因工程技术在生物燃料领域的应用进展
[12]基于CRISPR的生物分析化学技术
[13]生物信息技术在微生物研究中的应用
[14]高等工科院校创新型生物科技人才培养的探索与实践
[15]生物技术与信息技术的融合发展
[16]生物技术启发下的信息技术革新
[17]日本生物技术研究开发推进管理
[18]中国基因技术领域战略规划框架与研发现状分析及建议
[19]鸡细小病毒与H_9亚型禽流感病毒三重PCR检测方法的建立
[20]基于化学衍生-质谱技术的生物与临床样本中核酸修饰分析
[21]合成生物/技术的复杂性与相关伦理 政策法规 研究的科学性探析
[22]合成生物学技术发展带来的机遇与挑战
[23]应用型本科高校生物技术专业课程设置改革的思考
[24]知识可以改变对转基因食品的态度吗?——探究科技争议下的极化态度
[25]基因工程在石油微生物学中的研究进展
[26]干细胞技术或能延缓人类衰老速度
[27]生物技术复合应用型人才培养模式的探索与实践
[28]动物转基因高效表达策略研究进展
[29]合成生物学与专利微生物菌种保藏
[30]加强我国战略生物资源有效保护与可持续利用
[31]微生物与细胞资源的保存与发掘利用
[32]颠覆性农业生物技术的负责任创新
[33]生物技术推进蓝色经济——NOAA组学战略介绍
[34]人工智能与生物工程的应用及展望
[35]中国合成生物学发展回顾与展望
[36]桓聪聪.浅谈各学科领域中生物化学的发展与应用
[37]转基因成分功能核酸生物传感检测技术
[38]现代化技术在农业 种植 中的应用研究
[39]生物技术综合实验及其考核方式的改革
[40]生物技术处理船舶舱底含油污水
[41]校企合作以产学研为平台分析生物技术类人才培养
[42]生物技术专业“三位一体”深化创新创业 教育 改革
[43]基于环介导等温扩增技术的生物传感器研究进展
[44]分子生物学技术在环境工程中的应用
[45]生物有机化学课程的优化与改革
[46]地方农业高校生物技术专业“生物信息学”课程的教学模式探索
[47]不同育种技术在乙醇及丁醇高产菌株选育中的应用
[48]探秘生命的第三种形式——我国古菌研究之回顾与展望
[49]适应地方经济发展的生物技术专业应用型人才培养模式探索
[50]我国科研人员实现超高密度微藻异养培养
生物教学论文题目
1、本地珍稀濒危植物生存现状及保护对策
2、中学生物实验的教学策略
3、如何上好一节生物课
4、中学生生物实验能力的培养
5、激活生物课堂的教学策略
6、中学生物课堂教学中存在的问题及对策
7、中学生物教学中的创新教育
8、本地生物入侵的现状及其防控对策
9、论生物多样性与生态系统稳定性的关系
10、室内环境对人体健康的影响
11、糖尿病研究进展研究及策略
12、心血管病研究进展研究及策略
13、 儿童 糖尿病的现状调查研究
14、结合当地遗传病例调查谈谈对遗传病的认识及如何优生
15、“3+X”理科综合高考试题分析
16、中学生物教学中的差生转化教育
17、中学生物学实验教学与学生创新能力的培养
18、在当前中学学科分配体制下谈谈如何转变学生学习生物学的观念
19、中学生物教学中学生科学素养的提高
20、直观教学在中学生物学教学中的应用
21、中学生物学实验教学的准备策略
22、编制中学生物测验试题的原则与方法
23、浅析生态意识的产生及其培养途径
24、生物入侵的危害及防治对策
25、城镇化建设对生态环境的影响
26、生态旅游的可持续发展-以当地旅游区为例
27、城市的生态环境问题与可持续发展
28、农村的生态环境问题及其保护对策-以当地农村为例
29、全球气候变化与低碳生活
30、大学与高中生物学教育的内容与方法衔接的初步研究
31、国内、国外高中生物教材的比较研究
32、中学生物实验教学模式探索
33、河北版初中生物实验教材动态分析研究 “
34、幼师生物学教材改进思路与建议
35、中学生物学探究性学习的课堂评价体系研究及实践
36、中学生物双语教材设计编写原则探索与研究
37、信息技术应用于初中生物课研究性学习的教学模式构想
38、生物学课堂教学中学生创新能力培养的研究与实践
39、中学生物学教学中的课程创生研究初探
40、信息技术与中学生物学教学的整合
41、中学生物学情境教学研究
42、游戏活动在高中生物学教学中的实践与思考
43、合作学习在高中生物教学中的实践性研究
44、尝试教学法在高中生物教学中的应用与研究
45、生物科学探究模式的研究与实践
46、生物课堂教学引导学生探究性学习的实践与探索
47、白城市中学生物师资队伍结构现状的调查及优化对策
48、结合高中生物教学开展环境教育的研究
49、让人文回归初中生物教育
50、课程结构的变革与高中生物新课程结构的研究
51、在中学生物教学中，如何培养学生的创新能力
52、在中学生物教学中如何激发学生的学习兴趣
53、实验在中学生物教学中的重要性探讨
54、中学生物教学现状研究
55、中学生物课堂教学艺术探讨
56、“生态系统”一节的 教学方法 探讨
57、中学生物教学中的学生科学素质培养
58、初中生物教学中观察能力的培养
59、浅谈生物教学中的科学素质教育
60、中学生物探究性教学的实践与思考
生物技术本科毕业论文题目
1、生物反馈技术在运动性疲劳监控中的应用研究
2、微流控生物催化技术酶促合成天然产物的增效机理研究
3、海洋生物污损过程的分子标记技术研究
4、浮游生物多样性高效检测技术的建立及其在渤海褐潮研究中的应用
5、基于QCM生物传感器技术的组氨酸标签蛋白芯片和悬浮细胞芯片的研制及其应用
6、蛋白核小球藻油脂检测技术评价及光生物反应器培养的研究
7、基因工程制备微藻生物柴油中两项关键技术的研究
8、农业水污染治理环节中的生物技术应用问题研究
9、人工构建耐热大肠杆菌的分子设计与应用
10、我国合成生物技术产业发展战略及政策分析
11、基于原子力显微镜的细胞生物特征识别技术研究
12、利用菊粉和木薯淀粉生产高浓度山梨醇和葡萄糖酸的生物技术
13、转基因生物安全评价中的非科学因素探究
14、面向分子生物系统的计算技术应用研究
15、大规模生物数据中的生物信息挖掘技术研究
16、电化学生物传感技术用于重金属和蛋白质的检测
17、电化学生物传感技术用于单碱基突变与蛋白质的检测
18、基于功能核酸的生物传感技术的研究
19、论我国生物技术专利保护
20、纳米生物相关技术专利分析系统设计与开发
21、生物技术发展困境及其人文 反思
22、基因发明专利制度相关问题分析
23、转基因动物专利研究
24、GAPDH作为原核及真核生物通用型内标蛋白的研究及相关生物技术研发
25、基于生物信息与影像技术识别材料缺陷的研究
26、基于金属纳米材料的光学生物传感技术用于酶活性的检测
27、DNA assembler技术在顺
28、晋西黄土高原生物农业发展初探
29、睡眠剥夺差异表达基因的筛选及生物信息学分析
30、太赫兹时域光谱技术对生物组织的初步研究
31、我国农业转基因生物技术安全管理研究
32、人类基因专利战略布局
33、Web Services和XML技术在生物信息数据发布及整合中的应用
34、面向快速成型技术高分子生物医学材料的研究
35、化学修饰电极与液相色谱-电化学检测技术联用在生物分析中的应用
36、小型底栖生物样品自动分离技术研究
37、激光诱导荧光技术及其在生物仪器中的应用
38、强电场常压离子注入方法研究
39、生物信息学中的模式发现算法研究
40、聚类和分类技术在生物信息学中的应用
生物类专业的论文题目及选题方向相关 文章 ：
★ 生物技术专业论文选题题目
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★ 生物制药专业毕业论文范文
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★ 生物制造技术论文范文(2)
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论文题目同时应鲜明醒目，能吸引读者，向读者提供最直接的信息和对论文主题作准确的说明。下面我给大家带来医学相关专业硕士 毕业 论文题目参考，希望能帮助到大家!
医学微生物学论文题目参考
1、PCR 方法 快速检验HBV
2、人感染埃博拉病毒的研究进展
3、肠道菌群研究方法进展
4、胃肠道微生物及其分子生态学技术研究进展
5、基于血凝素的新型流感疫苗的研究进展
6、肠道菌群影响宿主行为的研究进展
7、理性和科学的态度认识埃博拉
8、新型人感染H7N9禽流感病毒病原学研究进展
9、肠道病毒71型灭活疫苗的小鼠细胞免疫效果
10、基于结构的HIV-1整合酶抑制剂的虚拟筛选
11、结核分枝杆菌免疫逃逸分子机制的研究进展
12、柯萨奇病毒A组16型研究新进展
13、大肠杆菌生物膜的筛选及生长曲线测定
14、肺炎克雷伯菌耐药机制的研究进展
15、微生物菌种保藏方法及标准菌种管理
16、马尔堡病毒形态特征研究
17、乙型脑炎病毒侵染细胞机制的研究进展
18、5种病毒性脑炎相关RNA病毒多重RT-PCR检测方法
19、肠道菌群调节制剂的研究进展
20、适用于分离人肠道中双歧杆菌的选择性培养基
21、益生菌与肠黏膜互作的分子机制研究进展
22、鲍曼不动杆菌的耐药机制及抗生素治疗研究进展
23、半枝莲总黄酮抗甲型H1N1流感病毒感染的药效学研究
24、轮状病毒感染相关受体的研究进展
25、分子生物学技术在肠道菌群研究中的进展
26、细菌黑色素的合成途径及生物功能研究进展
27、铜绿假单胞菌耐药率与生物膜形成能力之间的相关性分析
28、细菌鞭毛的致病性及其免疫学应用的研究进展
29、人腺病毒的研究进展
30、浅析埃博拉病毒致病机制
31、肠道病毒71型研究进展
32、抗生素对小鼠菌群失调腹泻肠道菌群多样性的影响
33、白念珠菌凋亡诱导研究进展
34、幽门螺杆菌基因分型的研究进展
35、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的研究进展
36、肺炎克雷伯菌耐药机制的研究进展
37、流感病毒在MDCK细胞中培养的条件优化
38、耐药鲍氏不动杆菌的耐药相关基因检测与聚类分析
39、埃博拉病毒研究文献计量与可视化分析
40、博卡病毒的检测方法概述
41、泛素-蛋白酶体途径在病毒感染中的作用
42、双歧杆菌降胆固醇的作用机制
43、幽门螺旋杆菌的研究进展
44、军团菌检测方法概述
45、噬菌体治疗中细菌对噬菌体的抗性
46、水产品中致病性弧菌分布及毒力基因特征分析
47、T细胞免疫在抗结核杆菌感染中的研究进展
48、新发高致病性禽流感H5N1病毒的致病性、传播力研究
49、空肠弯曲杆菌生物学特性及分型技术研究
50、冠状病毒附属基因功能研究
预防医学毕业论文选题
1、公众如何预防新型冠状病毒感染的肺炎
2、 儿童 乙型肝炎疫苗预防接种效果探讨
3、预防新型冠状病毒感染的肺炎口罩使用指南
4、健康 教育 在社区传染病预防控制中的应用效果评价
5、孕前检查预防出生缺陷的优生优育对策分析
6、预防接种薄弱区量化甄别与考核效果分析
7、出生缺陷的相关因素及预防现状分析
8、青少年流行性传染病的控制及预防方法研究
9、浅谈煤矿尘肺病预防及粉尘危害防治
10、呼吸道传染病的主要特点及预防控制办法
11、研究学校学生传染病的预防与控制 措施
12、探讨宫血宁胶囊预防药物流产后子宫出血的效果
13、室内装修过程中的职业危害预防
14、社区传染病的预防和控制措施
15、职业性布鲁氏菌病的预防
16、职业性中毒性肾病的危害和预防
17、靖江市儿童家长预防接种服务满意度调查分析
18、高危人工流产术后宫腔粘连的预防疗效观察
19、于计划免疫月龄前发生麻疹的预防措施分析
20、健康教育在儿童保健和预防接种中的效果分析
21、公共卫生管理在传染病预防工作中的作用
22、探讨调查细菌性食物中毒的病原菌与预防对策分析
23、儿童家长预防接种知识知晓情况分析
24、公共卫生监测对传染病预防控制的影响
25、瑞昌市新入学儿童预防接种情况及影响因素分析
26、20_-20_年禽流感流行情况及其监测和预防
27、中国破伤风免疫预防的现状、问题与展望
28、儿童计划免疫预防接种依从性影响因素分析
29、常见肾脏疾病儿童的预防接种
30、流行传染病的控制及预防方法探讨
31、芬吗通在临床中预防术后宫腔粘连的应用效果
32、一例接种卡介苗后疑似预防接种异常反应的分析
33、职业性急性钡及其化合物中毒的预防
医学检验免疫毕业论文题目
1、基于纳米颗粒的分子展示应用于超灵敏检测
2、SLE患者中几种新型自身抗体的检测及其临床诊断价值的探讨
3、多肽酶检测和细胞表面荧光标记的新方法研究
4、区域检验服务协同平台的设计与实现
5、胶体金喷膜仪的设计与开发
6、重庆市乡镇卫生院医疗资源的调查研究
7、基于氧化石墨烯和硫化铅纳米颗粒的荧光生物传感器研究
8、产气荚膜梭菌α毒素快速诊断金标试纸条的研制及初步应用
9、纳米粒子免疫层析法在检测异位妊娠和膀胱癌中的应用
10、现代医院检验科模块化设计研究
11、酶免工作站监控系统的设计与实现
12、乙型肝炎表面抗原胶体金免疫层析法血清快速测定的性能评估
13、基于微型压电与光谱生化分析系统的POCT新技术研究
14、长江三角洲地区犬猫皮肤真菌病调查及体外药敏试验
15、我国医学检验本科专业人才培养的问题与对策研究
16、基于电化学分子信标基因传感技术的HIV-1核酸检测新方法研究
17、Free β-hCG和PAPPA光激化学发光免疫分析试剂的研制
18、乙肝快速分析仪的研究与开发
19、阿托伐他汀对动脉粥样硬化患者外周血中PPAR γ的作用研究及相关炎症因子与动脉粥样硬化关系的建模分析
20、综合性医院医学检验资源优化管理研究
21、全自动多功能免疫检验过程关键问题的优化研究
22、HMGB1通过NF-κB激活TGF-β1诱导特发性肺纤维化发病机制的研究
23、若干病毒感染模型的动力学分析
24、现代综合医院检验中心空间设计研究
25、大型公立医院创建医学独立实验室可行性研究
26、高血压病证型与血清褪黑色素水平的相关性研究
27、医用臭氧与α-干扰素对照治疗慢性乙型病毒性肝炎
28、网织血小板在系统性红斑狼疮患者的临床应用
29、G公司第三方独立医学实验室服务营销策略研究
30、临床毛细管电泳的研究
31、基于光电检测与信息处理技术的纳米金免疫层析试条定量测试的研究
32、贫铀长期作用后的吸收分布特点及其主要蓄积器官的损伤效应研究
33、基于磁性微球的PMMA微流控免疫分析芯片系统的研究
34、hr HPV、L1壳蛋白、p16蛋白与宫颈病变的关系及诊断价值研究
35、76例急性白血病的MICM分型及预后
36、国产化学发光法诊断系统检测乙肝表面抗原的评价
37、蛋白A-藻蓝蛋白β亚基双功能蛋白的性质及其在免疫检测中的应用
38、上海市社区卫生服务中心检验开展现状及检验项目合理化设置研究
39、__医学检验集团发展战略研究
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学术堂整理了十个关于大肠杆菌的论文题目,供大家参考:1、大肠杆菌表达系统的研究进展2、重组大肠杆菌高密度发酵研究进展3、山东省鸡大肠杆菌的分离鉴定4、大肠杆菌mtID基因和gutD基因的克隆,全序列测定和高效表达5、我国部分地区禽病原性大肠杆菌的分离与鉴定6、中国不同地区家禽大肠杆菌血清型分布和耐药性比较研究7、大肠杆菌毒力因子研究概况8、致病性大肠杆菌的耐药性监测9、动物大肠杆菌耐药性的变化趋势10、纳米银对大肠杆菌的抗菌作用及其机制
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分子生物技术在微生物降解环境 污染物中的应用 [摘要〕介绍了与环境微生物关键降解酶基因的筛选、克隆及应用相关的分r生物技术，包括聚合酶链式反应技 术、基因重组技术、荧光原位杂交技术和生物信息学等技术，并对这些技术在污染物降解基因检测、筛选和克隆方 面的应用进行了阐述与探讨、 [关键词]分子生物技术;微生物;基因;环境污染物;降解 随着现代j:\地技术的发展，多环芳烃、含氯有 机物和硝基苯类化合物等人工合成井难以降解的 污染物大量排放，造成世界范围内的环境污染和生 态破坏，严重地威胁人类和其他生物的正常生存和 发展。利用微生物修复技术对受污染的水体及土 壤进行处理，凸显了其重要的意义和可行性。研究 人员发现并筛选到一些微生物，它们不仅对环境有 较高的适应性、对污染物有较高的耐受性，而且对 污染物有较强的降解效率和专一性。然而环境中 存在的大量微生物中仅有少于1%可通过传统的培 养方法进行培养、分离和纯化，绝大多数细菌需要 非常严格的营养条件川。因此，为了对修复环境有 所贡献却难以培养的微生物进行更全面了解，也为 了筛选到更多有利于降解环境污染物的微生物菌 种及其关键酶基因，分子生物技术和手段逐渐被广 泛应用到环境可降解污染物及降解机理方面的研 究中。 本文对近年来发展起来的聚合酶链式反应 (PCR)技术、基因重组技术、荧光原位杂交(FISH) 技术和生物信息学等多种分子生物技术进行了介 绍，并总结了它们在污染物降解基因检测、筛选和 克隆方面的应用。 1与环境污染物降解相关的分子生 物技术 1.1PCR及其相关技术 PCR是一种利用脱氧核糖核酸(DNA)半保留 复制原理，在体外扩增位于两段已知序列之间的 DNA区段从而得到大量拷贝的分子生物技术。根 据其模板、引物来源或扩增条件的不同，PcR技术 可分为以下几种:(l)反转录pCR(RT一PeR)技 术，将mRNA反转录为cDNA后再对其进行PCR 扩增，可用来构建cDNA文库，分析不同生长时期 的mRNA表达状况和相关性以及mRNA的定量测 定等;(2)巢式PCR技术，在扩增大片段目的DNA 时，先用非特意性引物扩增再用特意性引物对第一 次扩增产物进行第二次扩增，以获得可供分析的 DNA;(3)竞争PCR技术，是一种定量PCR，向PCR 反应体系中加人人工构建的带有突变的竞争模板， 通过控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度， 对目的模板作定量研究;(4)实时荧光定量PCR技 术，在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信 号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线 对未知模板进行定量分析，该法已广泛用于基因表 达研究、转基因研究等方面;(5)扩增的rDNA限制 酶切分析技术，根据原核生物rDNA序列的保守性， 将扩增的rDNA片段进行酶切，通过酶切图谱来分 析菌间的多样性;(6)RNA随机引导PCR技术，基 于任意寡核昔酸引物与RNA之间可能的配对，在 低严谨度条件下经聚合酶催化使链延伸，将细胞总 RNA或InRNA作为反转录反应的模板，此技术结 合单链构象多态性，用非变性胶分辨大小相同而构 象不同的片段，可用于诊断遗传突变及分析污染条 件下序列的多态性;(7)随机扩增多态DNA (RAPD)技术，是一种基于PCR检测PCR引物结合 位点序列改变的方法，通常以10bp的寡核昔酸序 列为引物，对基因组DNA随机扩增，电泳分离染色 扩‘增产物，再分析多态性。 1.2FISH技术 FISH技术利用荧光标记的探针在细胞内与特 异的互补核酸序列杂交，通过激发杂交探针的荧光 来检测信号。荧光探针比放射性探针更安全，具有 较好的分辨力，不需要额外的检测步骤。近年来， 由于FISH技术具有灵敏、便捷等优点，迅速发展完 善成为研究环境微生物的有力工具。此外，可用不 同激发和散射波长的荧光染料标记探针，在一步反 应中同时检测几个靶序列。该技术主要包括试样 固定、预处理、预杂交、探针和试样变性、杂交、漂洗 去除未结合的探针、检测杂交信号等步骤。由于 165rRNA具有遗传稳定性，因此成为FISH技术检 测最常用的靶序列。 1.3基因重组技术 基因重组技术是从供体生物的基因组中通过 酶切扩增等手段获取目的基因，与载体连接形成重 组DNA分子，再导入到受体细胞中，让外源基因得 以表达。在已经分离出的许多菌株中，与降解能力 有关的基因多在质粒体上。由于质粒很容易在细 菌的繁殖过程中遗失，对细菌降解能力的长期稳定 非常不利，可将其与污染物降解有关的酶基因重组 到大肠杆菌等微生物中进行表达，以此构建的各种 生物降解特性增强的重组菌可用于污染环境的治 理修复或发酵某些废弃物。 1.4生物信息学 20世纪后期，生物学的迅猛发展，从数量上和 质量上极大地丰富了基因组数据库、蛋白质数据 库、酶数据库和文献数据库等许多生物科学的数据 资源。已有多个国家和国际科研组织建立了生物 信息数据库，如欧洲分子生物学实验室(Eur叩ean MolecularBiologyLaboratory)核酸序列数据库和美 国国家生物技术情报中心(Nationaleente:fo:Bio- technologyInformation，NCBI)基因序列数据库等。 科学家利用计算机及生物信息分析软件分析这些 数据资源，确定大分子序列、结构、表达模式和生化 途径与生物数据之间的关系，区分生物个体间遗传 差异，揭示DNA多样性。例如，基本局部比对搜索 工具(BasieLoealAlignmentSearehTool，BLAST)， 是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似 性比较的分析工具。它基于Altschul等的方法「2〕， 在序列数据库中对查询序列进行同源性比对工作。 BLAST程序可对一条或多条、任何数量、任何形式的 序列在一个或多个核酸或蛋白序列库中进行比对，甚 至将有缺口的比对序列也考虑在内，利用比较结果中 的得分对序列进行相似性说明。基因的序列分析可 揭示出生物物种之间的关系，在污染治理研究中可用 于生物基因组特殊区域或特异基因的测序。 2分子生物技术在环境污染物降解 中的应用 2.1土壤试样总DNA的提取 用适当方法直接从土壤中提取DNA并纯化， 是从分子生物学角度对土壤微生物进行研究的前 提条件，而后可进行酶切、PCR扩增、核酸分子杂交 等分子生物学技术操作。从土壤中提取微生物 DNA主要分为汽接法和间接法}’{。直接法是在 ogram等的方法基础卜发展起来的，其主要包括2 个步骤:(l)原位细胞裂解;(2)DNA提取和纯化。 直接法提取的DNA超过细菌总DNA的60%且省 力，但提取的DNA常常有折断、腐殖酸污染、甚至 提取物中还夹杂有未知的胞外DNA和真核生物的 DNA。最先报道间接法的是Faegri等[‘〕，其主要包 括4个步骤:(l)分散土壤;(2)分离细胞与土壤; (3)细胞裂解;(4)DNA纯化。间接法提取DNA 产量低且费力，但纯度较高、DNA损伤小，提取的 大片段DNA可用来构建cos而d和细菌人工染色体 文库等。 2.2采用PCR及相关技术扩增分析DNA片段 可降解污染物的微生物必然能产生分解代谢 该污染物的酶。selvaratnam等L’l用编码苯酚单加 氧酶dmpN摹因的RT一PCR技术来检测序列间歇 式活性污泥反应器‘{一，降解酚的假单胞菌。检测结 果表明，RT一PCR技术不仅能检测微生物降解酚的 能力，还能测量dmpN基因的转录水平，从而确定假 单胞菌特殊的分解活性，发现了在转录水平下，酚 浓度与通气时间之问存在正相关关系。 将PCR技术和变性梯度凝胶电泳(DGGE)结 合起来，在变性条件适当的情况下能分辨一个碱基 对，分辨率较高。染色后的凝胶用成像系统进行分 析，可在一定程度l几反应试样的复杂性。条带的多 少能反应试样「 一 }1微生物组成的差异，条带的亮度能 反应试样中微生物的多少。基于以上优点，日前该 技术在微生物群落结构的分析和动态研究方面得 到了厂‘泛应用。DGGE可通过分析PCR扩增的基 因点突变来探索微生物的复杂性。徐玉泉等[“〕从 某废水中分离出一株能以苯酚为惟一碳源的菌株 PHEA一2，使用PCR一DGGE技术对该菌165 rDNA进行分析，发现该菌与醋酸钙不动杆菌同源。 M盯sh等r了)利用PcR一DGGE技术获得了活性污泥 中真核微生物的种群变化情况。王峰等下8〕采用 PCR一DGGE技术对城市污水化学生物絮凝处理中 活性污泥和生物膜微生物种群结构进行了分析，结 果表明活性污泥培养前后微生物种群结构发生r 很大改变。 RAPD技术也是一种应用比较广泛的以多态性 引物来扩增某些片段的技术。RAPD技术可用于检 测含有混合微生物种群的各种微生物反应器中微 生物的多样性。用RAPD技术分析检测实验室规 模的油脂淤泥培养料中的细菌菌群发现，用油脂淤 泥改良过的培养料比未改良的更适于不同的微生 物种群生长[9j。vainio等t’。〕从516种孤立的菌落 中提取出165rDNA，经PCR扩增后进行测序，检测 活性污泥中微生物种群的结构。这些组合技术的 应用显著增强r对微生物的检测和鉴定能力，为理 论研究工艺优化及提高生物处理效率提供了条件。 2.3基因重组 基因工程技术应用于环境保护起始于20世纪 80年代。其基本原理是通过基因分离和重组技术， 将目的基因片段，比如可编码降解某种污染物的 酶，转移到受体生物细胞中并表达，使受体生物具 有该目的基因表达显现的特殊性状，从而达到治理 污染的目的。找到特定污染的抗性基因，利用基因 重组技术转基因后也可获得其他抗性植株以及筛 选到可转化污染物的植物，还可开发超量积累植物 进行污染土壤的生物修复。 罗如新等L”〕用放射性同位素标记tfdc基因片 段作探针，Southemblot杂交定位Ll菌株的邻苯二 酚1，2一双加氧酶基因位于Pstl的I片段和BamH I的M、N片段，回收并将其直接克隆至表达载体 pKT230卜，获得的重组子能转化不具开环酶活性 的甲胺磷降解菌P2，得到高于天然宿主21倍的邻 苯二酚1，2一双加氧酶。stingley等{”〕通过构建基 因文库和重组质粒等基因工程方法证实了NidAB 双加氧酶是降解菲的关键酶类，并首次鉴定出此基 因通过磷苯二甲酸实现降解功能。chae等‘”}发现 不能降解苯酚的su如lobusso扣taricu、98/2菌株中 的儿茶酚2，3一双加氧酶基因与能降解苯酚的 sulfolo右u，，o如taricu、咫有[6J源区，分析得知它们 是山共同祖先进化而来。把儿茶酚2，3一双加氧酶 基因克隆到大肠杆菌中表达，可获得有较高降解活 性的双加氧酶。 重金属污染是环境污染的重要方面之一。随 着分子生物学技术的发展，越来越多的修复性蛋白 基因正被从植物、微生物和动物中陆续分离出来， 如汞离子还原酶基因、有机汞裂解酶基因、汞转运 蛋自基因、金属硫蛋白基因、植物络合素合成酶基 因、铁离子还原酶基因和锌转运蛋白基因L’‘〕。这些 基因通过基因工程的改造，重组到合适的受休细胞 中表达相应的蛋白质和酶，达到治理难以降解的有 毒有害污染物的目的。sorsa等〔”〕把MTS插人 LamB序列的153位点，在E.eoli中表达MTs，解决 r细胞内MTs对金属离子有限的吸附能力。综L 所述，基因重组技术具有快速、高效的特性，已逐渐 成为环境生物技术的研究热点。 2.4FISH技术 FISH技术利用核糖体内长度适中(约1500bp)、 高度保守的165:RNA序列作为理想的基因分类靶 序列，其中使用的165:RNA寡核普酸探针一般是 进行了荧光标记的20bp左右特异性核昔酸片段， 利用该报告分子(如生物素、地高辛)与荧光素标记 的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测系 统对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 FISH技术能提供处理过程中微生物的数量、空间分 布和原位生理学等信息。 硝化细菌是一类生理上非常特殊的化能自氧 菌，传统的研究方法要经过富集、分离、分类和鉴定 步骤，耗时长。HSH技术的引人解决了上述困难。 FlsH技术还被广泛用于活性污泥系统、硝化流化床 反应器和膜生物反应器等废水处理系统}’61。 基因工程微生物越来越多地被用于农业害虫 控制和环境污染的生物修复，对人类健康和环境的 影响引起广泛关注。1994年出现了一种新的标记 系统:绿色荧光蛋白(GFP)，由于GFP基因表达产 物对细胞没有毒害作用，且由GFP产生的荧光标记 检测卜分方便、简单。在某些被污染的环境中可分 离出降解该污染物的细菌，通过基因重组等手段使 用GFP分子标记，可更容易的分离检测被标记的 细胞叫。 Bastes等[’8]进行了苯酚降解菌染色体GFP基 因标记实验。通过PCR和Southemblot分析，证明 GFP基因已成功整合到宿主细胞的染色体中。对 标记菌与野生型的降解能力比较结果证明，GFP分 子标记的插人并不影响细胞的苯酚降解能力。 用G即标记Pseudomonasputida，研究活性淤 泥中细菌存活情况{’9飞。Pseudomonasputida被转到 活性淤泥2min后，观察到细胞在淤泥絮凝物间自 由游动;培养3d后，发现荧光细胞减少，大部分已 被合并到淤泥絮凝物中，以防止细菌被原生动物捕 食。用oFP标记石.eozi和Serraliamarceseern，考 察菌株附到絮凝物卜的过程{’()j。使用表面荧光显 微镜能将带有GFP标记的细胞从活性污泥中区分 开，井进行观察和记数。而聚焦激光扫描显微镜 (cLsM)可使GFP标记细菌产生三维轮廓，结合表 面荧光显微镜和CLSM观察GFP标记细胞，结果表 明，细胞表面疏水性在细菌附到絮凝物的过程中起 重要作用，两种细菌附在絮凝物上的模式有很大不 同，通过这种方法可更好地理解细菌赫附机理，有 助于提高废水处理效果。 3结语 分子生物技术的应用使研究人员可从微观的 角度更细致深人地了解微生物对污染物降解的具 体生理生化机制，在分子水平 _ _ [揭示生物体吸收、 迁移、积累有害物质最终被毒害，及适应、抗性等生 态问题，从而筛选到更多有利用价值的微生物。随 着越来越多微生物全部基因序列的解码，对各种细 菌体内可降解基因的分布和表达会有更深人的了 解，有关技术的发展和成熟必将对污染物的降解过 程有一个整体的、生态水平上的认识。 参考文献 l李凤，刘世贵 . 分子生物学技术在环境微生物研究中的 应用 . 世界科技研究与发展，2003，25(4):88一92 2AltsehulSF，GishW，MillerW，etal.Basieloealalign- mentsearehtool . JMolBiol，1990，215(3):403一410 3魏志琴，曾秀敏，宋培勇 . 土壤微生物DNA提取方法研 究进展 . 遵义师范学院学报，2006，8(4):53一56 4FaegriA，TorsvikVL，GoksoyrJ.Baeteria]andfunga] aetivitiesin5011:seParationofbacteriaandfungibyaraPid fraetionatedeentrifugationteehnique5011BiolBioehem， 1977，9(2):105一112 5SelvaratnamS，SehoedelBA，MeFarlandBL，etal APPlieationofreversetranseriPtasePCRformonitoring exPressionoftheeataboliedmPNgeneinaPhenol- degradingsequencingbatehreaetor . APPIEnviron Microbiol，1995，61(11):3981一3985 6徐玉泉，张维，陈明等 . 一株苯酚降解菌的分离和鉴 定 . 环境科学学报，2000，20(4):450一455 7MarshTL，LiuWT，ForneyLJ . Beginningamoleeular analysisoftheeukiU洲aleollllllunityinaetivatedsludge. WaterSeiTechnol，1998，37(4一5):455一460 8王峰，傅以钢，夏四清等.PCR一DGGE技术在城市污 水化学生物絮凝处理中的特点 . 环境科学，2004，25 (6):74一79 9涂书新，韦朝阳 . 我国生物修复技术的现状与展望 . 地 理科学进展，2004，23(6):20一31 10VainioEJ，MoilanenA，KoivulaTT，etal . ComParison ofpartial165rRNAgenesequeneesobtainedfromactiva- tedsludgebaeteria . APPIMierobiolBioteehnol，1997，48 (l):73一79 11罗如新，张素琴，李顺鹏 . 邻苯二酚1，2一双加氧酶
修改:相关网站:我给你提供一些大肠杆菌的资料,比较乱,自己去整理.三凉食品这个术语没有听说过,如果可以解释一下,或许我会知道.大肠杆菌O157: H7实验诊断研究进展 大肠杆菌O157: H7感染临床表现出血性肠炎：鲜血样便，腹部痉挛性疼痛，低热或不发热。 溶血性尿毒综合征（HUS）：主要发生在儿童，常出现在腹泻后数天或1-2周。病死率一般在10%，各别可高达50%。血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：主要发生在成年人，尤其老年人。病人主要表现为发热、血小板减少、溶血性贫血、肾功能异常等症状，病情发展迅速，病死率高，有时可出现70%的病人死亡。大肠杆菌O157: H7传染源和传播途经大肠杆菌O157: H7基本上是一种食源性病原菌，可通过食用大肠杆菌O157: H7污染的牛肉、牛奶、牛肉或制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、水等感染,也可通过人与人、人与动物密切接触传播。在实验室，大肠杆菌O157: H7可以感染小鼠、鸡、兔、猪、牛等动物。大肠杆菌O157: H7的感染已成为世界性的问题我国情况也不容乐观一、细菌培养与鉴定 1．分离培养早期培养对确定病原有重要意义。 培养的对象首先是急性血性腹泻患者，其次是HUS、TTP等住院病人，再其次是高危接触者。培养基：山梨醇麦康凯琼脂、胰胨大豆琼脂改良的伊红美兰 、改良的SD-39（MSD）琼脂 添加了头孢克肟 和 亚碲酸钾的山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC）添加了头孢克肟和鼠李糖（0.5%)的山梨醇麦康凯琼脂（CR-SMAC）“科玛嘉”大肠杆菌O157: H7显色培养基四溴荧光亚甲基兰琼脂H7抗血清—山梨醇发酵培养基 增菌液：含10mg/L 新生霉素的EB肉汤或肠道增菌液含10mg/L 新生霉素或10mg/L盐酸-吖啶黄的胰蛋白胨大豆肉汤新生霉素MEC肉汤月桂基胰蛋白胨肉汤加入下例任何一种抑制剂均可增加培养基的选择性头孢克肟 0.05mg/L 亚碲酸钾2.5mg/L 新生霉素10mg/L 万古霉素40mg/L2．免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法是将特异性抗体吸附于一种能被吸附的磁性珠子上,然后利用抗原抗体反应特性将样品中的大肠杆菌O157: H7富集起来。方法:1.增菌;2.取样品1ml加大肠杆菌O157: H7免疫磁珠20ul;3.轻轻混合10分钟;4.将试管插入磁架上;5.吸取上清;6.加PBS,重复3-5过程;7.取管壁沉淀物,划线接种于CT-山梨醇麦康凯琼脂(C-头孢克肟,T-亚碲酸钾)等选择性培养基。37℃培养6-24小时，挑取可疑菌落进行鉴定。Chapman等 共检测大便标本690份, 免疫磁珠分离法检出25 。用免疫磁珠分离法分离的l2株大肠杆菌O157: H7中,直接培养阳性仅5株。Wright等将接种大肠杆菌O157: H7的碎牛肉标本置加有万古霉素和头孢克肟的缓冲蛋白胨水培养,然后直接或用大肠杆菌O157抗体包被的磁珠分离细菌后,接种于CT-SMAC,结果直接次培养检出量为200cfu/g,而免疫磁珠分离法仅需 2cfu/g 。Chapman等先用EC肉汤增菌,然后用免疫磁珠分离法富集牛粪便大肠杆菌O157: H7菌株,再用选择性培养基分离，并与CR-SMAC和CT-MAC直接培养作比较。用前者检测接种12株不同大肠杆菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。 Cubbon等用免疫磁分离法（IMS）检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157: H7。在一起经牛奶传播的大肠杆菌O157: H7爆发中,用IMS、粪便培养和多聚酶链反应(PCR)检测Vero毒素基因的携带,用三种方法对粪便大肠杆菌O157: H7的分离率作比较结果,在受检的142份粪便标本中,直接培养和IMS均阳性20 份,另13份仅IMS阳性。因此,IMS提高了大肠杆菌O157: H7感染病例的检出率,与PCR符合率高。目前，污染的肉、家畜，甚至饮用水均面临大肠杆菌O157: H7的卫生威胁。检测食品和水源中肠道病原体使用传统的培养法,结果不理想。IMS和其它检测的研究表明,对快速检测食品和环境标本似乎前景良好,Yu检等以IMS结合电化学发光检测法(ECL)检测食品和污染物中的大肠杆菌。结果显示,在原缓冲液检出大肠肠菌的范固为100－1000 cfu/lm,在食品检出的范围为1000－2000cfu/lm ，检测时间十分快,一般不到1小时。菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。在监测牛群的4个月间,从牛采集1024份直肠标本,其中检出大肠杆菌O157: H784份（8.2%）84份中有23份（27.4%）由直接培养和IMS分离。23份中15份由两种培养基、5份仅由CT-SMAC、3份仅由CR－SMAC分离,其余61份(72.6%)仅IMS分离。用含吐温－20 的PBS洗涤磁珠可减少其它微生物与磁珠的非特异性结合。用无关的抗体包被磁,则大肠杆菌O157: H7不结合。IMS具有快速、操作简单、特异性高,在流行病学调查中有价值。 3．生化反应 目前许多国家使用的O157和 H7特异性抗体与极少数细菌具有不同程度交叉反应。因此用生化试验确定为大肠杆菌是必须的。典型大肠杆菌的主要生化反应结果如下：动力试验（+） 葡萄糖（+） 麦芽糖（+）甘露醇（+） 蔗糖（－/+） 硫化氢（－） 尿素（－） 靛基质（+） 甲基红（+） V-P试验（－）枸橼酸盐（－）苯丙氨酸脱羧酶（－）赖氨酸脱羧酶（+/－）鸟氨酸脱羧酶（ +/ －）氧化酶（－）氰化钾（－）与O157有鉴别意义的生化反应见表1。MUG即4-甲基伞形化内酯-β-葡萄糖醛酸苷。大多数大肠杆菌具有葡萄糖醛酸酶,可水解MUG产生荧光, 但O157: H7中大多数菌株则不水解MUG。Thompson等建立了一种快速MUG试验,取 MUG试剂0.5ml置试管中,以无菌棉签挑取待检菌纯培养物混匀于其中,44.5℃置20min,暗室内高强度光源下观察结果,产生蓝色荧光者为阳性。 二．血清学检测1．玻片凝集试验2. 胶体金免疫技术3. ELISA 4．免疫荧光技术5．胶乳凝集 6. 间接血凝分析(IEHA)7. 全自动抗原抗体检测系统8. 免疫印记法1．玻片凝集试验玻片凝集试验是鉴定O抗原最经典的方法,实验中如果凝集反应不明确，但根据临床表现和生化反应等菌株高度可疑时,可100℃加热菌液30min再行玻片凝集试验。这样可去除K抗原的影响。为排除交叉反应引起的凝集造成假阳性,应继而做试管凝集反应,所测得的效价不应低于诊断血清原标定效价的一半。鉴定H抗原也应同时做玻片和试管凝集试验,并应先对待检菌做动力试验,在动力活泼时取培养物做H抗原鉴定。2. 胶体金免疫技术胶体金免疫技术特点是以胶体金作为标记物进行的抗原抗体反应。这一技术最初用于免疫电镜技术。至今，在免疫测定中，金标记常与膜载体配合，形成特定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛的一种简便、快速的血清学检验方法。胶体金的制备多采用还原法，氯金酸是主要还原材料。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。胶体金免疫层析试验时以硝酸纤维膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一样。中国预防医学科学院微生物研究所利用胶体金技术、双抗体夹心法和显色反应等特点，研制了大肠杆菌O157: H7病原体快检金卡，通用于定性检测粪便、食品、水等样品中的O157: H7大肠杆菌。显色程度与样品中细菌含量成正比，最低测菌量为少于100个菌细胞，主要特点是敏感性高，可用于待检样品初筛，阳性样品可进行细菌分离，减少工作量。3. ELISA 大肠杆菌O157: H7的常用检测方法是粪便培养后作细菌分离,然后用生物化学和免疫学方法鉴定,一般需72 小时。Dylla等用一种快速ELISA直接检测粪便中大肠杆菌O157: H7,并与标准培养方法加以对照。结果显示,ELISA检测183份粪便标本,检出大肠杆菌O157: H7 9份。常规培养法阴性176份,而ELISA阴性174份。总特异性为98.9%。该法与其它非O157: H7大肠杆菌无交叉反应,是一种准确、敏感、特异、易观察结果的筛选方法，尤其适用于中、小实验室及大量粪便标本的流行病学调查。Padhye等用单克隆抗体进行直接ELISA反应检测O157: H7,除O26 ：H11外，未发现与沙门氏菌、结肠炎耶氏森菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯民菌等有交叉反应。单克隆抗体用于检测大肠杆菌O157: H7有明显特异性，可作为一种免疫试剂用于临床和食物标本的快速检测。Clark 等近一步对单克隆抗体的研究发现,此种单克隆抗体识别的物质是LPS,这种LPS抗原决定簇用全细胞ELISA同样可以在其它血清型大肠杆菌和产生或不产生Vero毒素的大肠杆菌中检测到, 而且易受到胆盐、吖啶黄和温度的影响,但可以通过结合免疫捕获的修饰方案来提高ELISA的特异性。4．免疫荧光技术 DEFT 与Ab-DEFT： 直接荧光技术（DEFT）与抗体定位荧光技术(Ab－DEFT)的主要特点是,显微镜下直接计数样品菌细胞。由于无需培养或分离过程,因此检测非常快速。DEFT的基本原理为:对样品进行过滤,用荧光染料(如吖啶橙)对留在滤膜上的菌细胞染色后,用荧光显微镜观察计数。但由于荧光染料的非特异染色,不但被检菌被染色,本底杂菌也可染色,从而影响了结果的精确性。Ab-DEFT则克服了这一缺点,过滤后的菌细胞与荧光标记的特异抗体作用,然后用荧光显微镜观察计数。 固相荧光毛细管免疫分析此方法高度敏感，具有快速、试剂用量少、易于操作等优点。Czajlu等用热杀死的O157: H7菌包被玻璃毛细管作固形支持物。 样品中加入结合了生物素的O157: H7多克隆抗体,作用一段时间,然后将此样品/抗体混合物与标记了Cy5 (一种荧光花青染料)的亲和素加入到毛细管,孵育2min,冲洗、吹干,由激光传感器系统发射650nm波长激发光激发花青染料,之后用光学传感器系统测定荧光发射密度。直接免疫荧光抗体染色 Park等对粪便样品进行离心后,用免疫荧光抗体对粪便涂片进行标记,可检测到所有培养法证实的菌株,检测时间<2h。5．胶乳凝集 该方法是以胶乳颗粒作载体,以O157: H7特异性抗体致敏,制成特异的胶乳试剂,将标本乳化于玻片或有色烧盘上，滴加胶乳试剂,呈明显凝集而对照胶乳不凝集时即为阳性。 6．间接血凝分析(IEHA)该法多用于对LPS、可溶性本体抗原、未加热抗原的抗体检测,对检测H抗原的抗体效果不佳。Morooka等检测了溶血性尿毒综合征(HUS)病人血清LPS抗体,虽然甲醛化羊红细胞(SRBC)有低水平非特异性吸附,但不影响该方法作为一种有效、快速（<3h）的诊断方法。因为感染病人血清的滴度明显高于非特异性吸附。7. 全自动抗原抗体检测系统VIDAS是一种全自动抗原抗体检测系统。可直接从感染性疾病患者标本中检测细菌、病毒、弓形虫、衣原体和螺旋体等微生物的抗原、抗体或毒素。基本原理：采用酶联免疫（夹心法）原理，并在底物中掺入荧光物质，最终产生荧光产物4-甲基-7-羟刀豆素，荧光强弱与标本中被测物浓度相关，经扫描样本读数与标准比较计算出标准值，并根据阴性和阳性临界值判定结果。 8.免疫印记法目的是检测大肠杆菌O157: H7感染者血清中的O157脂多糖和溶血素特异性 抗体。基本原理是将提纯的脂多糖或溶血素用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，通过转移电泳转移到硝酸纤维膜上，然后用抗原抗体进行免疫检测。包括SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移电泳、免疫检测三部分。特点是具有比较高的特异性和敏感性 。免疫检测 将封闭好的硝酸纤维素膜按梳子齿的宽度剪成每一个泳道一条，依次编号。1) 每条加入1毫升用PBS稀释的病人血清，室温震荡2小时，同时设阳性对照和阴性对照；2) 用2.5毫升／条PBST震荡洗涤3次，每次5分钟；3) 加入用1毫升用PBS稀释的II抗，室温震荡1小时；4) 用2.5毫升／条PBST震荡洗涤2次，每次5分钟，再用PBS洗涤一次； 5) 将膜放入12毫升显色液中显色，室温震荡15-30分钟，至阳性对照出现满意的蓝紫色 ；6) 将膜放入蒸馏水中终止显色反应，照相；7) 当显色的条带和溶血素的分子量或0157脂多糖的条谱一致时，结果判断为阳性。二．分子生物学检测 分子生物学的出现，为更快诊断微生物提供了许多分子学工具。 这一新的研究是用基因型而不是表型因子来鉴定特异性病原体。因此其特异性更好。加之 操作程序自动化使得DNA分析在实验室应用中已成为常规操作。自动化DNA提取仪，聚合酶链式反应仪(PCR仪)，DNA序列分析仪，脉冲凝胶电泳仪(用于分离DNA大片段，如完整的染色体) 在疾病诊断中都是很有用的。 1．DNA探针探针(probe)标记：放射性核素 、非放射性物质标记 。探针的来源 ：①克隆的基因组DNA探针；②cDNA探针；⑧RNA探针；④寡核苷酸探针。标本处理：根据标本来源和量的不同而处理不同 。杂交方法：斑点杂交 、southern印迹 、原位杂交 、Northern印迹 等。杂交信号检测 ： (1)测量放射性核素射线脉冲数 (2)放射自显影 (3)显色法 (4)发光法。 O157: H7特异噬菌体上的sltⅠ、Ⅱ基因、大质粒溶血素基因及染色体上eae基因等都已制成了可杂交检测的特异探针。Beutin等曾用VT1(750bp,)、VT2(850bp)、溶血素(3.4kb)等探针进行流行病学调查。Thomas等用地高辛标记的VT2B亚单位基因、VT2C基因探针检测不同噬菌体型O157: H7菌。Huck等筛选了O157: H7大质粒上限制性片段,发展了一种2.0kb的Sma I片段探针,认为此探针对O157: H7血清型最为特异,可与所有O157: H7试验菌杂交。2. PCR技术 聚合酶链式反应技术（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。具有特异性强、敏感性高、快速、简便、可扩增RNA或cDNA、对起始材料质量要求低等优点。PCR技术扩增体系的基本成分引物: PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应充分考虑引物特异性。引物长度一般为15-30个碱基,G+C含量为40- 60%,浓度0.1-1umol/L 。TaqDNA聚合酶：浓度为1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异DNA扩增 。模板DNA：应避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂及能结合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制备方法有加热法、冻溶法、超声波粉碎法、碱变性法、SDS裂解法等多种。 4×dNTPs ： dNTP储存液pH应为7.0，在反应体系中，4种dNTP的浓度应相同，每种dNTP的浓度以50-200 umol/L为宜。缓冲液及其他成份：PCR反应体系中，一般采用Tris-HCl缓冲液。适宜的Mg2+浓度为高于dNTP总浓度0.2-2.5 mmol/L。 PCR技术循环参数PCR扩增是由变性、退火和延伸三个步骤反复循环而实现的。确定正确的循环参数是PCR成功的保证。循环参数1．变性温度和时间 模板DNA和PCR产物的变性不完全，是PCR反应失败最常见的一个原因,在变性步骤，使温度达到双链DNA完全分离的变性条件是95 ℃ ，30s。对GC含量高的靶DNA序列，宜用较高的变性温度。在解链温度下，DNA的变性仅需几秒。但是，使反应管内达到解链温度需要一定的时间。原则上变性步骤应高温、短时，即要保证变性充分，又要保持聚合酶在整个反应中的活性。循环参数2．引物退火 引物退火的温度和时间取决于引物的长度、碱基组成及其在反应体系中的浓度 。对GC含量约50％，长20个碱基的典型寡核苷酸引物而言，最佳的退火温度为55 ℃ 。在温度较高的条件下退火，可提高PCR的特异性。 循环参数3．引物延伸 ：引物延伸是DNA聚合酶将脱氧单核苷酸逐一地加到引物的3’一OH末端，引物延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度。如用TaqDNA聚合酶，一般取70-75 ℃ ，常用72 ℃ 。 延伸步骤的时间则取决于目标序列的长度、浓度和延伸温度。目标序列越长、浓度越低、延伸温度越低，则所需的延伸时间越长；反之，目标序列越短、浓度越高、延伸温度越高，所需的延伸时间则越短 一般而言，每1000个碱基的序列，延伸时间1分钟便足够了。对于扩增100—300个碱基的短序列片段，可省去延伸温度这一步骤，而采用快速简便的变性、退火双温循环。这是因为TaqDNA聚合酶即使在退火温度下仍保持很强的活性，而延伸过程可在退火温度转变为变性温度的过程中完成。 循环参数扩增产物长度 100bp 500bp 1000bp 2000bp94℃变性时间（秒） 30 30 60 6055℃复性时间（秒） 30 30 60 6072℃延伸时间（秒） 30 38 120 180一般作25-30个循环即可，进行最后一次循环时间、延伸时间增加5分钟。PCR扩增产物的检测方法PCR反应混合物经过循环扩增后，所需做的工作就是检测反应液中是否存在预期扩增产物及产物的特异性。目前已经发展了许多检测分析PCR扩增产物的方法。包括凝胶电泳、高压液相色谱、核酸探针杂交、探针捕获酶免疫分析、酶切图谱分析、单链构型多态性分析、核酸序列分析。PCR技术类型 免疫PCR技术 原位PCR技术 不对称PCR技术 巢式PCR技术 反向PCR技术 逆转录PCR技术 复合PCR技术 彩色PCR技术 抗原捕获PCR技术增敏PCR技术 酶标PCR技术 二温式PCR技术 锚定PCR技术 定量PCR技术 毛细管PCR技术 多重PCR技术 巢式或套式PCR技术PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用(1)简单PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段为基础设计了一对引物,扩增产物为633bp的DNA片段。其退火温度为60℃－63℃, 应用煮沸法与基因释放法,大肠杆菌O157: H7检出限分别为25与38CFU/ml,检测时间为3h。Thomas等用PCR扩增了slt基因片段。引物：正链5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3',反链5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’ 其PCR产物由凝胶电泳测定,检测时间为ld 。徐建国等根据O157: H7 特有的hlyA、B基因序列设计了PCR引物,产物为338bp。PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（2）多重PCR:由于鉴定O157: H7血清型不能仅仅依靠简单PCR,近年来国外学者对多重PCR方法在大肠杆菌O157: H7的诊断价值方面进行了研究。Meng等同时扩增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其长度分别为633、210、484bp。此引物设计可有效区别O157: H7血清型与O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一个单一反应中同时扩增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa质粒保守序列,其产物分别为1087、227、224、166bp。严笠选用针对大肠杆菌O157: H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157: H7大肠杆菌及其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌15株。结果复合PCR方法较单一PCR方法具有较高的特异性，12株O157: H7取得了稳定、可靠的阳性结果。能迅速、有效地与其它致病性大肠杆菌及沙门氏菌、志贺菌相鉴别。PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（3）原位PCR:kurokawa等不用培养过程,直接用原位PCR技术结合落射显微镜,在单细胞水平快速检测O157: H7 。4.23SrRNA在大肠杆菌O157: H7分型、检测中的应用传统的细菌分类方法主要依赖于细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等特征。随着现代分子生物学理论和技术的迅速发展，微生物检测进入了基因时代，以核糖体核糖核酸序列为基础的分类方法为微生物的鉴别提供了新的分子生物学方法。如16srRNA、 23srRNA、 16-23srRNA区间序列分析等等，它完全不同于传统方法，具有快速、简便、敏感和特异等优点。23SrRNA基因特征：原核生物的核糖体有三种大小（分别为23S、16S、 5S）的rRNA。目前已知23SrRNA基因全长序列的菌种数目已达250种。长度大约为3000pb。对许多细菌的23SrRNA基因序列分析发现，其序列的可变性比16SrRNA基因要明显，特别是亲源关系近的种系。利用这些可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分类鉴定。同时对已知23SrRNA基因序列分析也发现，在最初的520pb中有6个保守区域（5-10区域），并发现，这6个保守区域中6区段和10区段最保守，该序列在14个菌种中完全一致。应用：检测临床感染性疾病的病原菌 首先，将两条引物设计在保守区，成为通用引物，而在变异区中选择序列作为特异性探针，先用通用引物作PCR扩增，可筛选出含有病原菌的样本，再用特异性探针与扩增产物进行杂交，对目的细菌作出鉴定，达到诊断病原体及分型的目的。鉴定特定细菌种属 目前认为，已发现的23SrRNA基因的IVSs具有种属特异性，可利用IVSs（插入序列）进行PCR扩增达到对某一种属细菌的诊断。在流行病学方面的应用利用可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分析。为流行病提供依据。除以上介绍的各方法外,常用的有效检测方法还有脉冲场电泳、随机扩增多态性DNA指纹分析、细胞毒试验等,在此不一一赘述。 大肠杆菌O157: H7的检验程序 样品 增菌6小时 磁珠浓缩 可疑菌落 山梨醇麦康凯琼脂G染色 生化反应 血清学 毒力基因 大肠杆菌O157: H7实验室诊断依据 有下列情况之一具有实验室确诊意义： 1) 从腹泻病患者的粪便标本中分离出大肠杆菌O157: H7 ；2) 经PCR或DNA杂交试验证实具有溶血素基因 及志贺样毒素基因；3) 腹泻病患者恢复期血清抗O157LPS IgG抗体呈4倍升高；4) 具有血性便的腹泻患者的急性期血清或恢复期血清，蛋白印记试验证实含有和O157LPS、EHEC溶血素或志贺毒素的特异性抗体．小结自从O157: H7被认识以来,对其基因的研究越来越细,已经探明了许多结构与功能基因,对其病因学、病理学及临床治疗方面均有很大促进作用。由于引起感染所需的O157: H7剂量很低,有必要发展一些灵敏度高的方法,用于快速有效地检测。另外,现已发现存在许多变异株,单用一种方法来检测往往是不够的。如发酵山梨醇的变异株用SMAC即不能检测到;由于许多非EHEC(EPEC、霍乱弧菌、志贺菌等)也可产生SLT,故单纯检测SLT也会产生假阳性结果。因此对一个样品的检测需结合使用多种方法才能获得准确的结果。 第三章 大肠菌群测定 一、大肠菌群检验(一)检验方法(二)培养基 (三)检验时应注意事二、大肠菌群的卫生学意义 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。过去我国在大肠菌群的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。1974年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法(包括快速检验方法)及其卫生学意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。 在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于1983～1985年对大肠菌群检验方法进行了实验研究，并作了对比观察，同时对国内常用的大肠菌群快速检测方法也进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供了科学依据。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。有些科学工作者又用靛基质、甲基红、V～P、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和44．5℃乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。不论分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为基础。一、大肠茵群检验(一)检验方法 1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。 2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。 3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时
0引言脆性X综合征（fragile X syndrome, FXS）是一种最常见的遗传性智力发育不全综合征，有超过99%的FXS是由脆性X智障基因1（fragile X mental retardation, FMR1）中5′端非编码区CGG三核苷酸重复序列不稳定扩增及其CpG岛异常甲基化导致. FMR1基因的表达产物FMRP的缺乏导致FXS的发生［1-2］. 本实验对编码基因存在于3号染色体［3］，能与FMR1 基因5′ d (CGG)n3′重复序列特异性结合的蛋白CGGBP1进行原核表达，并对其DNA结合活性进行研究.1材料和方法1.1材料大肠杆菌DH5α, BL21（ DE3）和表达载体pRSET A均为本实验室保存. 质粒提取试剂盒购自Sigma公司； 限制性内切酶BamH I和KpnI购自宝生物工程公司；T4 DNA连接酶购自Promega公司； Ni2+NTA金属螯合蛋白质纯化系统购自Qiagen公司；链酶亲和素磁珠购自Dynal公司；低分子质量蛋白标准购自上海西巴斯生物技术有限公司. 1.2方法 1.2.1表达载体的构建根据CGGBP1基因起始密码子和终止子邻近序列设计PCR引物：CGGBP1F CGC GGA TCC GAG CGA TTG TAG TAA CAG CA，CGGBP1R GGG GTA CCT CAA CAA TCT TGT GAG TTG AG. 其上游及下游引物分别加入BamHI和KpnI酶切识别位点序列(引物序列下划线部分). PCR反应以人淋巴细胞cDNA文库为模板，扩增编码CGGBP1的基因序列. 设计PCR扩增体系25 μL，灭菌去离子水10 μL，10×反应缓冲液2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，DMSO 2.5 μL，4× dNTP混合物（每种2.5 mmol/L）2 μL，CGGBP1F和CGGBP1R各10 pmol，模板3.5 μL（50 ng/μL）， Taq DNA（5 μ/μL）聚合酶0.5 μL. 扩增条件：95℃预变性5 min，再94℃ 30 s， 53℃ 1 min，72℃ 1 min循环40次，最后72℃终末延伸产物10 min. PCR产物经琼脂糖电泳分离，用胶回试剂盒回收目的基因. 用BamHI和KpnI酶切PCR产物和pRSET A，酶切产物电泳后回收，在T4连接酶作用下，目的片段定向克隆至pRSET A的BamHI和KpnI克隆位点. 将重组质粒转入大肠杆菌DH5α，接种到含氨苄青霉素的LB培养基平板并挑取单菌落.1.2.2融合蛋白的诱导表达将测序正确的重组质粒转入BL21（ DE3）. 挑取携带目标质粒的单菌落接种于含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基中， 37℃振荡培养12 h， 按10 mL/L比例转接于新鲜培养基，37℃振荡培养至对数生长期时，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，32℃诱导振荡培养4 h，离心收集菌体，SDSPAGE分析重组蛋白的表达.1.2.3蛋白表达形式的分析取5 mL菌液离心，用500 μL的裂解液（10 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L磷酸二氢钠 pH 8.0）重悬，加溶菌酶至终浓度为1 mg/mL，冰浴30 min，超声波裂菌，离心后分别将上清和沉淀进行SDSPAGE分析.1.2.4融合蛋白的纯化将1 mL 500 mL/L Ni2+NTA悬液和4 mL细菌裂解上清液轻轻混匀4℃放置60 min，直接过柱. 过柱结束后，用4 mL漂洗液（20 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH 8.0），洗脱未和Ni珠结合的杂蛋白. 经过2次漂洗后再用0.5 mL洗脱液(250 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH 8.0) 3次洗脱特异结合的目的蛋白，分步收集. 取收集液，进行SDSPAGE分析.1.2.5CGGBP1与（CGG）29重复序列双链DNA结合实验取10 μL磁珠用1 mL的无RNA酶的三蒸水清洗磁珠2次，除去防腐剂. 1×生物素亲和素结合缓冲液（10 mmol/L TrisHCl，2 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 g/L Tween 20）15 μL重悬磁珠，各5 μL分3组实验. 其中一组加入25 μL（100 ng/μL）生物素化的（CGG）29重复序列双链DNA，另外两组分别加入25 μL（100 ng/μL）非生物素化的（CGG）29重复序列双链DNA和25 μL三蒸水做对照；三组分别再加入2×生物素亲和素结合缓冲液30 μL，25℃轻摇1 h. 经磁力吸附后，弃上清. 重复上述步骤3次；加入纯化后CGGBP1（500 μg/mL）15 μL 和2×核酸蛋白结合缓冲液（20 mmol/L HEPES，100 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L DTT，100 g/L甘油）20 μL，室温下静置30 min；经磁力吸附后，弃上清；用1×核酸蛋白结合缓冲液清洗磁珠2次；加三蒸水10 μL，沸水煮10 min，进行SDSPAGE分析.2结果2.1原核表达载体的构建及鉴定扩增产物在15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，可观察到一条约504 bp的条带（图1）； 重组质粒pRSET A/CGGBP1及质粒pRSET A分别用BamHI和KpnI酶切，pRSET A/CGGBP1分为两个片段，分别为2.9 ku和504 bp（图2），均与预计结果相同.2.2CGGBP1的表达用BamHI和KpnI双酶切pRSET A/CGGBP1表达质粒，筛选阳性重组质粒. 携带有pRSET A/CGGBP1质粒的E.coli BL21(DE3)菌株，经IPTG诱导后，在Mr 约25 000处出现1条表达条带；而未经IPTG诱导的菌体则无此条带. 诱导后的菌体经溶菌酶及超声波裂解，离心后分为上清和沉淀两部分. 经SDSPAGE分析表明，CGGBP1部分存在于细菌裂解液的上清中，为可溶性蛋白，上清液中的目标蛋白相对较少（图3）. 2.3CGGBP1蛋白纯化在表达质粒pRSET A多克隆酶切位点的上游， 插入有连续6个组氨酸的序列 —(His )6 tag. 重组质粒经诱导表达后，(His )6 tag可以和外源插入片段共同表达. 利用(His )6 tag 和金属Ni2+的螯合所设计的固定化金属配体亲和柱层析方法，是纯化目的蛋白的一种高效而简单的方法. SDSPAGE显示，CGGBP1得到较高程度的纯化（图4）.2.4CGGBP1与5′d（CGG）293′重复序列双链DNA结合实验生物素化的5′d（CGG）29 3′重复序列双链DNA被固定到链酶亲和素磁珠上，非生物素化的5′d（CGG）293′重复序列双链DNA因无法固定到链酶亲和素磁珠上而被洗脱掉. 同理，加入CGGBP1后，未和5′d (CGG）293′重复序列双链DNA结合的蛋白也被洗脱（图5）.3讨论关于微卫星的产生机制，普遍认为是DNA复制过程中DNA聚合酶的滑动［4］，或DNA复制和修复时滑动链与互补链碱基错配，导致一个或几个重复单位的插入或缺失. 已发现微卫星可能是一种非常活跃的碱基序列，通常各种简单的重复序列成簇地聚集在一个染色体区域，这个染色体区形成特异染色体结构的能力将会增强. 这些区域在核糖体RNA基因中非常复杂，同时这些重复序列所折叠形成的结构还能与特异的蛋白质相结合，成为“染色质折叠密码”［5-6］，参与遗传物质的结构改变，基因调控及细胞分化等过程. 脆性X综合征是Igarashi等［7］研究报道的与三核苷酸重复片段扩增突变有关的7种神经变性疾病其中的一种. 该蛋白只和（CGG）n重复序列发生特异性结合，而与其它类型的三核苷酸重复序列不结合［8］. 因此，对该蛋白功能的研究具有重要的理论研究意义. 本实验成功地构建了含CGGBP1的重组质粒，以可溶性蛋白形式获得较高表达. 通过Ni2+NTA柱纯化，获得纯化的目标融合蛋白质，同时证明了该蛋白能和人FMR1基因5′d (CGG)293′重复序列双链DNA特异性结合. 这将为进一步开展真核生物蛋白CGGBP1功能的研究和阐释CGG三核苷酸动态突变的致病机理奠定基础.
学术堂整理了十个关于大肠杆菌的论文题目,供大家参考:1、大肠杆菌表达系统的研究进展2、重组大肠杆菌高密度发酵研究进展3、山东省鸡大肠杆菌的分离鉴定4、大肠杆菌mtID基因和gutD基因的克隆,全序列测定和高效表达5、我国部分地区禽病原性大肠杆菌的分离与鉴定6、中国不同地区家禽大肠杆菌血清型分布和耐药性比较研究7、大肠杆菌毒力因子研究概况8、致病性大肠杆菌的耐药性监测9、动物大肠杆菌耐药性的变化趋势10、纳米银对大肠杆菌的抗菌作用及其机制
大肠埃希菌201株耐药性分析胆盐抑制冷冻保存大肠杆菌生长的研究分子生物学中常用的大肠杆菌菌株大肠杆菌高效表达重组蛋白策略