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一、基因疫苗的诞生自1796年英国医生琴娜(Jener)首次采用牛痘苗以来,疫苗已在世界范围内被广泛应用,200多年来各种疫苗已经帮助人类战胜了包括天花在内的多种传染病.然而,现有的疫苗主要有两种：第一种疫苗是传统疫苗，即弱毒活苗和灭活苗，如鸡新城疫弱毒苗，猪瘟灭活苗，它是直接将无毒或减毒的病原体作为疫苗接种到人或动物体内，刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答，从而预防疾病的发生；第二种疫苗是基因工程苗，它是通过基因工程，先分离得到具有强烈免疫原性但无毒性的抗原蛋白的编码基因，然后导入表达载体中，再在宿主细胞表达出重组抗原蛋白，经分离纯化后的重组抗原蛋白作为疫苗接种如重组乙肝疫苗。但它存在一些不可忽视的缺陷如:灭活疫苗难以诱发细胞免疫,需多次免疫注射;亚单位疫苗免疫原性差;减毒活疫茵存在毒性回升的危险等问题.因此,现在对一些传染病仍缺乏相应的安全有效的疫苗. 第三代疫苗基因疫苗的问世,为解决这些难题带来了希望.基因疫苗（genetic vaccine）又称核酸疫苗(nucleic acid vaccine)或DNA疫苗，是在基因治疗（genetic therapy）技术的基础上发展而来的。基因治疗是从20世纪80年代发展起来用于预防和治疗疾病的最具革命性的生物医学医疗技术，其原理是将人或动物的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的。1990年Wolff JA等在进行基因治疗试验时，以裸DNA注射作对照，结果意外发现裸DNA可被骨骼肌细胞吸收并表达出外源性蛋白。1992年Tang 、 DC等首次证明经基因免疫产生的外源性蛋白质——人生长激素可刺激小鼠免疫系统产生特异性抗体，而且加强免疫后抗体效价增加，从而宣告基因疫苗的诞生。（注：1）概括起来，基因疫苗就是指将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的载体上，然后直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，该抗原蛋白可直接诱导机体产生免疫应答。抗原基因在一定时限内的持续表达，不断刺激机体免疫系统产生应答反应，从而达到预防疾病的目的。二、核酸免疫的作用机理目前对核酸免疫作用机理的认识主要还仅限于理论推测，且多数资料来自基因治疗试验，二者在作用机理上很相似。在基因免疫中，含病原体抗原基因的核酸疫苗被导入宿主细胞，被周围的组织细胞、APC细胞或其它炎性细胞摄取，并在细胞内表达。表达产物作为抗原可能的呈递途径是：肌细胞直接摄入或经T小管和细胞样内陷摄取进入，在外源基因启动子作用下使外源基因表达，使产物在胞内水解酶的作用下分解成长短不一的多肽，其中的一部分被hsp70运到内质网，经网膜上的TAP分子转入膜内与主要组织相容性复合物（MHC）I类结合，最终在细胞膜表面被CDS十细胞识别；另一部分短肽进入溶酶体，与（MHC）Ⅱ分子结合，运到细胞表面被 CD4＋细胞识别。这些多肽含有不同的抗原表位，它们将诱导细胞毒性T淋巴前体、B细胞和特异性辅助T细胞，产生细胞免疫和体液免疫。同时，基因表达可以通过细胞分泌和分裂的方式进入组织细胞间隙，以天然折叠方式被B淋巴细胞识别。核酸免疫后，还可以使肌细胞和抗原递呈细胞被感染，从而使CD4＋和CD8＋细胞亚群活化，产生特异的免疫应答。 CorrM等（1996）的研究表明，从转染DNA得肌肉组织释放出的抗原被APC摄入，运送到管状淋巴结中，在B淋巴细胞和T淋巴细胞表达， I类MHC限制的CTL应答可能主要以这种方式产生。以前曾认为该过程需要内源抗原的表达，但现在的研究表明，只要有外源抗原的存在，也能有效地引起I类MHC限制的CTL应答。 三、基因疫苗质粒载体的构建获得准确的抗原编码基因并将它插入到合适的载体DNA上，是发展基因疫苗的主要工作。1、编码抗原蛋白基因的分离制备DNA疫苗首先要获得编码抗原的基因，一般选择编码病原体表面糖蛋白的基因。抗原蛋白产生后可在宿主体内正确糖基化，从而诱导对病原体的免疫应答反应；对于易变异的病原体，最好选择各种变型都具有的核心蛋白保守的DNA序列，这样可对各种变异的病原体产生免疫应答反应，避免因病原体变异产生的免疫逃避问题。2 目的基因质粒的载体构建基因疫苗大多采用质粒作载体。一般说来，基因疫苗质粒载体至少包括5个主要的部件：（1）细菌复制子，以便质粒DNA在细菌体内复制扩增，得到大量的拷贝，但不能在宿主细胞（真核细胞）中复制；（2）原核生物选择性标记基因，如抗生素抗性基因，以筛选含有质粒DNA的阳性细菌克隆（菌株）；（3）真核生物的启动子、增强子、终止子、内含子等转录调控元件；（4）编码抗原蛋白的目的基因序列；（5）多聚核苷酸信号序列，以保证mRNA翻译时适时终止。另外，基因疫苗质粒载体通常含有一段未甲基化的CpG序列，其具有刺激Th1细胞的免疫活性。四、严重创伤后全身性炎症反应综合征及免疫调节治疗严重创伤后机体免疫功能表现为双向性改变。一方面表现为以吞噬功能和白细胞介素-2（IL- 2）等产生降低为代表的免疫受抑状态；另一方面表现出以全身性炎症反应综合征为特征的过 度炎症反应。正是这二方面共同作用构成了创伤后机体免疫功能紊乱，诱发多器官功能不全综合症（Multiple Organ Dysfunction Syndrome,MODS）。下面就全身性炎症反应综合征和免疫调节治疗作一综述。
免疫复合物的检测对于判定疾病的活动性、治疗效果、预后以及探讨发病原因有重要意义。某些自身免疫性疾病(如全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、结节性多动脉炎等)、膜增殖性肾炎、急性链球菌感染后肾炎、传染病(如慢性乙型肝炎、麻风、登革热、疟疾等)以及肿瘤患者，血清中都可能检出循环免疫复合物。
循环免疫复合物（circulating immunocomplex，简称CIC）是一类在抗原量稍过剩时，形成中等大小的可溶性IC(8.8～19S)，它既不能被吞噬细胞清除，又不能通过肾小球滤孔排出、可较长时间游离于血液和其他体液中，当血管壁通透性增加时，此类IC可随血流沉积在某些部位的毛细血管壁或嵌合在肾小球基底膜上，激活补体导致ICD（免疫复合物沉积）的发生。检查组织内或循环IC的存在有助于某些疾病的诊断、发病机制的研究、预后估计、病情活动观察和疗效判断等。
沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，其病原沙门氏菌属肠道细菌科，包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。它们除可感染人外，还可感染很多动物包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾病，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。蛋、家禽和肉类产品是沙门氏菌病的主要传播媒介，感染主要取决于沙门氏菌的血清型和食用者的身体状况，受威胁最大的是小孩、老年人及免疫缺陷个体。根据国际惯例，要求对易受沙门氏菌污染的食品进行分类管理，以使大多数食物不含沙门氏菌，从而有效预防沙门氏菌病。为此，人们在探索沙门氏菌检测方法的过程中，作出了不懈的努力，现将有关进展报告如下，并介绍两种快速检测沙门氏菌的试剂盒。自19世纪后期，沙门氏菌首次被鉴定为人类的一种病原以来，检测方法学都是建立在采取感染病人的粪便或血液作为临床病料的基础上。此后的60年间，用于从食品中分离沙门氏菌的方法实质上与那些用于临床病料的方法是相同的。但至少有三个因素限制了用于临床病料的方法应用在食品分析上。第一，通常，沙门氏菌的含量水平在污染食品中比有感染病人的病料中要低很多；第二，食品本身的性质会干扰病原的检测，例如，某些食品中固有菌群可能处在一个很高的水平，从而影响特定细菌的选择性分离和鉴定；第三，与临床病料不同的是，经过加工的食品，由于加热、干燥、高含盐量、酸和冷冻等因素的作用，其中的沙门氏菌受到了尚不致命的损伤或称“致伤”。这就形成了一个具有不同生长特性的细菌群。这种现象对那些希望从食物样品中分离出沙门氏菌的食品分析家来说有很大影响，因为在选择培养基上直接培养“致伤”的沙门氏菌通常是以细菌死亡和试验失败而告终。为克服这些困难，人们建立了一种简单的微生物增殖步骤，专门针对以食品为传播载体的病原。虽然这些方法本身证明是可靠的，但却很费力、耗时，需要4～7天才能完成。因此，在需要及时、快速评价食品中微生物的安全性时，通常不被采用。随着DNA和抗体技术的发展，近10～15年间发展了无数改进的方法，其中许多可以在48h内检出沙门氏菌，这些方法通称为快速检测。1 传统的培养方法用于沙门氏菌分析的传统方法是食物样品分步增菌，以增加病原的可检出率，这种培养方法总体可分4个不同阶段或步骤。第一步(预增菌)，将样品加到一种高营养、无选择性的培养基中，温度37℃，使那些“致伤”的细菌复苏及使所有微生物生长。虽然缓冲胨水被建议常规使用(由于其可保持溶液pH值稳定)，但对培养基的选择仍存有争论。第二，是选择性增菌步骤，它使沙门氏菌生长而使肉汤中同时存在的微生物数量减少，与预增菌培养基相似，对选择性培养基的选择，也存在许多不同的观点。目前应用的主要有如下3种类型：连四硫基盐肉汤(Tetrathionate broth)、硒酸盐胱氨酸肉汤(Selenite cystine broth)和RV(Rappaport-Vassiliadis)培养基。由于没有任何一种培养基可以全面地保持所有食品基质或各种沙门氏菌血清型，所以，较适当的做法就是使用两种培养基平行地进行试验。第三步是分离步骤，即选择性培养物在含一种或多种抑制非沙门氏菌生长制剂的琼脂平板上划线培养，然后对平板上肉眼可见的特征性菌落进行确认，并对该菌落分离物进行一系列生化和血清学检测，以作出鉴定。传统沙门氏菌检测法全过程需时至少4～7天，才能得出明确的诊断结果。2 以抗体为基础的检测方法利用抗原-抗体反应的显著特异性，来进行细菌的鉴别和血清学定型，已有半个多世纪的历史。细菌菌体或鞭毛抗原的特异性抗体的存在，使得人们可以建立一些快速方法来检测以食品为载体的病原。已经建立的沙门氏菌免疫学检测方法有许多种，大致可分为以酶标抗体(ELISA)，荧光抗体染色(免疫荧光法)，同位素标记抗体(放射免疫试验)为基础的方法及其它多种以抗体为基础，利用乳胶凝集、免疫传感器、免疫扩散及免疫色谱技术的方法。但常规中最广泛采用的是以双位点ELISA技术即夹心ELISA为基础的方法。此法改进后用有放射活性的同位素替代标记抗体，概括地说，是指以固定在固体基质上的“捕捉”抗体来捕捉目标抗原，经洗涤除去未结合的成分，加入第二种酶标抗体，此者结合在捕捉到的抗原的不同位点上，第二次洗涤后加入酶作用基质，并令其与颜色成分反应，然后用分光光度法即很容易检 测到目标抗原。采用微量滴定板作为固态基质使反应形式标准化，并促成其自动化。最近黎兆滚等人首次在国内口岸系统应用微量板ELISA法(Salmonelle test 1)对进出口动物产品(鱼粉、肉骨粉等)进行沙门氏菌检测。该法采用预先包被了沙门氏菌(A-E群)单克隆抗体的微量板，加入经增菌处理的样品，反应后再加入一定的指示剂，作用毕后用酶标仪测定OD值来判定结果。食物样品经适当的增菌处理，也可用此法进行沙门氏菌检测。ELISA法检出沙门氏菌的极限范围在105～106个细胞/ml，因此，要得出可靠的结果，食物样品首先必需进行预增菌、选择性增菌，通常还要在含有D-甘露糖的肉汤(M肉汤)中进行后增菌，以促进鞭毛发育。总的来说，标准的ELISA法样品的制备，约需要经过40～48h的孵育才能完成。黎兆滚等人的微量板ELISA法(Salmonella test 1)样品制备过程分三步，共耗时24h：①选用营养肉汤进行预增菌(6h)，使“致伤”、冷冻的沙门氏菌复苏。②使用选择性培养基RV进行增菌(14h)，使沙门氏菌大量繁殖，同时抑制其它杂菌生长。③使用营养肉汤(蛋白胨水)进行后增菌(4h)，使沙门氏菌的数量大大增加。比上述标准的ELISA法样品制备过程缩短了一半的时间。ELISA方法本身，则仅需要大约2h而已(其中30min是操作时间，90min是孵育时间)。相比之下，黎兆滚等人的方法可在27h内完成，比上述方法缩短了一半的时间，颇值得推广应用。最新式的沙门氏菌免疫学检测法，利用经特异性抗体敏化的免疫色谱卡片为基础。几滴样品加到卡片上，结果可以直接用肉眼读出。免疫色谱卡片极易操作，且由于无需要特殊设备，很适合小型实验室使用。尽管卡片检测法与ELISA法一样需要对样品进行增菌处理，但它(卡片法)本身通常需时不超过10min，如果采用黎兆滚等人的样品制备法，则可使操作时间更为缩短。3 以核酸为基础的方法细胞核酸DNA和RNA是唯一一类可以携带信息的大分子。由于所有的细胞都含有这种分子，可以利用它作为检测的标靶。标靶通常是一个特异性核酸序列，它可通过以补体核酸分子作为探针来检出。与免疫学方法相似，探针也需要加附适当的标记，如放射性同位素、酶或发光的标识物。Fitts等人在食品沙门氏菌检测中引入了第一代DAN—RNA杂交技术，此法应用的探针含有用放射性同位素标记的伤寒沙门氏菌DNA片段，其敏感性高，经大约48h的增菌步骤后，检测极限可达108个细菌/ml，但由于要使用放射性同位素，只能在专门的实验室应用，此方法的优点都被抵消了。为此，以核酸杂交为基础的第二代技术—比色计目前已发展起来。这种方法依赖于沙门氏菌核糖体RNA(rRNA)—核糖体发育过程中储存的核酸成分的检测。核糖体是细胞蛋白质合成器的一部分，每个细菌细胞中存在5000～20 000个复制体，而相比之下染色体DNA复制体仅2～10个。这种天然富含rRNA标靶序列的情况使得用无辐射计检测成为可能，同时又保持了与放射性同位素方法相当或更高的敏感性。其另一优点是由于rRNA为单链(而DNA为双链)，杂交前无需经过变性步骤。要得到阳性结果，此法需要105个靶细胞/ml，因此对沙门氏菌检测来说，需要进行预增菌和选择性增菌，总共约50h。rRNA探针法比沙门氏菌ELISA法更耗时，但二者成本相近。食品细菌检测法的最新进展是在化学扩增体系方面的发展，即聚合酶链反应(PCR)，用该体系可对制备好的样品进行细菌DNA扩增，以便更易于用诸如凝胶电泳法或比色型ELISA法检测。用于检测沙门氏菌和其它以食物为载体的病原的PCR方法业已建立，其中一些方法显示了极好的敏感性。但该法较难自动化，且必需经选择性增菌以稀释可能干扰检测反应的某些成分。一个完整的以PCR为基础的方法，需要2天才能完成，很大程度上抵销了其高敏感性的优点，但这种方法对那些含沙门氏菌较少或沙门氏菌“致伤”严重难以复苏而仍保有沙门氏菌rRNA的样品尤其有效。尽管目前用来检测沙门氏菌的方法各有优缺点，但随着科学发展，技术进步，人们探索、实践的继续深入，我们可以期待，将会有更多，敏感性更高，特异性更强，诊断时间更短的新方法出现。4 两种沙门氏菌快速检测法4.1 Transia沙门氏菌平板检测法 与耗时、昂贵的传统方法相比，此法快1～2天，且每次检测所需的操作时间缩短。该法建立在夹心ELISA法的基础上，利用多抗体混合物以保证检出所有的沙门氏菌血清型。反应的固相载体是一种有可见或不可见条纹的微量反应板。其小孔内包被有沙门氏菌的特异性单克隆抗体。第一阶段，在小孔内加入样品和抗体联合物(沙门氏菌属特异性单克隆和多克隆抗体的混合物)。孵育期间，沙门氏菌抗原和包被抗体形成了一种复合物：包被单克隆抗体-沙门氏菌抗原-抗体联合物。洗涤后，通过每孔加入基质溶液(过氧化脲)和色素原溶液(四甲基氨基丙苯)来显示上述复合物；酶催化色素原的氧化，结果产生蓝色。加入反应终止液终止催化反应，并使反应混合物酸化，颜色由蓝变黄。这种ELISA方法可对经选择性增菌及热休克作用后，释放了特异性沙门氏菌抗原的食品和环境样品进行检测。如采用黎兆滚等人的样品制备法，可大大缩短检测时间；此法可在没有酶标仪的实验室进行，从这点来说，Transia沙门氏菌平板检测法比黎兆滚等人的微量板ELISA法(Salmonella test 1)更适应于一般的实验室使用。4.2 Transia沙门氏菌卡片检测法 此法以单步免疫反应即夹心型免疫色谱反应为基础。反应固相包括一块用“抗沙门氏菌抗体-染料”偶合物浸透的染料衬垫和一张薄膜条，抗沙门氏菌抗体就固定在薄膜的反应区上。增菌后，增菌肉汤用移液管加到样品小孔内并令其吸收，如样品存在沙门氏菌抗原，它们会与偶合物作用，然后依次迁移到膜上，与固定在膜上反应区的抗体结合，在反应窗上呈现一条色带。最后结果可在5～7min内读取。此法也适用于没有酶标仪的实验室。如采用黎兆滚等人的样品制备法，可更加缩短检测时间，可在普通实验室条件下进行。参考文献1.黎兆滚，陈博文,等.用ELISA法快速检测沙门氏菌.中国进出境动植检,1997，(3)：34.2.Frank Axelsson,Marie-laure Sorin.Transia Salmonella technical handbook 1997,16～22.Backa bergogata 5,S-422 46 Hisings Backa,Sweden.3.Kevin Engler.Salmonellosis in laboratry animals.NAL.SRB 89-01,October 1988,1～2.National agricultural Libraty,Beltsville,MD20705.Animal Welfare Information Center (AWIC).(301)344～3212.
浅谈酶联免疫吸附试验实验教学思考的分析论文
【摘要】 酶联免疫吸附试验是广泛应用于临床检验诊断的免疫学检验技术，实验教学中采用该技术检测“乙肝两对半”。为适应中职生教育人才培养模式的教学改革，使学生符合具有“理论知识适度、技术应用能力强”的要求，我们对实验教学内容和方法进行改革，从适用性角度选题，通过实验操作考核，采取以考促学的手段，加强酶联免疫吸附试验的训练力度，提高学生实验操作能力，培养学生独立工作的能力。
【关键词】 酶联免疫吸附试验；免疫学检验；实验；考核
酶联免疫吸附试验(enzyme－linkedimmunosorbentassay，ELISA)是广泛应用于临床检验诊断的免疫学检验技术。该技术集基本理论、基本技能为一体，能使学生能对前期所学的理论知识及技能进一步加强和提高，是一个能为学生进人临床实习打好基础的系统实训。目前该技术的临床检测多采用商品化的ELISA试剂盒，实验步骤较少，操作简单。然而，参与反应的成分很多，如抗原抗体浓度、酶结合物浓度以及试剂的质量控制等等，影响因素众多。传统的实验教学中，实验材料的准备、仪器的准备及调试、标本及试剂的处理等工作基本上是由教师包办。实验的许多环节学生没有亲自做，因而在实验完成后，部分学生对实验还是一知半解，更谈不上能力的锻炼和培养［1］。为适应中职生教育人才培养模式的教学改革，使学生符合具有“理论知识适度、技术应用能力强”的要求，对免疫学检验实验教学内容和方法进行改革势在必行。为此我们通过实验技能操作考核，采取以考促学的手段，加强了酶联免疫吸附试验内容的训练力度，也收到了一定的效果，以下谈谈我们的做法及效果。
1精选考核内容，以适应临床实践的需要
考核内容的选择上以围绕临床实际进行选择，真正使学生做到学以致用。不但要让学生了解、掌握先进的免疫学检验技术和操作方法，还必须着重培养学生的创造性思维和综合分析问题的能力，从而全面提高学生素质［2］。ELISA由于操作简单、灵敏度高、可定性定量，在临床检验诊断中应用最为广泛。常用于如病毒性肝炎、艾滋病、疱疹等传染性疾病的检测诊断，还常用于补体、免疫球蛋白和肿瘤标志物的检测。要想在有限的课时里完成诸多的内容训练，显然是不现实的。因此我们仅选择了最具有代表性的“乙肝两对半”检测作为该技术的训练及考核内容。“乙肝两对半”共有五项检测项目，即HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb，实验中所需要的实验器材均能由检验实验室提供，易于准备，给学生提供了选择和发挥的空间。实验过程中所需要的待测血清标本为阳性或阴性标准物，不具传染性，保证了学生实验的安全性。学生只要掌握了“乙肝两对半”的检验程序和检验方法，其他在临床上需要用ELISA技术检测的常见项目则触类旁通，能起到事半功倍的效果，至于少见的、较为复杂的检测项目可以在日后的实习及工作中继续学习。
2调整考核内容，可行性及针对性强
酶联免疫吸附试验教学内容在学时安排上有6课时，理论与实验课课时之比为1．1。以往的教学形式为先理论授课，教师讲解实验的原理及检验程序，实验教学中教师讲解后进行示范教学，学生照葫芦画瓢的再做实验;实验操作考核只设HBsAg项目的考核，考核项目单一、形式单一。学生只需完成实验操作，报告结果即可。而现行的考核内容是“乙肝两对半”的共五项检测项目，各个项目的检验过程如标本的稀释、试剂选择、加样顺序有所不一。从限制考核时间的角度考虑，学生在考核时随机抽考其中的一个项目，由考生自主选择所需物品进行实验操作，这样增加了考试的随机性和灵活性。虽然抽考使得考核难度增加，但能强化学生对ELISA检测乙肝两对半操作步骤的理解。当学生抽到题目后，在熟悉操作步骤的基础上，只要懂得该项目检测时需注意的细节，如检测HBcAb需将血清稀释50倍，HBeAb的检测需加入中和试剂，学生在对离心机、水浴箱及微量移液器的使用相当熟悉的基础上，不难将标本中的结果如实地检测出来。
3考核的形式
学生重理论、轻实验的现象普遍存在，有的学生每操作一步就看一下笔记，或者是询问其他同学，有的学生甚至希望教师能一步步的教，因而学生对酶联免疫吸附试验缺乏系统的认知。我们将考核的形式设计有理论测试(占30分)和操作考核(占70分)。通过调整考核内容，将能力培养贯穿于整个训练过程，将单纯理论教学融合于实验教学中，能把理论知识激活，也强化了学生的实验操作能力及解决问题、分析问题能力。理论测试采用本教研室的计算机交互平台进行，根据教学内容特点，理论测试我们进行这样的设计，首先收集乙肝两对半检测相关试题，建立题库，内容涉及实验原理、操作、材料、结果观察及临床意义。如(1)乙肝两对半检测涉及ELISA的哪些原理?分别检测什么项目?(2)通过各反应孔显色，判断疫苗接种者、病毒携带者、“大三阳”、“小三阳”;(3)手工洗涤有何要求;(4)加终止液的目的是什么;(5)ELISA常用的酶是哪种?其底物是什么。共组10套试题，学生抽签后通过计算机交互平台指向性地发布试题、进行考试。考虑到学生对理论考试容易产生畏难情绪，在题型的设计上，设有填充题，标示题、连线题及填空题等，内容直观、清晰，学生“寓考于乐”，在轻松愉快的心理环境下地完成理论测试。
4考试评分严谨，设计合理
理论考核从试题集中抽取出6道题组卷，每题5分，共30分。操作考核的评分项目包括:专业素质(衣着仪表、考试态度、纪律)5分;实验准备(实验用品、试剂的预处理、标本处理、标记记录)5分;实验步骤(加样、微量移液器的使用、孵育、洗涤、显色)35分，结果观察10分;操作后清场(试剂、器材归位、实验台面清理)5分，综合评价(规定时间完成、实验后清场、消毒等)10分，共70分。评分标准于考试前告知学生，给学生能充分地复习和准备，注意操作细节，提高考试质量。考试时每个学生独立完成试验，教师全程监考，及时对出错环节扣分，评出总分。
5效果分析
在酶联免疫吸附试验的实验教学中，采用考核方式，取得了以下成效。
5．1利于调动学生的主观能动性，激发起学习的热情
实验操作考核综合反映出学生的实验预习、实验过程和实验态度等各方面的表现。考核成绩占期末总成绩的30%，将学生实验考核计入课程总成绩后，学生上实验课的目的性增强，课上都抢着做实验，从以往实验缺乏主动性，不预习，不复习，变为积极思考，认真准备。实验报告抄袭现象也明显减少，改变了重理论轻实践的现象［3］。从学生提出的'问题，如溶血标本可以检测“乙肝两对半”吗?如果用溶血标本检测，会有什么影响，会影响什么试剂?从这些问题的提出可以看出，学生懂得对实验进行思考，也懂得遇到问题主动和老师商量，学生不断发现问题、思考问题、解决问题的能力得到提高。
5．2独立工作能力的培养
独立工作能力是一个医学检验工作者最基本素质，中职生毕业后就业单位多是基层医院，基层医院的检验科可能只有1至2名检验员，每天的检验工作任务都要独立完成。因而学生在就学期间即应注重独立工作能力培养。在实验考核过程中，实验物品的选择、摆放，实验结束后操作台的清理等，是学生自己准备和独立完成。学生在考核时需考虑到考核时间的限制，因此只有熟悉基本的理论知识、熟练基本操作，才能在规定时间内完成实验，得出正确的结果，考试前不做好准备实验将无法顺利完成。
5．3实验基本技能的训练
由于酶联免疫吸附试验涉及环节多，通过考试能综合考核学生的基本实验技术，如移液管的准确吸样，血清等倍稀释的方法;能考察学生对常用仪器设备如离心机、恒温孵育箱、酶标仪、洗板机的操作;在对血清标本进行检测时，使用过的物品如棉签、试管、注射器的正确处置，能增强学生的无菌操作技术和观念。
5．4学生的评价及反馈
此考核方案在两届学生进行了实施，通过操作考核，学生们得到较为系统的训练，对ELISA检测乙肝两对半的整个流程有了较为深刻的认识。有必要开展，通过考核能更好地将理论与实践相结合，学生能自如地、成功地检测出标准物血清标本的正确结果，同时也很有成就感，增强了对实习及将来的工作的信心。在对2013级的学生进行实习情况跟踪、访谈中得知，学生普遍认为，ELISA技术在临床免疫检验诊断中应用广泛，用此技术检测的项目多，工作量较大。由于在操作考核强化了技能，在实习老师的指导下，能很快地进入角色，增强了工作自信心。对学生进行实验考核的同时，也对教师提出了更高要求。教师准备的理论测试问题在内容上需与临床免疫检验接轨，使考核更科学合理化。规范实验教学，严谨、规范示作好示教。学生操作过程中，巡视督查，及时纠正学生的错误。以考促学法强化酶联免疫吸附试验的实验教学，补充和完善了免疫学检验实验教学的内容和方法，也希望能以此提高学生对其他课程学习的主动性及激发起学习的热情。
血清肿瘤标志物联合检测在肺癌诊断中的问题综论文
【 摘要 】 目的 探讨血清肿瘤标志物癌胚抗原（CEA）、细胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、鳞状细胞癌相关抗原（SCCA）联合检测在肺癌诊断中的临床应用价值。方法 68例肺癌患者为肺癌组， 65例健康体检者为对照组， 采用微粒子化学发光法检测血清中CEA、CYFRA21-1、NSE、SCCA含量， 并比较肿瘤标志物单独或联合检测肺癌的灵敏度、特异度和准确度。结果 肺癌组血清CEA、CYFRA21-1、NSE、SCCA含量均明显高于对照组（P<0.05）， 4种肿瘤标志物联合检测的灵敏度为81%， 准确度为86%， 明显高于单独检测， 差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 血清CEA、CYFRA21-1、NSE、SCCA检测在肺癌诊断中具有临床应用价值， 联合检测可提高诊断的灵敏度和准确度， 且具有较好的特异度， 有助于提高肺癌的检出率。
【关键词】 肺癌；肿瘤标志物；联合检测
目前， 肺癌的发病率和死亡率均位于我国恶性肿瘤之首[1]。肺癌早期发现和治疗具有重要的临床意义。血清肿瘤标志物不仅可用于肿瘤诊断， 并且对肿瘤分期、疗效及预后判断有重要的临床价值[2]， 但单项检测肿瘤标志物具有局限性， 本文通过检测CEA、CYFRA21-1、NSE、SCCA这4种肿瘤标志物在肺癌患者血清中的表达， 探讨肿瘤标志物在肺癌诊断中的应用价值及联合检测的意义。现报告如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 选择2011年7月～2013年12月在本院住院治疗的肺癌患者68例为肺癌组， 男39例， 女29例， 平均年龄（67.2±14.9）岁， 经病理组织学检查确诊为鳞癌的27例， 腺癌24例， 小细胞肺癌17例， 同期健康体检者65例为对照组， 男37例， 女28例， 平均年龄（67.6±15.1）岁。两组一般资料比较， 差异无统计学意义（P>0.05）， 具有可比性。
1. 2 检测方法 采集受检者清晨空腹静脉血4 ml， 及时分离血清， 采用微粒子化学发光法， 用深圳新产业PLUS200仪器及配套试剂检测CEA、CYFRA21-1、NSE、SCCA水平， 严格按仪器标准操作规程及试剂说明书操作， 检测当日室内质控均再控。正常参考区间分别为CEA 0～5 ng/ml， CYFRA21-1 0～7 ng/ml， NSE 0～10 ng/ml， SCCA 0～2.5 ng/L。
1. 3 阳性判定标准 单项检测时以结果大于正常参考区间上限为阳性， 联合检测时4种肿瘤标志物中有一项为阳性即判定为阳性。
1. 4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 组间比较采用t检验；计数资料以百分率（%）表示， 组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。按照标准公式计算肿瘤标志物对肺癌诊断的灵敏度、特异度和准确度。灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）×100% ；特异度=真阴性/（真阴性+假阳性）×100%；准确度=（真阳性+真阴性）/（真阳性+假阳性+真阴性+假阴性）×100%。
2 结果
2. 1 4种血清肿瘤标志物含量比较 肺癌组血清CEA、CYFRA21-1、NSE、SCCA含量均明显高于对照组， 差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2. 2 不同病理组织类型肺癌患者4种血清肿瘤标志物阳性率比较 CEA在肺腺癌中的阳性率高于鳞癌和小细胞肺癌（P<0.05）；cyfra21-1在3种肺癌中的阳性率均较高， p="">0.05）；NSE在小细胞肺癌中的阳性率高于鳞癌和腺癌（P<0.05）；SCCA在鳞癌中的阳性率高于腺癌和小细胞肺癌（P<0.05）。4项联合检测的阳性率均高于单项检测。见表2。
2. 3 4种肿瘤标志物单项和联合检测用于诊断肺癌的灵敏度、特异度和准确度 4种肿瘤标志物单独用于诊断肺癌时， 灵敏度最高的是CYFRA21-1（56%）， 最低的.是CEA （29%）， 4种指标联合检测后灵敏度可达81%， 4种肿瘤标志物联合检测的灵敏度、准确度均明显高于各项单独检测， 差异有统计学意义（P<0.05）。联合检测后特异度略有下降， p="">0.05）。见表3。
3 讨论
肺癌是一种恶性肿瘤。近年来， 虽然临床肿瘤诊断和治疗学有着很大的进展， 但肺癌的死亡率仍然居高不下[3]， 肺癌的诊断除影像学、细胞学和组织病理学以外， 肿瘤标志物的检测也是一种主要方法。肿瘤标志物主要是指在血液、体液及组织中可检测到的与肿瘤相关的物质， 这些物质达到一定的水平时能揭示某些肿瘤的存在， 肿瘤标志物在肿瘤发生明显影像学改变之前就可以通过血清学方法检测出来， 为肿瘤的早期诊断、早期治疗提供了一个新的途径。由于肺癌组织病理的多样性， 同种病理组织细胞的异质性和肿瘤生物学行为的复杂性， 多种肿瘤标志物联合检测不失为一种能有效提高肺癌检出率的手段[4]。
CEA属于非器官特异性肿瘤相关抗原， 也是最早被发现的肿瘤标志物之一， 在肿瘤的发生和转移过程中有十分重要的作用[5]。肿瘤状态时， 癌细胞分泌CEA进入血液和淋巴循环， 因此肿瘤患者血清中CEA含量可见不同程度的升高。本研究表明， 肺癌患者血清CEA水平明显高于健康对照组， 并且在肺腺癌中的阳性率达到75%， 在鳞癌和小细胞肺癌中的阳性率较低， 分别为26%和24%， 因此CEA可作为肺腺癌的辅助性诊断指标之一。
NSE是一种糖酵解酶， 为烯醇化酶的同工酶， 存在于中枢、周围神经组织和神经外胚层起源的恶性肿瘤中， 小细胞肺癌是一种神经内分泌起源的肿瘤， NSE作为小细胞肺癌的血清肿瘤标志物具有较高的敏感度和特异度[6]。本研究结果显示NSE在小细胞肺癌中的阳性率为71%， 在鳞癌和腺癌中的阳性率较低， 分别为22%和25%， 也证明了NSE在鳞癌和腺癌的诊断中意义较低， 可作为小细胞肺癌的辅助性诊断指标之一。
CYFRA21-1是细胞角蛋白19的片段， 为正常及恶性的上皮细胞支架蛋白， 主要分布在单层上皮细胞， 在上皮组织来源的肿瘤组织中的含量明显增高， 是非小细胞肺癌较敏感的肿瘤标志物[7]。本研究观察到CYFRA21-1在肺鳞癌中的阳性率为78%， 其次是肺腺癌， 阳性率为54%， 在小细胞肺癌中的阳性率很低， 与文献报道一致。
SCCA为鳞状细胞癌相关抗原， 是用单克隆技术从肿瘤相关抗原TA4提纯出的一个糖蛋白片段， 本研究观察到SCCA在肺鳞癌中的阳性率为67%， 在腺癌和小细胞癌中的阳性率均较低。
本研究结果显示4种肿瘤标志物在肺癌患者血清中的含量均明显高于健康对照组， 差异具有统计学意义（P<0.05）， 表明这4种肿瘤标志物的检测在肺癌的临床诊断中均有一定的应用价值。但单项检测的阳性率均不高， CEA仅在肺腺癌中阳性率较高， NSE可作为小细胞肺癌的辅助性诊断指标之一， CYFRA21-1在肺鳞癌中的阳性率较高， SCCA是具有较好特异度的鳞癌标志物。而这4种肿瘤标志物联合检测后在各组织类型的肺癌中均具有较高阳性率。研究也表明， 它们作为单一诊断指标应用于临床具有一定的特异性， 但灵敏度和准确度均不理想， 联合检测后提高了灵敏度和准确度， 有利于肺癌的早期诊断和治疗。
参考文献
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肺癌 是致死率较高的癌种，死亡病例一直高居世界癌症死亡榜首。近年来，随着免疫治疗的发展，以免疫疗法为基础的综合治疗大大改善了预后，并已成为治疗转移性非小细胞肺癌的主要方法。 新辅助免疫治疗 包括术前和术后。其主要目的是激活患者的免疫系统，诱导已经浸润到肿瘤内部的免疫细胞发挥抗肿瘤作用，杀灭肿瘤细胞，缩小肿瘤，降低肿瘤分期。 近期，一项 新辅助免疫治疗 研究项目NADIM刊发了其3年随访结果，显示新辅助免疫治疗联合化疗，能够为可切除IIIA期小细胞肺癌患者带来病理缓解和生存获益。 NADIM是一项II期研究，共纳入46例IIIA期可切除的非小细胞肺癌患者。具体的 治疗方案 如下： 01 患者接受三个周期的纳武利尤单抗+紫杉醇+卡铂治疗，每21天为一个周期。 02 在治疗结束后6-7周内进行手术。 03 手术后的第3～8周开始接受为期1年的纳武利尤单抗术后维持治疗。 此研究的主要终点是24个月时的无进展生存期，结果在之前已经发表过：无进展生存率为63.4%，主要病理缓解率为82.9%。这次发表的论文主要涉及次要终点——3年总生存期和生物标记物的分析。 研究人员按照ITT人群和PP人群来评估无进展生存期和总生存期。 ITT人群：包括所有接受新辅助治疗的患者。 PP人群：包括所有接受肿瘤切除并至少接受一周期辅助治疗的患者。 此次研究随访数据表明，治疗完成3年后： 01 ITT组和PP组的存活率分别为81.9%和91.0%。这是IIIA期非小细胞癌患者前所未有的高存活率，其生存时间是以往历史系列报道的三倍。 02 两组患者36个月和42个月的无进展生存率均为69.6%，病情进展的患者的中位进展时间为19.4个月。 03 接受手术的患者的总生存期显著改善（HR：0.14；95%CI）。 04 27例(73.0%)患者在辅助治疗过程中出现1级或2级不良事件，最常见的是疲乏，在10例患者（27.0%）中出现，5例(13.5%)患者出现3级或4级的不良事件。没有注意到长期毒性。 生物标志物方面，研究人员发现： 01 PD-L1在肿瘤细胞中表达的高低与无进展生存期或总生存期的改善无关，无法作为预测预后的指标。 02 肿瘤突变负荷的评估与生存结果无关，无法作为预测预后的指标。 03 循环肿瘤DNA水平不但与肿瘤大小显著相关，而且，比起循环肿瘤DNA水平高的患者，循环肿瘤DN水平低的患者的无进展生存期和总生存期显著改善，提示循环肿瘤DNA可以作为预测预后的生物标志物。 小知识 循环肿瘤DNA是肿瘤细胞在坏死或凋亡过程中产生的，是一种特征性的肿瘤生物标记。 这项3年随访结果表明，新辅助纳武利尤单抗联合化疗，能够为可切除IIIA期非小细胞肺癌患者带来病理缓解和生存获益，而循环肿瘤DNA有望作为长期生存的预测指标。 不过，由于此次II期研究的样本数量较少，接下来还需要更大样本的III期随机对照试验来进一步验证。参考文献： Provencio M, Serna-Blasco R, Nadal E, et al. Overall Survival and Biomarker Analysis of Neoadjuvant Nivolumab Plus Chemotherapy in Operable Stage IIIA Non–Small-Cell Lung Cancer (NADIM phase II trial)[J]. Journal of Clinical Oncology, 2022: JCO. 21.02660.
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浅谈酶联免疫吸附试验实验教学思考的分析论文
【摘要】 酶联免疫吸附试验是广泛应用于临床检验诊断的免疫学检验技术，实验教学中采用该技术检测“乙肝两对半”。为适应中职生教育人才培养模式的教学改革，使学生符合具有“理论知识适度、技术应用能力强”的要求，我们对实验教学内容和方法进行改革，从适用性角度选题，通过实验操作考核，采取以考促学的手段，加强酶联免疫吸附试验的训练力度，提高学生实验操作能力，培养学生独立工作的能力。
【关键词】 酶联免疫吸附试验；免疫学检验；实验；考核
酶联免疫吸附试验(enzyme－linkedimmunosorbentassay，ELISA)是广泛应用于临床检验诊断的免疫学检验技术。该技术集基本理论、基本技能为一体，能使学生能对前期所学的理论知识及技能进一步加强和提高，是一个能为学生进人临床实习打好基础的系统实训。目前该技术的临床检测多采用商品化的ELISA试剂盒，实验步骤较少，操作简单。然而，参与反应的成分很多，如抗原抗体浓度、酶结合物浓度以及试剂的质量控制等等，影响因素众多。传统的实验教学中，实验材料的准备、仪器的准备及调试、标本及试剂的处理等工作基本上是由教师包办。实验的许多环节学生没有亲自做，因而在实验完成后，部分学生对实验还是一知半解，更谈不上能力的锻炼和培养［1］。为适应中职生教育人才培养模式的教学改革，使学生符合具有“理论知识适度、技术应用能力强”的要求，对免疫学检验实验教学内容和方法进行改革势在必行。为此我们通过实验技能操作考核，采取以考促学的手段，加强了酶联免疫吸附试验内容的训练力度，也收到了一定的效果，以下谈谈我们的做法及效果。
1精选考核内容，以适应临床实践的需要
考核内容的选择上以围绕临床实际进行选择，真正使学生做到学以致用。不但要让学生了解、掌握先进的免疫学检验技术和操作方法，还必须着重培养学生的创造性思维和综合分析问题的能力，从而全面提高学生素质［2］。ELISA由于操作简单、灵敏度高、可定性定量，在临床检验诊断中应用最为广泛。常用于如病毒性肝炎、艾滋病、疱疹等传染性疾病的检测诊断，还常用于补体、免疫球蛋白和肿瘤标志物的检测。要想在有限的课时里完成诸多的内容训练，显然是不现实的。因此我们仅选择了最具有代表性的“乙肝两对半”检测作为该技术的训练及考核内容。“乙肝两对半”共有五项检测项目，即HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb，实验中所需要的实验器材均能由检验实验室提供，易于准备，给学生提供了选择和发挥的空间。实验过程中所需要的待测血清标本为阳性或阴性标准物，不具传染性，保证了学生实验的安全性。学生只要掌握了“乙肝两对半”的检验程序和检验方法，其他在临床上需要用ELISA技术检测的常见项目则触类旁通，能起到事半功倍的效果，至于少见的、较为复杂的检测项目可以在日后的实习及工作中继续学习。
2调整考核内容，可行性及针对性强
酶联免疫吸附试验教学内容在学时安排上有6课时，理论与实验课课时之比为1．1。以往的教学形式为先理论授课，教师讲解实验的原理及检验程序，实验教学中教师讲解后进行示范教学，学生照葫芦画瓢的再做实验;实验操作考核只设HBsAg项目的考核，考核项目单一、形式单一。学生只需完成实验操作，报告结果即可。而现行的考核内容是“乙肝两对半”的共五项检测项目，各个项目的检验过程如标本的稀释、试剂选择、加样顺序有所不一。从限制考核时间的角度考虑，学生在考核时随机抽考其中的一个项目，由考生自主选择所需物品进行实验操作，这样增加了考试的随机性和灵活性。虽然抽考使得考核难度增加，但能强化学生对ELISA检测乙肝两对半操作步骤的理解。当学生抽到题目后，在熟悉操作步骤的基础上，只要懂得该项目检测时需注意的细节，如检测HBcAb需将血清稀释50倍，HBeAb的检测需加入中和试剂，学生在对离心机、水浴箱及微量移液器的使用相当熟悉的基础上，不难将标本中的结果如实地检测出来。
3考核的形式
学生重理论、轻实验的现象普遍存在，有的学生每操作一步就看一下笔记，或者是询问其他同学，有的学生甚至希望教师能一步步的教，因而学生对酶联免疫吸附试验缺乏系统的认知。我们将考核的形式设计有理论测试(占30分)和操作考核(占70分)。通过调整考核内容，将能力培养贯穿于整个训练过程，将单纯理论教学融合于实验教学中，能把理论知识激活，也强化了学生的实验操作能力及解决问题、分析问题能力。理论测试采用本教研室的计算机交互平台进行，根据教学内容特点，理论测试我们进行这样的设计，首先收集乙肝两对半检测相关试题，建立题库，内容涉及实验原理、操作、材料、结果观察及临床意义。如(1)乙肝两对半检测涉及ELISA的哪些原理?分别检测什么项目?(2)通过各反应孔显色，判断疫苗接种者、病毒携带者、“大三阳”、“小三阳”;(3)手工洗涤有何要求;(4)加终止液的目的是什么;(5)ELISA常用的酶是哪种?其底物是什么。共组10套试题，学生抽签后通过计算机交互平台指向性地发布试题、进行考试。考虑到学生对理论考试容易产生畏难情绪，在题型的设计上，设有填充题，标示题、连线题及填空题等，内容直观、清晰，学生“寓考于乐”，在轻松愉快的心理环境下地完成理论测试。
4考试评分严谨，设计合理
理论考核从试题集中抽取出6道题组卷，每题5分，共30分。操作考核的评分项目包括:专业素质(衣着仪表、考试态度、纪律)5分;实验准备(实验用品、试剂的预处理、标本处理、标记记录)5分;实验步骤(加样、微量移液器的使用、孵育、洗涤、显色)35分，结果观察10分;操作后清场(试剂、器材归位、实验台面清理)5分，综合评价(规定时间完成、实验后清场、消毒等)10分，共70分。评分标准于考试前告知学生，给学生能充分地复习和准备，注意操作细节，提高考试质量。考试时每个学生独立完成试验，教师全程监考，及时对出错环节扣分，评出总分。
5效果分析
在酶联免疫吸附试验的实验教学中，采用考核方式，取得了以下成效。
5．1利于调动学生的主观能动性，激发起学习的热情
实验操作考核综合反映出学生的实验预习、实验过程和实验态度等各方面的表现。考核成绩占期末总成绩的30%，将学生实验考核计入课程总成绩后，学生上实验课的目的性增强，课上都抢着做实验，从以往实验缺乏主动性，不预习，不复习，变为积极思考，认真准备。实验报告抄袭现象也明显减少，改变了重理论轻实践的现象［3］。从学生提出的'问题，如溶血标本可以检测“乙肝两对半”吗?如果用溶血标本检测，会有什么影响，会影响什么试剂?从这些问题的提出可以看出，学生懂得对实验进行思考，也懂得遇到问题主动和老师商量，学生不断发现问题、思考问题、解决问题的能力得到提高。
5．2独立工作能力的培养
独立工作能力是一个医学检验工作者最基本素质，中职生毕业后就业单位多是基层医院，基层医院的检验科可能只有1至2名检验员，每天的检验工作任务都要独立完成。因而学生在就学期间即应注重独立工作能力培养。在实验考核过程中，实验物品的选择、摆放，实验结束后操作台的清理等，是学生自己准备和独立完成。学生在考核时需考虑到考核时间的限制，因此只有熟悉基本的理论知识、熟练基本操作，才能在规定时间内完成实验，得出正确的结果，考试前不做好准备实验将无法顺利完成。
5．3实验基本技能的训练
由于酶联免疫吸附试验涉及环节多，通过考试能综合考核学生的基本实验技术，如移液管的准确吸样，血清等倍稀释的方法;能考察学生对常用仪器设备如离心机、恒温孵育箱、酶标仪、洗板机的操作;在对血清标本进行检测时，使用过的物品如棉签、试管、注射器的正确处置，能增强学生的无菌操作技术和观念。
5．4学生的评价及反馈
此考核方案在两届学生进行了实施，通过操作考核，学生们得到较为系统的训练，对ELISA检测乙肝两对半的整个流程有了较为深刻的认识。有必要开展，通过考核能更好地将理论与实践相结合，学生能自如地、成功地检测出标准物血清标本的正确结果，同时也很有成就感，增强了对实习及将来的工作的信心。在对2013级的学生进行实习情况跟踪、访谈中得知，学生普遍认为，ELISA技术在临床免疫检验诊断中应用广泛，用此技术检测的项目多，工作量较大。由于在操作考核强化了技能，在实习老师的指导下，能很快地进入角色，增强了工作自信心。对学生进行实验考核的同时，也对教师提出了更高要求。教师准备的理论测试问题在内容上需与临床免疫检验接轨，使考核更科学合理化。规范实验教学，严谨、规范示作好示教。学生操作过程中，巡视督查，及时纠正学生的错误。以考促学法强化酶联免疫吸附试验的实验教学，补充和完善了免疫学检验实验教学的内容和方法，也希望能以此提高学生对其他课程学习的主动性及激发起学习的热情。
一、基因疫苗的诞生自1796年英国医生琴娜(Jener)首次采用牛痘苗以来,疫苗已在世界范围内被广泛应用,200多年来各种疫苗已经帮助人类战胜了包括天花在内的多种传染病.然而,现有的疫苗主要有两种：第一种疫苗是传统疫苗，即弱毒活苗和灭活苗，如鸡新城疫弱毒苗，猪瘟灭活苗，它是直接将无毒或减毒的病原体作为疫苗接种到人或动物体内，刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答，从而预防疾病的发生；第二种疫苗是基因工程苗，它是通过基因工程，先分离得到具有强烈免疫原性但无毒性的抗原蛋白的编码基因，然后导入表达载体中，再在宿主细胞表达出重组抗原蛋白，经分离纯化后的重组抗原蛋白作为疫苗接种如重组乙肝疫苗。但它存在一些不可忽视的缺陷如:灭活疫苗难以诱发细胞免疫,需多次免疫注射;亚单位疫苗免疫原性差;减毒活疫茵存在毒性回升的危险等问题.因此,现在对一些传染病仍缺乏相应的安全有效的疫苗. 第三代疫苗基因疫苗的问世,为解决这些难题带来了希望.基因疫苗（genetic vaccine）又称核酸疫苗(nucleic acid vaccine)或DNA疫苗，是在基因治疗（genetic therapy）技术的基础上发展而来的。基因治疗是从20世纪80年代发展起来用于预防和治疗疾病的最具革命性的生物医学医疗技术，其原理是将人或动物的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的。1990年Wolff JA等在进行基因治疗试验时，以裸DNA注射作对照，结果意外发现裸DNA可被骨骼肌细胞吸收并表达出外源性蛋白。1992年Tang 、 DC等首次证明经基因免疫产生的外源性蛋白质——人生长激素可刺激小鼠免疫系统产生特异性抗体，而且加强免疫后抗体效价增加，从而宣告基因疫苗的诞生。（注：1）概括起来，基因疫苗就是指将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的载体上，然后直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，该抗原蛋白可直接诱导机体产生免疫应答。抗原基因在一定时限内的持续表达，不断刺激机体免疫系统产生应答反应，从而达到预防疾病的目的。二、核酸免疫的作用机理目前对核酸免疫作用机理的认识主要还仅限于理论推测，且多数资料来自基因治疗试验，二者在作用机理上很相似。在基因免疫中，含病原体抗原基因的核酸疫苗被导入宿主细胞，被周围的组织细胞、APC细胞或其它炎性细胞摄取，并在细胞内表达。表达产物作为抗原可能的呈递途径是：肌细胞直接摄入或经T小管和细胞样内陷摄取进入，在外源基因启动子作用下使外源基因表达，使产物在胞内水解酶的作用下分解成长短不一的多肽，其中的一部分被hsp70运到内质网，经网膜上的TAP分子转入膜内与主要组织相容性复合物（MHC）I类结合，最终在细胞膜表面被CDS十细胞识别；另一部分短肽进入溶酶体，与（MHC）Ⅱ分子结合，运到细胞表面被 CD4＋细胞识别。这些多肽含有不同的抗原表位，它们将诱导细胞毒性T淋巴前体、B细胞和特异性辅助T细胞，产生细胞免疫和体液免疫。同时，基因表达可以通过细胞分泌和分裂的方式进入组织细胞间隙，以天然折叠方式被B淋巴细胞识别。核酸免疫后，还可以使肌细胞和抗原递呈细胞被感染，从而使CD4＋和CD8＋细胞亚群活化，产生特异的免疫应答。 CorrM等（1996）的研究表明，从转染DNA得肌肉组织释放出的抗原被APC摄入，运送到管状淋巴结中，在B淋巴细胞和T淋巴细胞表达， I类MHC限制的CTL应答可能主要以这种方式产生。以前曾认为该过程需要内源抗原的表达，但现在的研究表明，只要有外源抗原的存在，也能有效地引起I类MHC限制的CTL应答。 三、基因疫苗质粒载体的构建获得准确的抗原编码基因并将它插入到合适的载体DNA上，是发展基因疫苗的主要工作。1、编码抗原蛋白基因的分离制备DNA疫苗首先要获得编码抗原的基因，一般选择编码病原体表面糖蛋白的基因。抗原蛋白产生后可在宿主体内正确糖基化，从而诱导对病原体的免疫应答反应；对于易变异的病原体，最好选择各种变型都具有的核心蛋白保守的DNA序列，这样可对各种变异的病原体产生免疫应答反应，避免因病原体变异产生的免疫逃避问题。2 目的基因质粒的载体构建基因疫苗大多采用质粒作载体。一般说来，基因疫苗质粒载体至少包括5个主要的部件：（1）细菌复制子，以便质粒DNA在细菌体内复制扩增，得到大量的拷贝，但不能在宿主细胞（真核细胞）中复制；（2）原核生物选择性标记基因，如抗生素抗性基因，以筛选含有质粒DNA的阳性细菌克隆（菌株）；（3）真核生物的启动子、增强子、终止子、内含子等转录调控元件；（4）编码抗原蛋白的目的基因序列；（5）多聚核苷酸信号序列，以保证mRNA翻译时适时终止。另外，基因疫苗质粒载体通常含有一段未甲基化的CpG序列，其具有刺激Th1细胞的免疫活性。四、严重创伤后全身性炎症反应综合征及免疫调节治疗严重创伤后机体免疫功能表现为双向性改变。一方面表现为以吞噬功能和白细胞介素-2（IL- 2）等产生降低为代表的免疫受抑状态；另一方面表现出以全身性炎症反应综合征为特征的过 度炎症反应。正是这二方面共同作用构成了创伤后机体免疫功能紊乱，诱发多器官功能不全综合症（Multiple Organ Dysfunction Syndrome,MODS）。下面就全身性炎症反应综合征和免疫调节治疗作一综述。