莲属隶属于被子植物门双子叶植物纲睡莲科Nymphaeaceae的莲亚科Sufam.Nelumboideae。该属植物有2种，分别为美洲黄莲NelumbopentapetalaFernald.,北部为中心分布在北美；中国莲 N.nucferaGaertn.,以中国为中心分布在亚洲、大洋洲。我国仅有中国莲一种，为多年生水生草本植物，在湖南、湖北、浙江、江苏等地有广泛种植。
传统医学中荷叶、荷花、藕和莲子都多有应用，在治疗咽病、胸痛、遗精、白癒风、天花、痢疾、咳嗽、呕血、略血、血尿、子宫出血、高脂血症、发热、霍乱、肝病、剧渴等病症上均有疗效。同时,莲生物体的不同部位,如荷叶、莲藕、莲子等,又具有很高的食用价值。从莲的各个部位分离出的单体成分主要包括生物碱类、黄酮类、三萜类、类固醇、多酚类等E-]。
荷叶是莲的干燥叶,具有清暑化湿，升发清阳，凉血止血等功效，荷叶中含丰富的生物碱类化合物，目前对荷叶的应用多集中于减肥功效的开发。为了更好的利用和开发该植物,选取荷叶为研究对象，对其所含的化学成分进行分离及活性筛选。从荷叶中共分离得到化合物27个，包括15个黄酮,2个生物碱，2个甾体,2个甾体苷,3个脂肪醇,1个苯酚和2个megastigmaneglucosides类化合物。其中，6个为首次从该植物中分离得到,4个为首次从荷叶中分离得到。
1材料
Bruker-AV^600型核磁共振仪，内标为TMS;JMS-T100CSmass型质谱仪，电离电压为70eV;RE-52型旋转蒸发仪（河南巩义市英峪仪器厂）；Taike-X6显微熔点测定仪（温度计未校正）；循环水真空泵DLSB40L(巩义市英峪仪器厂）；KQ-300超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；柱色谱硅胶（160~200，200~300目，青岛海洋化工厂）；D101大孔树脂SephadexLH-20(GE);GF254色谱硅胶板（Merck);所有化学试剂均为分析纯。
实验材料于2009年10月购于北京市卫仁饮片厂，经中国中医科学院中药研究所王智民研究员鉴定为莲N.nuce/era的干燥叶。
2提取与分离
荷叶干燥样品20kg经粉碎后,70%乙醇12倍体积中试化回流提取2次，每次2h,合并提取液，减压浓缩后得浓缩液30L。将浓缩液用乙酸乙酯萃取3次，正丁醇萃取2次，浓缩后得乙酸乙酯部分495g(A部分），正丁醇部分700g(B部分）。乙酸乙酯部分495g(A部分）硅胶柱色谱粗分，石油醚-丙酮梯度洗脱（1:0~10:1~3:1~0:1)得到4部分Ai~A4，其中A2部分硅胶柱色谱分离以石油醚-丙酮（1:0~30:1)梯度洗脱得到化合物1(28mg),2(230mg),3(20mg),4(22mg),23(28mg),24(48mg),A3部分硅胶柱色谱分离以石油醚-丙酮（10:1~0:1)梯度洗脱得FrA3_^PFrA3_2，其中卩^4硅胶柱色谱分离以石油醚-丙酮（5:1)洗脱，得到21(56mg),22(17mg),FrA3_2硅胶柱色谱以石油醚-丙酮（3:1)洗脱，得到5(25mg),A4部分硅胶柱色谱分离以石油醚-丙酮（3:1~25:1)梯度洗脱，得到6(29mg),7(16mg),25(20mg)。
正丁醇部分700g(B部分）经过D101大孔树脂粗分，分别用水,30%,50%乙醇梯度洗脱，得到3部分B1~B3,其中B1部分再硅胶柱色谱分离分别以氯仿-甲醇-水（40:8:1)洗脱，得到化合物14(10mg),15(10mg);以氯仿~甲醇-水（30:8:1)洗脱得到化合物10(150mg),之后，此部分收集到的第13份（Fr.13),经过SephadexLH-20(甲醇洗脱）得到化合物8(12mg),第14份（Fr.14),经过Sephadex[只-20(甲醇洗脱）得到化合物9(14以8);最后，以氯仿-甲醇-水（20:8:1)洗脱，得到的第15份(Fr.15)经过SephadexLH-20(甲醇洗脱）得到化合物11(15mg),12(8mg),第16份（Fr.16),经过SephadexLH-20(甲醇洗脱)得到化合物13(6mg)。B2部分硅胶柱色谱分离以氯仿-甲醇-水（40:8:1~0:0:1)洗脱得到化合物27(15mg)。B3部分以氯仿-甲醇-水(240:20:1)洗脱得到化合物16(28mg),20(85mg),洗脱收集到的第31份（Fr.31)再经过SephadexLH-20(甲醇洗脱）得到化合物17(14mg)。第34份经过SephadexLH-20(甲醇洗脱）得到化合物18(11mg),第35份以氯仿-甲醇-水(120:20:1)洗脱得到化合物19(120mg),26(13mg)。
3结构鉴定
化合物1白色粉末，易溶于氯仿，难溶于甲醇，mp85~90°C。EI-MSm/z297,157,139,125,111,97,83,69,57〇1H-NMR(CDCl3,600MHz)S：3.59(1H,m,H40),1.44~1.26(52H,brs,H-2~9,11~27),0.88(3H,t,J=7.2Hz,H4),0.88(3H,t,J=7.2Hz,H-28)。通过分析质谱裂解规律及比对文献8]的报道,鉴定化合物为10-二十八院醇（10->ctacosanol)。
化合物6黄色针晶（氯仿），mp158~160C。1H-NMR(CDCl3,600MHz)S：13.55(1H,s,-OH),7.87(1H,d,J=15.0Hz,H-3),7.83(1H,d,J=
8.4Hz,H-6'),7.63(2H,d,J=8.4Hz,H-2,6),7.46(1H,d,=15.0Hz,H-a),6.95(2H,d,J=8.4Hz,H-3,5),6.50(1H,d,J=8.4Hz,H-5'),6.48(1H,s,H-3'),3.87(6H,s,-OCH3)；13C-NMR(DMSO-d6,150MHz)S:191.9(C=O),166.6(C-6'),166.0(C-4'),161.8(C-4),144.3(C-8),131.3(C-l),130.4(C-2),130.4(C-6),127.5(C-a),117.8(C4'),114.5(C-3),107.6(C-5),101.0(C-3'),101.0(C-2'),55.6(4-OCH3),55.4(4'-OCH3)。以上数据与文献9]报道基本一致，鉴定为6'~hy-droxy-4,4'-dimethoxychalcone。
化合物7棕黄色针晶（氯仿），mp150C。
ESI-MSm/z289[M+H]+,274[M+H-CH3]+。1H-NMR(CDCl3,600MHz)S：13.26(1H,s,-OH),7.33(1H,d,J=9.0Hz,H-6),7.16(1H,d,J=9.0Hz,H-5),6.33(1H,d,J=3Hz,H-4),6.30(1H,d,J=3.0Hz,H-2),4.0(3H,s,8~OCH3),3.93(3H,s7-OCH3),3.87(3H,s,3-OCHj)；13C-NMR(DMSO-d6,150MHz)S:163.8(C4),96.8(C-2),166.4(C-3),157.1(C-4),112.8(C-5),120.4(C-6),148.8(C-7),151.0(C-8),157.1(C-4a),149.2(C-4b),115.7(C-8a),104.0(C-8b),181.2(C=O),57.1(3~OCH3),55.8(7-OCH3),61.8(8~OCH3)。以上数据与文献10]报道基本一致,鉴定为1-羟基-3,7,8-二甲氧基Bill酉同（3,7,8~trimetlioxy-l~hyckoxy^can-thone)。
化合物8黄色粉末，易溶于甲醇，不易溶于氯仿，mp236~238C。ESI-MSm/z479[M+H]+。1H-NMR(DMSO-i6,600MHz)S：6.33(1H,d,J=
1.8Hz,H-6),7.74(1H,d,J=1.8Hz,H-8),7.61(1H,dd,J=1.8,8.0Hz,H-2'),6.87(1H,d,J=8.4Hz,H-3'),6.58(1H,d,/=1.8Hz,H-6'),5.29
(1H,d,J=10.8Hz,H4"),3.34(1H,m,H~2"),3.48(1H,m,H-3"),3.42(1H,m,H-T),3.22(1H,m,H-5"),3.71(1H,m,H-6"),3.57(1H,m,H-6"),3.86(3H,s,7-OCH3)；13C-NMR(DMSO-i6,150MHz)5:156.6(C-2),133.7(C-3),177.6(C-〇,160.9(C-5),97.8(C-6),165.1(C-7),92.1(C-8),156.2(C-)),104.9(C40),121.0(C4'),115.1(C-2'),144.8(C-3'),148.6(C-4'),116.1(C-5'),122.0(C-3'),101.3(C4"),74.5(C-2"),76.9(C-3"),70.5(C-4"),78.0(C-5"),61.5(C-3")。以上数据与文献11]报道基本一致，鉴定为鼠李素-3-9-3-D-B比喃葡萄糖苷（rhamnetin-5-9-3~D~glucopyrano-side)。
化合物15黄色粉末，易溶于甲醇，不易溶于氯仿，mp170~173°C。ESI-MSm/z779[M+Na]+。酸水解化合物15,薄层色谱检验水解产物，检出葡萄糖，鼠李糖和来苏糖。1H-NMR(DMSO-^,600MHz)5：7.79(1H,d,J=2.2Hz,H-2'),7.52(1H,dd,=2.2,8.6Hz,H-3'),6.89(1H,d,=8.6Hz,H-5'),6.22(1H,d,J=2.2Hz,H-8),6.01(1H,d,=2.2Hz,H-3),5.50(1H,d,=7.5Hz,H4"),3.46(1H,m,H-2"),3.46(1H,m,H-3"),3.60(1H,t,=5.9Hz,H-T),3.27(1H,d,J=5.9Hz,H-5"),3.70(2H,m,H-3"),4.83(1H,d,=4.3Hz,H-T),3.23(1H,d,=5.9Hz,H-2"),3.46(1H,m,H-3m),3.66(1H,d,=8.9Hz,H-T),3.74(1H,d,=11.3Hz,H-5),3.22(1H,dd,J=5.9,11.2Hz,H-5),4.35(1H,s,H4""),3.40(1H,d,J=2.0Hz,H-2""),3.06(1H,t,J=9.1Hz,H-3""),3.46(1H,m,H-T〇,3.23(1H,d,J=5.9Hz,H-5〃"），0.97(1H,d,J=6.5Hz,H-6ffff),3.85(3H,s,-OCH3)；13C-NMR(DMSO-d6,150MHz)5：155.5(C-2),132.4(C-3),176.3(C-0,161.0(C-5),99.8(C-3),164.8(C-7),94.3(C-8),156.8(C-9),102.3(C-10),121.0(C4'),113.1(C-2'),146.9(C-3'),149.6(C-4'),115.3(C-5'),122.3(C-3'),99.0(C-r),78.9(C-T),76.9(C-3"),70.1(C-T),75.7(C-5"),66.9(C-3"),101.9(C-T),70.4(C-2m),71.9(C-3m),65.4(C-T),62.1(C-5),100.9(C-T"),70.3(C-2""),70.5(C-3""),71.7(C-T"),68.3(C-5""),17.7(C-3""),55.6(-OCH3)。以上数据与文献12]报道基本_致，鉴定该化合物为异鼠李素-3-9-al-鼠李糖-(H)-a-3-来苏糖-(1-2)-3-)-葡萄糖苷](isorhamnetin-3-O-a-L-'hamnopyranosyl-C1->?6)-[a-D-lyxopyranosyl-(1--2)-3-D-glucopyrano-side])。
化合物16黄色粉末，易溶于甲醇，不易溶于氯仿，mp170~173C。ESI-MSm/z633[M+Na]+。酸水解化合物16,薄层色谱检验水解产物，检出葡萄糖和来苏糖。1H-NMR(DMSO-i6,600MHz)5:7.93(1H,d,J=1.8Hz,H-2'),7.58(1H,dd,=1.8,8.6Hz,H-3'),6.93(1H,d,J=8.6Hz,H-5'),6.45(1H,d,J=1.8Hz,H-8),6.20(1H,d,J=1.8Hz,H-3),5.68(1H,d,J=7.3Hz,H4"),3.48(1H,t,=5.1Hz,H-2"),3.48(1H,t,J=5.1Hz,H-3"),3.13(1H,m,H-4"),3.13(1H,m,H-5"),3.57(1H,m,H-6"),3.33(1H,m,H-6"),4.79(1H,d,=4.8Hz,H-T),3.55(1H,m,H-2"),3.41(1H,m,H-3),3.63(1H,m,H-T),3.68(1H,dd,J=6.2,11.3Hz,H-5m),3.21(1H,dd,J=2.7,11.3Hz,H-5),3.85(3H,s,-OCH3);13C-NMR(DMSO-i6,150MHz)5：155.9(C-2),132.8(C-3),177.1(C-4),161.2(C-5),98.8(C-5),164.6(C-7),93.7(C-8),156.3(C-)),103.8(C40),121.0(C4'),113.3(C-2'),146.9(C-3'),149.5(C-4'),115.3(C-5'),122.3(C-3'),98.6(C-T),79.6(C-2"),77.1(C-3"),69.7(C-4"),77.4(C-5"),60.5(C-3"),102.3(C-T),70.6(C-2m),72.0(C-3m),65.8(C-T),62.7(C-5m),55.6(-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致，故鉴定该化合物为异鼠李素-3-9-a-)-来苏糖-(1-2)-3-D-葡萄糖苷[isorhamnetin-5-9-a-D-lyxopyrano-syl-(1--2)-3-D-glucopyranoside]。
化合物17黄色粉末，易溶于甲醇，不易溶于氯仿，mp167~170C。ESI-MSm/z477[M-H]_。酸水解化合物17,薄层色谱检验水解产物，检出葡萄糖。^-NMRCDMSO-^,600MHz)5:7.94(1H,d,=1.8Hz,H-2'),7.50(1H,dd,=8.4,1.8Hz,H-6'),6.92(1H,d,/=8.4Hz,H-5'),6.46(1H,d,/=1.8Hz,H-8),6.21(1H,d,J=1.8Hz,H-6),5.57(1H,d,J=8.8Hz,H4"),3.83(3H,s,-OCH3)；13C-NMR(DMSO-d6,150MHz)5：156.3(C-2),133.5(C-3),177.5(C-〇,161.3(C-5),98.8(C-6),164.3(C-7),93.8(C-8),156.4(C-9),104.1(C-10),121.2(C4'),115.3(C-2'),149.5(C-3'),146.9(d),114.6(C-5'),122.1(d),100.9(C-r),74.4(C~2"),76.4(C-3"),69.8(C-T),77.5(C-5"),60.6(CV),55.8(-XH3)。以上数据与文献13]报道基本_致,故鉴定该化合物为异鼠李素-3-O-3~D-甸萄糖音（isorhamnetinJ-O-J^D-^lucopyrano-side)。
化合物18黄色粉末，易溶于甲醇，不易溶于
氯仿，mp178~180°C。ESI-MSm/z617[M+Na]+,593M-H]-。酸水解化合物18,薄层色谱检验水解产物，检出葡萄糖和鼠李糖。1H-NMR(DMSO-i6,600MHz)5:7.85(1H,d,J=2.0Hz,H-2'),7.50(1H,dd,,=8.0,2.0Hz,H-6'),6.92(1H,d,/=8.0Hz,H-5'),6.46(1H,d,/=2.0Hz,H-8),6.20(1H,d,J=2.0Hz,H-6),5.54(1H,d,J=8.8Hz,H4"),4.42(1H,d,J=2.0Hz,H4m),3.85(3H,s,3'-OCH3),0.96(3H,d,J=6.5Hz,H-3m);13C-NMR(DMSO-d6,150MHz)5：156.4(C-2),133.0(C-3),177.3(C-0,161.2(C-5),98.8(C-3),164.2(C-7),93.8(C-8),156.5(C-9),104.2(C-10),121.2(C4'),115.3(C-2'),149.2(C-3'),146.7(C-4'),115.4(C-5'),122.0(C-5'),101.2(C-r),74.5(C-T),74.6(C-3"),72.0(C-T),76.0(C-5"),67.0(C-3"),100.9(C-T),70.1(C-2m),70.7(C-3m),72.0(C-T),68.5(C-5m),17.9(C-3m),55.7(-3CH3)。经查阅文献，以上数据与文献[14]报道基本_致,故鉴定该化合物为异鼠李素-3-O-a-L-鼠李糖-(1->6)-3~D-葡萄糖苷（isorhamnetin-3-O-a-L-hamnopyranosyl-(1->6)-3-D-glucopyranoside)。
化合物24白色针状晶体（甲醇），mp157~159C。EI-MSm/z414,399,396,381,329,303,273,271,255,246,231,213。H-NMR(CDCl3,600MHz)5:5.32(1H,m,H-7),3.54(1H,m,H-3),0.92(3H,d,,=6.6Hz,H-21),0.85(3H,t,J=7.4Hz,H-29),0.83(3H,d,,=7.5Hz,H-26),0.81(3H,d,J=7.5Hz,H-27),0.80(1H,s,H49),0.53(1H,s,H48);13C-NMR(CDCl3,150MHz)5:37.2(C4),31.3(C-2),73.7(C-3),40.5(C-4),46.1(C-5),26.8(C-6),120.1(C-7),139.4(C-8),49.9(C-9),34.8(C40),21.6(C41),39.7(C42),43.1(C-13),56.0(C44),23.2(C45),28.2(C46),56.5(C47),12.1(C48),13.0(C49),36.8(C-20),19.1(C-21),34.1(C-22),26.4(C-23),46.0(C-?706?24),29.5(C-25),20.1(C-26),19.2(C-27),23.3(C-28),12.2(C-29)。以上数据与文献15]对照一致，鉴定该化合物为stigmast-7-sn-3S-jl。
化合物25白色针状结晶（氯仿），mp104~105C。EI-MSm/z10(M+')MHz)5:6.76(2H,m,H-3,6),6.67(2H,m,H-4,5);13C-NMR(CDCl3,150MHz)5:146.8(C4,2),121.5(C-3,6),117.1(C-4,5)。以上数据与文献[16]对照一致，故鉴定该化合物为邻二羟基苯（benzene4,2-diol)。
化合物2,与J-谷甾醇对照品共薄层Rf相同，故鉴定为J-谷甾醇(J-sitosterol);化合物3,数据与文献16]对照一致，鉴定为1-十一烷醇（1-rnde-canol);化合物4,数据与文献[17]对照一致，鉴定为1-二十烷醇（14cosanol);化合物5,与胡萝卜苷对照品薄层色谱Rf及显色情况一致,故鉴定为胡萝卜苷（daucosterol);化合物9,数据与文献[18]对照-致，鉴定为chrysoeriol-7~O-3~D~glucoside;化合物10,数据与文献19]对照1致,鉴定为槲皮素-3-O-J-D-A比喃葡萄糖苷（quercetin-3-O-3~D~glucopyrano-side);化合物11,数据与文献20]对照一致，鉴定为槲皮素-3-^U比喃鼠李糖苷（quercetin-3-O~a-L-hamnopyranosyl);化合物12,数据与文献21]对照一致，鉴定为金丝桃苷（hyperoside);化合物13,数据与文献22]对照一致,鉴定为槲皮素-34■芸香糖苷（quercetin-3-O-utinoside);化合物14,数据与文献23]对照一致，鉴定为紫云英苷（astragalin);化合物19,数据与文献22]对照一致，鉴定为槲皮素（quercetin);化合物20,数据与文献20]对照一致,鉴定为山柰酚（kaempferol);化合物21,数据与文献24]对照一致，鉴定为去氢荷叶碱（dehydro-nuciferine);化合物22,数据与文献24]对照一致，鉴定为莲碱（roemerine文献对照一致，鉴定为stigmast-Z-sn^-O-J-D-gluco-pyranoside;化合物26,数据与文献26]对照一致，鉴定为alangionosideL;化合物27,数据与文献27]对照一致,鉴定为icarisideB2。
4药理活性
4.1体外淀粉样蛋白（J-imyloid,AS)抑制活性筛选各单体化合物均配置质量浓度为74.0g?L-1,溶剂为二甲基亚砜（DMSO)。0.1mgamyloid(1-42)溶于80^LDMSO,用720^LPBS稀释至待测浓度，并取25^mol?L-1待测；样品贮存液（25g?L-1,溶于DMSO)为待测溶液；Curcumint贮存液（10g?L-1,溶于DMSO)以DMSO稀释至样品测定质量浓度(0.1g?L-1)作为阳性对照；ThT贮存液（2mmol?L_1,溶于0.1mol?L_1Gly/NaOH缓冲液）以0.1mo卜L_1Gly/NaOH缓冲液稀释至5pmol?L_1测定浓度。
将25pmol?L_1制备好的amyloid溶液与2^L样品待测溶液加入0.2mL试管中，轻摇混匀，室温避光静置反应，且尽量避免溶剂挥发。10反应液分别于48,72h加入200^L浓度为5pmol?L_1的ThT溶液，并将该反应液置于96孔板上。用荧光分光光度计测定荧光吸光度,反映酶的活性。激发波长450nm,发射波长482nm。每样品设3平行管。样品的betaamyloid(142)抑制活性=[1-(A-ThT)/(B-ThT)]x100%,式中A为加入样品的酶活性值;B为没有加入样品的酶活性值。
分别考察化合物1~27对AS的抑制活性，结果显示，在试样浓度均为2.27mg?L-1时，化合物6,8,10,11,13,15作用呈现阳性，抑制率均大于50%,分别为（63.99±24.29)%,(79.61士4.49)%,(49.96±12.61)%,(101.19±8.19)%,(88.41±6.76)%,(72.48±8.97)%。在这6个化合物中，有5个为黄酮类化合物，其中鼠李素-3-9-3-D-1比喃葡萄糖苷的抑制作用最强，超过了阳性对照Curcumint的（73.94±14.33)%。不同浓度下化合物活性的测定有待进一步进行活性复筛。
4.2体外其他活性筛选考察了化合物1~27对体外脂肪酶抑制活性、体外乙酰胆碱酯酶抑制活性和体外人胰岛淀粉样多肽抑制活性，以抑制率（％)表示抑制活性。结果显示，体外脂肪酶抑制活性试样在质量浓度为8.75
抑制活性试样在浓度为74mg?L-1,体外人胰岛淀粉样多肽的抑制活性在浓度为2.27mg?L-1时，各试样的抑制率均<50%,因此认为无明显抑制作用。
5讨论
通过对化合物的分离鉴定发现，正丁醇萃取层中主要以黄酮类化合物为主要成分，且含量较大。以往对荷叶的开发利用，主要利用了其生物碱类成分的活性，开发的新药及保健类食品也主要侧重于减肥降脂方面的功效。而其所含有的大量黄酮类化合物成分的活性则开发的不够，如抗氧化，抑菌等活性。淀粉样蛋白(S-amyloid,AS)来源于一种称为淀粉样蛋白前体(S-amyloidprecursorprotein,APP)的跨膜糖蛋白，目前有研究观点倾向AS沉积是ad发生的主要原因128,本实验发现的对betaamyloid(1-42)具抑制活性的黄酮类化合物，为天然抑制剂的研究提供了线索，也为荷叶新药用功效的研究提供了理论依据。因此以成分分离为基础，并进一步明确荷叶中所含黄酮类成分的药理作用，可以为进-步开发利用荷叶奠定基础。
