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Coriolus versicolor固体发酵产漆酶的研究

2015-06-18 10:54 来源:学术参考网 作者:未知

  摘 要:研究云芝固体发酵产漆酶的营养条件和培养条件,得出较好的培养基组成:固体发酵基料选择麸皮与花生壳,其合适的比例为1:1,液体营养盐中葡萄糖浓度为0.5%,培养基含水率为70%,初始pH为2.0,接种量为20%、培养温度为30℃。通过对产酶条件的优化,优化后的漆酶的最高酶活力是优化前的4.1倍,杂色云芝在该条件下产漆酶,达到最高酶活需要10天,并且最高酶活可以维持3~4天。

  关键词:杂色云芝;固体发酵;漆酶;发酵基料

  漆酶最早是在漆树的汁液中发现的,故将其命名为漆酶。漆酶广泛存在大量植物、真菌中。分泌漆酶的真菌主要集中于担子菌亚门(Basidiomycotina )、子囊菌亚门(Ascomycotina)及半知菌亚门(Deuteromycotina)等高等真菌,其中最主要的是担子菌亚门的白腐真菌。漆酶在食品工业、造纸工业、环境保护等领域中具有广泛应用,Pertersen利用漆酶中铜离子的催化特性,除去色拉、蛋黄酱等食品中溶解的氧,消除了食品中的亚麻酸和溶解氧反应生成的挥发性异味组分。Jujiop通过研究发现,用漆酶对木材中的木质素进行处理,可以节省30%的动力。

  本实验选用杂色云芝为菌种,着重研究杂色云芝固体发酵产漆酶的营养条件和培养条件,从而提高漆酶的活力,使漆酶能得到高效的应用。

  1材料与方法

  1.1菌种

  杂色云芝菌(Coriolus versicolor),南京林业大学微生物技术实验室保藏。菌丝体于4℃保存在PDA斜面培养基上。

  1.2基本培养基

  (1)固体斜面培养基(g/L):马铃薯200;葡萄糖20;琼脂20。

  (2)固体发酵培养基(/瓶):麸皮5g;花生壳5g;液体营养盐23 mL;吐温80 2滴。

Coriolus versicolor固体发酵产漆酶的研究

  (3)液体营养盐的配制(/L):葡萄糖5g;(NH4)SO4;KH2P043g;MgS04·7H2O O.5g;愈创木酚4g;CaCl22g;CuSO40.6mg;0.2mol/L pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液100mL;微量元素浓缩液1mL。

  (4)微量元素浓缩液的配制(g/L):MnSO4 0.3;FeSO4·7H2O 3;ZnSO4·7H2O 0.3;VB1 0.1。

  1.3 培养基中漆酶酶活的测定:

  在3mL总反应体积中,含有0.5mmol/L底物[2,2 -连氮-二-(3 - 乙基苯并噻唑-6-磺酸)简称ABTS 1mL,50mmol柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和酶液共计2mL。将缓冲液和ABTS在50℃水浴保温5min后,立即用移液枪添加适量酶液,并同时开始计时,分别测定1min, 2min, 3min时420nm处吸光值。定义每分钟氧化1μmolABTS所需酶量为一个酶活单位(U)。

  液体酶活计算方法:液体酶活力(U/L)= △OD×V1/( V2×t×ε)

  式中: △OD:吸光度增加值;t:间隔时间(min);V1:总反应体积(mL)

  V2:酶液体积;ε:消光系数(M-1 cm-1)[ε420= 36000 ×10-6 M-1cm-1]

  固体酶活计算方法:固体酶活(U/g原料)=液体酶活力(U/L)×M1×M2

  式中: M1:提酶时固体基质(g)与所用的缓冲液(L)的比值

  M2:发酵以后固体基质的湿重(g)与固体原料的重量(g)的比值

  1.4蛋白含量的测定方法:

  采用改良的Bradford法测定

  1.5发酵方法

  将C. versicolor菌种从PDA培养基上刮到无菌水中,用匀浆机打碎菌丝体,开低档,时间约4s。用移液管吸取3mL菌丝体悬浮液于固体培养基中,在无菌条件下用玻璃棒搅拌均匀。放置在30℃恒温培养箱内培养,并保证一定湿度,培养10天左右。

  1.6固体酶曲中漆酶的提取

  称取1g湿曲,加入49 mL柠檬酸缓冲液并充分搅匀,40℃下提取1h。然后将浸泡液于10000rpm, 4℃条件下离心5 min,得上清液即初酶液。

  2 结果与讨论

  2.1最佳固体发酵基料的确定

  选用稻草、甘蔗渣、玉米芯、玉米皮、花生壳等纤维废弃物为固体发酵产漆酶的发酵基料,各称取5g放入250ml的三角瓶中,加入5g麸皮、23 mL液体营养盐和2滴吐温80,在30℃的恒温培养箱中培养16天,结果见图1。

  图1 不同纤维原料对产酶的影响

  由图可知,以花生壳为原料时,云芝分泌漆酶的活力最高(46.4U/g原料),并且周期较短,达到最高酶活时仅需要8天。这是因为花生壳结构比较疏松,里面的营养物质更容易被菌丝体利用,而且发酵过程中透气性较好。玉米芯也具有与花生壳类似的特点,所以产酶活力也比较高,仅次于花生壳,但是达到最高酶活力的时候比花生壳要多两天。稻草是常见的农业废弃物,但是利用稻草固体发酵产漆酶时,菌体生很缓慢,漆酶分泌量也很少,这可能是因为稻草表面有蜡质,C. versicolor菌丝不能吸收稻草中的营养物质,因而也就不利于菌体产酶。

  2.2麸皮和花生壳最佳比例的确定

  麸皮与上述五种纤维原料有所不同,除了能够提供必要的碳氮源,还可以为漆酶合成提供丰富的微量元素和生长因子。经过对发酵基料的比较,花生壳的产酶效果相对较好,因此,在确定花生壳作为发酵基料的基础上,着重考察麸皮与花生壳按不同配比混合后,云芝产漆酶的情况。选取11个不同的麸皮与花生壳的比例水平,培养12天,从第6天开始每天取样,选取第6天、第8天、第10天的数据进行比较分析,结果见图2。

  在实验过程中,固体基质采用全麸皮的时候,菌丝体生长旺盛,但是漆酶产率较低;固体基质采用全花生壳时虽然菌丝体生长比全麸皮时生长缓慢,但是其漆酶产率比麸皮要高。由此可以看出,麸皮有利于菌丝体生长,花生壳有利于后期的产酶。由图2可知,麸皮和花生壳比例为1:1时,产酶周期较短,漆酶酶活最高为86.6U/g原料。

  图2 麸皮和花生壳比例对产漆酶的影响

  2.3液体营养盐中葡萄糖浓度的确定

  葡萄糖是微生物较容易利用的单糖,本实验以5g麸皮,5g?花生壳为原料,在30℃下培养一定时间,比较葡萄糖浓度对云芝产漆酶的影响。液体营养盐中葡萄糖浓度选用了5个浓度水平:0%、0.25%、0.5%、075%、1%,在第6天,第8天,第10天测酶活,其结果如图3所示。

  图3 液体营养盐中葡萄糖浓度对漆酶形成的影响

  由图可知,液体营养盐中葡萄糖浓度以0.5%为宜,在第8天时达到最高酶活(33.5U/g原料),在菌体前期生长过程中,培养基中添加一定量的葡萄糖有利于菌体生长,对漆酶的形成有利,而添加的葡萄糖过多时,菌体生长过旺,消耗大量的营养成分,不利于后期漆酶的形成。

  2.4培养基中水分含量的确定

  实验以5g麸皮和5g花生壳为发酵基料,液体营养盐中葡萄糖浓度为 0.5%,选取6个含水量浓度水平:50%、55%、60%、65%、70%、75,在30℃的恒温培养箱中培养12天,在第6天,第8天,第10天测酶活,比较不同含水率对产漆酶的影响,结果如图4所示。

  由图可知,当培养基的含水率小于70%时,随着培养基含水率的增加,云芝产漆酶的酶活力逐渐升高,因为在一定范围内,初始含水量越高,固体基质内水活度越高,当含水率为70%时漆酶酶活力达到最高(52.5U/g原料),是50%时的3.24倍。发酵培养基的初始含水量为75%时的酶活低于70%,可能的原因是含水率太高影响热量的散失,从而影响漆酶的分泌。

  图4 培养基含水率对产漆酶的影响

  2.5固体发酵培养基中最佳pH的确定

  根据上面优化的条件组成新的培养基,采用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液将固体发酵培养基的初始pH调为6个水平: pH2.0、pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0,在30℃条件下培养12天,结果如图5、图6所示。

  由图5可知,培养基的初始pH不同对产漆酶没有太明显的影响,但前期的pH越低越不利于杂菌的生长,从这个角度来考虑,初始pH偏低有利于抗杂菌因此选用初始pH值在2.0左右比较适宜。

  图5 培养的的初始pH对产漆酶的影响

  2.6最佳接种量的确定

  接种量也是影响微生物的生长和产物合成的主要因素之一。接种量小,微生物生长缓慢,培养周期延长;接种量多,微生物生长迅速,在培养初期可能引起溶氧不足而改变代谢途径,从而导致产物形成减少。不同接种量对云芝合成漆酶的影响如图6所示。由图可知,接种量在5~15%时,漆酶酶活力随着接种量的增加而增大,当接种量为20%时,酶活力达到最高值135.3U/g原料,之后随着接种量的增加,漆酶的酶活力没有太明显的变化,但接种量过大,给种子的扩大培养带来困难。因此选用20%为最佳接种量。

  图6 接种量对产漆酶的影响

  2.7最佳培养温度的确定

  温度是影响微生物生长繁殖的重要因素之一,从酶反应动力学来看,温度越高,生长代谢加快,但是温度过高,会导致酶的活力下降。

  图7 温度对漆酶合成的影响

  将麸皮与花生壳比例为1:1,培养基含水率为70%,接种量为 20%的固体培养基,分别置于26℃、28℃、30℃、32℃下培养10天,取样测定各样品的漆酶活力。结果如图7所示。由图可知,云芝固体发酵合成漆酶的最适温度为30℃,此时酶活力为139.1U/g原料;在32℃时,菌体生长缓慢,酶活力偏低;在26~30℃范围内,酶活力随着温度的升高而增加;在30℃的条件下,第10天时的酶活是139.1U/g原料,是26℃的1.60倍,是32℃的1.61倍。实验结果与张树江等人的研究结果相同。

  2.8云芝产漆酶发酵产酶历程

  以1:1麸皮与花生壳为发酵基料,在葡萄糖浓度为0.5%,含水率70%、接种量20%、初始pH 2.0、30℃的条件下培养10天,培养过程中各参数随时间的变化规律如图 9所示。

  图8 云芝产漆酶固体发酵历程

  由图可以看出,pH呈现先下降后上升的趋势,可能因为发酵初期,氮源是硫酸铵,硫酸铵的利用使得pH下降;后期随着发酵的进行,pH值上升。由图还可以看出,发酵前4天内,菌体处于生长阶段,几乎不产漆酶。之后随着培养的进行,漆酶的合成量不断增加,在第10天是达到最大酶活103.4U/g原料。

  参考文献:

  [1] 尹亮, 陈章和, 赵树进. 白地霉产漆酶条件优化及对偶氮染料的脱色[J]. 华南理工大学学报(自然科学版), 2008, 12 (36) :85-90.

  [2] 许 颖, 兰 进. 真菌漆酶研究进展[J]. 食用菌学报, 2005, 2 (1) : 57-64.

  [3] Jujop. Enzymes are breaking into paper[J]. Pulp and Paper Int, 1991, 33 (9) :81.

  [4] 赵树江. 固态发酵产漆酶及其应用基础研究[D]. 杭州:材化学院生物化工系, 2006.

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