发布时间：
原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来。将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中，利用磁力搅拌器。常用的半透膜：玻璃纸、火棉和其他材料合成。当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。
沉淀法也称溶解度法。其纯化生命大分子物质的基本原理是根据各种物质的结构差异性来改变溶液的某些性质，进而导致有效成分的溶解度发生变化。1、盐析法盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。2、有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：其一、与盐溶液一样具有脱水作用；其二、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。3、蛋白质沉淀剂蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用，常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。4、聚乙二醇沉淀作用聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。5、选择性沉淀法根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点，用适当的选择性沉淀法，即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中，从而达到纯化有效成分的目的。 1、吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。2、薄层层析薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。3、聚酰胺薄膜层析聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。 亲和层析的原理与众所周知的抗原-抗体、激素-受体和酶-底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中，特异的底物（S）才能和一定的酶（E）结合，产生复合物（E-S）一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。而亲和层析与酶-底物反应不同的是，前者进行反应时，配体（类似底物）是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L（对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等）以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M（如活化琼脂糖等）上，制成亲和吸附剂M-L，或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。因此，当把固相载体装人小层析柱（几毫升到几十毫升床体积）后，让欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力，以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上，而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来，并形成了第一个层析峰。然后，恰当地改变起始缓冲液的pH值、或增加离子强度、或加入抑制剂等因子，即可把物质S从固相载体上解离下来，并形成了第M个层析峰。显然，通过这一操作程序就可把有效成分与杂质满意地分离开。如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力（其大小有差异）时，采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。上面介绍的亲和层析法亦称特异性配体亲和层析法。除此之外，还有一种亲和层析法叫通用性配体亲和层析法。这两种亲和层析法相比，前者的配体一般为复杂的生命大分子物质（如抗体、受体和酶的类似底物等），它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。而后者的配体则一般为简单的小分子物质（如金属、染料，以及氨基酸等），它成本低廉、具有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。 聚焦层析也是一种柱层析。因此，它和另外的层析一样，照例具有流动相，其流动相为多缓冲剂，固定相为多缓冲交换剂。聚焦层析原理可以从pH梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述。1、PH梯度溶液的形成在离子交换层析中，pH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的。例如，当使用阴离子交换剂进行层析时，制备pH由高到低呈线性变化的梯度溶液的方法是，在梯度仪的混合室中装高pH溶液，而在另一室装低pH极限溶液，然后打开层析柱的下端出口，让洗脱液连续不断地流过柱体。这时从柱的上部到下部溶液的pH值是由高到低变化的。而在聚焦层析中，当洗脱液流进多缓冲交换剂时，由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团，故pH梯度溶液可以自动形成。例如，当柱中装阴离子交换剂PBE94（作固定相）时，先用起始缓冲液平衡到pH9，再用含pH6的多缓冲剂物质（作流动相）的淋洗液通过柱体，这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换对结合发生中和作用。随着淋洗液的不断加入，柱内每点的pH值从高到低逐渐下降。照此处理J段时间，从层析柱顶部到底部就形成了pH6～9的梯度。聚焦层析柱中的pH梯度溶液是在淋洗过程中自动形成的，但是随着淋洗的进行，pH梯度会逐渐向下迁移，从底部流出液的pH却由9逐渐降至6，并最后恒定于此值，这时层析柱的pH梯度也就消失了。2、蛋白质的行为蛋白质所带电荷取决于它的等电点（PI）和层析柱中的pH值。当柱中的pH低于蛋白质的PI时，蛋白质带正电荷，且不与阴离于交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动，固定相中的pH值是随着淋洗时间延长而变化的。当蛋白质移动至环境pH高于其PI时，蛋白质由带正电行变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合。由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境pH 再次低于PI时，它又带正电荷，并从交换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反复进行，于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来，从而达到了分离的目的。不同蛋白质具有不同的等电点，它们在被离子交换剂结合以前，移动之距离是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。3、聚焦效应蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。pH梯度的形成是聚焦效应的先决条件。如果一种蛋白质是加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，它将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，其蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。若在此蛋白质样品被洗出前，再加入第二份同种蛋白质样品时，后者将在洗脱液的作用下以同样的速度向前移动，而不被固定相吸附，直到其迁移至近似本身等电点的环境处（即第一个作品的缓慢迁移处）。然后两份样品以同样的速度迁移，最后同时从柱底洗出。事实上，在聚焦层析过程中，一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的时间进行聚焦，剩余样品还可再加到柱上，其聚焦过程都能顺利完成，得到的结果也是满意的。 多种组分的混合样品进入色谱仪的气化室气化后呈气态。当载气流入时，气化的物质被带人色谱柱内，在固定相和流动相中不断地进行分配．在理想状态下，溶质于气-液两相间的分配可用分配系数Kg描述。当分配系数小时，溶质在柱中就停留时间短，也即滞留因子（Rf）大，所以它将首先从色谱柱流出而进入鉴定器，经放大系统放大后，输出讯号便在记录仪中自动记录下来，这时呈现的图形为色谱图，亦称色谱峰；当分配系数大时，溶质在柱中停留时间就长，其色谱图在记录仪上后出现。由于不同物质有不同的分配系数，所以将一混合样品通过气-液色谱柱时，其所含组分就可得到分离。气相色谱柱效率高、分辨率强的重要原因是，理论塔板数（N）大。毛细管气相色谱的N可达105~6。增加理论塔板数和降低样品组分的不同分子在展层中扩展程度（速率理论），就可明显地提高柱效。以下将讨论塔板理论和速率理论对柱效的影响：1、塔板理论塔板理论是将色谱假设为一个蒸馏塔，塔内存在许多块塔板，样品各组分在每块塔板的液相和气相间进行分配，在柱内塔板间高度H（即理论塔板高度）一定时，在有效范围内，柱子越长，N也就越大，样品各组分分配次数也就越多，分辨率自然提高；若柱长一定时，塔板理论高度H越小，就越能增加样品各组分的分配次数，进而提高其分辨率。因此 N=L/H 在线性分配和忽略塔板间纵向扩散的条件下，根据样品组分的保留时间tr、峰宽W或半峰高宽度2ΔXi，Martin导出了计算N的公式，样品组分峰宽度值越小，理论塔板数越高。实际上，进行色谱分析时，峰宽度值的大小是衡量分辨率高低的一个尺度。2、速率理论根据塔板理论，在H（塔板理论高度）一定时，增加柱长可以提高柱效。但是，柱子过长，将会延长分析时间，降低检测的灵敏度。所以实践中应设法降低H，提高柱效。速率理论主要是分析同一样品的不同分子，在色谱柱中迁移速度差异所引起色谱峰的扩张程度。而涡流扩散、纵向分子扩散和质量传递（包括流动相传质和固定相传质）等因子与速率理论值（H）的密切关系可用下面的公式表示：H=A+B/U+C涡流扩散（A）是由于样品组分随着流动相的移动通过固定相颗粒不均匀的色谱柱时，引起同一组分的不同分子在流动相中形成不规则的"涡流"，致使色谱峰变宽、柱效降低。如固定相颗粒均匀、直径小时，则可降低"涡流"现象发生。纵向扩散（B/U）亦称分子扩散项。纵向扩散与样品分子在色谱柱中的流畅程度（有无阻碍）、流动相的速度（U）等因子有关。因此，降低溶质在流动相中扩散系数和缩短溶质在流动相中停留时间，均可降低纵向扩散。传质阻力（C）：溶质分子在气相与气液界面进行交换所受的阻力，以及在进入固定相液膜传递的差异性统称传质阻力。传质阻力分别与固定相颗粒直径的平方和固定相液膜厚度成正比关系。 高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统，下面将分别叙述其各自的组成与特点。1、进样系统一般采用隔膜注射进样器或高压进样器完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。2、输液系统该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为×107Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、pH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。3、分离系统该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10～50cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管），内径为2～5mm，由"优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，住内装有直径为5～10μm粒度的固定相（由基质和固定液构成）。固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性（如硅胶表面的硅酸基团基本已除去）、多孔性（孔径可达1000?）和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定相的制备一样），或者用化学法偶联各种基团（如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C，通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。4、检测系统高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。（1）紫外检测器该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。其特点：使用面广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；灵敏度高（检测下限为10-10?g/ml）；线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。（2）示差折光检测器凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。目前，糖类化合物的检测大多使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为10-7?g/ml），流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。（3）荧光检测器凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定，其灵敏度很高（检测下限为10-12～10-14?g/ml），痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。（5）数据处理系统该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。
我觉得你应该说你要表达纯化什么蛋白吧现在表达纯化一个蛋白不是那么难的
蛋白质的分离纯化方法 根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果 离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 根据溶解度不同进行分离纯化影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最低;相反,有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解。因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质。王洪新等[8]研究茶叶蛋白质提取过程发现,pH值为时茶叶蛋白提取效果最好,提取率达到36·8%,初步纯化得率为91·0%。李殿宝[9]在从葵花脱脂粕中提取蛋白质时将蛋白溶液的pH值调到3~4,使目标蛋白于等电点沉淀出来。等电点沉淀法还应用于葡萄籽中蛋白质的提取。李凤英等[10]测得葡萄籽蛋白质的等电点为3·8。他们利用碱溶法提取葡萄籽蛋白质,得到了最佳的提取工艺为:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃搅拌40 min,葡萄籽蛋白质提取率达73·78%。另外还可以利用碱法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均优于酶法提取[11]。利用酸法提取得到的鲢鱼鱼肉蛋白质无腥味、色泽洁白,蛋白质产率高达90%[12]。 蛋白质的盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象,其中,增加蛋白质溶解度的现象称盐溶,反之为盐析。应当指出,同样浓度的二价离子中性盐,如MgCl2、(NH4)2SO4对蛋白质溶解度影响的效果,要比一价离子中性盐如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工艺中除了可以利用碱溶法还可以利用盐溶法来提取蛋白质,其最佳提取工艺是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃搅拌提取30min,蛋白质提取率为57·25%[10]。盐析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法,其中硫酸铵盐析法广泛应用于生产。由于硫酸铵在水中呈酸性,为防止其对蛋白质的破坏,应用氨水调pH值至中性。为防止不同分子之间产生共沉淀现象,蛋白质样品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后,通常要使用透析或者凝胶过滤的方法除去中性盐[13]。有机溶剂提取法的原理是:与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低;而且在一定温度、pH值和离子强度下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此,控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。例如,在冰浴中磁力搅拌下,在4℃预冷的培养液中缓慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,从而纯化冰核蛋白[14]。由于在室温下,有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀,而且伴随着变性。因此,通常要将有机溶剂冷却,然后在不断搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高,蛋白质变性问题就可以很大程度上得到解决。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的蛋白质,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取,它们有一定的亲水性和较强的亲脂性,是理想的提取液。冷乙醇分离法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制备丙种球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO规程和中国生物制品规程推荐的方法,不仅分辨率高、提纯效果好、可同时分离多种血浆成分,而且有抑菌、清除和灭病毒的作用[15]。萃取是分离和提纯有机化合物常用的一种方法,而双水相萃取和反胶团萃取可以用来分离蛋白质。双水相萃取技术(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相,由于被分离物在两相中分配的不同,便可实现分离,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。此方法可以在室温环境下进行,双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性,收率较高。对于细胞内的蛋白质,需要先对细胞进行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到浓缩,细胞碎片等固体物分布在下相中。采用双水相系统浓缩目的蛋白,受聚合物分子量及浓度、溶液pH值、离子强度、盐类型及浓度的影响[16]。反胶团萃取法是利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的。反胶团是当表面活性剂在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的一种纳米尺寸的聚集体。这种方法的优点是萃取过程中蛋白质因位于反胶团的内部而受到反胶团的保护。程世贤等[17]就利用反胶团萃取法提取了大豆中的蛋白质。 根据电荷不同进行分离纯化 根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类。 在外电场的作用下,带电颗粒(如不处于等电点状态的蛋白质分子)将向着与其电性相反的电极移动,这种现象称为电泳。聚丙烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳,常用于分离蛋白质。它的优点是设备简单、操作方便、样品用量少。等电聚焦是一种高分辨率的蛋白质分离技术,也可以用于蛋白质的等电点测定。利用等电聚焦技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中进行的。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的pH值梯度处形成一个窄条带。孙臣忠等[18]研究了聚丙烯酰胺电泳、等电聚焦电泳和等速提纯电泳在分离纯化蛋白质中的应用。结果发现,聚丙烯酰胺电泳的条带分辨率低,加样量不高;等电聚焦电泳分辨率最高,可以分离同种蛋白的亚成分,加样量最小;等速提纯电泳区带分辨率较高,可将样品分成单一成分,加样量最大。离子交换层析(Ion exchange chromatography,IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。当蛋白质处于不同的pH值条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。李全宏等[19]将离子交换层析应用于浓缩苹果汁中蛋白质的提纯。另外,离子交换层析还用于抗凝血蛋白的提取[7]。 利用对配体的特异亲和力进行分离纯化 亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(即生物学亲和力)建立起来的一种有效的纯化方法。它通常只需一步处理即可将目的蛋白质从复杂的混合物中分离出来,并且纯度相当高。应用亲和层析须了解纯化物质的结构和生物学特性,以便设计出最好的分离条件。近年来,亲和层析技术被广泛应用于靶标蛋白尤其是疫苗的分离纯化,特别是在融合蛋白的分离纯化上,亲和层析更是起到了举足轻重的作用,因为融合蛋白具有特异性结合能力[20]。亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应用也相当广泛[21]。范继业等[22]利用壳聚糖亲和层析提取的抑肽酶比活达到71 428 BAEE·mg-1,纯化回收率达到62·5%。该方法成本较低,吸附剂价格低廉、机械强度高、抗污染能力较强、非特异性吸附较小、可反复使用、适用性广,产品质量稳定。3 展望 在实际工作中,很难用单一方法实现蛋白质的分离纯化,往往要综合几种方法才能提纯出一种蛋白质。理想的蛋白质分离提纯方法,要求产品纯度和总回收率越高越好,但实际上两者难以兼顾,因此,考虑分离提纯的条件和方法时,不得不在两者之间作适当的选择;一般情况下,科研上更多地选择前者,工业生产上更多地选择后者。因此,每当需要提纯某种蛋白质时,首先要明确分离纯化的目的和蛋白质的性质,以便选择最佳的分离纯化方法,从而得到理想的效果。今后,蛋白质提纯技术的发展将不断促进对蛋白质性质的研究,同时对蛋白质性质的研究也将反过来提高蛋白质分离纯化技术,两者的互相促进终将会对生命科学的进步作出重大贡献。
沉淀法也称溶解度法。其纯化生命大分子物质的基本原理是根据各种物质的结构差异性来改变溶液的某些性质，进而导致有效成分的溶解度发生变化。1、盐析法盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。2、有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：其一、与盐溶液一样具有脱水作用；其二、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。3、蛋白质沉淀剂蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用，常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。4、聚乙二醇沉淀作用聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。5、选择性沉淀法根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点，用适当的选择性沉淀法，即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中，从而达到纯化有效成分的目的。 1、吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。2、薄层层析薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。3、聚酰胺薄膜层析聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。 亲和层析的原理与众所周知的抗原-抗体、激素-受体和酶-底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中，特异的底物（S）才能和一定的酶（E）结合，产生复合物（E-S）一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。而亲和层析与酶-底物反应不同的是，前者进行反应时，配体（类似底物）是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L（对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等）以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M（如活化琼脂糖等）上，制成亲和吸附剂M-L，或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。因此，当把固相载体装人小层析柱（几毫升到几十毫升床体积）后，让欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力，以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上，而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来，并形成了第一个层析峰。然后，恰当地改变起始缓冲液的pH值、或增加离子强度、或加入抑制剂等因子，即可把物质S从固相载体上解离下来，并形成了第M个层析峰。显然，通过这一操作程序就可把有效成分与杂质满意地分离开。如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力（其大小有差异）时，采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。上面介绍的亲和层析法亦称特异性配体亲和层析法。除此之外，还有一种亲和层析法叫通用性配体亲和层析法。这两种亲和层析法相比，前者的配体一般为复杂的生命大分子物质（如抗体、受体和酶的类似底物等），它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。而后者的配体则一般为简单的小分子物质（如金属、染料，以及氨基酸等），它成本低廉、具有较高的吸附容量，通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。 聚焦层析也是一种柱层析。因此，它和另外的层析一样，照例具有流动相，其流动相为多缓冲剂，固定相为多缓冲交换剂。聚焦层析原理可以从pH梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述。1、PH梯度溶液的形成在离子交换层析中，pH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的。例如，当使用阴离子交换剂进行层析时，制备pH由高到低呈线性变化的梯度溶液的方法是，在梯度仪的混合室中装高pH溶液，而在另一室装低pH极限溶液，然后打开层析柱的下端出口，让洗脱液连续不断地流过柱体。这时从柱的上部到下部溶液的pH值是由高到低变化的。而在聚焦层析中，当洗脱液流进多缓冲交换剂时，由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团，故pH梯度溶液可以自动形成。例如，当柱中装阴离子交换剂PBE94（作固定相）时，先用起始缓冲液平衡到pH9，再用含pH6的多缓冲剂物质（作流动相）的淋洗液通过柱体，这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换对结合发生中和作用。随着淋洗液的不断加入，柱内每点的pH值从高到低逐渐下降。照此处理J段时间，从层析柱顶部到底部就形成了pH6～9的梯度。聚焦层析柱中的pH梯度溶液是在淋洗过程中自动形成的，但是随着淋洗的进行，pH梯度会逐渐向下迁移，从底部流出液的pH却由9逐渐降至6，并最后恒定于此值，这时层析柱的pH梯度也就消失了。2、蛋白质的行为蛋白质所带电荷取决于它的等电点（PI）和层析柱中的pH值。当柱中的pH低于蛋白质的PI时，蛋白质带正电荷，且不与阴离于交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动，固定相中的pH值是随着淋洗时间延长而变化的。当蛋白质移动至环境pH高于其PI时，蛋白质由带正电行变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合。由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境pH 再次低于PI时，它又带正电荷，并从交换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反复进行，于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来，从而达到了分离的目的。不同蛋白质具有不同的等电点，它们在被离子交换剂结合以前，移动之距离是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。3、聚焦效应蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。pH梯度的形成是聚焦效应的先决条件。如果一种蛋白质是加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，它将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，其蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。若在此蛋白质样品被洗出前，再加入第二份同种蛋白质样品时，后者将在洗脱液的作用下以同样的速度向前移动，而不被固定相吸附，直到其迁移至近似本身等电点的环境处（即第一个作品的缓慢迁移处）。然后两份样品以同样的速度迁移，最后同时从柱底洗出。事实上，在聚焦层析过程中，一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的时间进行聚焦，剩余样品还可再加到柱上，其聚焦过程都能顺利完成，得到的结果也是满意的。 多种组分的混合样品进入色谱仪的气化室气化后呈气态。当载气流入时，气化的物质被带人色谱柱内，在固定相和流动相中不断地进行分配．在理想状态下，溶质于气-液两相间的分配可用分配系数Kg描述。当分配系数小时，溶质在柱中就停留时间短，也即滞留因子（Rf）大，所以它将首先从色谱柱流出而进入鉴定器，经放大系统放大后，输出讯号便在记录仪中自动记录下来，这时呈现的图形为色谱图，亦称色谱峰；当分配系数大时，溶质在柱中停留时间就长，其色谱图在记录仪上后出现。由于不同物质有不同的分配系数，所以将一混合样品通过气-液色谱柱时，其所含组分就可得到分离。气相色谱柱效率高、分辨率强的重要原因是，理论塔板数（N）大。毛细管气相色谱的N可达105~6。增加理论塔板数和降低样品组分的不同分子在展层中扩展程度（速率理论），就可明显地提高柱效。以下将讨论塔板理论和速率理论对柱效的影响：1、塔板理论塔板理论是将色谱假设为一个蒸馏塔，塔内存在许多块塔板，样品各组分在每块塔板的液相和气相间进行分配，在柱内塔板间高度H（即理论塔板高度）一定时，在有效范围内，柱子越长，N也就越大，样品各组分分配次数也就越多，分辨率自然提高；若柱长一定时，塔板理论高度H越小，就越能增加样品各组分的分配次数，进而提高其分辨率。因此 N=L/H 在线性分配和忽略塔板间纵向扩散的条件下，根据样品组分的保留时间tr、峰宽W或半峰高宽度2ΔXi，Martin导出了计算N的公式，样品组分峰宽度值越小，理论塔板数越高。实际上，进行色谱分析时，峰宽度值的大小是衡量分辨率高低的一个尺度。2、速率理论根据塔板理论，在H（塔板理论高度）一定时，增加柱长可以提高柱效。但是，柱子过长，将会延长分析时间，降低检测的灵敏度。所以实践中应设法降低H，提高柱效。速率理论主要是分析同一样品的不同分子，在色谱柱中迁移速度差异所引起色谱峰的扩张程度。而涡流扩散、纵向分子扩散和质量传递（包括流动相传质和固定相传质）等因子与速率理论值（H）的密切关系可用下面的公式表示：H=A+B/U+C涡流扩散（A）是由于样品组分随着流动相的移动通过固定相颗粒不均匀的色谱柱时，引起同一组分的不同分子在流动相中形成不规则的"涡流"，致使色谱峰变宽、柱效降低。如固定相颗粒均匀、直径小时，则可降低"涡流"现象发生。纵向扩散（B/U）亦称分子扩散项。纵向扩散与样品分子在色谱柱中的流畅程度（有无阻碍）、流动相的速度（U）等因子有关。因此，降低溶质在流动相中扩散系数和缩短溶质在流动相中停留时间，均可降低纵向扩散。传质阻力（C）：溶质分子在气相与气液界面进行交换所受的阻力，以及在进入固定相液膜传递的差异性统称传质阻力。传质阻力分别与固定相颗粒直径的平方和固定相液膜厚度成正比关系。 高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统，下面将分别叙述其各自的组成与特点。1、进样系统一般采用隔膜注射进样器或高压进样器完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。2、输液系统该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为×107Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、pH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。3、分离系统该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10～50cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管），内径为2～5mm，由"优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，住内装有直径为5～10μm粒度的固定相（由基质和固定液构成）。固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性（如硅胶表面的硅酸基团基本已除去）、多孔性（孔径可达1000?）和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定相的制备一样），或者用化学法偶联各种基团（如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C，通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。4、检测系统高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。（1）紫外检测器该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。其特点：使用面广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；灵敏度高（检测下限为10-10?g/ml）；线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。（2）示差折光检测器凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。目前，糖类化合物的检测大多使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为10-7?g/ml），流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。（3）荧光检测器凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定，其灵敏度很高（检测下限为10-12～10-14?g/ml），痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。（5）数据处理系统该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。
活性不高的话，是不是离子交换过程中pH、缓冲液等等不合适，让蛋白质失活了？做做正交实验调整一下条件看看？（我还不算这行的，没毕业呢）
蛋白表达纯化已经是非常经典简单的实验了，没有LSS说的那么吓人。说说我的蛋白表达纯化以及下面的单抗制作工作总体设计概要吧：1 首先要知道你要纯化蛋白的编码DNA序列，查阅相关文献，看目的基因在那些细胞或者组织中高表达，进而设计该基因的引物，扩增出目的DNA片段的ARF。这一布叫目的基因片段的获取2 构建表达载体：根据你获得的基因本身的特性确定原核或者真核载体中表达，这一步的主要问题就是构建带有目的基因的质粒，导入表达系统中。一般原核表达时间短，成本低，表达量大，常优先考虑；但是有些基因在E coli中就是表达不出，可能是密码子优化等出现问题，也或者是由于想纯化得到更好的活性蛋白的考虑（原核的蛋白折叠系统显然没有真核的好），有很多研究者选择在毕赤酵母中表达。（我手里就有相关资料，因为以前做过表达纯化及后来的单抗制备），这一步再强调一下，优化密码子对于蛋白的成功表达很重要3 载体构建好了，下面就是重组蛋白的表达了。这一过程涉及到用多少的诱导剂，诱导多少时间才能得到最多的蛋白的问题，即优化表达条件。就是在上述不同量诱导剂诱导条件下，取菌体上清（分泌型）或者破碎细胞（胞内表达的蛋白）电泳，看是否得到目的分子量大小的蛋白4 蛋白表达成功，下面是根据蛋白质本身亲水/疏水，电荷带电特性等确定蛋白纯化的方法。一般步骤：离心，取蛋白所在的相如果是分泌表达的蛋白，则取上清，超滤，没有超滤仪器可以用透析袋等代替，用离子交换柱层析。基本上这一步能得到纯化的95％的蛋白，电泳鉴定基本不会看到有杂带出现。如果还是纯度不符合要求，可以在表达蛋白最初在构建表达载体质粒的时候在蛋白的ORF后面加上HIS－标签，这样得到的蛋白不但可以用于HIS柱的进一步纯化，在不确定自己的融合蛋白是否有表达的时候，也可以单单用抗HIS的抗体做一WB，分析确认目的蛋白是否表达，这是蛋白表达的常用手段。5 经过纯化后的蛋白仍然含有一部分无机盐，如果需要的话可以将蛋白经真空冻干机冻干，得到纯蛋白。我们实验室做出来的一个蛋白，编码序列GC含量高75达％，但是功夫不负有心人，只要你想做那件事情，积极的寻找解决问题的手段，总会搞定的，没有跨不过的坎。如果坎太宽，搭桥解决总行。
我觉得你应该说你要表达纯化什么蛋白吧现在表达纯化一个蛋白不是那么难的
【关键词】 树突状细胞；绿色荧光蛋白；RNA；转染 Effect of dendritic cells transfected with total RNA of HepG2 cell line using GFP marker in vitro 【Abstract】 AIM: To investigate the feasibility of GFP as a marker to observe the dendritic cells (DCs) transfected with total RNA of tumor cells and the feasibility of the transfected DCs serving as a vaccine for potential immunotherapy. METHODS: Plasmid pGFPC3 was transfected into HepG2 stably. Total RNA was extracted from the HepG2GFP using Trizol; DCs were induced by liver cancer patients peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and transfected with the total RNA. The effect of transfection was observed by a fluorescence microscope, the changes of phenotype were detected by flow cytometry, and the change of IL12 secretion in the supernatant of DCs was detected by ELISA assay. The cytotoxic effect of CTLs was assessed by MTT assay. RESULTS: GFP was expressed stably in the HepG2GFP cells that presented green fluorescence under a fluorescence microscope, so did DCs transfected with total HepG2GFP cell RNA. After transfection, the expression of membrane molecules such as CD80 ( to ), HLADR ( to ), CD83 ( to ), CD86 ( to ) was increased dramatically, IL12 secretion in the supernatant was elevated significantly 〔(±) ng/L to (±) ng/L, P＜〕. The CTLs activated by DCs transfected with total HepG2GFP RNA showed a potent specific lysis to HepG2 cells. CONCLUSION: GFP could be used as a marker to observe the effect of transfection of DCs with total tumor cell RNA. DCs transfected with total tumor cell RNA may serve as a promising vaccine of immunotherapy. 【Keywords】 dendritic cell；green fluorescent protein；RNA；transfection 【摘要】 目的：探讨GFP作为标记观察肝癌细胞RNA转染DCs效果的可行性及肿瘤细胞RNA转染DCs制备疫苗的可行性. 方法：绿色荧光蛋白质粒载体 pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2，Trizol法提取筛选后细胞HepG2GFP总RNA；分离肝癌患者外周血单核细胞体外诱导DCs细胞，总RNA转染DCs，荧光显微镜下观察转染效果，流式细胞仪检测转染前后DCs表型变化；ELISA法检测转染前后上清中IL12变化情况；MTT法检测效应细胞对靶细胞的杀伤率. 结果：pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2后可得到稳定表达GFP的细胞HepG2GFP，荧光显微镜下呈绿色荧光；总RNA转染的DCs荧光显微镜下呈绿色荧光，CD80(上升至)，HLADR(上升至)，CD83(上升至)，CD86(上升至)表达明显升高，上清IL12分泌量ng/L显著增高(±→±，P＜)；诱导的CTL能够对肝癌细胞株HepG2起特异性杀伤作用. 结论：GFP可以作为肿瘤细胞RNA转染树突状细胞的观察标记，肿瘤细胞RNA转染DCs可作为一种有效的肿瘤疫苗. 【关键词】 树突状细胞；绿色荧光蛋白；RNA；转染 【中图号】 0引言 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一种常见的恶性肿瘤，适合手术治疗的患者只占一少部分，具有较高的复发率，预后很差，严重威胁人类健康〔1〕. DCs(dendritic cells, DCs)是体内功能强大的专职性抗原提呈细胞，它能够高效的摄取、处理抗原，并将处理后的多肽呈递给静息型T细胞，引起针对该抗原的特异性免疫反应〔2〕. 国内外类似的研究中，都没有明确的可以观察肿瘤RNA转染DCs效果的指标，我们应用绿色荧光蛋白质粒载体 pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2，提取筛选后细胞HepG2GFP总RNA转染DCs，观察转染后DCs绿色荧光蛋白表达及特异性表面标志及功能相关分子表达，检测其上清细胞因子分泌，探讨其作为肿瘤疫苗的可行性. 1材料和方法 材料肝癌患者外周血单个核细胞来源于我科造血干细胞移植患者；HepG2肝癌细胞株由我科常规传代培养. 流式细胞仪（BD），DG3022A型酶联免疫检测仪（华东电子管厂），荧光显微镜Optiphot XIF（Nicon）等均为我院常备. FITCCD80，FITCHLADR，PECD83，PECD86抗体购自BD公司；rhGMCSF，rhIL4购自Peprorotec公司；TNFα购自我校生物技术中心；绿色荧光蛋白载体pGFPC3由陕西省肿瘤医院贾军博士惠赠；脂质体Transfection2000，Trizol Reagent购自Invitrogen；RPMI 1640培养基、胎牛血清、G418购自Gibco公司，Xvivo无血清培养基购自BioWhittaker；IL12 ELISA检测试剂盒购自Bioscience公司；MTT购自Sigma公司. 方法参照Transfection2000说明书，pGFPC3转染HepG2，G418筛选2 mon. 筛选细胞命名HepG2GFP，荧光显微镜下观察. Trizol试剂提取HepG2GFP总RNA，紫外灯下观察，-80℃冻存备用. 同样方法提取HepG2总RNA. 取肝癌患者造血干细胞分离液，贴壁法分离单核细胞，贴壁细胞在细胞因子rhGMCSF，rhIL4作用下，诱导DCs. 倒置显微镜、电子显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞表型. 转染树突状细胞收集培养4 d的DCs，转入6孔板，转染HepG2GFP总RNA. 另设转染HepG2总RNA及空白对照组. 继续培养48 h. 荧光显微镜下观察. 细胞因子分泌的测定48 h后，收集各组DCs上清，ELISA法检测转染前后各组细胞上清中IL12分泌量. 效应收集各组DCs，30 Gy 60Co照射后与复苏冻存的非贴壁细胞按20∶1比例混合接种于24孔板，培养5 d，收集的细胞即为效应细胞. 收集对数生长期的HepG2细胞作为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按20∶1比例混合接种于96孔板. 同时设单一靶细胞组、单一效应细胞组. 培养24 h后，MTT法检测.以下述公式计算杀伤效率.CTL杀伤效率=〔1-（效靶A490-效应细胞A490）/靶细胞A490〕×100%.统计学方法：结果采用SPSS 统计软件分析.2结果 总RNA转染DCs稳定转染及筛选后得到的HepG2GFP细胞，能够稳定的表达GFP，荧光显微镜下所有细胞都呈现绿色荧光（图1），传代20次以上仍无消失. 与对照细胞相比，GFP基因修饰细胞在形态、生长等特性上均无显著改变，也未见GFP表达对靶细胞的毒性. 使用Trizol提取HepG2GFP细胞总RNA后，取2 μL总RNA进行凝胶电泳，可见5 s，18 s和28 s条带（图2）. 单个核细胞贴壁后，贴壁细胞在细胞因子GMCSF，IL4的作用下，培养第2日出现细胞集落，但细胞集落较小. 5 d后，集落明显增加、变大，出现具有毛刺状突起的细胞. 至7 d，集落开始减少，产生大量具有树枝状突起的细胞（图3A，B）. 荧光显微镜下，HepG2GFP总RNA转染DCs组细胞呈绿色荧光，而HepG2总RNA转染组及空白对照组则无明显荧光表达（图4A，B，C）. 图1荧光显微镜下pGFPC3稳定转染后HepG2胞浆荧光阳性 ×250（略） 图2HepG2GFP细胞的总RNA电泳（略） 图3树突状细胞形态(第7日)（略） 流式细胞仪检测细胞表型诱导d 7，DCs表达CD80 ，HLADR ，CD86 ，CD83低表达，仅；转染后上述分子表达明显升高，分别为CD80 ，HLADR ，CD86 ，CD83 ，提示转染后细胞具有成熟DCs特征. 图4总RNA转染DCs×250（略） 检测IL12分泌HepG2GFP总RNA转染DCs组上清中IL12分泌明显增加，显著高于转染前〔（±) ng/L vs (±) ng/L； n=6，P＜〕. 介导细胞毒效应HepG2GFP总RNA转染DCs刺激的CTL对HepG2细胞杀伤率为（±）%，未转染的DCs刺激的T细胞对HepG2的杀伤作用为(±)%，无DCs刺激T细胞对HepG2的杀伤作用为(±)%，总RNA转染DCs刺激的CTL对HepG2细胞杀伤率明显高于两个对照组（n=6，P＜）. HepG2GFP总RNA转染DCs刺激的CTL对SMMC7721和K562细胞杀伤率分别为(±)%和(±)%，对HepG2细胞杀伤率明显高于SMMC7721和K562细胞（n=6，P＜）. 3讨论 DCs是体内功能最强大的专职性抗原提呈细胞，它在T细胞免疫中发挥着极其重要的作用〔2〕. 应用各种肿瘤抗原致敏DCs制备疫苗是近年来研究的热点 〔3-8〕. 肿瘤细胞总RNA转染DCs制备疫苗与其他方法相比，具有如下优越性：首先，它不受已知肿瘤抗原的限制，可诱导出多克隆的CTL；其次，转染所需的RNA可以通过扩增方法得到，很少量的肿瘤组织样本即可扩增得到大量的RNA〔8〕. 但目前国内外的研究中，尚未有可以明确观察总RNA转染DCs效率的方法. 我们应用稳定表达GFP的HepG2GFP总RNA转染DCs，以GFP为标记观察总RNA转染DCs的效率，探讨其作为肿瘤疫苗的可行性，为肝癌临床治疗提供实验基础. 本试验中，HepG2GFP总RNA转染后的DCs在荧光显微镜下观察，胞质呈现绿色荧光，证实GFP mRNA可以在DCs胞质内正常表达，同时说明肿瘤细胞总RNA同样也可以在DCs胞浆内进行翻译表达. 转染后CD83，CD80，CD86，HLADR表达明显升高，IL12分泌明显增加，说明RNA转染，促进了DCs的体外成熟. 成熟DCs主要通过MHCI类途径，将肿瘤细胞总RNA在DCs胞质内进行翻译表达的肿瘤抗原呈递给T淋巴细胞. 此途径诱导的T淋巴细胞主要为CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）. 本试验中，诱导的CTL对HepG2的细胞毒效应明显高于对照组T细胞，证实诱导的T淋巴细胞为肿瘤特异性的. 因此，在当前仍未发现肝癌特异性抗原情况下，应用肝癌细胞总RNA转染DCs制备瘤苗，诱导针对肝癌细胞的多克隆CTL，可以作为肝癌DCs疫苗的一个发展方向. 【参考文献】 〔1〕 Qin LX, Tang ZY. The prognostic molecular markers in hepatocellular carcinoma 〔J〕. World J Gastroenterol, 2002, 8(3):385-392. 〔2〕 张红梅,任军,张利旺,等. 外周血造血干细胞体外定向诱导树突状细胞及功能鉴定〔J〕. 第四军医大学学报,2003, 24(1):83-85. 〔3〕 Kaplan JM, Yu Q, Piraino ST, et al. Induction of antitumor immunity with dendritic cells transducted with adenovirus vector encoding endogenous tumorassociated antigens 〔J〕. J Immunol,1999, 163(2): 699. 〔4〕 Schnurr M, Galambos P, Scholz C, et al. Tumor cell lysatepulsed human dendritic cells induce a Tcell response against pancreatic carcinoma cells: An in vitro model for the assessment of tumor vaccines 〔J〕. Cancer Res, 2001, 61(17):6445-6450. 〔5〕 Barbuto JA, Ensina LF, Neves AR, et al. Dendritic celltumor cell hybrid vaccination for metastatic cancer 〔J〕. Cancer Immunol Immunother, 2004, 53: 1111-1118. 〔6〕 Heiser A, Maurice MA, Yancey DR, et al. Induction of polyclonal prostate cancerspecific CTL using dendritic cells transfected with amplified tumor RNA 〔J〕. J Immunol, 2001, 166: 2953-2960. 〔7〕 Heiser A, Coleman D, Dannull J, et al. Autologous dendritic cells transfected with prostatespecific antigen RNA stimulate CTL responses against metastatic prostate tumors 〔J〕. J Clin Invest, 2002, 109(3):409-417. 〔8〕 Kalady MF, Onaitis MW, Emani S, et al. Dendritic cells pulsed with pancreatic cancer total tumor RNA generate specific antipancreatic cancer T cells 〔J〕. J Gastrointest Surg, 2004, 8(2):175-181.
问题一：大一写论文需要注意什么？ 1、论文题目：要求准确、简练、醒目、新颖。 2、目录：目录是论文中主要段落的简表。（短篇论文不必列目录） 3、提要：是文章主要内容的摘录，要求短、精、完整。字数少可几十字，多不超过三百字为宜。 4、关键词或主题词：关键词是从论文的题名、提要和正文中选取出来的，是对表述论文的中心内容有实质意义的词汇。关键词是用作机系统标引论文内容特征的词语，便于信息系统汇集，以供读者检索。 每篇论文一般选取3-8个词汇作为关键词，另起一行，排在“提要”的左下方。 主题词是经过规范化的词，在确定主题词时，要对论文进行主题，依照标引和组配规则转换成主题词表中的规范词语。 5、论文正文： （1）引言：引言又称前言、序言和导言，用在论文的开头。 引言一般要概括地写出作者意图，说明选题的目的和意义, 并指出论文写作的范围。引言要短小精悍、紧扣主题。 〈2）论文正文：正文是论文的主体，正文应包括论点、论据、 论证过程和结论。主体部分包括以下内容： a.提出-论点； b.分析问题-论据和论证； c.解决问题-论证与步骤； d.结论。 6、一篇论文的参考文献是将论文在和写作中可参考或引证的主要文献资料，列于论文的末尾。参考文献应另起一页，标注方式按《GB7714-87文后参考文献著录规则》进行。 中文：标题--作者--出版物信息（版地、版者、版期）：作者--标题--出版物信息所列参考文献的要求是： （1）所列参考文献应是正式出版物，以便读者考证。 （2）所列举的参考文献要标明序号、著作或文章的标题、作者、出版物信息。 问题二：要写大学论文了，有经验的说下怎么写 其实主要是注重格式,每个学校论文都有相应的排版格式,还有目录,如果不熟悉word使用的话,建议去当地书城买一本word使用教程来学习一下 主要是注意生成目录,还有各个标题,子标题,写的时候要注意区分标题,这样对你以后生成目录很有帮助. 另外还有注意字体大小,行距,不然论文写得再好排版不好还是要重新再答应. 至于内容,其实前面七页和后面七页认认真真写,中间的可以比较简略,省略的写就好,其实一般老师都是随便翻翻前面几页和后面几页就算了,没有老师真正去通读全文的. 还有注意适当引用,有的大学是需要学生在论文中引用一定数量的论文,还有最后参考文献的格式也有讲究(不过网上有工具可以生成). 还有一定需要注意的是现在大学都有防抄袭系统,句子不要抄得太一样咯,尽量避免直接复制粘贴,是在要用别人的观点,就尝试用自己的话来说咯,其实也就是尽量拖长句子. 至于字数要求,其实老师看的是页数比较多,页数到达一定数量就好,没有人真正的去数字数. 论文内容最好自己写,要有亮点,亮点尽量写得玄学,别人看不懂就最好,最好套用一点专用名词上去. 这一点可以学习一些手机厂家,好像普通塑料就不能说塑料,要写亚克力材质.又比方说普通的金属钢片不能说钢片,要说奥氏体304不锈钢,总之要高大上,最好连老师都不懂,这样老师一般就不会问这个,如果老师真的问,你就说一句众所周知亚克力就是新型材料什么的,用于XXX\XXX有广泛引用,你一旦套上众所周知,一般提问的教授为了体现自己有水平,就会说噢噢,即使听不懂,也会不懂装懂.. 是在不会答辩可以去看看这么多年的小米\魅族的新品发布会,还有就是苹果的发布会,答辩跟那些其实就差不多,不过小米\魅族的可能更适合国内答辩.. 总之论文如果想拿高分就要尽量多用深奥的词汇,说的玄之又玄,明明很简单的东西都要说拗口了..不知道怎么说可以参考一些国内的教材..反正就是那个思路,写教材的人其实就是答辩过很多次的高手习惯了,就这么写教材,大家都看不懂,然后不懂装懂的人就觉得很有水平...其实国外教材根本不会这样,都是由浅入深一步一步的,所以国外教材一般都比较厚,国内比较薄雷同率也比较高...这个就不扯了... 总之前面7页后面7页认真写,多用专有名词,写的神乎其神,简单的东西复杂化,复杂的东西玄学化,保证答辩拿高分.... 问题三：写大学论文具体需要哪些步骤 你的论文准备往什么方向写，选题老师审核通过了没，有没有列个大纲让老师看一下写作方向？老师有没有和你说论文往哪个方向写比较好？写论文之前，一定要写个大纲，这样老师，好确定了框架，避免以后论文修改过程中出现大改的情况！！ 学校的格式要求、写作规范要注意，否则很可能发回来重新改，你要还有什么不明白或不懂可以问我，希望你能够顺利毕业，迈向新的人生。 第一，你在写论文的时候先确定你的论点，也就是你这篇论文是关于什么，是要论证什么东西，一般来说，也只有你对这个比较熟悉有一定的基础才能进行研究。 第二，在确定好论文方向后你可以查阅相关的书籍，一般包括一手和二手资料，一手就是关于你论证对象的资料，二手就是另外一些学者对于该对象的研究成果，比如你要研究鲁迅的话，第一手资料就是鲁迅的作品，第二首资料就是其他人关于鲁迅作品研究的成果。这些成果你都可以引用，但是在引用的时候必须注明出处，也就是你用了谁的观点，包括作者、作品名、出版社第几年第几版、第几页，这些写在论文的结尾处，以注释说明。 第三，摘要，摘要就是你论文研究的论点是什么，大概内容是什么，你有什么新看法。摘要一般不多，规范论文的摘要字数在200到500字之间，一般300字左右。 第四，关键字，关键字是抽取你论文的最主要的字眼，但是这字眼能明白看出你论文的大意的。比如你研究鲁迅的《阿Q正传》的，关键字可以有：鲁迅，阿Q正传，国民性，精神胜利法，革命。一般关键字为3到5个。 第五，正文，主要就是关于你的论点展开论述了。一般的论文的都在5000字以上，如果你是一个学生，小论文的话字数一般3000到5000字，而且标准也不高。当然，毕业论文除外。 第六，注释，注释就是关于你的参考作品，标明出处，也可以对于某些观点再做论述，但是一般字数不要太多。 第七，如果你有指导教师的话，在此表示感谢，有则可，没有不强求。 如果你写的是很重要的论文的话，一般还有英文摘要，错别字概率一般在万分之一，如果不是很严格的论文也不会有这些要求。最关键的就是正文了，一般你要有自己新颖的观点，但是不能哗众取宠，牵强附会，还要有结构层次，不能杂乱无章，也就是由浅到深。论文是实证性的，最好不要加入你的主观价值判断，就是最好不要有“应该”两个字，你不能告诉别人应该怎么做。 如何写毕业论文大纲 毕业论文大纲其实就是我们中学时候写作文要求的提纲. 写毕业论文大纲主要是提供我们论文写作的思路, 列出我们论文的框架结构, 这样方便我们后续写论文 (一)指导选题 选题是毕业论文写作的开端。能否选择恰当的题目，对于整篇毕业论文写作是否顺利，关系极大。好比走路，这开始的第十步是具有决定意义的，第一步迈向何方，需要慎重考虑。否则，就可能走许多弯路，费许多周折，甚至南辕北辙，难以到达目的地。 指导学员选题，要遵循这样两条基本原则：第一条是价值原则，即论文的选题要有价值。论文价值有价值和价值之分，选题时，要把应用价值摆在首位。学员写的毕业论文不是毫无实际意义的“空对空”的文字游戏，而是来源于现实，并为现实服务的。第二条是可行原则。选题时要充分考虑主客观条件。客观条件主要是写作的时间、地点、环境；主观条件包括作者的才能、学识和所掌握的材料等。学员在选择毕业论文题目时，必须考虑自己的主、客观条件，量力而行。即要选择那些客观上需要，主观上又有能力完成的题目。 (二)指导搜集材料 材料是文章的血肉，写文章不能没有材料。毕业论文如果缺少翔实的材料，就会像 *** 同志曾经批评......>> 问题四：大学论文怎么写啊 论文怎么写 一、标题 标题是文章的眉目。各类文章的标题，样式繁多，但无论是何种形式，总要以全部或不同的侧面体现作者的写作意图、文章的主旨。毕业论文的标题一般分为总标题、副标题、分标题几种。 (一)总标题 总标题是文章总体内容的体现。常见的写法有： ①揭示课题的实质。这种形式的标题，高度概括全文内容，往往就是文章的中心论点。它具有高度的明确性，便于读者把握全文内容的核心。诸如此类的标题很多，也很普遍。如《关于经济体制的模式问题》、《经济中心论》、《县级行政机构改革之我见》等。 ②提问式。这类标题用设问句的方式，隐去要回答的内容，实际上作者的观点是十分明确的，只不过语意婉转，需要读者加以思考罢了。这种形式的标题因其观点含蓄，容易激起读者的注意。如《家庭联产承包制就是单干吗?》、《商品经济等同于资本主义经济吗?》等。 ②交代内容范围。这种形式的标题，从其本身的角度看，看不出作者所指的观点，只是对文章内容的范围做出限定。拟定这种标题，一方面是文章的主要论点难以用一句简短的话加以归纳；另一方面，交代文章内容的范围，可引起同仁读者的注意，以求引起共鸣。这种形式的标题也较普遍。如《试论我国农村的双层经营体制》、《正确处理中央和地方、条条与块块的关系》、《战后西方贸易自由化剖析》等。 ④用判断句式。这种形式的标题给予全文内容的限定，可伸可缩，具有很大的灵活性。文章研究对象是具体的，面较小，但引申的思想又须有很强的概括性，面较宽。这种从小处着眼，大处着手的标题，有利于科学思维和科学研究的拓展。如《从乡镇企业的兴起看中国农村的希望之光》、《科技进步与农业经济》、《从“劳动创造了美”看美的本质》等。 ⑤用形象化的语句。如《激励人心的管理体制》、《科技史上的曙光》、《普照之光的理论》等。 标题的样式还有多种，作者可以在实践中大胆创新。 (二)副标题和分标题 为了点明论文的研究对象、研究内容、研究目的，对总标题加以补充、解说，有的论文还可以加副标题。特别是一些商榷性的论文，一般都有一个副标题，如在总标题下方，添上“与××商榷”之类的副标题。 另外，为了强调论文所研究的某个侧重面，也可以加副标题。如《如何看待现阶段劳动报酬的差别――也谈按劳分配中的资产阶级权利》、《开发蛋白质资源，提高蛋白质利用效率――探讨解决吃饭问题的一种发展战略》等。 设置分标题的主要目的是为了清晰地显示文章的层次。有的用文字，一般都把本层次的中心内容昭然其上；也有的用数码，仅标明“一、二、三”等的顺序，起承上启下的作用。需要注意的是：无论采用哪种形式，都要紧扣所属层次的内容，以及上文与下文的联系紧密性。 对于标题的要求，概括起来有三点：一要明确。要能够揭示论题范围或论点，使人看了标题便知晓文章的大体轮廓、所论述的主要内容以及作者的写作意图，而不能似是而非，藏头露尾，与读者捉迷藏。二要简炼。．论文的标题不宜过长，过长了容易使人产生烦琐和累赘的感觉，得不到鲜明的印象，从而影响对文章的总体评价。标题也不能过于抽象、空洞，标题中不能采用非常用的或生造的词汇，以免使读者一见标题就如堕烟海，百思不得其解，待看完全文后才知标题的哗众取宠之意。三要新颖。标题和文章的内容、形式一样，应有自己的独特之处。做到既不标新立异，又不落案臼，使之引人入胜，赏心悦目，从而激起读者的阅读兴趣。 二、目录 一般说来，篇幅较长的毕业论文，都没有分标题。设置分标题的论文，因其内容的层次较多，整个理论体系较庞大、复杂，故通常设目录。 设置目录的目的主要是： 1．使读者能够在阅读该论......>> 问题五：大一新生求论文的标准格式 一、论文应采用统一格式。要求如下 1、标题：黑体三号；副标题：宋体四号；段落标题：宋体小四号字加粗。 2、作者姓名：楷体小三号。 3、作者单位：加括号，楷体小四号。 例：（南京晓庄学院 小学教育专业 01本x班） 4、指导教师：楷体小三号。 例：指导教师：x x x 5、摘 要 摘要要简明，能涵盖文章的主要内容，100字左右。摘要内容（楷体五号）与“摘要” （黑体五号，加粗，加方括号）两字之间空两格。 例：[摘要] x x x x x x x x x 6、关键词 关键词应能反映文章的基本概念，不超过5个，不堆砌关键词。关键词内容（楷体小五号）与“关键词” （黑体五号，加粗，加方括号）三字间空两格。词与词之间加分号，最后一个词后不加句号 例：[关键词] x x；x x；x x；x x x 7、正文：宋体五号。 不能写“正文”一词；正文与关键词部分间隔一行；段落标题为宋体小四号（加粗）并与前后段落各间隔一行。 正文体例一般为：论文按一、（一）、1、（1）的顺序编段落号。调查报告、研究报告或实验报告按1、、的顺序编段落号。凡有编号的段落也都应在起头空两格。 凡所做图表应加题头，如 “表1”、“图1”空两格再加标题。 例：表1 x x x x x x x x x 凡引文应加注释。引文右上方加上标序号，注释加在本页页脚，宋体六号，序号应与上标一致。 注释的写法：被引文献作者姓名，引文题目或书名，出版社或杂志名，出版年份或杂志年份与期号，页码（杂志不用注页码）。 例：①拉尔夫，理解并引导教师的专业成长，郎曼出版社，1992， 文章应加页码，居中。 8、参考文献 “参考文献”一词与正文及文献内容各间隔一行，黑体五号，加粗。 文献目录：序号用 *** 数字并加方括号；不加书名号或引号；与“参考文献”一词隔一行。 例1：[1]作者名.文献名.出版地：出版社（全称），出版年份. 例2憨[1]作者名.文献名.期刊名（全称），出版年份，（期号）. 9、总格式如下： 标题 副标题 作者姓名 作者单位 指导教师及其姓名 摘要 关键词 正文 参考文献 英文摘要 二、编辑格式 1、间距：行间距为倍，字间距为标准间距； 2、纸型：A4纸张； 3、页边距：上、下边距为厘米，左、右边距为厘米。 问题六：什么是论文？大学新生怎样开始写论文？ 如果你的论文是想要在申请的时候用的话 你的论文需要时国家核心期刊上发表的论文 不要求你必须是第一作者，当然如果你是第一作者的话当然更好了 这种论文必须是你所申请研究生的专业领域的论文 所以这种论文是要求你有一定的专业基础的。 作为新生，这个貌似有点勉强。 当然如果你是牛人的话就尽量发挥自己的才智吧。多发表几篇，多多益善的。 所以 如果你不是牛人的话，就只能跟着教授好好混了。教授做项目的时候你参加，然后论文让他把你写作第二作者或者第三作者。 最好你能够搜寻你理想学校的外国教授他的研究方向，了解并写到相关课题的论文，那么你之后跟他套磁才会增大录取甚至拿奖学金的可能啊。 至于论文怎么写，你百度吧。就查查毕业论文的格式。把那个大长篇浓缩成精华就是能发表的了。你给杂志的编辑发邮件等消息，或者联系你们教授熟悉的编辑吧。教授都是要发很多论文才能当教授的，他们肯定有熟人。。。 总之教授是关键。。。 问题七：大学论文怎么写 一、选题：要在自己的专业方向里面选择一个合适的题目或者方向，一般应具有独创性、新颖性。 二、搜集相关资料：包括相关的书籍、期刊资料等其他资料，可以通过期刊网、图书馆等搜集 三、拟写论文提纲，这个与选题一般是同步进行的，提纲就是论文的主体结构。 四、开始拟写论文。这个与搜集资料调整论文提纲同时进行。 五、反复修改论文，征求导师意见。 六、定稿 问题八：大学论文应该怎么写 简单，先找资料，然后确定题目，再根据实习情况加参考文献写开题报告，在开题报告中已经为论文列下了框架，写文章在大框架的前提下就可以具体细化了。一定要跟指导老师多沟通，他会告诉你怎么修改
1、选择一款蛋糕:选择蛋糕需要有恰当的主题，以便为你的论文能更生动，有灵魂；2、选择贴切的包装材料和结构：包装材料，可以选择环保、低碳的，能贴合当前的社会关注点；包装结构，要能完好的保护蛋糕，最好能在结构上有些亮点；3、设计蛋糕包装图案：（1）蛋糕包装的图案与蛋糕的图案最好主题一致，且蛋糕是包装的升华。（2）蛋糕包装盒内部设计图形，在打开包装盒后可以与蛋糕图案成为一个主题。（3）包装盒的图案设计能与结构浑然一体，打开后可以与蛋糕浑然一体，并可以使人在打开蛋糕的一刻感情升华（主题很关键）
鸡蛋、白糖、面粉。2比1比1鸡蛋加糖打泡，加面粉继续打泡。倒入蛋糕模烘烤
海绵蛋糕的制作 在西方，蛋糕是一种具有代表性的西点，倍受人们的钟爱。目前在我国，蛋糕也作为一种老少皆宜、四季应时的食品，正逐渐走进了千家万户。 一、海绵蛋糕的概念与制作原理 海绵蛋糕是利用蛋白起泡性能，使蛋液中充入大量的空气，加入面粉烘烤而成的一类膨松点心。因为其结构类似于多孔的海绵而得名。国外又称为泡沫蛋糕，国内称为清蛋糕(PlainCake)。 在蛋糕制作过程中，蛋白通过高速搅拌使其中的球蛋白降低了表面张力，增加了蛋白的黏度，因黏度大的成分有助于泡沫初期的形成，使之快速地打入空气，形成泡沫。蛋白中的球蛋白和其他蛋白，受搅拌的机械作用，产生了轻度变性。变性的蛋白质分子可以凝结成一层皮，形成十分牢固的薄膜将混入的空气包围起来，同时，由于表面张力的作用，使得蛋白泡沫收缩变成球形，加上蛋白胶体具有黏度和加入的面粉原料附着在蛋白泡沫周围，使泡沫变得很稳定，能保持住混入的气体，加热的过程中，泡沫内的气体又受热膨胀，使制品疏松多孔并具有一定的弹性和韧性。 二、海绵蛋糕的用料、配方 制作海绵蛋糕用料有鸡蛋、白糖、面粉及少量油脂等，其中新鲜的鸡蛋是制作海绵蛋糕的最重要的条件，因为新鲜的鸡蛋胶体溶液稠度高，能打进气体，保持气体性能稳定；存放时间长的蛋不宜用来制作蛋糕。制作蛋糕的面粉常选择低筋粉，其粉质要细，面筋要软，但又要有足够的筋力来承担烘时的胀力，为形成蛋糕特有的组织起到骨架作用。如只有高筋粉，可先进行处理，取部分面粉上笼熟，取出晾凉，再过筛，保持面粉没有疙瘩时才能使用，或者在面粉中加入少许玉米淀粉拌匀以降低面团的筋性。制作蛋糕的糖常选择蔗糖，以颗粒细密、颜色洁白者为佳，如绵白糖或糖粉。颗粒大者，往往在搅拌时间短时不容易溶化，易导致蛋糕质量下降。 海绵蛋糕在制作过程中，一般有两种做法：一种是只用蛋清而不用蛋黄的“天使蛋糕”，另一种是用全蛋的“黄海绵蛋糕”，因而配方也各有不同。 天使蛋糕由蛋清、白糖、面粉、油脂等按5：3：3：1的比例配合制作而成，因配方中没有用蛋黄，所以其发泡性能很好，糕体内部组织相对比较细腻，色泽洁白，质地柔软，几乎呈膨松状。 黄海绵蛋糕传统的配方一般有两种：一种是鸡蛋与糖、面粉的比例为 1：1：1，另一种为鸡蛋与糖、面粉的比例为2：1：1。与天使蛋糕的不同之处在于其不仅使用蛋清，同时也使用了蛋黄，如果制作方法得当，其成品品质与天使蛋糕无异。 三、海绵蛋糕的搅糊工艺 1．蛋白、蛋黄分开搅拌法 蛋白、蛋黄分开搅拌法其工艺过程相对复杂，其投料顺序对蛋糕品质更是至关重要。通常需将蛋白、蛋黄分开搅打，所以最好要有两台搅拌机，一台搅打蛋白，另一台搅打蛋黄。先将蛋白和糖打成泡沫状，用手蘸一下，竖起，尖略下垂为止；另一台搅打蛋黄与糖，并缓缓将蛋白泡沫加入蛋糊中，最后加入面粉拌和均匀，制成面糊。在操作的过程中，为了解决吃口较干燥的问题，可在搅打蛋黄时，加人少许油脂一起搅打，利用蛋黄的乳化性，将油与蛋黄混合均匀。 2．全蛋与糖搅打法 蛋糖搅拌法是将鸡蛋与糖搅打起泡后，再加入其他原料拌和的一种方法。其制作过程是将配方中的全部鸡蛋和糖放在一起，入搅拌机，先用慢速搅打2分钟，待糖、蛋混合均匀，再改用中速搅拌至蛋糖呈乳白色时，用手指勾起，蛋糊不会往下流时，再改用快速搅打至蛋糊能竖起，但不很坚实，体积达到原来蛋糖体积的3倍左右，把选用的面粉过筛，慢慢倒入已打发好的蛋糖中，并改用手工搅拌面粉(或用慢速搅拌面粉)，拌匀即可。 3．乳化法 乳化法是指在制作海绵蛋糕时加入了乳化剂的方法。蛋糕乳化剂在国内又称为蛋糕油，能够促使泡沫及油、水分散体系的稳定，它的应用是对传统工艺的一种改进，尤其是降低了传统海绵蛋糕制作的难度，同时还能使制作出的海绵蛋糕中能溶入更多的水、油脂，使制品不容易老化、变干变硬，吃口更加滋润，所以它更适宜于批量生产。 其操作时，在传统工艺搅打蛋糖时，使蛋糖打匀，即可加入面粉量的10％的蛋糕油，待蛋糖打发白时，加入选好的面粉，用中速搅拌至奶油色，然后可加入 30％的水和15％的油脂搅匀即可。 四、海绵蛋糕的灌模 蛋糕原料经调搅均匀后，一般应立即灌模进入烤炉烘烤。蛋糖调搅法应控制在15分钟之内，乳化法则可适当延长些时间。蛋糕的形状是由模具的形状来决定的。 1．模具的选择 蛋糕的成形一般都是借助于模具来完成的。一般常的用模具有马口铁、不锈钢、白铁皮、金属铝以及耐热玻璃材料制成。其形状圆形、长方形、花边形、鸡心形、正方形等。边沿还可分为高边和低边两种。选用时要依据蛋糕的配方不同、比重不同、内部组织状况的不同，灵活进行选择。海绵蛋糕因其组织松软，易于成熟而可以灵活地进行选择模具，一般可依据成品的形状来选择模具。 2．蛋糕糊灌模的要求 为了使烘烤的蛋糕很容易地从模具中取出，避免蛋糕黏附在烤盘或模具上，面糊在装模前必需使模具清洁，还要在模具四周及底部铺上一层干净的油纸，在油纸上还要均匀地涂上一层油脂。如能在油脂上撒一层面粉则效果更佳。 海绵蛋糕依据打发的膨松度和蛋糖面粉的比例不同而不同，一般以填充模具的七八成满为宜。在实际操作中，以烤好的蛋糕刚好充满烤盘，不溢出边缘，顶部不凸出，这时装模面糊容量就恰到好处。如装的量太多，烘烤后的蛋糕膨胀溢出，影响制品美观，造成浪费。相反，装的量太少，则在烘烤过程中由于水分过多地挥发而降低蛋糕的松软性。 五、海绵蛋糕的烘烤 1．正确设定蛋糕烘烤的温度和时间 烘烤的温度对所烤蛋糕的质量影响很大。温度太低，烤出的蛋糕顶部会下陷，内部较粗糙；烤制温度太高，则蛋糕顶部隆起，中央部分容易裂开，四边向里收缩，糕体较硬。通常烤制温度以180℃-220℃为佳。烘烤时间对所烤蛋糕质量影响也很大。正常情况下，烤制时间为30分钟左右。如时间短，则内部发黏，不熟；如时间长，则易干燥，四周硬脆。烘烤时间应依据制品的大小和厚薄来进行决定，同时可依据配方中糖的含量灵活进行调节。含糖高，温度稍低，时间长；含糖量低，温度则稍高，时间长。 2．蛋糕出炉处理 出炉前，应鉴别蛋糕成熟与否，比如观察蛋糕表面的颜色，以判断生熟度。用手在蛋糕上轻轻一按，松手后可复原，表示已烤熟，不能复原，则表示还没有烤熟。还有一种更直接的办法，是用一根细的竹签插入蛋糕中心，然后拔出，若竹签上很光滑，没有蛋糊，表示蛋糕已熟透；若竹签上粘有蛋糊，则表示蛋糕还没熟。如没有熟透，需继续烘烤，直到烤熟为止。 如检验蛋糕已熟透，则可以从炉中取出，从模具中取出，将海绵蛋糕立即翻过来，放在蛋糕架上，使正面朝下，使之冷透，然后包装。蛋糕冷却有两种方法，一种是自然冷却，冷却时应减少制品搬动，制品与制品之间应保持一定的距离，制品不宜叠放。另一种是风冷，吹风时不应直接吹，防止制品表面结皮。为了保持制品的新鲜度，可将蛋糕放在2℃-10℃的冰箱里冷藏。 六、海绵蛋糕质量标准 海绵蛋糕的质量标准是：表面呈金黄色，内部呈乳黄色，色泽均匀一致，糕体较轻，顶部平坦或略微凸起，组织细密均匀，无大气孔，柔软而有弹性，内无生心，口感不黏不干，轻微湿润，蛋味甜味相对适中。 总之，掌握了以上选料、配方、原理及制法后，你也可以做出一盘香喷喷的蛋糕来!浆果奶酪蛋糕 浆果汁： 红加仑400克 蓝莓400克 水50克 蛋糕浆： 奶油芝士千克 酸奶600克 浆果汁600克 蛋黄12个 鱼胶300克 淡奶油600克 蛋白12个 砂糖500克 蛋糕底： 蛋糕粉700克 玉米淀粉220克 砂糖220克 黄油450克 香草少许 镜面： 浆果汁250克 水250克 砂糖250克 鱼胶粉20克 夏威夷奶酪蛋糕 夏威夷糖果： 砂糖 200克 夏威夷果 450克 葡萄糖胶 150克 水 150克 黄油 240克 盐 5克 苏打粉 克 奶酪蛋糕： 奶油芝士 5千克 糖粉 千克 鸡蛋 30个 淡奶油 5千克 蛋糕底： 黄油 180克 棕糖 70克 蛋糕粉 330克 核桃碎 150克 蛋糕面： 黄油 120克 牛奶 340克 砂糖 1050克 黑巧克力 780克 烘烤过的夏威果 少许 蛋糕底： 蛋白 600克 砂糖 500克 棕糖 100克 杏仁粉 500克 饼粉 100克 脆米层： 牛奶巧克力 千克 榛子酱 千克 脆米 400克 巧克力慕司： 黑巧克力 千克 牛奶 650克 淡奶油 千克 巧克力汁： 淡奶油 350克 葡萄糖胶 350克 黑巧克力 500克 黄油 100克 黄油忌廉蛋糕 黄油 350克 蛋黄 12个 砂糖 210克 柠檬皮 3个 蛋糕粉 450克 玉米淀粉 300克 泡打粉 25克 蛋白 12个 砂糖 210克 奶油： 水 1升 速溶吉士粉 400克 黄油 400克 干果碎蛋糕 黄油 175克 砂糖 175克 干果粉 175克 蛋糕粉 175克 蛋黄 2个 鸡蛋 2个 泡打粉 3克 香草玉桂柠檬皮碎 少许 蛋糕碎 200克 草莓或树莓果占 300克 英式水果蛋糕 黄油 千克 砂糖 千克 杏仁膏 100克 鸡蛋 900克 蛋糕粉 千克 泡打粉 15克 樱桃 800克 杏仁粉 600克 杂果皮 400克 巧克力碎 600克 香草 少许 柠檬皮 5个 橙皮 5个
1.鸡蛋提前从冰箱取出，将蛋清、蛋黄分离，低筋面粉加入玉米淀粉、泡打粉、盐混合均匀，过筛备用；2.在蛋黄中加入20克白糖，搅打均匀，然后分3-4次加入色拉油、牛奶，搅打至蛋黄液体均匀、浓稠，没有油、水分离的现象；3.轻轻加入面粉，快速切拌均匀，液体不能出现面粉颗粒。此时可以将烤箱预热到180度；4.蛋清中加入柠檬汁，用打蛋器打出鱼眼形的大泡，然后加入20克白糖，剩余的40克白糖每搅打1-2分钟加入一次，分两次加入，直到蛋白硬性发泡。提起打蛋器，顶部的蛋白成三角状竖立，不会弯曲；5.取出1/3的蛋清和之前拌好的蛋黄混合，用橡皮刮刀切拌均匀，然后将混合好的面糊倒入蛋清中，迅速的切拌均匀；6.立即倒入蛋糕模子中，放入烤箱中层，用180度上下火烘烤40分钟，烤好后取出立即倒扣，晾凉后即可脱模；很多装饰类的蛋糕（奶油水果蛋糕）、奶酪蛋糕、幕斯蛋糕都会用戚风蛋糕做底衬，所以戚风蛋糕在甜点里比较基础和重要。方法二1、准备材料。面粉需要过筛，蛋白蛋黄分离，盛蛋白的盆要保证无油无水，最好使用不锈钢盆，用打蛋器把蛋白打到呈鱼眼泡状的时候，加入1/3的细砂糖(20克)。2、继续搅打到蛋白开始变浓稠，呈较粗泡沫时，再加入1/3糖。3、再继续搅打，到蛋白比较浓稠，表面出现纹路的时候，加入剩下的1/3糖。4、再继续打一会儿，当提起打蛋器，蛋白能拉出弯曲的尖角的时候，表示已经到了湿性发泡的程度。如果是做戚风蛋糕卷，蛋白打发到这个程度就可以了。但如果制作常规的戚风蛋糕，就还需要继续搅打。5、当提起打蛋器的时候，蛋白能拉出一个短小直立的尖角，就表明达到了干性发泡的状态，可以停止搅打了。6、蛋白打发的程度非常关键，打到干性发泡以后，就不要继续搅打了，如果搅打过头，蛋白开始呈块状，会造成戚风制作的失败。把打好的蛋白放入冰箱冷藏，开始制作蛋黄糊。7、把5个蛋黄加入30克细砂糖，用打蛋器轻轻打散。不要把蛋黄打发（如果蛋黄被打到颜色变浅，体积变大，就说明被打发了。蛋黄打发会导致戚风蛋糕成品中出现较大的孔洞，不够细腻）。8、依次加入40克色拉油和40克牛奶，搅拌均匀，再加入过筛后的面粉，用橡皮刮刀轻轻翻拌均匀。不要过度搅拌，以免面粉起筋。9、盛1/3蛋白到蛋黄糊中，用橡皮刮刀轻轻翻拌均匀(从底部往上翻拌，不要划圈搅拌，以免蛋白消泡)，翻拌均匀后，把蛋黄糊全部倒入盛蛋白的盆中，用同样的手法翻拌均匀，直到蛋白和蛋黄糊充分混合。10、混合好后的状态应该是比较浓稠均匀的浅黄色。将混合好的蛋糕糊倒入模具，抹平，用手端住模具在桌上用力震两下，把内部的大气泡震出来。11、入烤箱，170度，约1个小时即可。烤好后的蛋糕从烤箱里取出来，立即倒扣在冷却架上直到冷却。12、然后，脱模，切块即可享用(直接吃已经非常好吃了)。也可以用来制作各种裱花蛋糕。方法三原料：面粉、泡打粉、牛奶、糖、食用油1、没有低粉高粉，就用了普通的面粉 2、没有牛奶，用30克水冲的奶粉，凉了待用（1）5克糖倒入牛奶中，融化后待用（2）1克泡打粉倒入50克面粉把50克油倒入（1）中，搅拌一下，然后把（2）倒入，用刮刀或者筷子搅拌均匀，加入2个蛋黄，搅拌成蛋黄糊待用。因为是豆油所以颜色比较黄，色拉油就不会了。（2） 打蛋白时，分3次加入糖第一次：打出粗泡，放入10克糖，打蛋器打15秒第二次：泡沫细腻些，放入10克糖，打蛋器打15秒第三次：加入10克糖，打至干性发泡，装蛋白的盆子倾斜时，蛋白不会轻易滑落就差不多了。（3）蛋白打好后，将1/3的蛋白倒入蛋黄糊中，搅拌均匀这个时候可以150度预热烤箱。（4）把搅拌好的蛋黄糊倒入剩下的蛋白中，搅拌均匀。戚风蛋糕制作步骤戚风蛋糕制作步骤(5张)（5）快速倒入蛋糕模具中，放入烤箱150度上下火烤50分钟。（6）刚出炉的蛋糕。（7）出炉凉一会后，倒扣出来，就可以吃了。
索尔维制碱法与侯氏制碱法（也叫做氨碱法与联碱法） 无水碳酸钠，俗名纯碱、苏打。它是玻璃、造纸、肥皂、洗涤剂、纺织、制革等工业的重要原料，还常用作硬水的软化剂，也用于制造钠的化合物。它的工业制法主要有氨碱法和联合制碱法两种。 一、氨碱法（又称索尔维法） 它是比利时工程师苏尔维（1838～1922）于1892年发明的纯碱制法。他以食盐（氯化钠）、石灰石（经煅烧生成生石灰和二氧化碳）、氨气为原料来制取纯碱。先使氨气通入饱和食盐水中而成氨盐水，再通入二氧化碳生成溶解度较小的碳酸氢钠沉淀和氯化铵溶液。其化学反应原理是：NaCl＋NH3＋H2O＋CO2＝NaHCO3↓＋NH4Cl 将经过滤、洗涤得到的NaHCO3微小晶体，再加热煅烧制得纯碱产品。2NaHCO3＝Na2CO3＋H2O＋CO2↑放出的二氧化碳气体可回收循环使用。含有氯化铵的滤液与石灰乳[Ca(OH)2]混合加热，所放出的氨气可回收循环使用。CaO＋H2O＝Ca(OH)2，2NH4Cl＋Ca(OH)2＝CaCl2＋2NH3↑＋2H2O其工业生产的简单流程如图所示。 氨碱法的优点是：原料（食盐和石灰石）便宜；产品纯碱的纯度高；副产品氨和二氧化碳都可以回收循环使用；制造步骤简单，适合于大规模生产。但氨碱法也有许多缺点：首先是两种原料的成分里都只利用了一半——食盐成分里的钠离子（Na＋）和石灰石成分里的碳酸根离子（CO32－）结合成了碳酸钠，可是食盐的另一成分氯离子（Cl－）和石灰石的另一成分钙离子（Ca2＋）却结合成了没有多大用途的氯化钙（CaCl2），因此如何处理氯化钙成为一个很大的负担。氨碱法的最大缺点还在于原料食盐的利用率只有72％～74％，其余的食盐都随着氯化钙溶液作为废液被抛弃了，这是一个很大的损失。 二、联合制碱法（又称侯氏制碱法） 它是我国化学工程专家侯德榜（1890～1974）于1943年创立的。是将氨碱法和合成氨法两种工艺联合起来，同时生产纯碱和氯化铵两种产品的方法。原料是食盐、氨和二氧化碳——合成氨厂用水煤气制取氢气时的废气。其化学反应原理是：C＋H2O＝CO＋H2 CO＋H2O＝CO2＋H2 联合制碱法包括两个过程：第一个过程与氨碱法相同，将氨通入饱和食盐水而成氨盐水，再通入二氧化碳生成碳酸氢钠沉淀，经过滤、洗涤得NaHCO3微小晶体，再煅烧制得纯碱产品，其滤液是含有氯化铵和氯化钠的溶液。第二个过程是从含有氯化铵和氯化钠的滤液中结晶沉淀出氯化铵晶体。由于氯化铵在常温下的溶解度比氯化钠要大，低温时的溶解度则比氯化钠小，而且氯化铵在氯化钠的浓溶液里的溶解度要比在水里的溶解度小得多。所以在低温条件下，向滤液中加入细粉状的氯化钠，并通入氨气，可以使氯化铵单独结晶沉淀析出，经过滤、洗涤和干燥即得氯化铵产品。此时滤出氯化铵沉淀后所得的滤液，已基本上被氯化钠饱和，可回收循环使用。其工业生产的简单流程如图所示。 联合制碱法与氨碱法比较，其最大的优点是使食盐的利用率提高到96％以上，应用同量的食盐比氨碱法生产更多的纯碱。另外它综合利用了氨厂的二氧化碳和碱厂的氯离子，同时，生产出两种可贵的产品——纯碱和氯化铵。将氨厂的废气二氧化碳，转变为碱厂的主要原料来制取纯碱，这样就节省了碱厂里用于制取二氧化碳的庞大的石灰窑；将碱厂的无用的成分氯离子（Cl－）来代替价格较高的硫酸固定氨厂里的氨，制取氮肥氯化铵。从而不再生成没有多大用处，又难于处理的氯化钙，减少了对环境的污染，并且大大降低了纯碱和氮肥的成本，充分体现了大规模联合生产的优越性。
纯碱是最重要的基础化工原料之一,被称为“化工之母”,其产量和消费量通常被作为衡量一个国家工业发展水平的标志之一。本文从目前我国纯碱企业的发展现状着手,分析纯碱企业的存在问题,并对纯碱企业的发展提出一些建议,仅供参考。1纯碱工业的基本概况近年来,与中国经济在全球经济中呈现出一枝独秀一样,中国纯碱也在全球纯碱中发挥起越来越重要的作用,产能和需求的强劲增长,使全球纯碱产能和需求分别突破徘徊多年的45Mt和35Mt,到2003年底,世界纯碱的总产能约为,实际产量可达,而且在未来的几年间,世界纯碱的产能和需求仍…
工业制烧碱：氯碱工业--电解饱和食盐水，方程式：2NaCl+2H2O==2NaOH+Cl2+H2 (条件：电解) 制纯碱（Na2CO3）:侯氏制碱法向饱和食盐水里通二氧化碳和氨气 CaCO3==CaO+CO2（制CO2） N2+3H2==2NH3（工业合成氨） NaCL+NH3+CO2+H2O==NaHCO3+NH4CL（制纯碱的关键步走） 2NaHCO3==Na2CO3+H2O+CO2（得到纯碱）
以食盐（氯化钠）、石灰石（经煅烧生成生石灰和二氧化碳）、氨气为原料来制取纯碱。先使氨气通入饱和食盐水中而成氨盐水，再通入二氧化碳生成溶解度较小的碳酸氢钠沉淀和氯化铵溶液。其化学反应原理是：NaCl＋NH3＋H2O＋CO2＝NaHCO3↓＋NH4Cl 将经过滤、洗涤得到的NaHCO3微小晶体，再加热煅烧制得纯碱产品。2NaHCO3＝Na2CO3＋H2O＋CO2↑放出的二氧化碳气体可回收循环使用。含有氯化铵的滤液与石灰乳[Ca(OH)2]混合加热，所放出的氨气可回收循环使用。
氨碱法的优点是：原料（食盐和石灰石）便宜；产品纯碱的纯度高；副产品氨和二氧化碳都可以回收循环使用；制造步骤简单，适合于大规模生产。但氨碱法也有许多缺点：首先是两种原料的成分里都只利用了一半——食盐成分里的钠离子（Na＋）和石灰石成分里的碳酸根离子（CO32－）结合成了碳酸钠，可是食盐的另一成分氯离子（Cl－）和石灰石的另一成分钙离子（Ca2＋）却结合成了没有多大用途的氯化钙（CaCl2），因此如何处理氯化钙成为一个很大的负担。氨碱法的最大缺点还在于原料食盐的利用率只有72％～74％，其余的食盐都随着氯化钙溶液作为废液被抛弃了，这是一个很大的损失。