首页

> 学术期刊知识库

首页 学术期刊知识库 问题

基因编辑技术未来前景

发布时间:

基因编辑技术未来前景

如果基因可以编辑,我们可以把那些对人身体健康有影响的基因去除,这样人类就不用受病痛折磨。

关于目前人类对于自己本身的一个研究已经达到了炉火纯青的地步,但是我们对待生命来说很坐技术还有基因工程都被限制或者扼杀在摇篮当中,如果我们把这样的基因工程,这样的基因技术运用到现实生活当中的话。这对于我们人类来说,这是一场毁灭性的打击,一场浩劫。如果我们人类的基因可存在编辑的话,那么能给人类带来什么?这其中的答案主要有以下几点。

首先第一点就是关于如果我们人类的基因可以存在编辑的话那么人类的生物工程能够制造出奇形怪状的人类。因为我们可以把我们身体当中的一些较为劣质的基因给剪裁,重新换为一些较为优质的基因,而且把这样的基因内部进行突变或者进行变异,利用其他动物的一个基因进行替换,那么我们人类就会拥有较长的生命力。而且我们人类的一个形状也会发生一个较大的变化,例如我们有一些人会有4只眼睛一两张嘴巴或者8只手等等一些的情况。

其次就是我们人类的寿命也会大大提升,因为我们相信当人类的寿命可以提升之后,这对于我们人类来说会有很大的改观。那么医学上面的许多医学困难问题都能够很好的解决,例如这一次的一个大病毒大疫情爆发所带来的一个危机,通过基因编辑,那么我们就可能避免这一次的病毒侵扰。

最后就是关于我们人类的基因存在编辑技术的话,可能带来更多的浩劫,有些人为了不择手段,为了提升自己的一个生物能力,会进行不断的研究,让自己变得更强从而会导致生物本身的一个性质发生的变化。

β细胞是人体的胰岛素“工厂”。它们对升高的血糖作出反应,分泌出胰岛素,向肌肉细胞发出信号,以吸收并利用血液中的葡萄糖。

糖尿病患者的β细胞往往不能产生足够的胰岛素:对于2型糖尿病患者而言,是由于β细胞随着时间的推移而功能下降。对于1型糖尿病患者而言,是由于自身免疫系统发生故障,并攻击、损坏了β细胞。

在一些糖尿病患者中,β细胞衰竭是基因缺陷所导致的结果。在过去的十年里,研究人员发现基因代码中的少数几个地方,一旦发生微小的错误就会干扰身体感应或产生胰岛素的能力。其结果就是医学上所说的“单基因糖尿病”。

这种单基因突变导致的糖尿病远比人们所知的要多。美国纽约哥伦比亚大学Naomi Berrie糖尿病中心的干细胞生物学家Dieter Egli博士指出,大约1%到5%的糖尿病患者属于单基因糖尿病,在全球范围内这个数字以百万计,因此“单基因糖尿病”并不是一种罕见的疾病。

几十年来,替换失去功能的β细胞一直是治疗所有类型糖尿病的“圣杯”(注:代指具有神奇能力的事物)。研究人员已经尝试了从移植胰腺到植入β细胞的多种方法,但是,这些手术的成本很高,因为它们是外来器官、细胞,身体会排斥它们,控制这种免疫排斥反应需要借助强大的免疫抑制药物,或是用某种方法将所移植的β细胞“封装”起来,以瞒过自身免疫系统。

由于单基因糖尿病是单一基因缺陷或突变的结果,新的基因技术为单基因糖尿病患者提供了治愈的希望,甚至一些2型糖尿病患者也有望获得治愈。在美国糖尿病协会(American Diabetes Association,ADA)的资助下,Dieter Egli博士和他的科研团队正在进行单基因糖尿病的研究,特别是对于一些出生时或出生不久后身体就不能产生胰岛素的病例,他们制造出干细胞,借由干细胞再制造某些特定的人体组织,包括β细胞、神经组织等。

然后,他们使用了一种名为“CRISPR-Cas9”的尖端技术,来修复那些阻止β细胞正常工作的基因错误 [1] 。在过去的一年里,这项研究取得了可喜的成果,他们已经能够纠正干细胞的突变,使β细胞重新产生胰岛素。

下一步预期,可将经过修正的 β细胞 重新植入患者体内。因为它们来源于患者自身的细胞,所以可以被身体接受而不需要应用免疫抑制药物,植入后预计能像正常β细胞那样对血糖水平做出反应,并且产生胰岛素。

然而,基因编辑所依托的科学技术太前沿了,以至于还没有被美国食药监局(FDA)批准用于人体试验。为了观察新的β细胞是否能起作用,Dieter Egli博士将修正后的人类β细胞植入β细胞受损的实验动物体内。人们欣喜地看到,通过将β细胞移植到小鼠体内,可以保护缺乏 β细胞 的小鼠免于罹患糖尿病。

Dieter Egli博士说,如果能将修正后的β细胞安全地植入患有单基因糖尿病的人体内,那就相当于治愈了糖尿病。

在基因编辑技术应用于人类之前,还有很多工作要做。一些研究者担心,用于编辑基因突变的技术可能会在其他地方引起意想不到的“偏离目标”的影响。Egli博士表示,“利用老鼠模型是一个很好的开始,但是只有在人类身上进行尝试,我们才能最终得到答案。”

即使Egli博士和其他领域的研究人员能够证明这种基因治疗是安全的,与试纸、血糖仪和胰岛素注射相比,要获得好的成本-效益比,可能还需要一些时间。虽然到那时,患者不再需要支付胰岛素、口服降糖药和其他血糖管理用品的费用,但预计个性化干细胞治疗也可能会花费每位患者数万美元,甚至更多。

据了解,目前在国内也有一些学者在进行相关研究 [2] 。因此,笔者愿意乐观地相信,随着研究的深入、技术的成熟和普及,这种可能会治愈糖尿病的新疗法将会有走出实验室、走近你我身边的那一天。让我们一同拭目以待,继续关注来自这一领域的好消息吧!

参考文献:

[1] Hasegawa Y, Hoshino Y, Ibrahim AE, et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in Ins1-cre driver mice[J]. Exp Anim, 2016,65(3):319-327.

[2] 曹曦,宋丽妮,张怡尘,等. 应用CRISPR/Cas9技术制备MrgD基因敲除小鼠模型[J]. 首都医科大学学报,2018,39(4):517-521.

基因编辑技术

基因编辑是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术。目前最高效最常用的基因编辑方法是利用CRISPR/Cas9技术进行体内体外的基因编辑。这个系统的原理是利用gRNA特异性识别靶序列,并引导Cas9核酸内切酶对靶序列的PAM上游进行切割,从而造成靶位点DNA双链断裂,随之利用细胞的非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HDR)的方式对切割位点进行修复,实现DNA水平的敲除、敲入或点突变。

基因编辑技术形式有:

1、同源重组

同源重组(Homologous recombination)是最早用来编辑细胞基因组的技术方法。同源重组是在DNA的两条相似(同源)链之间遗传信息的交换(重组)。

2、核酸酶

基因编辑的关键是在基因组内特定位点创建DSB。常用的限制酶在切割DNA方面是有效的,但它们通常在多个位点进行识别和切割,特异性较差。为了克服这一问题并创建特定位点的DSB。

基因编辑技术的应用:

基因编辑和牛体外胚胎培养等繁殖技术结合,允许使用合成的高度特异性的内切核酸酶直接在受精卵母细胞中进行基因组编辑。 CRISPR -Cas9进一步增加了基因编辑在动物基因靶向修饰的应用范围。CRISPR-Cas9允许通过细胞质直接注射从而实现对哺乳动物受精卵多个靶标的一次性同时敲除(KO)。

单细胞基因表达分析已经解决了人类发育的转录路线图,从中发现了关键候选基因用于功能研究。使用全基因组转录组学数据指导实验,基于CRISPR的基因组编辑工具使得干扰或删除关键基因以阐明其功能成为可能。

以上内容参考:百度百科—基因编辑技术

什么是基因编辑?

什么是基因编辑技术

基因编辑技术的参考文献

“上帝的手术刀”对海洋生物做了啥? 今年的诺贝尔化学奖颁发给了两位女科学家——埃马纽埃尔·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)和詹妮弗·杜德纳(Jennifer A. Doudna),以表彰她们开发了被誉为“上帝的手术刀”“基因魔剪”的CRISPR/Cas9基因编辑技术。今年的诺贝尔化学奖得主 CRISPR即成簇的规律性间隔排列的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat )。Cas是CRISPR关联基因(CRISPR associated gene)的缩写。 CRISPR最初由日本科学家在大肠杆菌中发现,后来被证明广泛存在于约45%的细菌和约90%的古细菌中,是其抵御噬菌体入侵的重要武器。 当噬菌体第一次侵染细菌时,细菌的Cas1和Cas2蛋白会将噬菌体的一小段DNA片段整合到自己的重复序列区中,成为一个新的间隔序列。待同一种噬菌体再次来袭时,病毒DNA被间隔序列转录的guide RNA识别,并激活Cas核酸酶,切断噬菌体的DNA双链,从而守护自身安全。利用此原理,科学家们可以实现对研究对象某一特定序列的靶向敲除、敲入等。CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9系统可分为三类,其中CRISPR/Cas9结构和操作更简洁,由guide RNA引导Cas9核酸内切酶进行靶向基因编辑,自2013年首次运用到真核生物基因编辑以来,发展迅速,曾于2013年、2015年两次被Science杂志评为当年十大科学突破,且今年终于不负众望,摘得诺奖桂冠。 目前关于CRISPR基因编辑技术的报道多集中于人类医学(处于实验室研究阶段)和线虫、拟南芥、果蝇、斑马鱼、小鼠等模式生物。那么,这把“上帝的手术刀”在海洋生物中的应用取得了哪些进展呢?构建海洋模式生物与疾病模型 将CRISPR基因编辑技术运用于海洋生物的最早报道可追溯至2014年。这一年,Sasaki、Stolfi等人均以海洋模式生物——玻璃海鞘(Ciona intestinalis)为研究对象,利用CRISPR技术先后实现了Hox基因定位和ebf基因定点突变。 Hox基因是一种动物基因组内高度保守的发育调控基因,在动物体轴形成过程中起重要的作用。ebf基因可在胚胎发育过程中决定细胞命运。这两种基因突变的玻璃海鞘模型可用于探究脊索动物身体形成的分子机制。 2016年,Nymark等将CRISPR技术运用到了海洋藻类中, 成功敲除了三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的CpSRP54基因。 CRISPR技术为海洋生物模型构建提供了新的视角,加快了科学家们探秘海洋生物起源与进化的步伐。培育海洋经济新品种 海产鱼虾贝蟹是我们饮食中重要的蛋白质来源,而良种的培育能促进海水养殖业快速发展。利用基因编辑技术在新品种培育中具有诸多优势,如育种周期短、靶向性强、比转基因技术安全性高等,有着广阔的应用前景。 2019年,Kim等将肌生成抑制素(PoMSTN)基因相关基因编辑组件通过显微注射导入牙鲆(Paralichthys olivaceus)胚胎中,经过筛选,得到了杂合双等位基因突变体,表现为身体增厚,肉质更加肥满。与野生型(左)相比,PoMSTN基因杂合突变的牙鲆(右)的肥满度增加(图片来自Kim等,2019) 今年,来自河北大学的研究者们利用CRISPR/Cas9技术敲除了脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)的类胡萝卜素异构加氧酶(EcNinaB-X1)基因,发现突变体在受到副溶血性弧菌或嗜水弧菌的攻击时存活率明显高于野生型;又敲除了另一个类胡萝卜素加氧酶基因EcBCO2,突变体具有更高的抗病性。这些研究发现为培育抗病抗逆对虾新品种提供了新思路。解析海洋生物基因功能 解密基因的功能是解读生命这部“天书”的先决条件,基因编辑技术为科学家们提供了一个解密的绝妙手段。2014 年,Nakanishi等人将CRISPR 技术首次运用于甲壳动物,失活了大型溞(Daphnia magna)的pax6 基因,证明了该基因在眼发育中的关键作用。2019年,Liu等人成功敲除海胆的聚酮化合物合酶1基因(Psk1),突变个体从表现为白化。野生型(左)与Pks1基因敲除的白化海胆(右)(从3个月至成年) 需要承认,基因编辑技术在海洋生物的应用仍处于初级阶段,受到海洋生物材料本身问题(如显微注射后的受精卵孵化率有待提高、海洋生物细胞系数目较少等)、CRISPR系统脱靶问题等方面的制约。但毫无疑问,海洋生物基因编辑领域的前途是光明的,我们有理由相信科研工作者们会不断创新,成功解决上述问题,取得海洋生物基因编辑领域的一个又一个成就!参考文献Doudna J A, Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9[J]. Science, 2014, 346(6213): J, Cho J Y, Kim J W, et al. CRISPR/Cas9-mediated myostatin disruption enhances muscle mass in the olive flounder Paralichthys olivaceus[J]. Aquaculture, 2019, 512: D, Awazu A, Sakuma T, et al. Establishment of knockout adult sea urchins by using a CRISPR‐Cas9 system[J]. Development, Growth & Differentiation, 2019, 61(6): 378-388.

β细胞是人体的胰岛素“工厂”。它们对升高的血糖作出反应,分泌出胰岛素,向肌肉细胞发出信号,以吸收并利用血液中的葡萄糖。

糖尿病患者的β细胞往往不能产生足够的胰岛素:对于2型糖尿病患者而言,是由于β细胞随着时间的推移而功能下降。对于1型糖尿病患者而言,是由于自身免疫系统发生故障,并攻击、损坏了β细胞。

在一些糖尿病患者中,β细胞衰竭是基因缺陷所导致的结果。在过去的十年里,研究人员发现基因代码中的少数几个地方,一旦发生微小的错误就会干扰身体感应或产生胰岛素的能力。其结果就是医学上所说的“单基因糖尿病”。

这种单基因突变导致的糖尿病远比人们所知的要多。美国纽约哥伦比亚大学Naomi Berrie糖尿病中心的干细胞生物学家Dieter Egli博士指出,大约1%到5%的糖尿病患者属于单基因糖尿病,在全球范围内这个数字以百万计,因此“单基因糖尿病”并不是一种罕见的疾病。

几十年来,替换失去功能的β细胞一直是治疗所有类型糖尿病的“圣杯”(注:代指具有神奇能力的事物)。研究人员已经尝试了从移植胰腺到植入β细胞的多种方法,但是,这些手术的成本很高,因为它们是外来器官、细胞,身体会排斥它们,控制这种免疫排斥反应需要借助强大的免疫抑制药物,或是用某种方法将所移植的β细胞“封装”起来,以瞒过自身免疫系统。

由于单基因糖尿病是单一基因缺陷或突变的结果,新的基因技术为单基因糖尿病患者提供了治愈的希望,甚至一些2型糖尿病患者也有望获得治愈。在美国糖尿病协会(American Diabetes Association,ADA)的资助下,Dieter Egli博士和他的科研团队正在进行单基因糖尿病的研究,特别是对于一些出生时或出生不久后身体就不能产生胰岛素的病例,他们制造出干细胞,借由干细胞再制造某些特定的人体组织,包括β细胞、神经组织等。

然后,他们使用了一种名为“CRISPR-Cas9”的尖端技术,来修复那些阻止β细胞正常工作的基因错误 [1] 。在过去的一年里,这项研究取得了可喜的成果,他们已经能够纠正干细胞的突变,使β细胞重新产生胰岛素。

下一步预期,可将经过修正的 β细胞 重新植入患者体内。因为它们来源于患者自身的细胞,所以可以被身体接受而不需要应用免疫抑制药物,植入后预计能像正常β细胞那样对血糖水平做出反应,并且产生胰岛素。

然而,基因编辑所依托的科学技术太前沿了,以至于还没有被美国食药监局(FDA)批准用于人体试验。为了观察新的β细胞是否能起作用,Dieter Egli博士将修正后的人类β细胞植入β细胞受损的实验动物体内。人们欣喜地看到,通过将β细胞移植到小鼠体内,可以保护缺乏 β细胞 的小鼠免于罹患糖尿病。

Dieter Egli博士说,如果能将修正后的β细胞安全地植入患有单基因糖尿病的人体内,那就相当于治愈了糖尿病。

在基因编辑技术应用于人类之前,还有很多工作要做。一些研究者担心,用于编辑基因突变的技术可能会在其他地方引起意想不到的“偏离目标”的影响。Egli博士表示,“利用老鼠模型是一个很好的开始,但是只有在人类身上进行尝试,我们才能最终得到答案。”

即使Egli博士和其他领域的研究人员能够证明这种基因治疗是安全的,与试纸、血糖仪和胰岛素注射相比,要获得好的成本-效益比,可能还需要一些时间。虽然到那时,患者不再需要支付胰岛素、口服降糖药和其他血糖管理用品的费用,但预计个性化干细胞治疗也可能会花费每位患者数万美元,甚至更多。

据了解,目前在国内也有一些学者在进行相关研究 [2] 。因此,笔者愿意乐观地相信,随着研究的深入、技术的成熟和普及,这种可能会治愈糖尿病的新疗法将会有走出实验室、走近你我身边的那一天。让我们一同拭目以待,继续关注来自这一领域的好消息吧!

参考文献:

[1] Hasegawa Y, Hoshino Y, Ibrahim AE, et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in Ins1-cre driver mice[J]. Exp Anim, 2016,65(3):319-327.

[2] 曹曦,宋丽妮,张怡尘,等. 应用CRISPR/Cas9技术制备MrgD基因敲除小鼠模型[J]. 首都医科大学学报,2018,39(4):517-521.

crispr基因编辑

CRISPR的全称Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,意为成簇规律间隔短回文重复序列,Cas则是CRISPR-associated (Cas) systems。 CRISPR/Cas 系统是原核生物的免疫系统,这个系统可以识别出外源 DNA,并将它们切断,沉默外源基因的表达,用来抵抗外源遗传物质比如噬菌体病毒和外源质粒的入侵。这与真核生物中RNA干扰(RNAi)的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能,CRISPR/Cas 系统被开发成一种高效的基因编辑工具。在自然界中,CRISPR/Cas系统拥有多种类别,其中 CRISPR/Cas9 系统是研究最深入,应用最成熟的一种类别。 CRISPR/Cas9 利用一段小 RNA 来识别并剪切 DNA 以降解外来核酸分子。现在使用的 CRISPR/cas 9 系统是由最简单的 type II CRISPR 改造而来,该系统由单链的 guide RNA 和有核酸内切酶活性的 Cas 9 蛋白构成。 ⚠️nature video视频: CRISPR: 基因编辑原理及应用 基因敲除:sgRNA+Cas9 基因敲入:sgRNA+Cas9+目的基因(HDR模版) 5‘端开始数20个碱基这一段是需要设计的,这一段用来识别目的基因上的靶标,并通过碱基互补配对原理与靶点位置结合。 gRNA再往后数76个碱基,是另一段transactiviting RNA (tracrRNA)。它的序列是一定的,就像转运RNA一样可以形成空间结构,然后就可以和Cas9酶相结合。 这样一条完整的gRNA就可以识别靶点,并且把与它自身结合的Cas9酶带到这个靶点,引导Cas9酶在靶点处对目的基因的双链DNA进行切断,从而达到基因编辑的目的。 目前又很多在线工具可以用于设计sgRNA 不同的导入方式基因标记效率和脱靶效率不同 参考: CRISPR实验究竟怎么做?手把手教给你 CRISPR/Cas9 基因编辑全套操作和解决方案(TAKARA 讲解)

CRISPR技术再分子生物学发挥重要的作用,许多细菌免疫复合物都相对复杂,其中科学家掌握了对一种蛋白Cas9的操作技术,并先后对多种目标细胞DNA进行切除。CRISPR/Cas9基因编辑系统具有非常精准、廉价、易于使用,并且非常强大的特点。其迅速成为生命科学最热门的技术;给科研工作者提供暨大帮助。

[](javascript:void(0);)

|

CRISPR/Cas系统是细菌和古菌特有的一种天然防御系统,用于抵抗病毒或外源性质粒的侵害。当外源基因入侵时,该防御系统的 CRISPR 序列会表达与入侵基因组序列相识别的 RNA,然后 CRISPR 相关酶(Cas)在序列识别处切割外源基因组DNA,从而达到防御目的。

根据Cas蛋白的特点,可将CRISPR/Cas系统分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系统需要借助复杂的蛋白复合体发挥作用,Ⅱ型系统仅借助 Cas9蛋白和sgRNA即可对靶目标进行编辑,结构简单,操作容易,因此目前主要使用Ⅱ型CRISPR/Cas9 系统。

CRISPR/Cas自诞生以来,迅速发展,已经成为生命科学领域最耀眼、最有前景的技术。尤其是近两年,在全世界科学家的共同努力下,CRISPR/Cas相关新进展新突破不断涌现。

一、基因编辑技术的发展史

基因编辑可以分为三代,第一代:ZFN;第二代:TELEN;第三代:CRISPR/Cas。这三个基因编辑技术都利用了DNA修复机制,所以我们先来了解一下DNA修复机制( 图1 )。[图片上传失败...(image-8dab49-1625385468208)]

图1-NHEJ修复(左),HDR修复(右)

NHEJ(Non-homologous end joining)

非同源性末端接合

NHEJ修复机制不需要任何模版,修复蛋白直接将双股裂断的DNA末端彼此拉近,在DNA连接酶的帮助下重新接合( 图1 )。

HDR(Homology directed repair)

同源重组修复

当细胞核内存在与损伤DNA同源的DNA片段时,HDR才能发生。

NHEJ的机制简单又不依靠模版,因而NHEJ的活性相对于HDR高出许多。但NHEJ修复出错的概率较高,容易造成移码突变等,基因编辑正是利用了这一点( 图1 )。

的识别切割机制

融合锌指模块和FokI切割结构域形成ZFN ;以二聚体的形式靶向切割每个锌指结构;特异识别3个碱基 ;组装多个锌指结构(识别12-18bp)形成的ZFN对可特异切割基因组靶点 ( 图2 )。

[图片上传失败...(image-3f1d8d-1625385468209)]

图2-ZFN基因编辑原理图

的识别切割机制

两个TALE靶向识别靶点两侧的序列;每个TALE融合一个FokI内切酶结构域;FokI通过TALE靶向形成二聚体切割靶点;设计灵活识别特异性强( 图3 )。

[图片上传失败...(image-6dcfc-1625385468209)]

图3-TELEN基因编辑原理图

的识别切割机制

crRNA通过碱基配对与 tracrRNA结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物,此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA( 图4 )。

[图片上传失败...(image-c85235-1625385468209)]

图4-CRISPR/Cas9基因编辑原理图

ZFN、TELEN、CRISPR/Cas9比较

[图片上传失败...(image-dd6344-1625385468209)]

图5-三种基因编辑的比较

二、CRISPR/Cas技术的介绍

CRISPR/Cas9 系统的发现

1987年,在大肠杆菌的基因组中首次发现了一个特殊的重复间隔序列——CRISPR序列,随后,在其他细菌和古菌中也发现了这一特殊序列。

2005年,发现这些CRISPR序列和噬菌体的基因序列匹配度很高,说明CRISPR 可能参与了微生物的免疫防御。

2011年,CRISPR/Cas系统的分子机制被揭示:当病毒首次入侵时,细菌会将外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的间隔区;病毒二次入侵时,CRISPR 转录生成 前体crRNA (pre-crRNA), pre-crRNA 经过加工形成含有与外源基因匹配序列的crRNA,该crRNA与病毒基因组的同源序列识别后,介导 Cas 蛋白结合并切割,从而保护自身免受入侵。

2013年,发现CRISPR/Cas9系统可高效地编辑基因组。随后张锋等使用CRISPR系统成功的在人类细胞和小鼠细胞中实现了基因编辑。

从此开始,CRISPR/Cas9技术给生命科学领域带来了巨大冲击,CRISPR/Cas9相关研究成果频频登上CNS等顶级期刊,近两年更是成为诺贝尔奖热门候选。

CRISPR/Cas技术的原理

CRISPR/Cas9系统的工作原理是 crRNA( CRISPR-derived RNA )通过碱基配对与 tracrRNA(trans-activating RNA )结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物,此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计 crRNA 和 tracrRNA 这两种 RNA,改造成具有引导作用的sgRNA (single guide RNA ),从而引导 Cas9 对 DNA 的定点切割(图4)。

CRISPR/Cas技术的优势

设计简单,简明的碱基互补设计原则,识别不受基因组甲基化影响,能靶向几乎任意细胞任意序列,方便同时靶向多个靶点,切割效率高。

三、CRISPR/Cas的脱靶效应

PAM**** (Protospacer adjacent motif )

前间区序列邻近基序

PAM序列区是CRISPR/Cas9系统行使切割功能的基本条件。如果靶序列 3′端没有PAM序列,即使靶序列与sgRNA序列完全匹配,Cas9蛋白也不会切割该序列位点。 PAM序列主要影响CRISPR/Cas9的DNA切割效率。在细胞水平上,NGG介导的切割效率是最高的。

sgR****NA ****(Single guide RNA )

向导 RNA

sgRNA与目标基因组相结合的 20nt 序列区决定着 CRISPR/Cas 系统的靶向特异性。CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性其实主要依赖于sgRNA与靠近PAM区的10~12 bp的碱基配对,而其余远离PAM序列 8~10 bp 碱基的错配对靶位点识别的影响并不明显。目前研究结果均提示,可能靠近 PAM 的 8~14 bp 序列是决定特异性的关键,其他序列也均在不同程度上影响脱靶效应。

CRISPR/Cas9的脱靶效应给研究带来了一定程度上的不确定性,也是限制其发挥更大潜力的主要原因之一。

2017年5月30日, Nature 杂志子刊 Nature Methods 刊登了美国哥伦比亚大学研究人员的一篇文章,研究人员通过CRISPR/Cas9成功修复了导致小鼠失明的基因后,对小鼠进行全基因测序,发现修复后的小鼠基因组有超过1500个单核苷酸突变,以及超过100个位点发生大片段插入或缺失( 图6 )。文章的结论无疑引发了巨大震动,也给正在进行中的CRISPR/Cas9带来了不确定性。

[图片上传失败...(image-f21b76-1625385468208)]

图6--动物体内实验中CRISPR/Cas9编辑后发生意想不到的突变

仔细分析后,发现该文章并不十分严谨,文章仅有两只小鼠作为实验组,一只作为对照组,数量不足以证明结论是否只是个例。而且单碱基突变是生物体内自然现象,不能全归于CRISPR/Cas9。整个实验只基于一个sgRNA数据,且该sgRNA特异性评分很低,造成脱靶效应也应该在预料之中( 图7 )。

[图片上传失败...(image-751d94-1625385468208)]

图7--针对 Nature Methods 文章的回应

经过一系列的研究和改进,目前CRISPR系统的脱靶性已经很低,当然,要想达到理想的状态,还有很长的路要走。

四、CRISPR/Cas技术的进展

2016年6月,张锋在 Science 发表文章,发现CRISPR/Cas13a能有切割细菌的特定RNA序列。

2016年9月,Jennifer Doudna在 Nature 发表文章,证实CRISPR/Cas13a可以用于RNA检测。

2017年2月22日,美国纪念斯隆.凯特林癌症中心(MSK)研究人员在 Nature 杂志发文,使用腺相关病毒(AAV)介导,将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于CAR-T疗法。该研究既解决了传统CAR-T疗法的随机整合可能存在的潜在危害,又大大降低了CAR-T细胞发生分化或癌化的风险,赋予了CAR-T技术全新的高效性、稳定性、安全性。

2017年8月2日,Shoukhrat Mitalipov在 Nature 发表长文,使用CRISPR/Cas9技术修正了植入子宫前的人类胚胎中一种和遗传性心脏病有关的变异。该研究证实了通过编辑人类胚胎进行治疗遗传病是安全可行的。值得一提的是,该成果受到了基因编辑领域大牛George Church等人的质疑。

2017年8月11日,杨璐菡等在 Science 发表文章,通过CRISPR/Cas9技术敲除猪基因组中的内源逆转录病毒(PERV)序列,并克隆出多只PERV失活小猪。向最终实现使用猪器官进行人体器官移植的终极目标迈进了一大步。

2017年9月,杂交水稻之父”袁隆平院士宣布使用CRISPR/Cas9技术敲除与镉吸收和积累相关基因的水稻育种成功。该研究从根本上解决了水稻镉污染的问题,将扭转我国部分农作物重金属超标的问题,进而改善部分人群重金属慢性中毒的问题。

2017年10月4日,张锋在 Nature 发表论文证实CRISPR/Cas13a能够在哺乳动物细胞中编辑特定的RNA。CRISPR/Cas13a能够达到RNAi相似的降低基因表达的效率,而且有更强的特异性,且对细胞内天然的转录后调控网络的影响更小。

2017年10月19日,Jennifer Doudna在 Nature 发表文章,设计了高精确性的Cas9变体—HypaCas9。该研究极大地降低了Cas9的脱靶效应,且不降低靶向切割效率。

2017年10月25日,张锋在 Science 发表文章介绍CRISPR新系统--REPAIR,可以高效的进行RNA的单碱基修复。因为不改变DNA序列,所以为通过基因编辑治疗遗传病而又不永久影响基因组提供了新可能。

2017年10月25日,哈佛大学Broad研究所的David Liu实验室在 Nature 发表长文,报道了新型腺嘌呤基因编辑器——ecTadA-dCas9,可以将A·T碱基对转换成G·C碱基对,该技术首次实现了不依赖DNA断裂即可进行基因编辑的技术,即单碱基基因编辑技术。该技术高于其它基因组编辑方法的效率,且几乎没有随机插入、删除或其它突变等不良副作用,因此为今后大范围治疗点突变遗传疾病提供了极大的便利。

五****、展望

近几年CRISPR/Cas基因编辑技术飞速发展,推广应用到了生物、医学、农业以及环境等多个领域,造就了一批批科研奇迹,尤其是在遗传病的治疗、疾病相关基因的筛查与检测、肿瘤治疗以及动植物的改造、病原微生物防治等领域有着巨大的潜力,也将深远地影响整个世界。

特别感谢:BioArt主编给予的帮助和意见以及吉满生物吴晨提供图1-图5的图片。

|

| |

重写生命的“剪刀”被发现,剪断基因重新组合,脑洞之大你敢信?但却有人做到了,改变生命的链接,一起来看本期的“剪刀”-CRISPR/Cas9基因编辑技术。

基因编辑技术及研究进展论文

这部文章中主要是通过DNA基因技术对核酸进行研究。这项技术与NgAgo之间有没有直接的联系,Ago相关的工具研究一直持续了6年之久,韩春雨目前已经是副教授级别,这个争议即使已经争议6年之久,但仍然没有得到一个很好的结果。

几年前,国外发明了一种新的基因改造技术,国内也有广泛应用,但国内外都只限使用于动植物(无论体细胞还是性细胞)或人类的体细胞。限于伦理问题以及一些国家的法律明文禁止,一直无人改造人类性细胞的基因。

这一状况,于4月18日被我国中山大学生物学副教授黄军就及其合作者打破。他们在世界上首次报道了改造人类性细胞基因后获得早期胚胎。一石激起千层浪,该研究引发的担忧近日不断发酵。

这一技术进展为何会引发巨大的伦理争议?基因技术一旦应用于性细胞,不仅可能出现基因的“私人定制”,而且可以影响很多代,甚至人类进化。《赛先生》将对此刊发多篇文章,欢迎不同意见投稿。在今天刊发的首篇文章中,中科院生物物理研究所助理研究员王承志认为,这一技术进展打开了“潘多拉魔盒”,引起的后果可能无法预料。

王承志(中科院生物物理研究所助理研究员)

4月18日,中山大学生物学副教授黄军就带领的研究组在Protein & Cell杂志发表论文,在世界上首次报道了使用基因编辑技术改造人类胚胎的研究进展。在这项研究中,该研究小组对人三原核受精卵中的HBB基因(编码红细胞珠蛋白)进行了改造。一石激起千层浪,国际科学界对该研究做出了迅速而态度迥异的反应,该研究引发的伦理担忧也在不断发酵。

遗传病:无尽的缺陷

在黄军就课题组发表的论文中,他们改造了受精卵中编码珠蛋白的HBB基因,该基因的突变会导致一种常见的遗传疾病——β地中海贫血。

这种疾病可导致严重贫血、发育不良、骨骼改变,甚至引起新生儿死亡。而类似的遗传疾病还有很多,它们中的很大一部分是家族性遗传。这些疾病一代又一代地折磨着整个家族,就像他们的祖先中了某种不可解的诅咒。

20世纪之前,人们对这些疾病的认识还非常肤浅,几乎毫无对策。让其雪上加霜的是,近亲结婚的风气在古代的东西方都非常盛行。16世纪,显赫一时的西班牙哈布斯堡王朝继承人查尔斯二世,因其家族长期近亲结婚而身患多种遗传疾病,特别是因生理缺陷而没有子嗣,进而最终导致了哈布斯堡王朝的迅速衰落。中国古代的近亲结婚也时常发生,比较著名的例子是汉武帝和其皇后陈阿娇是表亲。

显而易见,近亲结婚导致遗传缺陷基因在家族中不断继承并累积,而不同遗传背景的人通婚则会不断“稀释”遗传缺陷基因。但即使父母双方只有一个人的一条染色体含有某遗传缺陷基因,其后代继承该基因的可能性依然高达二分之一。显然,如果要在一个家族中彻底杜绝一种遗传病,就必须保证出生的所有婴儿都不携带患病基因,而生理条件下体内受精过程是随机的。

2014年,北京大学乔杰、谢晓亮和汤富酬研究组合作,利用极体的单细胞测序技术帮助一对患有遗传病的夫妇,体外选择了不含有致病基因和已知突变的胚胎,从而让他们的宝宝完全摆脱了“家族魔咒”。这是遗传病学历史上“里程碑”式的突破,让人类第一次在个体水平上终结了其家族的致病基因。

这项工作与黄军就团队的工作的区别,在于这只是一个人工选择受精胚胎的过程,并不触及人为改造胚胎基因的伦理红线。而这根红线,却不啻人类与“造物主”的分隔线。越过它,人类就可能进入改造自身物种的另一个世界。

基因改造:“上帝”之手

人类对于自身从哪里来,以及自身为何是人类这种问题的思考大概从未停止过,因为不同的文化中都能找到一个相似的故事:一位(或多位)具有超能力的“神”创造出了所有的物种,包括人。这些不同文化背景的神话故事中还能找到另外一些相似的故事,比如都有一些“神”能够改造现有的物种,如古希腊神话中雅典娜将美杜莎的长发改造成毒蛇,日本神话中甚至有邪鬼蛊惑一位男人种下其爱人头颅而得到人面树的传说。可见,人类的想象力已经可以跨界改造生物了。

事实上,人类对于改造物种的渴求一直存在并不断实践着。今天,和人类关系密切的动植物,从办公室中的盆栽到家里养的宠物,再到作为食物的各种畜牧动物,几乎都是人类通过各种育种方法改造(主要是通过杂交)而来,而这一切背后的原理直到上个世纪才被人类认识。

今天,关于生物性状两个最基本的知识几乎已变为常识:一切生物的性状都由基因决定;基因的本质是脱氧核糖核酸(DNA)序列。当人类窥探到了造物的奥秘以后,不可避免的事情即将发生:人类想改造自己。

人类是想改造自己的,从越来越风靡的整形医院就能看出来,但人类从未在基因层面上改造过自己。自从“双螺旋结构”的大门打开以后,人类对DNA的操作越来越随心所欲。限制性内切酶、连接酶、修饰酶等工具不断被发现和改造,科学家可以在试管中将DNA片段像乐高积木一样任意拼接;聚合酶链式反应、DNA合成技术和DNA测序技术使得科学家可以阅读并创造新的DNA序列;细胞内同源重组现象的发现使得科学家可以对细胞内的DNA进行编辑:首先是原核生物如大肠杆菌,随后低等的真核生物如酵母也被攻克,然后果蝇、斑马鱼、老鼠等一系列模式生物也都被科学家逐一“拿下”。

2013年,CRISPR-Cas9技术的问世,使得基因改造成为一项成本极其低廉,操作极其简单的事情,任何一个有基本分子生物学背景的学生都能在很短时间内学会并操作。至此,“上帝之手”仿佛已经掌握在人类手中:我们有能力改造人体细胞内的基因,甚至改变胚胎的基因而得到我们想要的个体。

配合美好的想象,技术可以让一切听上去都美好起来。科学界对于基因改造(业内人士称为基因编辑)技术也开始狂热起来,好消息接二连三地传来:科学家成功清除了艾滋病毒潜伏的细胞模型中的病毒DNA、科学家成功敲除了癌症细胞的致癌基因、科学家成功在人类干细胞中修改了遗传缺陷……科学家好像已经无所不能,只差将最后那扇门轻轻推开。

变种人:潘多拉魔盒?

电影《X战警》想象了由于基因进化人类出现了各种变种人,而变种人与普通人的冲突将世界带入各种灾难之中。基因编辑技术的成熟,使得基因可以人为被“进化”,从而可能让某些电影中的假想情节变为事实。

试想,如果人类胚胎基因可以被任意编辑,那么首先多种遗传疾病将可以被彻底根除,但人类并不会满足于此,因为人类还希望获得“更好”的基因。比如有些父母可能会希望孩子拥有“更聪明”“更健康”“更漂亮”等等的基因。基因技术一旦应用于胚胎,就可能出现基因的“私人定制”。正如整容技术最初在医学上,只是用于修复由于疾病或创伤造成的严重缺陷或畸形,而后不可避免地成为自我“定制”的途径。类似韩国选美赛中千篇一律的美貌面孔这种情形,谁知道会不会在基因层面再现?

如果基因改造仅仅是停留在人为选择甚至创造“更好”的基因来传给后代,世界也只是多些同质化的个体罢了。但倘若这个潘多拉魔盒一旦打开,引起的后果可能是无法预料的。

我们不能忘记,人类总有一些疯狂者,当他们掌握了某些资源后便会将人性踩在脚下。“二战”期间希特勒在对他的部下训话时说:“我们对于亿万愚蠢可笑的斯拉夫人,要采取这样的办法:把他们之中最优秀的按照我们的要求加以改造,而把其余的人隔离在他们自己的猪圈里”。即使人类文明经过惨痛的世界大战后进入了21世纪,极端宗教势力依然在很多地方横行。试想,他们中的某些人如果掌握了基因编辑技术并应用于人类,世界将会如何?

科学与伦理:人类将何去何从

爱尔兰剧作家萧伯纳曾有一句名言:“人生有两大悲剧,一是不能如愿,一是如愿。”科学家花费了大量精力将基因编辑技术发展到如今的高度,在多少代科学家消灭人类遗传病的愿望已经看到一丝曙光的时候,人类在“天堂”的门外是推门踏入禁区,还是三思而后行?这将决定人类的未来。

科学是纯洁的,正如法拉第将科学比喻为初生的婴儿。但婴儿终将长大成人,可怕的是,一旦其长大成人,就不再听父母的话了。它可能成为一位圣人,也可能成为恶魔。正如人类创造出财富,而如今财富也在控制着人类。科学如不能拴上伦理的红线,便可能变成脱缰的野马。

1996年,“多莉”克隆羊的诞生,标志着人类可以开始复制高等生物;2010年,“科学狂人”克莱格·文特尔首次合成人造生物“Synthia”,标志着人类可以创造全新物种;而如今,我们正站在定向改造人类——我们自身这个物种的禁区之前,伦理从来没有如此重要过。如今,多数国家已通过禁止克隆人的法律,也许现在到了我们的立法者直面这一问题的时候了。

时隔6年,韩春雨再次发表新论文,论文中有很多的信息都是值得关注的。比如说开发出了基于CAS6的RNA荧光追踪技术,这样的一个技术也让该论文可以在顶级的杂志上进行发表,并且也让人们更加关注韩春雨所作的生物科学相关的实验。

韩春雨是河北科技大学的副教授,同时也是硕士研究生导师.韩春雨在2016年的时候就发表过一个顶级的文章研究成果,是指发明的一种新的基因编辑技术,所以引发了强烈的关注,而且很多人都存在这一个技术是非常强的,而且也是非常吸引的。但是论文发表不代表就有相关的成果,一定要具有可重复性,所以有人就提出韩春雨的实验室无法重复的,有人也说是可以重复的,总而言之就是之前的实验成果备受争议。不过韩春雨并没有放弃,而是进行新技术的研发,开发出了基于CAS6的RNA荧光追踪技术,这样的一个系统其实还是属于基因上的编辑和追踪,而且是跟RNA有关的,也是人体中的基因部分,所以还是说明了韩春雨本人的科研能力是比较强的。

韩春雨本人可以说是处于舆论漩涡中,但是韩春雨自己的科研实力还是非常不错的,并且也能够体现出韩春雨的团队是能够继续的去进行相关的研发。只要韩春雨能够按照正确的方向,或者说自己想要研究的方向不断的努力,那么也是能够获得让更多人认可的实验成果,最终也能获得很多荣誉的。而且相关的知识科研性比较高,也只有同行来进行评判,才能够知道究竟是学术造假还是真正可以借鉴的实验成果。

科学研发的过程中必然会出现一些争议性的事情,这是很正常的。只要是有一定的科学证据是可以支撑的,那么都应该值得肯定。

他时隔6年再次发表新的论文开启了 RNA追踪技术,能够追踪人体中的细胞,开启了荧光追踪平台,具有极高的灵敏度和特异性,而且已经经过了同行之间的验证。

相关百科

热门百科

首页
发表服务