线粒体自噬毕业论文pink1

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导读 ：目前仍是个“谈癌色变”的时代，因为全球近1/6的死亡由癌症造成。长久以来，抗击肿瘤的征途道阻且长，虽有多项成果相继现世，但对浩浩肿瘤大军而言仍只是沧海一粟，尤其是肿瘤机制的相关研究进步缓慢。有研究显示肿瘤细胞与程序性坏死之间关系匪浅，但具体调控机制尚未明了。

作者：Ruthy

近日，英国格拉斯哥大学的研究人员发现一种帕金森相关蛋白—— Parkin竟“串场”到肿瘤发生机制中！ 他们指出Parkin可以高效抑制程序性坏死进而抑制肿瘤发生，而该机制正是机体存在的“天然”抗癌途径！

程序性坏死——与肿瘤那些不得不说的纠葛

程序性坏死，又称坏死性凋亡，是呈现坏死细胞形态学特征的一种程序性细胞死亡形式，是具有独特信号通路、信号传递过程可被特异性抑制剂所抑制而中断、受信号分子调控的有序坏死。程序性坏死主要由肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)启动，通过受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)和受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)作用于混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)，传递细胞死亡信号。越来越多的研究表明细胞程序性坏死可参与调控癌症的发生、发展和转移。

过往人们认为肿瘤细胞程序性坏死是一种免疫原性细胞死亡，可抑制肿瘤生长，但一系列新研究却指出细胞程序性坏死能增强髓系细胞诱导的适应性免疫抑制，进而促进肿瘤发生，而且内皮细胞和肿瘤细胞的程序性坏死还会促进肿瘤细胞的转移。那么，程序性坏死对肿瘤而言究竟是利是弊呢？

研究显示，肿瘤细胞可通过扰乱程序性死亡（细胞的另一种死亡方式）系统，激活程序性坏死，让坏死系统占据主导地位来自我保护，维持自身生长发展。也就是说，被肿瘤细胞激活的程序性坏死是肿瘤的“帮凶”。

Parkin——抑制细胞程序性坏死，“天然”抗癌的关键

研究证实每个人体内都会产生一定量的肿瘤细胞，而肿瘤细胞激活的程序性坏死会促进肿瘤的发生发展，那为什么总有人能幸免于难呢？研究人员指出，原因之一是人体内有一个“天然”的抗癌系统——以Parkin为中心的细胞程序性坏死抑制系统。

Parkin是E3泛素连接酶，可与PINK1共同介导线粒体自噬系统，同时还可作为肿瘤抑制因子来发挥功能，在与肿瘤发生相关的各种细胞过程中起到重要的作用。细胞发生异变时往往伴随线粒体的破坏，这就会引发线粒体自噬系统活化，PINK1/Parkin直接互相激活。

Parkin除了作用于线粒体本身，还可以和RIPK3 结合 并对其进行多泛素化修饰，阻止RIPK3与RIPK1形成坏死小体，从而抑制程序性坏死。另一方面，线粒体的破坏必然导致细胞ATP的耗竭，这就导致高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AMPK活化，而AMPK可以磷酸化Parkin进而激活其功能。

换言之，以Parkin为中心的细胞“天然”抗癌系统就是通过抑制程序性坏死，抗击细胞癌化以遏制肿瘤的发生。而一旦相应位点发生突变，出现“帮凶”，肿瘤自然无往不利。

这项研究深入解析了细胞程序性坏死抑制系统，指出帕金森相关蛋白Parkin“串场”后是抗癌系统的关键成员，而相关突变也有望成为未来肿瘤治疗的重要潜在靶点，让肿瘤治疗领域又向前迈了一步。

参考文献：

Kai Cao, Stephen W. G. Tait .Parkin inhibits necroptos is to prevent Cell Biologyvolume 21, pages915–91.

基础知识-研究方法-案例 1.基础知识：     分类： 非选择性自噬 -大自噬、小自噬、分子伴侣介导的自噬；                 选择性自噬 -线粒体自噬 (mitophagy)、聚集体自噬 (aggrephagy) 等选择性自噬；    一、 大自噬形成过程 ：3步：内质网和高尔基体等形成环状结构，包裹胞内结构形成双层膜囊泡结构， 即自噬体 ；然后自噬体与溶酶体融合；自噬体内蛋白或者细胞器在溶酶体内被溶酶体酶讲解。（ 三类标志物 ：囊泡形成过程的标志物、溶酶体标志物、自噬底物标志物）               囊泡形成过程的标志物:  （1） Atg12-Atg5复合物---WB检测： Atg12--15 kDa；Atg5--32 kD；复合体--55 kDa ；（2）Atg16L1--Atg12-Atg5- Atg16L1复合物，不过自噬体形成后就离开了； 检测早期自噬体的形成-方法： 进行免疫透射电镜和免疫染色的检测；（3） LC3 参与了自噬体膜的形成，包括相互转化的形式即LC3-I和LC3-II（细胞内新合成的LC3经过加工, 成为胞浆可溶形式的LC3-I, 后者经泛素化加工修饰, 与自噬体膜表面的PE结合, 成为膜结合形式的LC3-II。LC3-II定位于前自噬体和自噬体, 是 自噬体的标志分子 , 随自噬体膜的增多而增加）；检测方法--WB ：  LC3-I 18 kDa, LC3-II 16 kDa ；（尽管PE偶联形式的LC3-II的分子质量较LC3-I大, 但是其具有强疏水性, 因此在SDS-PAGE中电泳迁移率反而比LC3-I (非PE偶联的LC3) 快，可以通过Western blot比较组间LC3-II水平, 也可通过计算 LC3-II/LC3-I的比值来评价LC3-II水平 , 并推测自噬囊泡数量的多少。） 注意：LC3在含SDS的样品裂解液中易降解, 因此样品经煮沸裂解后应当尽快进行Western blot实验,并避免反复冻融。  （4）Atg9/mAtg9 --Atg蛋白中唯一的跨膜蛋白；哺乳动物细胞的为mAtg9，在形成成熟自噬体后, mAtg9 并未整合进自噬体囊泡上, 而是又游离进入胞浆；用来检测为自噬的发生；（5） Atg6/Beclin1： 用荧光显微镜或透射电镜可检测Beclin1-GFP的点状聚集或斑块作为自噬标志物            溶酶体标志物： 一般为溶酶体膜蛋白：溶酶体相关膜蛋白1 (lysosome-associated membrane protein type 1, LAMP- 1)、LAMP-2和溶酶体整合膜蛋白 (lysosomal integral membrane protein, LIMP-2)--检测方法：可用免疫组化或Western blot的方法检测溶酶体重要膜蛋白的水平, 并与其他自噬相关蛋白结合使用。                                                                                                                                                                                                            自噬底物标志物： p62也被称为SQSTM1, 在多种细胞和组织中 都有表达, 可作为一个货车蛋白参与多种信号转导过程。p62可连接LC3和泛素化的底物, 随后被整合到自噬体中, 并在自噬溶酶体中被降解； 当自噬被激活时自噬体与溶酶体融合, 自噬囊泡中p62等蛋 白或细胞器被溶酶体酶降解 , p62水平降低 ; 当 自噬被抑制 时自噬体积累 , p62水平升高 。因此, 可以用Western blot方法检测p62的水平, 作为自噬能力变化的指征。 二、CMA的标志物： CMA是胞浆内某些蛋白质被分子伴侣如热休克蛋白质70 (heat shock cognate protein of 70 kDa, HSC70) 识别, 并将其运送到溶酶体膜上, 再经溶酶体膜蛋白LAMP-2a结合后被转运到溶酶体腔中被溶酶体酶消化的过程，与大自噬和小自噬相比, CMA的主要特点是细胞质内的蛋白质直接经溶酶体膜蛋白转运入溶酶体腔, 不需形成自噬囊泡。（1）HSC70  70 kDa的热休克同源蛋白, 它是分子伴侣, 在胞浆识别带有KFERQ样序列的CMA底物；（2） LAMP-2a  CMA的速率直接依赖于溶酶体膜上LAMP-2a的含量，LAMP-2a在胞内的水平可由于转录水平改变或降解速率改变而发生变化。抑制LAMP-2a将引起CMA底物GAPDH的聚集; 过表达LAMP-2a, 则引起GAPDH水平下降。 三、 线粒体自噬标志物          线粒体自噬指在ROS、营养缺乏和细胞衰老等内外环境的刺激下, 细胞内的线粒体发生去极化, 而这些被损伤的线粒体将被特异性地包裹进自噬体中并与溶酶体融合, 从而完成 损伤线粒体的降解, 维持细胞内环境稳定 的过程。          流程：损伤的线粒体在发生线粒体自噬之前先发生动力相关蛋白1 (dynamin-related protein 1, DRP1) 介导的 线粒体分裂。线粒体膜电位的下降引起PTEN诱导假定激酶 (phosphatase and tensin homolog-induced putative kinase 1, PINK1) 的聚集, 接着招募E3泛素连接酶Parkin到线粒体。Parkin促进线粒体膜上蛋白质泛素化, p62蛋白与线粒体上泛素化蛋白相互作用, 借助p62与LC3的互作引导线粒体被自噬体包裹[ 24 ]。同时, 线粒体上存在自噬受体如BNIP3 (Bcl-2 and adenovirus E1B 19-kD interacting protein 3) 和NIX/ BNIP3L (BNIP3-like) 也可以与LC3互作使得受损线粒体通过自噬方式被去除。                                                                                                                                                                                                        通常用 线粒体标志物和 自噬标志物 LC3 共定位来显示线粒体自噬。此外, 还有几个线粒体自噬受体也可以考虑用作线粒体自噬的标志。          （1）Atg32是一个分子质量约59 kDa的跨膜蛋白, 定位在线粒体外膜上；         （2）BNIP3和NIX  BNIP3和NIX序列上有56% 的同源度, 且都有BH3结构域, 并与Bcl-2作用。     分子标记：如下图   （ATG5，LC3）         LC3： Atg8/微管相关蛋白1轻链3 (microtubule- associated protein1 light chain 3, LC3) reference：  2.研究方法：一般都是WB 3.研究案例： 本文就从最近师兄推给我的一篇文章，一起学习一下吧。总结一下：本文思路蛮清晰的简单的，动物与细胞表型；通路的探讨；直接作用的证明。其中，直接作用的证明用了模拟方式，没有通过实验。 这样就会想到：验证直接相互作用的方法：蛋白之间-蛋白DNA之间-蛋白RNA之间 相互作用，不管是酵母双杂交、CO-IP、pulldown、ChIP

因为线粒体活性进入休眠状态。线粒体自噬被抑制，线粒体数量减少，会使线粒体代谢引起氧化，导致线粒体活性细胞进入休眠状态。线粒体，是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器，细胞中制造能量的结构。