毕业论文野生菌方向

我以前写的，虽然不是论文，也许有点用。谈到云南小吃，我这个地道的北方人，也想发言呢。几次去云南旅游的经历让我对云南的小吃还是有所了解的，第一个当然是过桥米线啦~~哈哈~ 过桥米线最初起源于滇南的蒙自县城。相传在城外有一个南湖（现在犹存），湖水清澈如碧，湖畔垂柳成行。湖心有个小岛，岛上不公有亭台楼阁，而且翠竹成林，古木参天，景色优美幽静，空气清新宜人，是附近学子们攻读诗书的好地方，有个书生到湖心的小岛去读书备考，但因为埋头用功，常常忘记吃妻子送去的饭菜，等到吃的时候往往又凉了。由于饮食不正常，天长日久，身体日见消瘦，贤妻十分心疼。有一次，妻子杀了一只肥母鸡，用砂锅熬好后送去，很长时间仍角温热，便用当地人喜欢吃的米线和其他佐料放入，味道很鲜美，收生也喜欢吃，贤惠的妻子就常常仿此做好送去。后来，书生金榜题名，但他念念不望妻子的盛情，戏说是吃了妻子送的鸡汤米线才考中的。因为他妻子送米线到岛上要经过一道曲径小桥，书生便把这种做法的米线叫做"过桥米线"，此事一时传为美谈。人们纷纷仿照书生妻的做法吃米线，过桥米线从此流传开来。经过后人的加工改进，过桥米线越做越好，越传越远。第二要数宣威火腿~~ 云南省著名特产之一，素以风味独特而与浙江金华火腿齐名媲美，蜚声中外。宣威火腿，因产于宣威县而得名。它的主要特点是：形似琵琶，只大骨小，皮薄肉厚肥瘦适中；切开断面，香气浓郁，色泽鲜艳，瘦肉呈鲜红色或玫瑰色，肥肉呈乳白色，骨头略显桃红，似血气尚在滋润。其品质优良，足以代表云南火腿，故常称“云腿”。第三要算牛乾巴，牛干巴最常见的吃法是油煎，可以调以干椒、薄荷等，煎嫩一点则柔韧有嚼劲，煎透些则脆香，煎后施糖醋又是另一味。火烧干巴是把干巴用火烧熟，去除焦黑部分，大力捶松其组织，干巴呈肉松状而食用，风味十足。傣族多这样吃，不过他们的干巴在腌制时就割为小条，干巴丝是将干巴撕成极细而长的肉纤维，经油炸后入口就酥，这似乎是缅甸传来的做法了。三甲之外，冬瓜蜜饯我也很喜欢 ，虽然这个太甜了~~ 相传玉溪制作冬瓜蜜饯始于明代后期，至今已有四百多年的历史。民国初年玉溪凤香斋糕点铺名师唐家荣，增创"水晶蜜饯，使玉溪蜜饯声名大震。玉溪冬瓜蜜饯则分为红蜜饯和白蜜饯两种，两种蜜饯均呈透明状，且色泽鲜艳，故而红蜜饯被誉为"琥珀蜜饯"，白蜜饯被誉为"水晶蜜饯"。 玉溪冬瓜蜜饯，虽然称蜜饯，却并非以蜜制作，而是选用上等红、白糖精工制成，质优味美，让人吃后真有"不是蜜味胜似蜜味"感觉。竹筒饭 不算小吃了，但也局够有特色 。当金竹、香竹、薄竹、甜竹的新笋长节有叶之时，文山州的少数民族就要做竹筒饭。 吃筒竹饭，古已有之。那时，上山打猎，出远门做活，不便带锅带碗，只能就地取材煮制竹筒饭。而今，因竹筒饭色美味香，节庆时，人们仍好吃竹筒饭。 竹筒饭用新鲜的金竹、香竹、薄竹、甜竹的竹筒做容器，在每一节竹子中盛水盛米，一般用宽大的蕉叶、粽粑叶封口，米可用糯米或香米。除了大家都知道的过桥米线，还有一种豆花米线也很好吃 豆花米线的来历有一个故事：很久以前，昆明德胜桥边有一家人，专门做腌菜卖，因味道好，远近闻名。主人有一女儿名唤小花，她眉清目秀，心灵手巧，不仅学会了做腌菜的手艺，还学会了做豆腐。家里日子过得越来越好。 女儿到了十九岁，经媒人撮合，嫁给了一个姓杨的武官做四太太。这位杨武官已娶三房，但一直未生儿子，故娶了四太太后，盼望早生贵子。但事不如愿，四太太生下的还是女儿。于是，四太太受到了冷落。 性情温柔的四太太不怨天尤人，她常去寺庙敬香，后来，生活习惯也变了，天天吃斋念佛，平日里为家里做点腌菜、豆腐，家里人尝了，说“还可以”。四太太慢慢也学会了做寺庙里的斋饭，她用豆腐做出的素鸡、素肉，口感味道都不错，甚至达到以假乱真的程度。 一天，四太太的父母、兄弟姊妹及亲戚从远道来看望她。四太太为招待亲人，专门做了一桌素席。大家吃了，嘴说不错，可心里都觉得“太寡”。可老父亲心里着实不滑爽，脸色很难看，筷子没动几下就放下了，说： “我不想吃饭，要吃米线。”四太太小花忙到厨房，这可犯了难，米线倒是有，可没准备做荤菜，几年了一点肉也没买过，没有肉汤，没有肉帽，这米线怎么做呢。情急之中，四太太烫了碗米线，舀了一勺水豆腐做帽子，再放上甜咸酱油、冬菜(腌菜的一种)、胡椒、酱、香油、麻油、剁细的韭菜、油辣子等十多种佐料，恭恭敬敬端给了老父亲。老父亲皱着眉头问道：“这是哪样米线?”小花急中生智，随口答道： “豆花米线，你家尝尝。”老父亲滋成咂味，吃了两口，似觉不错，一小下吃完了。他顿了顿，说道： “再来一碗。”小花忙又如法炮制了一碗端来。老父亲三下两下就划完了。又说一句：“这个碗咋个这么小?”小花急忙进厨房用大碗又做了豆花米线抬来，老父亲居然又吃得干干净净。众人都看愣了，纷纷说： “是哪样东西，那么好吃，快给我也来一碗。”“我也要一碗。” “我也要……”小花忙得不亦乐乎，一口气做了十儿碗。大家吃了赞不绝口，连杨大官人吃了也笑呵呵的。 此后， “豆花米线”的名声传开了了，为满足人们的需求，四太太开了一家小吃铺子，专卖豆花米线。，有的人来吃后，也想学做豆花米线。四太太就教他们做。因都是家常原料，做法简单，大家一看就会，豆花米线在民间传得更广远了。 拌好,扒一口在嘴里,感觉到带有淡淡甜味的冬菜粒脆脆的,豆花的素净掩盖了辣酱的鲜辣,米线的软滑沾满了清香的韭菜.爱吃甜食的，还要尝尝豆面汤圆~ 和冰镇甜白酒 把汤圆放到装有豆面的盆里轻轻摇晃，汤圆就裹满了香香的豆面，再放进一些红糖稀，使汤圆不那么干。汤圆软软的，外面的豆面很香甜，味道很好。关于甜白酒 味道不用说了，简直是甜到心里了。。爱吃香腻的人，我推荐包烧猪脑~作为女孩，我怕胖，所以油油的东西不敢多吃，但是我味道确实很诱人，每次看家人们津津有味的品尝时都不禁流口水。于是吃不到葡萄说葡萄酸：“小心越吃头越大哦”！言外之意，小心变成猪头，哈哈！

云南的小吃数不胜数,不知道你具体想了解的昆明的,还是云南各个地方的都介绍一下!下面我还是给你一些信息,不知道是不是你想要的!1、“春城”昆明是云南省的首府，在不到500万人口的城市中，聚居着汉、彝、白、傣、哈尼、纳西族等少数民族。昆明满街的吃真是让人垂涎，街边的小吃、烧烤、环境优雅的室内餐厅都有当地的特色食品。在昆明品尝独特的民族食品，是游客难忘的选择。民族风味菜肴在制作上有烤、腌、冻、焐、舂等多种方法，器皿有石板、香竹、羊皮、卵石等。最值得一提的是，昆明的山珍在全国都很有名，山珍中的野生菌类，更是百吃不厌。不过，昆明菜的口味有点偏咸偏辣，对于四川、湖南那些口味重喜欢吃辣的地方来说算不了什么，而江浙一带口味清淡偏甜的人可能有点不太适应了，入乡随俗吧，否则那么多好吃的东西不能吃，就太遗憾了。总体来说，昆明吃喝较为集中的地方是北边的北大门美食街，西边的兴苑路，也就是在西山区政府大楼旁，另外还有滇池路、关上中路、官南大道、世博大道等。昆明的小吃数不胜数，对游客来说，恐怕敞开肚皮吃，短短的几天里也难以享遍美食，就让我们给你一点小小的提示吧。以下可是各种特色小吃的简略指南哦！西南商业城的炸臭豆腐、师大附中的卤饵丝、西山猫猫沟的农家菜、海埂公路大坝鳝鱼、大滇园的糊辣鱼、牛街庄的烧烤夜市、胖子火锅、关上的野山菌火锅、石闸立交桥下的黄焖羊肉火锅、昆明理工大学新迎校区宿舍门对面马路的沙锅米线……实在是不胜枚举啊！分类来说，大家会有个更清晰的概念。小吃：西南大厦旁边的小吃一条街野生菌：关上路野生菌一条街烧烤：东边的牛街庄烧烤；穿金路官房广场旁边的烧烤摊子；北边的“豆腐厂”；西站客运站附近铁路旁边的建水烧烤；西边还有丰菱小区赵家堆和鱼翅路，再往西就到红联烧烤了。狗肉：南市区的双龙桥狗肉店，十多家连成一片已有些年月，午夜时分那个热闹自不必说了，最好吃的在梁源小区内的区内的曲靖来的那家，味道特好。再就是老海埂路黄瓜营，那是昆明最老的狗肉摊了，狗肉米线，烤狗排，老远就让人闻着流口水。夜市集中的地方：景星街花鸟市场附近、滇池电影院、祥云美食城（柏联广场后面、金马碧鸡坊斜对面）、红联烧烤（春苑小区对面）、人民路上的“西南夜市烧烤城”、“幸福鱼”云南风味自助风味小吃（大观商业城内），“清明上河食廊”的自助式风味小吃，尚义街，官渡古镇（离昆明城区5公里）。昆明十大名特风味小吃：过桥米线、四喜汤圆、荞包子、太师饼、都督烧卖、荠菜饺、火腿豆焖饭、小锅米线、饵块、什锦凉米线。小贴士：昆明的物价不高，这里价格便宜的诱人的热带水果也是特色食品。一个对小吃有兴趣的人，到了云南，就几乎等于到了天堂。早起吃一碗饵丝、肚子饿了吃一碗饵丝或饵块，便宜又美味。此外，老豆腐绵软和气，下饭得很；凉鸡米线，调味不见得比四川的凉面少……而与这里的小吃相呼应的是云南的特殊调料——“喃咪”，它的意思和西餐中的沙司类似，代表一种酱。在这里，小吃和喃咪构成了云南美食的最初雏形。小吃如鲜花一样繁多云南小吃种类繁多得如同那里的鲜花。由于地域复杂民族众多，每个民族都有着自己的特色饮食。建水的草芽、石屏的豆腐、蒙自的过桥米线都以精制著称；而滇东北地区是进入中原地区的必经之路，菜豆花、荞凉粉、酥红豆等都是那里的地方名小吃；丽江的丽江粑粑、八大碗也是不能错过的。大救驾：大救驾是云南的名小吃之一，其实就是炒饵块。饵块用米制成，为云南独有。据古籍记载，麦类制作的食品古时统称为“饼”，米类制作的为“饵”。云南是古人类的发祥地，水稻栽种历史悠久，民间到了农历岁末，家家户户都要挑选最好的大米，洗净浸泡后蒸熟，放在碓中舂细如泥，案板上用蜂蜡抹好，再搓揉为长方、椭圆、扁圆等形状，用作馈赠的食品，称为“饵馈”，时间一久，老百姓就把它谐称为饵块了。炒饵块本为普通小食，成为名吃是因为一则典故，据传说，明末吴三桂打进昆明，永历帝桂王朱由榔仓皇逃往滇西。逃至腾冲，天色已晚，住在村子里，主人炒了一盘饵块让其充饥。这位落难皇帝本是深宫弱质，又经数月来长途奔波，历尽艰辛的劫难生活，今天进食此物，如食山珍海味，遂言“真乃救驾也”，从此，腾冲饵块名声远扬，誉名“大救驾”。此点红、绿、白、黄相映，饵块细糯滑润，鲜香甜美，油而不腻，脍炙人口。苦荞粑粑：云南的很多地方都有粑粑，比如大理喜州粑粑、丽江粑粑等等。而苦荞粑粑是彝族的主食，苦荞麦是云南高寒地区出产的一种粗粮，又有苦荞和甜荞之分，做粑粑实际上用的是不很苦的甜荞。荞麦具有清凉爽口、又纯又香的特点，而且同时具有人体需要的多种氨基酸，一直都是糖尿病人的理想主食之一。因为苦荞粑粑味道略苦，所以在彝族地区，每当春暖花开盛产蜂蜜的季节，把苦荞粑粑烧好或煎好后，人们都从蜂蜜桶里取下蜂蜜，用牛耳大的叶包好，蘸食苦荞粑粑。而在深圳吃到的苦荞粑粑口味并不很苦，因为考虑到本地人接受的程度而在里面适当地加了糖和鸡蛋，煎成金黄的苦荞饼十分松软，看起来有点像玉米饼，嚼起来清甜香口。“喃咪”是地道的民俗滋味云南美食是在极具个性的原材料基础之上再配以特殊调料和加工手段才料理出来的，相比之下，云南菜比其他地方的菜系，更多地使用了一些酱料、香料，吃的方法也有其独特之处。而“喃咪”的意思和西餐中的沙司类似，代表一种酱，是傣族的一道传统美食。酱料：云南的很多菜都用酱料当作调料，比如咸、鲜、辣、香的昭通酱，有点类似广东的XO酱，烧肉炒菜时搭配一些，味道十分香浓。此外，玉溪特产的甜酱油，是制作凉米线必不可少的调料。另外还有各种什锦酱、甜面酱、豆瓣酱、汤池的老酱等等，都是滇菜制作里常见的调料。蘸水：云南菜的另外一大特色是蘸水，这一点和广东的潮州菜有点相像，不同的菜要搭配着不同的蘸水一起吃。比如吃蜂蛹竹虫，要配椒盐蘸水，吃铜锅豆腐要配糊辣子，吃云南春卷要配腐乳，“喃咪”辣酱更是傣族的特色蘸水，吃很多菜的时候都要搭配上一点。正因为这些“蘸水”，才让滇菜的味道更添几分浓郁。咸菜：咸菜乍听起来有点突兀，其实云南的很多“咸菜”既可以单独吃，也是做菜调味的重要组成部分，而且不同的地方都有当地著名的“咸菜”，如弥度的酸腌菜、江川的萝卜酢、易门的豆豉、石林的腐乳等等，像其中的腌酸菜和腐乳是很多滇菜中必不可少的调料。过桥米线，是云南著名的风味小吃。过桥米线主要以汤、肉片、米线再加作料做成。汤用肥鸡、猪筒子骨等熬制以清澈透亮为佳，将鸡脯、猪里脊、肝、腰花、鲜鱼等切成薄片，摆入小碟，米线则以细白、有韧性者为好；同时备有豌豆尖、黄芽韭菜、嫩菠菜等。进餐时，以大“海碗”盛汤，加味精、胡菽、熟鸡油。汤滚油厚，不冒一丝热气。汤上桌后，将鸽蛋磕入碗内，继而将肉片氽入汤中，轻轻一搅，霎时变得雪白、细嫩。然后再放入鲜菜、米线，配上辣椒油、芝麻油等，便可食用。2、宣良烤鸭宣良烤鸭是别具一格的美味佳品，尤以狗街烤鸭为佳。早在60多年前就在滇中一带享有盛名了。宣良烤鸭制作考究。先将“汤褪”干净的鸭，从腋下开洞，剔弃内脏和脚爪，配以佐料，在鸭的皮肉间吹气，把鸭身吹鼓，再用铁丝钩吊住鸭脖将鸭挂于炉壁内侧慢慢烧烤。烘烤时，以松毛结为燃料，待其燃到烟尽，适时翻转鸭身，涂沫蜂蜜水、猪油和鸭唷扑于表皮。这样烤出的鸭，皮黄脆不焦，肉酥松软，甜嫩离骨，色鲜味美，香气四溢，非常可口。烤鸭又分仔鸭和肥鸭两种：仔鸭，肉质细嫩，食味香甜；肥鸭油脂较多，肉质老香，若配以葱白、花椒或酱制品食用，那更是别具风味。3、汽锅鸡汽锅鸡早在清代乾隆年间，就在滇南地区民间流传。建水县盛产陶器，有一种别致的土陶蒸锅，称为汽锅。汽锅鸡做法独特，吃起来鸡肉嫩香、汤汁鲜甜，是一道美名越传越远的云南名菜，深受中外食客的赞誉。加入“三七”、天麻、虫草等名贵药材烹饪，便成为“三七”汽锅鸡、天麻汽锅鸡、虫草汽锅鸡，为云南具有独特风味的滋补名菜。4、荞面包子荞面被称为保健食品。云南的高寒山区普遍种植荞麦，部分地区还把荞麦当主食。荞类食品很多，如糕点中的荞坨、荞饼等，面点中的面糕、荞面条、荞炒面等。荞包子是云南大众面点之一，制作方法颇多，经历代厨师研究创新，四味荞包曾在全国第二届烹饪比赛中获银质奖章，深受国内外营养学及食品工艺学的专家好评。荞包子色泽金红，外表酥松有小裂纹，口感酥、化、腻、香、甘，食后回甜，中老年人特别喜欢。按照中医药膳的观点，荞麦具有清热解毒、降气宽肠、除白浊白带、脾积泄泻的功效，适用于肠胃热积泄痢、自汗偏头痛、紫癜、疮毒等症。蒙自年糕 :用糯米粉、红糖、猪油、豆腐皮、香芝麻、玫瑰糖等料，调成糊状，入碗蒸制而成，呈半圆球形。深棕红色，鲜艳油润，味甜香糯，柔韧适口，能存放较长时间，生产一两天者可直接食用，存放时间较长者，则切片油煎、烘烤或蒸食。玫瑰米凉虾:米凉虾是云南风味小吃。用大米制浆煮熟，用漏勺漏入凉水盆中而成。因头大尾细形似虾，故此得名。用它配入糖水，加入玫瑰糖，是夏季解渴佳品，成品香甜软嫩，人口冰凉。原料：主料：上自米500克。调料：红糖300克，玫瑰糖100克。制法：（1）米淘洗干净，用水浸泡30分钟，磨成米浆入盆。锅内注入清水，旺火烧开，将米浆徐徐淋入，边淋边用手勺搅动，防止糊锅。熟后注入清石灰水，改用微火煮至糊状。取盆：个，注入冷开水，将米糊趁热放入漏勺，进冷水中即成米凉虾。红糖熬成糖水，玫瑰糖加开水调稀晾凉。（2）食用时，用漏勺捞出米凉虾入碗，放上红糖水、玫瑰糖稀即成。大理乳扇:乳扇是云南省的特产，为大理白族人民的风味食品。当地少数民族利用剩余的牛奶制成。由于美味可口，不但是当地人们喜爱的小吃，也是宴席中的名点。制作方法：1.先在锅内加入半勺由木瓜制成的酸水，加温至70℃左右，再以碗(约500毫升)盛奶倒入锅内，牛乳在酸和热的作用下迅速凝固。此时迅速加以搅拌，使乳变为丝状凝块。2.然后把凝块用竹筷夹出并用手揉成饼状，再将其两翼卷入筷子上，并将筷子的一端向外撑大，使凝块大致变为扇状，最后把它挂在固定的架子上晾干，即成乳扇。在晾挂中间必须用手松动一次，使干固后容易取下。按此法制造乳扇时，在每制一张乳扇后，需将锅内酸水倒出，重新放入新酸水。但使用过的酸水收集起来，经发酵后还可以备用。一般放入锅内的酸水与鲜乳的比例约为1∶2，每10千克鲜乳约可制1千克乳扇。3.酸水的制备：利用鲜木瓜或干木瓜加水煮沸后，经一定时间取其酸液即为酸水。在没有木瓜的季节或北方地区，可用乌梅代替木瓜。制作时可按乌梅与水1∶3的比例煮沸半小时，然后取其清液即为酸水。产品特点：乳白色，呈半透明状。光滑油润，形如扇子，故名乳扇。产品含水分、脂肪、蛋白质、乳糖、灰分。(宣威火腿:宣威火腿产于云南省的宣威县，距今已有二百五十多年的历史。其外形端正，个大骨小，肥瘦适中，肉质细嫩，吃起来清香扑鼻，它以独特的风味蜚声中外，早在二十世纪初就行销国内外，并多次在国际上得奖。现在当地还用宣威火腿加工成各种食品，主要有：云腿罐头、云腿午餐肉、云腿月饼及云腿奶糖等。(等等等等,云南是个多民族的风水宝地，各个民族都有自己的特色美食，数不胜数，就给你列举这么多吧！

分子生物技术在微生物降解环境 污染物中的应用 [摘要〕介绍了与环境微生物关键降解酶基因的筛选、克隆及应用相关的分r生物技术，包括聚合酶链式反应技 术、基因重组技术、荧光原位杂交技术和生物信息学等技术，并对这些技术在污染物降解基因检测、筛选和克隆方 面的应用进行了阐述与探讨、 [关键词]分子生物技术;微生物;基因;环境污染物;降解 随着现代j:\地技术的发展，多环芳烃、含氯有 机物和硝基苯类化合物等人工合成井难以降解的 污染物大量排放，造成世界范围内的环境污染和生 态破坏，严重地威胁人类和其他生物的正常生存和 发展。利用微生物修复技术对受污染的水体及土 壤进行处理，凸显了其重要的意义和可行性。研究 人员发现并筛选到一些微生物，它们不仅对环境有 较高的适应性、对污染物有较高的耐受性，而且对 污染物有较强的降解效率和专一性。然而环境中 存在的大量微生物中仅有少于1%可通过传统的培 养方法进行培养、分离和纯化，绝大多数细菌需要 非常严格的营养条件川。因此，为了对修复环境有 所贡献却难以培养的微生物进行更全面了解，也为 了筛选到更多有利于降解环境污染物的微生物菌 种及其关键酶基因，分子生物技术和手段逐渐被广 泛应用到环境可降解污染物及降解机理方面的研 究中。 本文对近年来发展起来的聚合酶链式反应 (PCR)技术、基因重组技术、荧光原位杂交(FISH) 技术和生物信息学等多种分子生物技术进行了介 绍，并总结了它们在污染物降解基因检测、筛选和 克隆方面的应用。 1与环境污染物降解相关的分子生 物技术 及其相关技术 PCR是一种利用脱氧核糖核酸(DNA)半保留 复制原理，在体外扩增位于两段已知序列之间的 DNA区段从而得到大量拷贝的分子生物技术。根 据其模板、引物来源或扩增条件的不同，PcR技术 可分为以下几种:(l)反转录pCR(RT一PeR)技 术，将mRNA反转录为cDNA后再对其进行PCR 扩增，可用来构建cDNA文库，分析不同生长时期 的mRNA表达状况和相关性以及mRNA的定量测 定等;(2)巢式PCR技术，在扩增大片段目的DNA 时，先用非特意性引物扩增再用特意性引物对第一 次扩增产物进行第二次扩增，以获得可供分析的 DNA;(3)竞争PCR技术，是一种定量PCR，向PCR 反应体系中加人人工构建的带有突变的竞争模板， 通过控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度， 对目的模板作定量研究;(4)实时荧光定量PCR技 术，在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信 号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线 对未知模板进行定量分析，该法已广泛用于基因表 达研究、转基因研究等方面;(5)扩增的rDNA限制 酶切分析技术，根据原核生物rDNA序列的保守性， 将扩增的rDNA片段进行酶切，通过酶切图谱来分 析菌间的多样性;(6)RNA随机引导PCR技术，基 于任意寡核昔酸引物与RNA之间可能的配对，在 低严谨度条件下经聚合酶催化使链延伸，将细胞总 RNA或InRNA作为反转录反应的模板，此技术结 合单链构象多态性，用非变性胶分辨大小相同而构 象不同的片段，可用于诊断遗传突变及分析污染条 件下序列的多态性;(7)随机扩增多态DNA (RAPD)技术，是一种基于PCR检测PCR引物结合 位点序列改变的方法，通常以10bp的寡核昔酸序 列为引物，对基因组DNA随机扩增，电泳分离染色 扩‘增产物，再分析多态性。 技术 FISH技术利用荧光标记的探针在细胞内与特 异的互补核酸序列杂交，通过激发杂交探针的荧光 来检测信号。荧光探针比放射性探针更安全，具有 较好的分辨力，不需要额外的检测步骤。近年来， 由于FISH技术具有灵敏、便捷等优点，迅速发展完 善成为研究环境微生物的有力工具。此外，可用不 同激发和散射波长的荧光染料标记探针，在一步反 应中同时检测几个靶序列。该技术主要包括试样 固定、预处理、预杂交、探针和试样变性、杂交、漂洗 去除未结合的探针、检测杂交信号等步骤。由于 165rRNA具有遗传稳定性，因此成为FISH技术检 测最常用的靶序列。 基因重组技术 基因重组技术是从供体生物的基因组中通过 酶切扩增等手段获取目的基因，与载体连接形成重 组DNA分子，再导入到受体细胞中，让外源基因得 以表达。在已经分离出的许多菌株中，与降解能力 有关的基因多在质粒体上。由于质粒很容易在细 菌的繁殖过程中遗失，对细菌降解能力的长期稳定 非常不利，可将其与污染物降解有关的酶基因重组 到大肠杆菌等微生物中进行表达，以此构建的各种 生物降解特性增强的重组菌可用于污染环境的治 理修复或发酵某些废弃物。 生物信息学 20世纪后期，生物学的迅猛发展，从数量上和 质量上极大地丰富了基因组数据库、蛋白质数据 库、酶数据库和文献数据库等许多生物科学的数据 资源。已有多个国家和国际科研组织建立了生物 信息数据库，如欧洲分子生物学实验室(Eur叩ean MolecularBiologyLaboratory)核酸序列数据库和美 国国家生物技术情报中心(Nationaleente:fo:Bio- technologyInformation，NCBI)基因序列数据库等。 科学家利用计算机及生物信息分析软件分析这些 数据资源，确定大分子序列、结构、表达模式和生化 途径与生物数据之间的关系，区分生物个体间遗传 差异，揭示DNA多样性。例如，基本局部比对搜索 工具(BasieLoealAlignmentSearehTool，BLAST)， 是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似 性比较的分析工具。它基于Altschul等的方法「2〕， 在序列数据库中对查询序列进行同源性比对工作。 BLAST程序可对一条或多条、任何数量、任何形式的 序列在一个或多个核酸或蛋白序列库中进行比对，甚 至将有缺口的比对序列也考虑在内，利用比较结果中 的得分对序列进行相似性说明。基因的序列分析可 揭示出生物物种之间的关系，在污染治理研究中可用 于生物基因组特殊区域或特异基因的测序。 2分子生物技术在环境污染物降解 中的应用 土壤试样总DNA的提取 用适当方法直接从土壤中提取DNA并纯化， 是从分子生物学角度对土壤微生物进行研究的前 提条件，而后可进行酶切、PCR扩增、核酸分子杂交 等分子生物学技术操作。从土壤中提取微生物 DNA主要分为汽接法和间接法}’{。直接法是在 ogram等的方法基础卜发展起来的，其主要包括2 个步骤:(l)原位细胞裂解;(2)DNA提取和纯化。 直接法提取的DNA超过细菌总DNA的60%且省 力，但提取的DNA常常有折断、腐殖酸污染、甚至 提取物中还夹杂有未知的胞外DNA和真核生物的 DNA。最先报道间接法的是Faegri等[‘〕，其主要包 括4个步骤:(l)分散土壤;(2)分离细胞与土壤; (3)细胞裂解;(4)DNA纯化。间接法提取DNA 产量低且费力，但纯度较高、DNA损伤小，提取的 大片段DNA可用来构建cos而d和细菌人工染色体 文库等。 采用PCR及相关技术扩增分析DNA片段 可降解污染物的微生物必然能产生分解代谢 该污染物的酶。selvaratnam等L’l用编码苯酚单加 氧酶dmpN摹因的RT一PCR技术来检测序列间歇 式活性污泥反应器‘{一，降解酚的假单胞菌。检测结 果表明，RT一PCR技术不仅能检测微生物降解酚的 能力，还能测量dmpN基因的转录水平，从而确定假 单胞菌特殊的分解活性，发现了在转录水平下，酚 浓度与通气时间之问存在正相关关系。 将PCR技术和变性梯度凝胶电泳(DGGE)结 合起来，在变性条件适当的情况下能分辨一个碱基 对，分辨率较高。染色后的凝胶用成像系统进行分 析，可在一定程度l几反应试样的复杂性。条带的多 少能反应试样「 一 }1微生物组成的差异，条带的亮度能 反应试样中微生物的多少。基于以上优点，日前该 技术在微生物群落结构的分析和动态研究方面得 到了厂‘泛应用。DGGE可通过分析PCR扩增的基 因点突变来探索微生物的复杂性。徐玉泉等[“〕从 某废水中分离出一株能以苯酚为惟一碳源的菌株 PHEA一2，使用PCR一DGGE技术对该菌165 rDNA进行分析，发现该菌与醋酸钙不动杆菌同源。 M盯sh等r了)利用PcR一DGGE技术获得了活性污泥 中真核微生物的种群变化情况。王峰等下8〕采用 PCR一DGGE技术对城市污水化学生物絮凝处理中 活性污泥和生物膜微生物种群结构进行了分析，结 果表明活性污泥培养前后微生物种群结构发生r 很大改变。 RAPD技术也是一种应用比较广泛的以多态性 引物来扩增某些片段的技术。RAPD技术可用于检 测含有混合微生物种群的各种微生物反应器中微 生物的多样性。用RAPD技术分析检测实验室规 模的油脂淤泥培养料中的细菌菌群发现，用油脂淤 泥改良过的培养料比未改良的更适于不同的微生 物种群生长[9j。vainio等t’。〕从516种孤立的菌落 中提取出165rDNA，经PCR扩增后进行测序，检测 活性污泥中微生物种群的结构。这些组合技术的 应用显著增强r对微生物的检测和鉴定能力，为理 论研究工艺优化及提高生物处理效率提供了条件。 基因重组 基因工程技术应用于环境保护起始于20世纪 80年代。其基本原理是通过基因分离和重组技术， 将目的基因片段，比如可编码降解某种污染物的 酶，转移到受体生物细胞中并表达，使受体生物具 有该目的基因表达显现的特殊性状，从而达到治理 污染的目的。找到特定污染的抗性基因，利用基因 重组技术转基因后也可获得其他抗性植株以及筛 选到可转化污染物的植物，还可开发超量积累植物 进行污染土壤的生物修复。 罗如新等L”〕用放射性同位素标记tfdc基因片 段作探针，Southemblot杂交定位Ll菌株的邻苯二 酚1，2一双加氧酶基因位于Pstl的I片段和BamH I的M、N片段，回收并将其直接克隆至表达载体 pKT230卜，获得的重组子能转化不具开环酶活性 的甲胺磷降解菌P2，得到高于天然宿主21倍的邻 苯二酚1，2一双加氧酶。stingley等{”〕通过构建基 因文库和重组质粒等基因工程方法证实了NidAB 双加氧酶是降解菲的关键酶类，并首次鉴定出此基 因通过磷苯二甲酸实现降解功能。chae等‘”}发现 不能降解苯酚的su如lobusso扣taricu、98/2菌株中 的儿茶酚2，3一双加氧酶基因与能降解苯酚的 sulfolo右u，，o如taricu、咫有[6J源区，分析得知它们 是山共同祖先进化而来。把儿茶酚2，3一双加氧酶 基因克隆到大肠杆菌中表达，可获得有较高降解活 性的双加氧酶。 重金属污染是环境污染的重要方面之一。随 着分子生物学技术的发展，越来越多的修复性蛋白 基因正被从植物、微生物和动物中陆续分离出来， 如汞离子还原酶基因、有机汞裂解酶基因、汞转运 蛋自基因、金属硫蛋白基因、植物络合素合成酶基 因、铁离子还原酶基因和锌转运蛋白基因L’‘〕。这些 基因通过基因工程的改造，重组到合适的受休细胞 中表达相应的蛋白质和酶，达到治理难以降解的有 毒有害污染物的目的。sorsa等〔”〕把MTS插人 LamB序列的153位点，在中表达MTs，解决 r细胞内MTs对金属离子有限的吸附能力。综L 所述，基因重组技术具有快速、高效的特性，已逐渐 成为环境生物技术的研究热点。 技术 FISH技术利用核糖体内长度适中(约1500bp)、 高度保守的165:RNA序列作为理想的基因分类靶 序列，其中使用的165:RNA寡核普酸探针一般是 进行了荧光标记的20bp左右特异性核昔酸片段， 利用该报告分子(如生物素、地高辛)与荧光素标记 的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测系 统对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 FISH技术能提供处理过程中微生物的数量、空间分 布和原位生理学等信息。 硝化细菌是一类生理上非常特殊的化能自氧 菌，传统的研究方法要经过富集、分离、分类和鉴定 步骤，耗时长。HSH技术的引人解决了上述困难。 FlsH技术还被广泛用于活性污泥系统、硝化流化床 反应器和膜生物反应器等废水处理系统}’61。 基因工程微生物越来越多地被用于农业害虫 控制和环境污染的生物修复，对人类健康和环境的 影响引起广泛关注。1994年出现了一种新的标记 系统:绿色荧光蛋白(GFP)，由于GFP基因表达产 物对细胞没有毒害作用，且由GFP产生的荧光标记 检测卜分方便、简单。在某些被污染的环境中可分 离出降解该污染物的细菌，通过基因重组等手段使 用GFP分子标记，可更容易的分离检测被标记的 细胞叫。 Bastes等[’8]进行了苯酚降解菌染色体GFP基 因标记实验。通过PCR和Southemblot分析，证明 GFP基因已成功整合到宿主细胞的染色体中。对 标记菌与野生型的降解能力比较结果证明，GFP分 子标记的插人并不影响细胞的苯酚降解能力。 用G即标记Pseudomonasputida，研究活性淤 泥中细菌存活情况{’9飞。Pseudomonasputida被转到 活性淤泥2min后，观察到细胞在淤泥絮凝物间自 由游动;培养3d后，发现荧光细胞减少，大部分已 被合并到淤泥絮凝物中，以防止细菌被原生动物捕 食。用oFP标记石.eozi和Serraliamarceseern，考 察菌株附到絮凝物卜的过程{’()j。使用表面荧光显 微镜能将带有GFP标记的细胞从活性污泥中区分 开，井进行观察和记数。而聚焦激光扫描显微镜 (cLsM)可使GFP标记细菌产生三维轮廓，结合表 面荧光显微镜和CLSM观察GFP标记细胞，结果表 明，细胞表面疏水性在细菌附到絮凝物的过程中起 重要作用，两种细菌附在絮凝物上的模式有很大不 同，通过这种方法可更好地理解细菌赫附机理，有 助于提高废水处理效果。 3结语 分子生物技术的应用使研究人员可从微观的 角度更细致深人地了解微生物对污染物降解的具 体生理生化机制，在分子水平 _ _ [揭示生物体吸收、 迁移、积累有害物质最终被毒害，及适应、抗性等生 态问题，从而筛选到更多有利用价值的微生物。随 着越来越多微生物全部基因序列的解码，对各种细 菌体内可降解基因的分布和表达会有更深人的了 解，有关技术的发展和成熟必将对污染物的降解过 程有一个整体的、生态水平上的认识。 参考文献 l李凤，刘世贵 . 分子生物学技术在环境微生物研究中的 应用 . 世界科技研究与发展，2003，25(4):88一92 2AltsehulSF，GishW，MillerW， mentsearehtool . 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微生物技术在城市生活垃圾处理中的应用 摘要：本文结合堆肥化、卫生填埋两种现行的城市生活垃圾处理工艺，主要介绍了城市生活垃圾生物处理过程中的微生物种群，以及通过分析开发出的新的微生物技术，指出了应用于城市生活垃圾处理的高效的微生物技术的研究方向。 关键词：城市生活垃圾 微生物 强化微生物处理技术 基因工程 ; 随着城市化进程在全球范围的加速，城市化带来的污染和人类聚居状况恶化等问题，已成为世界各国共同关心的问题。城市生活垃圾（Municipal solid waste, 简称MSW）是在城市日常生活及为城市生活提供服务的活动中产生的固体废弃物，是城市环境的主要污染物之一。目前，城市生活垃圾处理处置的方法主要包括卫生填埋（Sanitary landfill）、堆肥化(Composting)、焚烧(Incineration)三种，其中前两种处理方式均属于生物处理技术。具体来说，MSW生物处理技术就是城市生活垃圾中固有的或外添加的微生物，在一定控制条件下，进行一系列的生物化学反应，使得MSW中的不稳定的有机物代谢后释放能量或转化为新的细胞物质，从而MSW逐步达稳定化的一个生化过程。 1. 城市生活垃圾生物处理中主要的微生物。。。