分子生物学论文pcr

聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction）,聚合酶链式反应简称PCR.聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点.它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术. 编辑本段发展简史人类对于核酸的研究已经有100多年的历史.20世纪60年代末70年代初,人们致力于研究基因的体外分离技术.但是,由于核酸的含量较少,一定程度上限制了DNA的体外操作.Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想.但是,当时的基因序列分析方法尚未成熟,对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现,寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段,这种想法似乎没有任何实际意义. 1985年,美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下,经过两年的努力,发明了PCR技术,并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文.从此,PCR技术得到了生命科学界的普遍认同,Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖. 但是,最初的PCR技术相当不成熟,在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术.1988年初,Keohanog通过对所使用的酶的改进,提高了扩增的真实性.而后,Saiki等人又在黄石公园从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶,使得PCR技术的扩增效率大大提高.也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用,使该技术成为遗传与分子生物学分析的根本性基石.在以后的几十年里,PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段.到目前为止,PCR技术已有十几种之多,例如,将PCR与反转录酶结合,成为反转录PCR,将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等. 编辑本段技术原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径.双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝.在聚合酶链式反应实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链.因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制. 但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展.发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床. 编辑本段工作原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时聚合酶链式反应间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至40~60℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下,于72℃左右,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板.每完成一个循环需2～4分钟,2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍. 编辑本段反应特点特异性强 PCR反应的特异性决定因素为： ①引物与模板DNA特异正确的结合； ②碱基配对原则； ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； ④靶基因的特异性与保守性. 其中引物与模板的正确结合是关键.引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的.聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度.再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高. 灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=10-6）水平.能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌. 简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2～4 小时完成扩增反应.扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广. 对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板.可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测. 编辑本段反应五要素参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度.理论上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增. 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度：15-30bp,常用为20bp左右. ②引物扩增跨度：以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段. ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带.ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列. ④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带. ⑤引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败. ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处. ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性.引物量：每条引物的浓度～1umol或10～100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会. 编辑本段反应体系与反应条件标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液10ul 4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板～2ug TaqDNA聚合酶 Mg2+ 加双或三蒸水至100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+) 编辑本段PCR反应条件的选择 PCR反应条件为温度、时间和循环次数. 温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点.在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90～95℃变性,再迅速冷却至40 ～60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸.对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸（此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性）. ①变性温度与时间：变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因.一般情况下,93℃～94℃min足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响.此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败. ②退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素.变性后温度快速冷却至40℃～60℃,可使引物和模板发生结合.由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞.退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度.对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想.引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值（解链温度）=4(G+C)+2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃）在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合, 提高PCR反应的特异性.复性时间一般为30～60sec,足以使引物与模板之间完全结合. ③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性： 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子高于90℃时, DNA合成几乎不能进行. PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合.PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够的.3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min.延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现.对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些. 编辑本段酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶.催化一典型的PCR反应约需酶量（指总反应体积为100ul时）,浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少. dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性.dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M 的缓冲液将其PH调节到～,小量分装, -20℃冰冻保存.多次冻融会使dNTP降解.在PCR反应中,dNTP应为50～200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制）,如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低）,就会引起错配.浓度过低又会降低PCR产物的产量.dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低. 模板（靶基因）核酸模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本.SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸.提取的核酸即可作为模板用于PCR反应.一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增.RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA. Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为～为宜.Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少. 编辑本段工作步骤 PCR反应的基本过程标准的PCR过程分为三步（如图所示）：变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下, 氢键断裂,形成单链DNA 2.退火（复性）（40℃-65℃）：系统温度降低,引物与 DNA模板结合,形成局部双链. 3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′ 端延伸,合成与模板互补的DNA链. 每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍. 现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度. 编辑本段循环参数 1、预变性（Initial denaturation）．模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要,一般95℃加热3-5分钟. 2、引物退火（Primer annealing）退火温度一般需要凭实验（经验）决定. 退火温度对PCR的特异性有较大影响. 3、引物延伸引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）. 延伸时间随扩增片段长短及所使用Taq酶的扩增效率而定. 4、循环中的变性步骤循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性：变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易造成扩增失败. 5、循环数大多数PCR含25-35循环,过多易产生非特异扩增. 6、最后延伸在最后一个循环后,反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链. PCR-PCR常见问题编辑本段电泳检测时间一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚至消失. 假阴性,不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及, ④PCR循环条件.寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究. 模板：①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚.⑤模板核酸变性不彻底.在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改. 酶失活：需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性.需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭. 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因.有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为：①选定一个好的引物合成单位.②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决.如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度.③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效.④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等. Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带. 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul.或100ul,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul 后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败. 编辑本段物理原因变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性；退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率.有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一. 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的.假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高.引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列.靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性.需重新设计引物. 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性.这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外.除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒.所用离心管及样进枪头等均应一次性使用.必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸.二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性.可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除. 出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带.非特异性条带的出现,其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体.二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关.其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增.其对策有：必要时重新设计引物.减低酶量或调换另一来源的酶.降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数.适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性,65℃左右退火与延伸）. 出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带.其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起.其对策有：减少酶量,或调换另一来源的酶.②减少dNTP的浓度.适当降低Mg2+浓度.增加模板量,减少循环次数. 编辑本段克隆PCR产物 1）克隆PCR产物的最优条件是什么? 最佳插入片段：载体比需实验确定.1：1（插入片段：载体）常为最佳比,摩尔数比1：8或8：1也行.应测定比值范围.连接用5ul 2X连接液,50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶,插入片段共10ul.室温保温1小时,或4℃过夜.在这2种温度下,缺T-凸出端的载体会自连,产生蓝斑.室温保温1小时能满足大多数克隆要求,为提高连接效率,需4℃过夜. 2)PCR产物是否需要用凝胶纯化? 如凝胶分析扩增产物只有一条带,不需要用凝胶纯化.如可见其他杂带,可能是积累了大量引物的二聚体.少量的引物二聚体的摩尔数也很高,这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆,而非目的插入片段.为此需在克隆前做凝胶纯化. 3）如果没有回收到目的片段,还需要作什么对照实验? A）涂布未转化的感受态细胞. 如有菌落,表明氨苄失效,或污染上带有氨苄抗型的质粒,或产生氨苄抗型的菌落. B）转化完整质粒,计算菌落生长数,测定转化效率. 例如,将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化.用SOC稀释到1000ul后,用100ul铺板.培养过夜,产生1000个菌落.转化率为：产生菌落的总数/铺板DNA的总量. 铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数.具体而言转化用10ng DNA,用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA,用1/10铺板,共用1 ng DNA.转化率为： 1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug 转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞如没有菌落或少有菌落,感受态细胞的转化率太低. C）如用pGEM-T正对照,或PCR产物,产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞）,表明载体失去T.可能是连接酶污染了核酸酶.T4 DNA连接酶（M1801,M1804,M1794）质量标准好无核酸酶污染,不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换. D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体,连接pGEM-T正对照,转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤,可得100个菌落,其中60%应为白斑,如产生>20-40蓝斑,没有菌落或少有菌落,连接有问题. 4）对照实验结果好,却没有回收到目的片段,实验出了什么问题? A）连接用室温保温1小时,能满足大多数克隆,为提高效率,需4℃过夜. B）插入片段带有污染,使3`-T缺失,或抑制连接,抑制转化.为此,将插入片段和pGEM-T正对照混合,再连接.如降低了对照的菌落数,插入片段需纯化,或重新制备.如产生大量的蓝斑,插入片段污染有核酸酶,使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失. C）插入片段不适于连接.用凝胶纯化的插入片段,因受UV过度照射,时有发生.UV过度照射会产生嘧啶二聚体,不利于连接,DNA必需重新纯化. D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A,后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需.加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A.详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）. E）高度重复序列可能会不稳定,在扩增中产生缺失和重排,如发现插入片段高频率地产生缺失和重排,需用重组缺陷大肠杆菌菌株,如SURE细胞. 编辑本段PCR反应的分类 SOEing-PCR（重叠PCR）重叠区扩增基因拼接法,是基于普通PCR 技术衍生出的一种基因融合和定点突变的有效方法.众所周知,由于引物只需要与模板有效结合,尤其是5’端序列不必与模板完全配对,因此扩增引物的5’端可以添加一种甚至是两种酶切位点,以便于后期克隆.SOEing 法正是利用这一特点,向两个独立基因掺入一段新的序列以达到两个基因出现一个重叠区的目的,3’端的结合使基因融合或定点突变得以实现. RT-PCR（逆转录PCR） RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写.逆转录PCR,或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR）,是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形.在RT-PCR中,一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增.

PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。下面是我整理的关于pcr技术论文，希望你能从中得到感悟!

技术的研究进展

摘要 PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点，已被广泛地应用于水产、微生物检测等许多领域。该文从PCR技术的原理及应用方面进行了综述，并对其发展做出了展望。

关键词 PCR技术;研究进展;应用

中图分类号 Q819 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2012)10-0047-02

PCR(polymerase chain reaction，PCR)即聚合酶链式反应，它是一种体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。1985年，美国Karray等学者首创了PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2-3]。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR(mutiplex PCR)技术[4]、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术[5]、单分子PCR技术[6]。

1 PCR技术原理

PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列、人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94 ℃的条件下变性解链;第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55 ℃退火;第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链[7]。经过这个循环后，合成了新链，可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物的量以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00万~200万倍[1]。PCR反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生。

2 PCR技术的分类

在传统PCR技术的基础上，根据人们的需要以及各个领域的应用要求，又衍生出很多种类的PCR技术。新技术在各领域广泛应用并逐渐改进，为进一步的研究提供了基础。

实时荧光定量PCR技术

1996年，学者经过研究，在传统PCR技术的基础上，首创了实时荧光定量PCR技术，新技术已经应用至医学领域、分子生物学和其他基础研究领域。实时荧光定量PCR技术基于传统技术的优势，还具有实时性、准确性、无污染，实现了自动化操作和多重反应，是PCR技术研究史上从定性到定量的飞跃[8]。

荧光定量PCR技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助于荧光信号，累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[9]。实时监测这一特点是常规PCR技术所不具有的，因为其对扩增反应不能进行随时的检测。常规PCR技术的扩增终产物需要在凝胶电泳等条件下才能进行，无法对起始模板进行准确的定量，而荧光定量PCR技术的反应进程可以根据荧光信号的变化做出准确的判断[10-11]。一个PCR循环反应结束之后，定量PCR仪可以收集1个荧光强度信号，荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化情况，这样就可以得到1条荧光扩增曲线[12]。荧光信号在指数扩增阶段，PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，然后进行定量分析[13]。

多重PCR技术

多重PCR(mutiplex PCR)技术是PCR技术的一种，为同一管中加入多对特异性引物，与PCR管内的多个模板反应，在一个PCR管中同时检测多个目标DNA分子。多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段[14]。

在同一反应体系中，多重PCR技术进行多个位点的特异性扩增时，引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面，如果能选择适宜的反应体系和反应条件，可极大地提高多重PCR的扩增效果[15]。主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提质量也影响多重PCR扩增效率，如DNA抽提不干净或降解都将影响PCR扩增效果[16]。

单分子PCR技术(SM-PCR)

单分子PCR技术是在传统PCR技术的基础上发展的，基本循环过程相同，但在反应条件、模板数量、DNA 聚合酶选择、引物设计方面具有不同点。该技术是以少量或单个DNA分子为模板进行的PCR[17]。

单分子PCR技术反应中，DNA 模板浓度极低，这就要求模板有较高的质量。因为这是试验成败的决定性因素。在设计引物时，应该严格控制GC的含量和Tm值，同时尽量避免引物间存在可配对序列。在反应混合物模板数极低的情况下，若引物之间存在少量配对序列，扩增时极易形成二聚体，使反应无法进行，得不到所需要的产物[18]。由于单分子PCR技术反应的变性温度(96~98 ℃)大多比常规PCR技术(94 ℃)略高，因而对DNA 聚合酶热稳定性的要求也更加严格，需要有较好的热稳定性，以防止温度过高而使其失活。其变性时间(5~15 s)、退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术[17]。

3 PCR技术的应用

PCR技术在水产上的应用

基因表达是检测某个基因在不同发育期或不同组织中的表达量变化，或受到某种试验处理过程中的影响而出现表达量变化的情况。有学者应用real-time PCR技术研究碳水化合物含量对翘嘴红鲴糖代谢酶G6Pase、GK以及PEPCK表达量的影响[19-21]，研究结果可为翘嘴红鲴饲料配方中的最合适糖含量提供理论依据。孙淑娜等[22]研究叶酸拮抗剂对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响，表明叶酸拮抗剂对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。Sawyer et al[23]以斑马鱼的未受精卵、胚胎、仔鱼和成鱼为研究材料，采用实时荧光定量PCR技术，检测了P450aromA和P450aromB在不同组织的表达量，表明在各组织中均有2种基因的表达，但表达量显著不同，呈现组织特异性。

PCR技术在微生物检测上的应用

1990年，Bej et al[24]在利用多重PCR的方法检测了Leg-ionella类菌种和大肠类细菌，其结果是通过点对点方法固定的多聚dT尾捕捉探针和生物素标记的扩增DNA进行杂交来检测的。张志东等检测口蹄疫病毒(FMDV)持续性感染的带毒动物，表明实时荧光定量PCR技术具有快速检测、准确、客观等优势，较优于传统的检测方法[25-26]。Metzger-Boddien et al[27]对PCR-ELISA的方法进行了评价，结果显示，样品中沙门氏菌的检出率可以达到98%。

4 展望

传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来，已被广泛应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进与完善，荧光定量PCR技术将会逐渐完善并广泛应用。多重PCR技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中具有重要作用;未来的研究主要集中在去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面，其次是整合应用多重PCR与其他技术，必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景。

5 参考文献

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分子生物学杂志

期刊名 molecular biology of the cell 出版周期: 半月刊中科院杂志分区细胞生物学分类下的 3 区期刊 ,该杂志由于刊文量越来越大，影响力大大降低，由开始的7分以上一路下滑近四年影响因子:2013年度 2012年度 2011年度 2010年度出版社或管理机构杂志由 AMER SOC CELL BIOLOGY 出版或管理。 ISSN号：1059-1524 杂志简介/稿件收录要求 Molecular Biology of the Cell, the journal owned and published by The American Society for Cell Biology, publishes papers that describe and interpret results of original research concerning the molecular aspects of cell structure and function. Studies whose scope bridges several areas of biology are particularly encouraged, for example cell biology and genetics. The aim of the Journal is to publish papers describing substantial research

molecular biology of the cell是关于细胞生理、分子生物学的杂志。该杂志在 CELL BIOLOGY (细胞生物学) 同类期刊中的影响因子排名第 51 位。期刊详情：NLM ID：9201390 出版国家：United States 出版地：Bethesda, MD 出版商：American Society for Cell Biology 出版周期：月刊创刊年份：1992 语言：英语 SCI收录：YES ISSN：1059-1524 (印刷版)1939-4586 (电子版) 1059-1524 (ISSNLinking) 目前收录于：IM PubMed收录：YES 研究领域：细胞生理、分子生物学

American Journal of Preventive Medicine《美国预防医学杂志》美国ISSN:0749-3797，1984年创刊，全年8期，Elsevier Science出版社，SCI收录期刊，SCI 2005年影响因子。刊载预防医学基础和应用研究论文。涉及的学科包括流行病学、遗传学、营养学、毒理学和社会科学；应用的领域包括卫生管理、传染病防治、职业医学、环境卫生、航空航天医学、老年病、母婴保健、计划生育等。Annales de Génétique《遗传学纪事》法国ISSN:0003-3995,1958年创刊，全年4期，Elsevier Science出版社，SCI收录期刊，SCI 2005年影响因子。法国遗传学会的会刊。刊载遗传学研究论文、技术札记、文摘和消息。Biochimie《生物化学》法国ISSN:0300-9084，1914年创刊，全年12期，Elsevier Science出版社，SCI收录期刊，SCI 2005年影响因子。刊载有关酶学、遗传学、免疫学、微生物学和高分子结构等方面的研究论文及评论。Biomolecular Engineering《生物分子工程》荷兰ISSN:1389-0344，1983年创刊，全年6期，Elsevier Science出版社，SCI、EI收录期刊，SCI 2005年影响因子，2005年EI收录30篇。研究分子生物学、细胞生物学、免疫学、生物化学和遗传学中使用的新技术、材料及器械。刊载研究论文和综论。Cancer Genetics and Cytogenetics《癌遗传学与细胞遗传学》美国ISSN:0165-4608, 1979年创刊，全年16期，Elsevier Science出版社，SCI收录期刊，SCI 2005年影响因子。刊载癌细胞与分子的基础研究论文。反映癌遗传学和细胞遗传学领域的最新研究进展。Current Opinion in Genetics & Development《遗传学与发育新见》英国ISSN: 0959-437X, 1991年创刊，全年6期，Elsevier Science出版社，SCI收录期刊，SCI 2005年影响因子。著名遗传学权威专业性学术期刊，SCI收录期刊最高影响因子100种之一，刊载分子遗传学、疾病遗传学、遗传组织与变异、细胞繁殖、发育模式与机理等方面的研究进展评论。附近期有关学科主要论文索引。Developmental Biology《发育生物学》美国ISSN:0012-1606，1959年创刊，全年24期，Elsevier Science出版社，SCI收录期刊，SCI 2005年影响因子。著名生物学权威专业性学术期刊，从分子、细胞和遗传的水平上研究动植物发育、变异、生长、再生和组织修复的机能。发表论文。European Journal of Medical Genetics《欧洲医学遗传学》ISSN: 1769-7212，2005年创刊，Elsevier Science出版社，主要刊载关于给类人研究和医学遗传学以及基因实验模型方面的论文。European Journal of Pharmacology: Molecular Pharmacology《欧洲药理学杂志：分子药理浙江工业大学图书馆信息咨询部编 Elsevier Science 出版社期刊投稿指南 60学分册》荷兰ISSN:0922-4106，1989年创刊，全年12期，Elsevier Science出版社，刊载分子水平的药理学、药效学、神经系统药理学等方面的研究论文和简报，内容涉及分子神经传递，信号转导机理，蛋白质受体的遗传反应等。Human Immunology《人类免疫学》美国ISSN:0198-8859，1980年创刊，全年12期，Elsevier Science出版社，SCI收录期刊，SCI 2005年影响因子。刊载人类免疫系统和其他脊椎动物模拟系统的研究论文。侧重于组织适应性和免疫遗传学的研究。Infection, Genetics and Evolution《传染、遗传和进化》荷兰ISSN:1567-1348，2001年创刊，全年4期，Elsevier Science出版社。主要刊载遗传学领域，包括疾病等的传染、遗传、进化等方面的论文。Journal of Molecular Biology《分子生物学杂志》英国ISSN:0022-2836，1959年创刊，全年50期，Elsevier Science出版社，SCI收录期刊，SCI 2005年影响因子。刊载原始论文，论述分子生物学的各个方面，涉及基因结构、复制及解译机理、蛋白质、核酸等大分子的结构和性质、细胞和发育生物学、分子遗传学等。Molecular Genetics and Metabolism《分子遗传学与新陈代谢》美国ISSN:1096-7192，1976年创刊，全年12期，Elsevier Science出版社，SCI收录期刊，SCI 2005年影响因子。1998年前刊名为Biochemical and Molecular Medicine，从生物化学和分子生物学角度对人体正常代谢和代谢病进行研究。发表原始论文、短评和简讯。Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis《突变研究－突变原理与分子结构》荷兰ISSN:1388-2112，1964年创刊，Elsevier Science出版社。主要刊载关于包括遗传变异基因的作用，并体现突变，可变化合物的代谢方式到以不同的身份和修复受损DNA的细胞复制等方面的论文。Mutation Research/Genetic Toxicology《突变研究—遗传毒理学》ISSN: 0165-1218，Elsevier Science出版社，主要刊载化学物质的遗传毒性测试，以及对人类群体的遗传毒性效应、发育、进化的监督，监控等方面方面的文章。Mutation Research/Genetic Toxicology《突变研究—遗传毒理学》ISSN: 0165-1218，Elsevier Science出版社，主要刊载化学物质的遗传毒性测试，以及对人类群体的遗传毒性效应、发育、进化的监督，监控等方面方面的文章。Mutation Research/Reviews in Mutation Research《突变研究－突变研究评论》荷兰ISSN:1383-5742，1964年创刊，全年6期，Elsevier Science出版社，SCI收录期刊，SCI 2005年影响因子。主要刊载突变和疾病的关系，涵盖人类基因组研究进展(包括演变和功能基因突变检测技术)与临床应用遗传学、基因治疗、环境健康风险评估，遗传毒理学和环境突变(包括遗传因素调节活性剂环境)等方面的论文。Trends in Genetics《遗传学趋势》英国ISSN:0168-9525，1985年创刊，全年12期，Elsevier Science出版社，SCI收录期刊，SCI 2005年影响因子。权威专业性学术期刊，SCI收录期刊最高影响因子100种之一，刊载分子遗传学、变异、发育方面的评论、札记和书评，涉及临床遗传学、遗传学与社会、应用技术与人口遗传学等问题。

American Journal of Preventive Medicine《美国预防医学杂志》美国ISSN:0749-3797，1984年创刊，全年8期，Elsevier Science出版社，SCI收录期刊，SCI 2005年影响因子。刊载预防医学基础和应用研究论文。涉及的学科包括流行病学、遗传学、营养学、毒理学和社会科学；应用的领域包括卫生管理、传染病防治、职业医学、环境卫生、航空航天医学、老年病、母婴保健、计划生育等。Annales de Génétique《遗传学纪事》法国ISSN:0003-3995,1958年创刊，全年4期，Elsevier Science出版社，SCI收录期刊，SCI 2005年影响因子。法国遗传学会的会刊。刊载遗传学研究论文、技术札记、文摘和消息。Biochimie《生物化学》法国ISSN:0300-9084，1914年创刊，全年12期，Elsevier Science出版社，SCI收录期刊，SCI 2005年影响因子。刊载有关酶学、遗传学、免疫学、微生物学和高分子结构等方面的研究论文及评论。Biomolecular Engineering《生物分子工程》荷兰ISSN:1389-0344，1983年创刊，全年6期，Elsevier Science出版社，SCI、EI收录期刊，SCI 2005年影响因子，2005年EI收录30篇。研究分子生物学、细胞生物学、免疫学、生物化学和遗传学中使用的新技术、材料及器械。刊载研究论文和综论。Cancer Genetics and Cytogenetics《癌遗传学与细胞遗传学》美国ISSN:0165-4608, 1979年创刊，全年16期，Elsevier Science出版社，SCI收录期刊，SCI 2005年影响因子。刊载癌细胞与分子的基础研究论文。反映癌遗传学和细胞遗传学领域的最新研究进展。Current Opinion in Genetics & Development《遗传学与发育新见》英国ISSN: 0959-437X, 1991年创刊，全年6期，Elsevier Science出版社，SCI收录期刊，SCI 2005年影响因子。著名遗传学权威专业性学术期刊，SCI收录期刊最高影响因子100种之一，刊载分子遗传学、疾病遗传学、遗传组织与变异、细胞繁殖、发育模式与机理等方面的研究进展评论。附近期有关学科主要论文索引。Developmental Biology《发育生物学》美国ISSN:0012-1606，1959年创刊，全年24期，Elsevier Science出版社，SCI收录期刊，SCI 2005年影响因子。著名生物学权威专业性学术期刊，从分子、细胞和遗传的水平上研究动植物发育、变异、生长、再生和组织修复的机能。发表论文。European Journal of Medical Genetics《欧洲医学遗传学》ISSN: 1769-7212，2005年创刊，Elsevier Science出版社，主要刊载关于给类人研究和医学遗传学以及基因实验模型方面的论文。European Journal of Pharmacology: Molecular Pharmacology《欧洲药理学杂志：分子药理浙江工业大学图书馆信息咨询部编 Elsevier Science 出版社期刊投稿指南 60学分册》荷兰ISSN:0922-4106，1989年创刊，全年12期，Elsevier Science出版社，刊载分子水平的药理学、药效学、神经系统药理学等方面的研究论文和简报，内容涉及分子神经传递，信号转导机理，蛋白质受体的遗传反应等。Human Immunology《人类免疫学》美国ISSN:0198-8859，1980年创刊，全年12期，Elsevier Science出版社，SCI收录期刊，SCI 2005年影响因子。刊载人类免疫系统和其他脊椎动物模拟系统的研究论文。侧重于组织适应性和免疫遗传学的研究。Infection, Genetics and Evolution《传染、遗传和进化》荷兰ISSN:1567-1348，2001年创刊，全年4期，Elsevier Science出版社。主要刊载遗传学领域，包括疾病等的传染、遗传、进化等方面的论文。Journal of Molecular Biology《分子生物学杂志》英国ISSN:0022-2836，1959年创刊，全年50期，Elsevier Science出版社，SCI收录期刊，SCI 2005年影响因子。刊载原始论文，论述分子生物学的各个方面，涉及基因结构、复制及解译机理、蛋白质、核酸等大分子的结构和性质、细胞和发育生物学、分子遗传学等。Molecular Genetics and Metabolism《分子遗传学与新陈代谢》美国ISSN:1096-7192，1976年创刊，全年12期，Elsevier Science出版社，SCI收录期刊，SCI 2005年影响因子。1998年前刊名为Biochemical and Molecular Medicine，从生物化学和分子生物学角度对人体正常代谢和代谢病进行研究。发表原始论文、短评和简讯。Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis《突变研究－突变原理与分子结构》荷兰ISSN:1388-2112，1964年创刊，Elsevier Science出版社。主要刊载关于包括遗传变异基因的作用，并体现突变，可变化合物的代谢方式到以不同的身份和修复受损DNA的细胞复制等方面的论文。Mutation Research/Genetic Toxicology《突变研究—遗传毒理学》ISSN: 0165-1218，Elsevier Science出版社，主要刊载化学物质的遗传毒性测试，以及对人类群体的遗传毒性效应、发育、进化的监督，监控等方面方面的文章。Mutation Research/Genetic Toxicology《突变研究—遗传毒理学》ISSN: 0165-1218，Elsevier Science出版社，主要刊载化学物质的遗传毒性测试，以及对人类群体的遗传毒性效应、发育、进化的监督，监控等方面方面的文章。Mutation Research/Reviews in Mutation Research《突变研究－突变研究评论》荷兰ISSN:1383-5742，1964年创刊，全年6期，Elsevier Science出版社，SCI收录期刊，SCI 2005年影响因子。主要刊载突变和疾病的关系，涵盖人类基因组研究进展(包括演变和功能基因突变检测技术)与临床应用遗传学、基因治疗、环境健康风险评估，遗传毒理学和环境突变(包括遗传因素调节活性剂环境)等方面的论文。Trends in Genetics《遗传学趋势》英国ISSN:0168-9525，1985年创刊，全年12期，Elsevier Science出版社，SCI收录期刊，SCI 2005年影响因子。权威专业性学术期刊，SCI收录期刊最高影响因子100种之一，刊载分子遗传学、变异、发育方面的评论、札记和书评，涉及临床遗传学、遗传学与社会、应用技术与人口遗传学等问题。去邮局顶或者从网上面，当当网什么的就能订

药学分子生物学论文

中山大学的本科专业：药学，四年的专业课程如下：理学学士学位、四年、广州东校区。1-2：高等数学二I、无机化学、药学导论、分析化学、基础生物学、基础化学实验1-3：高等数学二II、有机化学、人体解剖与生理学2-2：现代分析技术与应用、药学分子生物学、生物化学与分子生物学实验、生物化学、细胞生物学、物理化学2-3：数理统计方法:、病理生理学、微生物与免疫学、药物化学I、生药学3-2：药理学I、药剂学I、天然药物化学、药事管理学、中医药学概论3-3：药物分析、临床药理学、药物治疗学、药物毒理学、生物药剂学与药代动力学、药物合成策略与实例、药物制剂设计策略与实例、药理学案例分析、生物技术制药、药物发现中的关键技术、药用高分子材料与新型给药系统、药理学进展4-2：药物化学II、药理学II、药剂学II4-3：毕业论文

生化，药化，药理

中医药学毕业论文题目

要想写好论文，就要从定一个好的题目开始。以下是我分享的中医药学毕业论文题目，一起来学习吧！

一、中医药学毕业论文题目

中药方剂治疗宫颈糜烂的临床疗效观察

《组合中药学》及其理论系统的建立

—种基于寒性对照抗原的中药药性物质基础研究的新方法

中药外敷治疗静脉炎的疗效观察与护理

中药电泳指纹图谱的构建与应用研究

加入WTO条件下中药行业发展对策研究

中药电导入对关节影响的实验研究

中药质量控制多维指纹图谱共有峰率和变异峰率双指标序列分析法研究液相色谱和光谱法结合化学计量学用于中药指纹图谱研究

中药安全性问题探悉

论中药的专利保护

论中药的双向调节

攻下清热活血中药对重症胰腺炎大鼠胰腺肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β基因表达的影响

近年来我国中药的安全性评价研究现状

中药超微细化及有效成分溶出特性研究

肝外DHBV复制治疗学意义及中药体外抗肝纤维化筛选平台的探讨抗IBDV中药筛选、作用机制及其临床应用研究

中药对骨髓间充质干细胞免疫调节作用干预的实验研究

中药细胞级微粉碎技术在中药制剂中的应用

针刺中药联合治疗在围绝经期失眠症中的临床研究

基层医院使用小包装中药饮片探讨

中药（新药）临床疗效综合评价的方法学研究

中药注射剂不良反应分析

中药注射剂不良反应的常见原因分析

中药治疗下肢骨折术后肿胀118例临床疗效探讨

中药企业创新路径选择——以香港维特健灵和培力为借鉴

浅谈中药制剂标准化与质量控制科学化

面向新版GMP的中药饮片生产质量管理研究

薄层扫描色谱在中药质量评价中应用的研究

中药鉴定技术的研究进展

补肾中药对体外培养成骨细胞增殖和功能的影响

中药公司投资价值分析

中药外敷及口服扶他林联合微波治疗膝骨性关节炎的护理

我院中药注射剂的应用和不良反应的分析

中药骨康对破骨细胞活性及凋亡的影响

中药对LPS诱导单核巨噬细胞增殖的抑制作用及其差异蛋白质分析中药四性的研究（Ⅰ）

中药饮片在临床应用中存在的问题及对策

中药对细胞色素P450影响的研究进展

术前、术后使用中药结合外剥内扎治疗混合痔的临床效果观察三伏天应用中药穴位敷贴治疗过敏性鼻炎的疗效观察及护理

拟除虫菊酯生殖毒性及中药干预作用的研究

三种中药有效成份抗人绒癌耐药细胞JAR/MTX作用的体外研究

中药“通腑洁肠汤”对不全性肠梗阻结直肠癌术前肠道准备的效果观察两种中药方剂联合甲氨喋呤治疗异位妊娠的作用探讨

中药四气理论的现代研究

二、中药治疗肝癌研究现状论文主要内容

原发性肝癌是临床上常见的恶性肿瘤之一。我国原发性肝癌多具有乙型肝炎和肝硬化背景，起病隐匿，进展迅速，确诊时往往已是晚期，患者生存期较短，预后差。积极探寻符合我国国情，高效且不良反应少的系统化中西医联合治疗方案是肝癌治疗的.重要课题。

对于肝癌的认识，中医认为属于“症瘕”“、积聚”、“黄疸”、“肝积”的范畴。已有临床疗效观察研究表明，中医药治疗肝癌的优势一方面在于能有效稳定病情，减轻毒副作用，改善临床症状，延长患者带瘤生存时间，使部分患者肿瘤缩小;另一方面治疗费用相对低廉。因此中医药治疗成为肝癌治疗中不可或缺的重要组成部分。

1中药治疗肝癌的理论基础中医认为肝癌的病因及病机为外受寒邪、损伤脾胃、肝气郁滞、气滞血瘀、结而成积。中医治疗应以清热解毒和活血化瘀为主，同时配合益气健脾和疏肝理气，并与手术、介入、放化疗等其他方法联合应用，可起到减毒增效之功效。具有益气健脾、活血化瘀、清热解毒、软坚散结、柔肝止痛等功效的中药经常被用于肝癌的治疗并取得临床疗效，临床应用及现代药理学研究较多为“有毒”中药及活血化瘀中药。

“有毒”中药与肝癌治疗中医认为恶性肿瘤与“毒邪”有关，因此“以毒攻毒”为重要治疗方法，即用峻猛中药以攻邪。历代医家有颇多论述，如虞抟《医学正传》中“大毒之病，必用大毒之药以攻之”[1]，明代罗天益《卫生宝鉴》“凡治积非有毒之品攻之则不可”[2]。这种“以毒攻毒”的方法目前在肝癌的治疗中也经常应用，常用的此类中药有、蜂房、全蝎、水蛭、蜈蚣、蟾蜍、守宫、常山、半夏、天南星、马钱子、巴豆、附子和乌头等。

活血化瘀中药与肝癌治疗气滞血瘀证是肝癌患者常见临床症候，历代医家常从气血运行失常而致气滞血瘀来探讨肿瘤形成的病机。如《圣济总录》认为“瘤之为义，留置而不去也，气血流行不失其常，则形体平和，或余赘及郁结壅塞，则乘应投隙，瘤所以生”[3]。王清任《医林改错》认为“肚腹结块，必有形之血也，血受寒则凝结成块，血受热则煎熬成块”[4]。

因此行活血化瘀也是中医药治疗肝癌的常用方法，常用中药有丹参、赤芍、三棱、水蛭和等。

中药治疗肝癌具有广泛的理论基础，在浩如烟海的中医古籍中不乏与肝癌相关病症的治疗，这些相关病症与肝癌及其并发症的对应是否精确还值得商榷。加强文献学的进一步细化整理研究是深入发掘中医治疗肝癌理论基础必不可少的环节，也是增强中医治疗肝癌说服力的重要途径。

2中药治疗肝癌的实验研究中药治疗肝癌的实验研究主要包括中药复方和单味中药的研究。随着分子生物学广泛应用于中医药研究，利用现代分子生物学技术研究中医药防治肝癌的机制，筛选抗肿瘤中药复方及单味中药成为重要的研究方向。

中药复方抗肝癌作用机制的研究历代古方中可用于肝癌治疗的中药复方较多，临床上常常根据肝癌的不同证型，选取与之对应的方剂进行加减治疗。如李江等[5]通过研究证实，采用水煎法、梯度乙醇提取法及醇水法从小柴胡汤中获得的提取物对小鼠H22肝癌实体瘤生长有明显的抑制作用，且具有提高荷瘤宿主免疫功能的作用。季幸姝等[6]通过观察膈下逐瘀汤对肝癌Bel7402细胞和大鼠肝癌组织中丝/苏氨酸激酶蛋白及FIEN编码蛋白表达的影响，发现P13K/Akt信号转导通路相关蛋白PA kt水平的降低和PT EN蛋白水平的升高可能是膈下逐瘀汤抗肝癌的主要作用机制之一。杜标炎等[7]研究发现六味地黄丸联用对小鼠移植性肝癌自杀基因治疗具有一定的增效作用，其疗效优于单纯自杀基因疗法或单纯六味地黄丸治疗。进一步研究发现，六味地黄丸含药血清对自杀基因系统10% tk/GCV杀伤大鼠肝癌CBRH7919细胞具有协同增效作用，且有一定的量效关系。

中药复方治疗肝癌的疗效不可否认，但目前存在的问题是中药复方成分的复杂性使其作用机制难以应用单一的药理途径阐明。以辨证论治为特色的中医个体化诊疗要得到推广，必须进行具有统计学说服力的临床研究，解决这个问题应使临床研究对象的选取进一步细化，在此基础上使中药复方规范化，同时通过网络药理学等方法对中药治疗作用产生的人体综合生物效应进行整体观察和分析，增强中药治疗肝癌有效性的可信度和可重复性。

单味中药抗肝癌作用机制的研究中药单体能在诱导肝癌细胞凋亡、抗肝癌细胞侵袭及转移、诱导肝癌细胞分化、抗肿瘤血管生成、抑制癌基因表达、促进抑癌基因表达、逆转肿瘤多药耐药等多个环节抑制肝癌的发生和发展。陈小义等[8]研究发现， mol/L及以上浓度蟾蜍灵对SMMC 7721细胞具有显著细胞毒作用，细胞生长相关基因P21wafl/cipl在蟾蜍灵诱导下表达上调，同时受P21wafl/cipl调控的增殖细胞核抗原的表达下降，二者呈负相关，提示中药可通过直接杀伤肝癌细胞和抑制其增殖而发挥抗癌效应。黄应申等[9]以10 mmol/L脂蟾毒配基处理Bel 7402细胞24 h后，发现癌细胞出现凋亡的形态变化，其凋亡率明显高于对照组细胞;脂蟾毒配基引起线粒体膜电位下降，释放入胞质中的细胞色素c增多，促进Caspase 3蛋白活化，抑制Bcl 2蛋白表达，诱导细胞凋亡，其诱导凋亡作用可能通过线粒体通路实现。黄炜等[10]探讨了18 β-甘草次酸和甘草酸对Bel 7402细胞增殖的抑制和诱导分化作用，揭示二者有抑制人肝癌细胞增殖和诱导分化的作用。魏志霞[11]研究发现，川芎嗪可提高SMMC7721/多柔比星细胞内化疗药物的浓度，增强多柔比星作用，表明从中药筛选出低毒的多药耐药逆转剂是可能的。

何芳等[12]探讨人参皂苷Rg3联合三氧化二砷对肝癌裸鼠移植瘤模型的治疗作用，发现人参皂苷Rg3能通过抑制肿瘤新生血管形成，明显降低肿瘤内微血管密度;人参皂苷Rg3与As203联合应用能明显抑制裸鼠肝癌移植瘤的生长。罗明等[13]通过采用腹腔注射苦参碱和氧化苦参碱观察二乙基亚硝胺诱发肝癌的大鼠肝脏病理改变、肝表面癌结节数和血清ALT、GGT、ALP 的变化，发现苦参碱和氧化苦参碱组的大鼠体重明显高于模型组，肝表面癌结节数、肝/体重比和血清ALT、GGT 明显低于模型组(P<)。而 ALP 升高，说明苦参碱和氧化苦参碱能延缓二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌形成，保护肝细胞免受损伤。

单味中药治疗肝癌的研究较中药复方研究更为深入，其原因在于相对于中药复方，单味中药的有效成分相对容易确定，其量效关系及药理学、药代动力学研究较中药复方易进行。目前的问题之一在于此类研究较多采取的是某味中药的提取物。尽管提取物能在某一方面说明该味中药的生物学效应的机制，但表现的生物学效应与该味中药相比有多少差距尚不能明确;另一方面单味中药提取物的研究往往是发现了某一化学成分的生物学效应或临床疗效，如何将其与中医的辨证论治治疗肝癌结合起来是我们不得不面对的问题。要解决这个问题，须要增强中药治疗肝癌研究的科学说服力，这仍有不易克服的困难。类似于中药药性本质及其临床效应生物学基础的相关研究为单味中药治疗肝癌的研究提供了新的思路和方法。

3中药治疗肝癌的临床研究中药联合放化疗治疗肝癌的研究顾本宇[14]通过观察益气健脾疏肝中药联合化学药物动脉灌注治疗中晚期原发性肝癌的临床疗效，发现中药联合化疗药物治疗组的稳定率为，明显高于对照组的(P<);治疗组 12、18、24 个月的生存率与对照组比较，差异有统计学意义(P<)。

尤建良等[15]通过观察中药调气行水方联合顺铂、白细胞介素-2腹腔内注射治疗肝癌腹水的临床疗效，发现该疗法能有效控制腹水，改善体力状况，提高患者生命质量，缓解常见临床症状，提高疾病控制率，提示配合中药能减轻化疗药物及生物反应调节剂的毒副反应。

目前中药联合化疗治疗肝癌的研究主要在临床有效性方面，阐述其有效机制的研究尚少，进一步深入研究须说明为什么联合中药会有较好的效果，这一点须要借助分子生物学等技术手段来寻找中药疗效的效应物质基础及作用靶标，这也是今后中药临床有效性的重点研究方向。

中药联合手术治疗肝癌的研究目前肝癌治疗普遍采用的根治性治疗方式为手术切除和肝移植，约30%～40%患者采用此法，肝移植的总体疗效优于手术切除治疗。现阶段肝移植治疗肝癌的最佳适应证仍为米兰标准，但由于移植器官不足，对移植适应证的扩大应慎之又慎，术后的复发和转移是影响疗效的主要因素。通过使用药物预防或延迟肿瘤的复发，针对肿瘤生物发生途径中的关键分子进行靶向治疗也可使肝癌治疗发展日趋完善[16]。中药联合手术治疗肝癌为有效的治疗方式，如陈立武等[17]通过观察中药全身治疗与手术相结合的协同作用，将60例患者随机分为2组，中西医结合治疗组(30例)在手术前1周开始复方中药治疗并于术后续行中药治疗，对照组(30例)只作单纯手术治疗，比较2组的疗效、生存率及并发症。结果发现治疗组与对照组相比，24、36 个月生存率有显著差异(P<)。

提示在肝癌围手术期中应用复方中药可减少并发症，提高手术疗效及累计生存率。

中药复方联合手术治疗肝癌的研究更多集中在对症候的改善、生存率的影响、并发症的减少等方面，存在的问题有：相关临床资料的样本数较少;

症候学改善等尚未建立统一的评价体系;未能深入分析其疗效的生物学机制等。进一步的研究须要扩大样本数量，建立症候学统一客观化评价体系，同时深入研究其疗效改善的机制，才能增强中药联合手术治疗肝癌的可信度和说服力。

中药介入治疗肝癌的研究中晚期肝癌患者常因伴有明显的器质性和功能性改变，难以进行手术治疗。肝癌介入治疗作为中晚期肝癌患者可选择的重要方法，能够延长患者生存期，改善生活质量。

存在的问题为化疗介入药物多可造成肝功能不同程度的损害，介入药物的不良反应又严重影响中远期的疗效。因此介入治疗中如何减少肝功能损害是治疗的重点。通过大量临床实践，目前已筛选出许多具有抗肿瘤作用的中药及其有效成分，与肝动脉化疗栓塞介入疗法结合进行研究，为肝癌的介入治疗提供了新的方法和手段。

李琦等[18]进行了去甲素微球介入治疗大鼠肝癌的有关研究，结果显示此疗法对大鼠肝癌有较好治疗作用，其作用机制与栓塞肿瘤微血管，缓慢释放去甲素，诱导肿瘤细胞凋亡和下调肝肿瘤细胞Ki-67的表达，从而抑制肿瘤细胞增殖相关。

冯敢生等[19]将白及用于肝动脉栓塞治疗肝癌，并与明胶海绵对照。结果表明，白及具有强大的栓塞作用，侧枝循环形成均在6个月以上，介入治疗间隔时间长，肿瘤坏死、缩小率及1、2、3 年生存率均优于明胶海绵。陈武进等[20]研究认为，采用酸钠联合常规化疗药物介入治疗中晚期肝癌患者可明显降低甲胎蛋白，提高疗效，同时减轻化疗药物对骨髓的抑制。以上研究表明，中药介入治疗具有增强免疫、抗炎、抗病毒和促进黏膜修复等作用，对肝功能无明显损害，无骨髓抑制，并有升高白细胞等作用。这些优点使中药可能部分或完全取代西药，成为肝癌介入治疗较理想的栓塞剂。

中药在肝癌的介入治疗中具有独特优势。中药介入治疗能减轻不良反应，使患者生存期延长，生存质量提高，而且中药资源丰富，经济合理，有利于减轻治疗负担。目前存在的问题是，中药的介入治疗总体上发展仍不够成熟。进一步的研究可从规范治疗方案，合理选择介入治疗药物，建立严格的疗效评价标准，研发抗癌中药新制剂和新剂型等方面进行。

其他中药治疗肝癌的研究中药用于肝癌的治疗方法除口服和介入注射外，还有许多新的途径可用于肝癌及其并发症的治疗。中药穴位注射治疗肝癌也被证明有明确的临床疗效，如胡军和瞿晓东[21]每天1～2次以丹参注射液、柴胡注射液或黄芪注射液进行双侧足三里、阳陵泉、曲池及内关注射。内关穴1 ml，其他穴位2～4 ml，4穴位交替进行，能够明显缓解晚期肝癌疼痛。中药瘤体内注射也可用于晚期肝癌的治疗，如涂小煌和戴西湖[22]曾应用超声引导下瘤体内注射去甲素治疗中晚期原发性肝癌，取得较好疗效。

中药治疗肝癌的方法较多，形式多样，从方法学的角度讲，有着更大的研究价值和意义。目前的研究须要注意如何更好地将这些方法进行合理的推广应用，同时临床疗效的观察还须进行严谨的实验设计，以增强中药治疗肝癌的有效性和可信度。

对于中药治疗肝癌的深入研究，须要更细化更严谨的文献研究为治法用方提供更有说服力的理论支持。在此基础上，借助分子生物学等技术手段，运用网络药理学等研究方法，从多学科交叉研究中药治疗肝癌的有效性出发，探寻中药疗效可能的效应物质基础及作用靶标，对单味中药及复方治疗肝癌的综合生物学效应进行整体观察和分析，进一步合理选择治疗药物，规范治疗方案，建立严格的疗效评价标准，深入研发抗癌中药制剂和剂型，充分发挥中药治疗肝癌的优势.

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