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论文批注是写论文时把写论文的感想、疑难问题，随手批写在书中的空白地方,以帮助理解，深入思考或者便于日后修改论文的东西。论文批注是记录论文心得体会精读文章常用的一种方法。做批注的方法1.赏析语言特色（如修辞生动、动词准确、修饰语精当、哲理深刻）2.评点人物3.生发联想4.剖析写法5.批判文本6.质疑问难
还是建议加上批注。避免引起不必要的麻烦。论文是一个汉语词语，拼音是lùn wén，古典文学常见论文一词，谓交谈辞章或交流思想。当代，论文常用来指进行各个学术领域的研究和描述学术研究成果的文章，简称之为论文。它既是探讨问题进行学术研究的一种手段，又是描述学术研究成果进行学术交流的一种工具。它包括学年论文、毕业论文、学位论文、科技论文、成果论文等。
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1、 自噬的定义： 细胞自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体(动物）或液泡（酵母和植物）中进行降解并得以循环利用。2、 自噬的过程： 从一张图片开始： 步骤1：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一个由2层脂双层组成的碗，可在电镜下观察到，被称为Phagophore，是自噬发生的铁证之一。 步骤2：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，我把它翻译为“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征：一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。 步骤3：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（加了个“可”字，意思是这种情况不是必然要发生的）。 步骤4：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。3 、自噬的特性： 1）自噬是细胞消化掉自身的一部分，即self-eating，初一看似乎对细胞不利。事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。这些诱发因素很多，也是研究的热门。既有来自于细胞外的（如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。 2）自噬过程很快，被诱导后8min即可观察到自噬体（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶体（autolysosome）基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。 3）自噬的可诱导特性：表现在2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。 4）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显著区别 5）“捕获”胞浆成分的非特异性：由于自噬的速度要快、量要大，因此特异性不是首先考虑的，这与自噬的应急特性是相适应的。 6）自噬的保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之间（包括肿瘤细胞），自噬都普遍被保留下来（谁不喜欢留一手呢？）。4 、自噬过程的调控： 从上面总结的自噬特点中可以看出，自噬这一过程一旦启动，必须在度过危机后适时停止，否则，其非特异性捕获胞浆成分的特性将导致细胞发生不可逆的损伤。这也提醒我们在研究自噬时一定要动态观察，任何横断面的研究结果都不足以评价自噬的活性。目前，已经报告了很多因素能诱导细胞发生自噬，如饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等等，这么多刺激信号如何传递的、哪些自噬蛋白接受信号、又有哪些自噬蛋白去执行等很多问题都还在等待进一步解答中。 关于传递自噬信号的通路目前比较肯定的有： 抑制类 1）Class I PI3K pathway（PI-phosphatidylinositol，磷脂酰肌醇）与IRS (Insulin receptor substrate)结合，接受胰岛素受体传来的信号（血糖水平高抑制自噬） 2）mTOR pathway（mammalian target of rapamycin） mTOR在人类中的同源基因是FRAP1（FK506 binding protein 12-rapamycin associated protein 1），是一个丝/苏氨酸蛋白激酶。能接受多种上游信号，如Class I PI3K、IGF-1/2、MAPK，能感受营养和能量的变化,rapamycin是最典型最常用的自噬激动剂. 激活类 1）Class III PI3K 结构上类似于Class I PI3K，但作用相反。3-MA是Class III PI3K的抑制剂,因此3-MA可以作为自噬的抑制剂. 5 、自噬的研究方法： 正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有： （一）自噬诱导剂 1）Bredeldin A /Thapsigargin / Tunicamycin ： 模拟内质网应激 2 ）Carbamazepine/L-690，330/ LithiumChloride（氯化锂）： IMPase 抑制剂 （即Inositolmonophosphatase，肌醇单磷酸酶） 3 ）Earle's平衡盐溶液： 制造饥饿 4 ）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3KPathway抑制剂 5 ）Rapamycin：mTOR抑制剂 6 ）Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂 （二）自噬抑制剂 1 ）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂 2 ）Bafilomycin A1：质子泵抑制剂 3 ）Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumenalkalizer（溶酶体腔碱化剂）除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。 细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有： 1）观察自噬体的形成 由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic vacuole，AV） 2）在荧光显微镜下采用GFP-LC3等融合蛋白来示踪自噬形成：(常用) GFP-LC3单荧光指示体系：由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成。我们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了GFP-LC3指示技术：无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。双荧光指示体系：汉恒生物科技（上海）有限公司已开发出用于表达mRFP-GFP-LC3融合蛋白的病毒产品。mRFP用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。 3）利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成。 自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。 (Note：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响) 4) 利用Western Blot检测p62蛋白来评价自噬以及自噬流的强弱:起初自噬所降解的底物被认为是随机的,但是后来的研究表明有些蛋白是选择性降解的,在这些蛋白之中研究的最为透彻的是p62蛋白，p62蛋白水平的多少与自噬流的强弱有着反比例关系。 5）MDC或者Cyto-ID染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。 6）Cell Tracker TM Green染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。 6、自噬体的发生： 目前认为，自噬体的膜不是直接来源于高尔基体或内质网，而是在胞浆中重新生成的，但具体的机制尚不清楚。当beclin-1被活化后，胞浆中先形成很多个membrane source（自噬体膜发生中心），在它们不断扩展的过程中(phagophore到autolysosome)，VMP1蛋白由内质网和高尔基体转位到自噬体膜上（VMP1又叫TMEM49，已知唯一与自噬有关的 跨膜 蛋白），同时，MAP1-LC3由胞浆型（即LC3-I）转位到自噬体膜（即LC3-II），LC3这一转变过程可被Western Blot和荧光显微镜检测到，现已成为监测自噬体形成的推荐方法。7、自噬与细胞死亡的关系： 有必要说明一下的是，细胞死亡是一个非常复杂的过程，为了研究方便，需进行分类，但我们思考时不要局限于这些 人为的分类，而应注重于现象本身来研究其背后的机制。 一直以来人们从不同角度、用不同方法来观察细胞的死亡，并把细胞的死亡方式分为2类：坏死和凋亡，因为两者有着明显的区别，其中最主要的区别之一就是细胞膜的通透性——坏死细胞的细胞膜丧失了完整性，内容物被释放出来，染料可自由进入细胞，而凋亡细胞保持完整，无内容物释放，染料也被排斥。很多实验亦根据这一原理来设计以区分坏死和凋亡，这将在后面一一介绍，如同刚刚说明的那样，这些实验只能说明细胞膜的通透性（必要条件，不是充分必要条件），而不能用来证实坏死细胞或凋亡细胞。一般认为坏死是被动的，不可控的，而凋亡是主动的，可控的。为了强调这一点，凋亡被定义为程序性细胞死亡（program celldeath，PCD）。但无论是坏死还是凋亡，都是一个过程，是需要时间的（尤其是凋亡，从启动到完成，细胞要执行很多反应），而且细胞死亡后都有“尸体”。在研究自噬与凋亡的关系时，人们发现细胞死亡前胞浆中存在大量的自噬体或自噬溶酶体，但这样的细胞缺乏凋亡的典型特点，如核固缩（pyknosis）, 核破裂（karyorhexis）、细胞皱缩（shrinkage）、没有凋亡小体的形成等，被称为自噬样细胞死亡（autophagic celldeath，ACD），它是一种新的细胞程序性死亡，为了与凋亡区别，被命名为Type II cell death，相应的，凋亡为Type I cell death，坏死为Type III cell death。尽管这样，但对于自噬是否是细胞死亡的直接原因目前还存在很大的争议。到底是Cell death by autophagy（自噬引起死亡）还是Cell death with autophagy（死亡时有自噬发生，但不是直接原因）？对此，自噬研究领域“大牛”级专家Levine Beth在一篇nature的Review中表达了自己的观点。由于在形态学上2者无明显区别，但通过阻断自噬，观察细胞的结局可区分开来：Cell death by autophagy细胞存活，而Cell death with autophagy细胞死亡。8、自噬与肿瘤的关系： 与凋亡（在肿瘤细胞中一般都存在缺限）不同，自噬是被优先保留的。无论是肿瘤细胞还是正常细胞，保持一种基础、低水平的自噬活性是至关重要的。因为细胞中随时产生的“垃圾”（破损或衰老的细胞器、长寿命蛋白质、错误合成或折叠错误的蛋白质等等）都需要及时清除，而这主要靠自噬来完成，因此， 自噬具有维持细胞自稳的功能 ；如果将自噬相关基因突变失活，如神经元会发生大量聚集蛋白，并出现神经元退化。同时，自噬的产物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物质又可为细胞提供一定的能量和合成底物，可以说， 自噬就是一个 “ 备用仓库 ” 。如Atg-5缺陷的小鼠在出生后喝上第一口奶之前就会饿死。更重要的是，自噬活性可在代谢应激（饥饿、生长因子缺乏、射线、化疗等）时大大增强，表现为胞浆中迅速涌现大量自噬体，这一现象被称为“自噬潮”（autophagic flux），广泛用于自噬形成的监测。自噬潮为细胞度过危机提供了紧急的营养和能量支持，有利于细胞的存活。 鉴于自噬的上述作用，自噬可为肿瘤细胞带来几大好处： 1 ）肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点，对营养和能量的需求比正常细胞更高，但肿瘤微环境往往不能如意，如肿瘤发生初始期到血管发生之前、肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养不足或供应中断，而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机。 2）当化疗、放疗后，肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分，而此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质，并提供应急的底物和能量为修复受损DNA赢得时间和条件。由于自噬减少了肿瘤细胞在代谢应激时发生坏死的机会，而对于肿瘤细胞群体而言，需要一部分细胞发生坏死，以引发适度的炎症（有利于血管的长入、吸引免疫细胞分泌生长因子等）。研究发现，很多类型的肿瘤在代谢应激时会“组成性”活化PI3K信号以抑制自噬（由于凋亡通路已受阻，抑制自噬会促进坏死），但具体机制尚不清楚。自噬与肿瘤的关系可能是双重的。①对不同的细胞，自噬的作用可能不同。②相同的细胞在不同的外部因素作用时，自噬的作用可能不同。③在肿瘤发生发展的不同阶段，自噬的作用可能不同。肿瘤生长的早期阶段自噬增强，是由于此时肿瘤的血管化作用不足，癌细胞的营养供给有限，需要通过自噬为自身提供营养。肿瘤进入发展阶段后基因变异积累，使包括 Beclin 1在内的众多抑癌基因失活，自噬活力降低。④对单个细胞和对整个肿瘤阻滞的作用可能不同。自噬功能不全的细胞易于坏死，但是坏死组织产生的细胞因子（包括部分生长因子）反而会促进肿瘤的生长。上述各种假设均有待证实。肿瘤为细胞分化障碍性的疾病已得到肯定，但自噬在肿瘤细胞的分化抑制过程中起着什么样的作用，自噬水平提高是抑制分化甚至导致去分化还是促进分化等问题尚未解决。 9、在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位： Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。 LysoTrackerTM探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。 pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。 MitoTracker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。 Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。 Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔 Note：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeabilize），可采用处理 自噬与细胞死亡经常需一起考虑，下面介绍一些检测细胞死亡的方法： 1）△ψmdissipation（线粒体跨膜电位的消失）：TMRM发红色荧光，DiOC6（3）发绿色荧光。 2）Phosphatidylserine Externalization（磷脂酰丝氨酸外翻）：Annexin V-FITC（绿色）染细胞膜。 3）检测线粒体产生的ROS：无荧光的HE（hydroethidine，氢化乙啶）可被ROS氧化为EthBr（ethidium bromide，溴乙啡啶），发红色荧光。NAO（nonylacridine orange，烷化吖啶橙，可发荧光）能与非氧化的cardiolipin（心磷脂，可被ROS氧化）反应而失去荧光。 4）线粒体IMS蛋白的释放：AIF，细胞色素c，分别用荧光二抗染色。 5）Capase 3a 染色：用荧光二抗染色，胞浆弥散分布。 6）细胞膜完整性检测：DAPI（蓝色）、Hoechst 33342或PI（红色）染核。胞膜完整的细胞（活细胞和早中期凋亡细胞）排斥，可联用annexin V。 10、如何用实验区分Cell death by autophagy和Cell death with autophagy？ 第一步：利用上述方法证实细胞死亡 第二步：证实细胞死亡前发生了自噬 第三步：在形态学上区别开“自噬样死亡”与凋亡 第四步：利用遗传学手段（反义RNA干扰Knockdown掉Atg基因或hVps34）或工具药抑制自噬 第五步：细胞存活则为Cell death by autophagy，反之，细胞死亡则为Cell death with autophagy。 自噬的抑制根据自噬形成的过程，自噬的抑制也分为不同的阶段，包括自噬的起始阶段，自噬泡和溶酶体融合阶段，以及溶酶体内的降解阶段。目前常用的一些抑制药物如下： 1）对自噬体形成的抑制：主要是PI3K通路的抑制剂（如3-MA, Wortmannin，LY294002等），这些药物均可干扰或阻断自噬体形成。3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）是磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂，可特异性阻断Autophagy中自噬体的形成，被广泛用作Autophagy的抑制剂。另外，渥曼青霉素（Wortmannin）、LY294002 也可用作Autophagy的抑制剂。 2）对自噬体与溶酶体融合的抑制：对自噬体与溶酶体融合过程进行阻断也能起着抑制自噬的作用，这些药物有巴伐洛霉素A1、长春碱、诺考达唑等。巴伐洛霉素A1（Bafilomycin A1）是一种来源于灰色链霉菌的大环内酯类抗生素，分子式C35H58O9，是空泡型H+-ATP酶的特异性抑制剂，具有抗菌、抗真菌、抗肿瘤等作用。当突触小泡经历胞外分泌时，巴伐洛霉素A1可以避免小泡重新酸化。有研究表明，在已发生自噬的肿瘤细胞中加入巴伐洛霉素A1，可使蛋白降解被抑制，自噬体增多而自噬溶酶体数目减少，并且自噬体中的酸性磷酸酶的活性也明显降低，从而证明其阻断了自噬体与溶酶体的融合过程。这种阻断是可逆的，在去除了药物作用后，自噬体仍可以与溶酶体融合形成自噬溶酶体，继续自噬进程。 3）对溶酶体降解的抑制:自噬体与溶酶体融合后最终被溶酶体中的水解酶水解，它首先经过囊泡酸化，达到所需的PH值后经多种蛋白酶作用使囊内容物降解，降解产物在细胞内再循环利用。对溶酶体的降解进行抑制，使得被降解的囊泡内容物大量蓄积于溶酶体内，而不能释放出来进入细胞内再循环利用，这也同样起着抑制自噬的作用。因此，蛋白酶抑制剂，如E64d、Pepstatin A等，在抑制溶酶体降解的过程中发挥着自噬抑制剂的作用。E64d和Pepstatin A均属于蛋白酶抑制剂，二者以1：1的比例联用可以抑制自噬。有研究表明，在结肠癌细胞系中联用E64d及Pepstatin A，可明显抑制溶酶体的降解从而阻断自噬的进展，而自噬体的形成并没有受到明显影响。11 、自噬领域的大牛们： 1）YoshinoriOhsumi博士。日本科学家，克隆了第一个酵母自噬基因Atg1以及LC3，主要成果在酵母模型下自噬研究； 2 ）Daniel J. Klionsky博士。美国科学家，主要成果在酵母模型的自噬研究。最早在《Science》上发表综述介绍自噬，2005年创办了第一本自噬杂志《Autophagy》；2007年举办了第一次自噬国际会议，为自噬的宣传做了大量工作。 3 ）Noboru Mizushima博士。日本科学家，2001年主要报道了Atg5的功能，被认为是哺乳动物分子机制研究的第一环，以及参与克隆自噬标志物LC3，而且制备了一些ATG基因敲除老鼠以及LC3转基因老鼠； 4 ）Beth Levine博士。美国科学家，首先克隆了第一个哺乳动物自噬基因Beclin 1； 5 ）Guido Kroemer博士。法国科学家，是细胞凋亡和死亡领域中引用率第一的科学家。在细胞凋亡研究中作出了卓越贡献而且涉猎及其广泛。目前也从事自噬研究，例如p53，Bcl2家族与细胞自噬。 6 ）Tamotsu Yoshimori博士。日本科学家，2000年克隆了目前广泛使用的自噬标志物LC3文章的通讯作者，而且也参与了2010年ATG5机制研究，是通讯作者之一。在方法学上也有关键贡献。目前主要研究ATG14和ATG16。值得注意的是，上述三位日本科学家合作紧密，克隆了目前大部分的ATG基因，经常共享文章通讯作者。 7 ）Patrice Codogno博士。法国科学家，2000年首先证实了PI3K信号通路在自噬的作用，I型抗自噬，III型促自噬，是自噬信号通路的开拓者。 8 ）Ana Maria Cuervo博士。美国科学家，是分子伴侣自噬的开拓者。 9 ）David Rubinsztein博士。英国科学家，2004年首次报道了mTOR与自噬的关系，抑制mTOR促进自噬。目前利用rapamycin诱导自噬成为经典模型之一。2010年Nature的报道首次证实了自噬对mTOR的负反馈调节。 12 、自噬信号通路： 1 ） KEGG 2 ） Abcam 3 ） CST 4) Enzo 13、我在做自噬课题中的一些心得： 自噬小体的增多有两种可能：一是形成增加即自噬被诱导；另外一种是自噬体成熟受抑即自噬体不能和溶酶体结合。该怎么来判断呢？自噬体增多，也就是“自噬潮”出现的原因一是形成增多，二是与溶酶体融合受阻（如使用了氢化氯喹或氯喹，另外，溶酶体的酶抑制剂和质子泵抑制剂的使用亦有可能影响溶酶体与自噬体或异噬泡的融合），使自噬体不能降解而积聚，这种积聚造成的自噬体增多的效应要大于自噬体诱导剂效应的数倍之多。鉴于这样的原因，单纯的GFP-LC3荧光斑点增多不足以作为自噬激活的证据，可联用多个方法来判断： 1 ）加用自噬体与溶酶体融合的抑制剂，如氯喹，观察自噬潮的变化。 2 ）或加用LC3和溶酶体示踪物在荧光显微镜下观察共定位情况。 3 ）或Knockdown掉LAMP-2基因（溶酶体膜蛋白）。 4 ）检测胞浆长寿蛋白的降解。 WesternBlot 检测LC3时除了上述的原因外，还有几个需考虑到的地方： 1 ）抗体的亲和力：有报道认为LC3抗体对II型LC3的亲和力较高 2 ）结合于自噬体内层膜的LC3-II在与溶酶体结合后被降解。 3 ）自噬过程很快，一个自噬体从产生到降解仅需2~3个小时或更短，其中自噬体形成阶段更迅速，数分钟即可完成，而溶酶体降解阶段耗时相对较长。因此，设置多个检测时间点（time frame）是非常重要的。
正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有：（一）自噬诱导剂1）Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）3）Earle's平衡盐溶液：制造饥饿4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂5）Rapamycin：mTOR抑制剂 (最常用)6）Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂（二）自噬抑制剂1）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂2）Bafilomycin A1：质子泵抑制剂3）Hydroxychloroquine（羟氯喹）除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。（三）自噬检测方法：细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：1）Western Blot检测LC3的切割利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成。自噬形成时，胞浆型LC3会酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟PE结合转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。2）在荧光显微镜下采用GFP-LC3单荧光体系/mRFP-GFP-LC3双荧光体系等融合蛋白来示踪自噬形成：GFP-LC3 单荧光自噬指示体系：利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的原理，开发出GFP-LC3指示技术：无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。但是绿色斑点增多并不一定代表自噬活性增强，也有可能是自噬溶酶体降解途径受阻，可以通过western blot 检测游离的GFP、p62来验证。另一种方法是利用mRFP-GFP-LC3 。mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系：由于分子生物学的发展，现在已经诞生了mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系，用于标记及追踪LC3以及自噬流的变化。其中GFP是酸敏感型GFP蛋白，而mRFP是稳定的荧光表达基团，不受外界影响。由于自噬小体进入第二阶段后，与溶酶体进行融合，形成自噬溶酶体。自噬溶酶体由于溶酶体内部的酸性环境，可以导致PH下降，GFP淬灭，因此，GFP的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度，GFP越少，则从自噬小体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之，自噬小体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体进程受阻。mRFP是一直稳定表达的，因而可以通过GFP与mRFP的亮点比例来评价自噬流进程。mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系的出现，把自噬研究带入了一个新的阶段，自噬不再只是指标，而是一种机制，自噬流的顺畅与否，对于细胞生理功能的稳定非常关键。3）透射电镜下观察自噬体的形成：自噬经历了：吞噬泡(phagophore)--自噬小体(autophagosome)--自噬溶酶体(autolysosome)透射电镜下吞噬泡(phagophore)的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬小体(autophagosome)的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(autolysosome)的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。
一般来说，盲审与外审区别不大，如果外审也采用匿名制的话，就是一样了。盲审就是不知道你的论文的作者以及导师等信息，一般盲审都是送到外校的。外审是送到其他学校的，有的直接写上作者学校，姓名以及导师姓名等，而这些信息没有的话就是盲审了，不管是外审与盲审，都很重要，如果有一个不过的话，能不能答辩都难说了哦
盲审相对来说比较难，这是由学校统一往出送，多送到外省，隐去姓名和导师姓名，你不知道你的论文被送到哪里，那边老师也不知道这论文来自哪里是谁的学生，所以盲审相对比较客观，大约需一个半月左右。外审多是由院系自己往出送，虽然也是隐去学生姓名和导师姓名的，但多送到省内关系较好的兄弟院校，所以相对来说没有盲审那么严的，这个大约需一个月到一个半月左右。
扩展资料：
盲审是指一种组织专家组评审的制度，就是匿名送审，意味着评阅导师不知道论文作者是谁。这样打出来的分数作假率低，高校阅卷一般使用这个方法。盲审制度，就是将不署作者名的学位论文送给作者不可能知道的专家审核，这样打出来的分数，应是最为客观。一般高校，特别是研究生院，均有对学位论文进行定期盲审的相关规定，多为随机抽取一定数目的论文进行盲审。
外审是指将论文送外单位专家审阅，有的学校是学位办统一进行，有的学校是导师个人进行。自己导师指定的审论文专家，自己送审，占90%，由于专家和导师关系一般不错，都能通过。
参考资料：百度百科-盲审外审
硕士毕业论文外审主要审查论文的工作量，论文的内容是否符合毕业学位要求。 论文外审也称盲审，盲审制度，就是将不署作者名的学位论文送给作者不可能知道的专家审核，这样打出来的分数，应是最为客观。 一般高校，特别是研究生院，均有对学位论文进行定期盲审的相关规定，多为随机抽取一定数目的论文进行盲审。 毕业论文应反映出作者能够准确地掌握所学的专业基础知识，基本学会综合运用所学知识进行科学研究的方法，对所研究的题目有一定的心得体会，论文题目的范围不宜过宽，一般选择本学科某一重要问题的一个侧面。 论文盲审的工作要求： （一）论文盲审人员全部由校外同行专家承担，由研究生部负责在专家库中抽取。 （二）为了保证学位论文盲审工作正常进行，所有申请学位论文答辩的硕士生必须提前30天、博士生提前45天提交学位论文（扣除寒暑假时间）。 （三）参加盲审的论文，要在盲审结果确定后方可组织答辩工作，盲审结果应作为答辩资格、论文成绩评定的依据。
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【带批注的满分作文】：
《美丽的蝴蝶》、《生命，并没有结束》
【带批注的满分作文的原文及批注】：
一、《美丽的蝴蝶》
1、点评：中心词为美丽，生命的美丽。抓住了中心词就抓住了文章主题；题记和结尾，首尾呼应，深刻地点出文章主题。
2、原文
美丽的蝴蝶
生命是短暂的，但生命的美丽是永恒的。——题记
骤雨渐歇，我走出闷热的屋子透透气。眼前倏地一闪，啊!一只五彩的蝴蝶!蓝色的裙裳，白色的丝带，蝴蝶如仙女般飞过。不远处，是如此艳丽的花，在雨的洗涤中呈现出别样的美丽。蝶儿翩跹于花丛中，扰乱我的视线。忽又飞来，落到我身旁的一棵大树的树干上。它在向我炫耀它的美丽吗?我驻足观赏。
“噗!”蝶儿被一滴雨珠打中，落入树下的水洼之中。我愣住了，我不知道是否该捧起它，柔弱的翅膀在水中无力地拍着。我忽然发现我的呼吸跟着急促起来。渐渐地，渐渐地，奇迹出现了，它一点一点爬到水洼中的一朵小花上，竖起湿淋淋的翅膀，在风中微微颤动。
我心里泛起一片喜悦。顽强的生命终于战胜了噩运。忽然一阵微风吹过，树上又落下无数雨滴。蝴蝶再一次不幸被击中，悲惨地落下。我心里一痛。那水面泛起浅浅的涟漪，这个小生命仍在不停地挣扎，它还活着!我似乎感到了一股强大的生命的悸动!连忙小心翼翼地将它捧起。那颤抖的翼，微微地展开闭合，我的心也随之一起一伏。柔弱的蝴蝶呀，你能不能挺过来呢?又一阵风吹过，天晴了，一道彩虹挂在天空。那勇敢的蝴蝶呀，它试了几次，终于从我手中一跃而起，向那花丝冉冉飞去……
我静静地站着，看它。可敬的蝴蝶，为了美，空破丝茧的束缚，为了美，战胜风雨的磨难，它不正向我阐述着生命的永恒的美丽么?
二、《生命，并没有结束》
1、点评： 作者选取了三个有代表性的人物和他们的感人事迹——有文学家、有科学家；有中国的、有外国的；有著名的、有普通的——从中归纳出自己的观点：“生命没有高低贵贱之分,它们以各自不同的方式演绎着一个个不灭的传奇”，同时照应了题目。值得称道的不止是作者选材的得当，还有他对材料的掌握程度，如确切的时间和数字引用，表明了作者在平常积累上下了扎实的功夫。
2、原文
生命，并没有结束
一个伟大的灵魂在上海大陆新村寓所停止思考，永远闭上了眼睛。然而——七十多年过去了，他的音容笑貌依然时常出现在人们眼前，人们无时无刻不沐浴在他思想的光辉里，无时无刻不会感受到他的存在.。
他一生战斗不息，以笔为枪，不倦的向旧势力发出挑战；他伏首甘为孺子牛,对青年人总是无私的呵护。人们诵读他的着作时时常感到惊悚，因为在作品里人物的身上经常发现自己的影子。它象皮鞭一样考问着人们的良知，“仿佛要榨出皮袍下藏着的小来”，教人惭愧,催人自新.。诗人赞美他“有的人死了,他还活着”；在广大的人民心里,他代表了民族魂! 他就是鲁迅.。
他是一位亿万富翁,更是一位杰出的发明家。他把自己的一生都贡献给了人类科学事业，光专利就取得了255种，而且还在身后留下遗嘱，把财产全部献给科学事业，用来奖励后人.。于是,每年的12月10日,这个伟人逝世的日子,在瑞典的首都斯德哥尔摩,都要举行简朴而隆重的颁奖仪式,奖励在过去一年里全世界在人类物理、化学、医学、文学及和平事业上取得巨大成就的人,奖金的数额非常丰厚.。他就是诺贝尔。
他是个普普通通的小男孩，人们早已忘记了他的名字。十二岁的他不幸身患绝症，将不久于人世了。然而在临终之际他却提出要把自己的角膜捐献给需要它的患者，“这样我就还能时刻看到你，妈妈“，他这样说服自己的妈妈。妈妈流着泪答应了他的要求。小男孩平静的走了，一个幸运者却因此得以重见光明。
生命，没有高低贵贱之分。它们以各自不同的方式演绎着一个个不灭的传奇.。
美丽的蝴蝶 生命是短暂的，但生命的美丽是永恒的。 --题记 骤雨渐歇，我走出闷热的屋子透透气。眼前倏地一闪，啊!一只五彩的蝴蝶!蓝色的裙裳，白色的丝带，蝴蝶如仙女般飞过。不远处，是如此艳丽的花，在雨的洗涤中呈现出别样的美丽。蝶儿翩跹于花丛中，扰乱我的视线。忽又飞来，落到我身旁的一棵大树的树干上。它在向我炫耀它的美丽吗?我驻足观赏。 “噗!”蝶儿被一滴雨珠打中，落入树下的水洼之中。我愣住了，我不知道是否该捧起它，柔弱的翅膀在水中无力地拍着。我忽然发现我的呼吸跟着急促起来。渐渐地，渐渐地，奇迹出现了，它一点一点爬到水洼中的一朵小花上，竖起湿淋淋的翅膀，在风中微微颤动。 我心里泛起一片喜悦。顽强的生命终于战胜了噩运。忽然一阵微风吹过，树上又落下无数雨滴。蝴蝶再一次不幸被击中，悲惨地落下。我心里一痛。那水面泛起浅浅的涟漪，这个小生命仍在不停地挣扎，它还活着!我似乎感到了一股强大的生命的悸动!连忙小心翼翼地将它捧起。那颤抖的翼，微微地展开闭合，我的心也随之一起一伏。柔弱的蝴蝶呀，你能不能挺过来呢? 又一阵风吹过，天晴了，一道彩虹挂在天空。那勇敢的蝴蝶呀，它试了几次，终于从我手中一跃而起，向那花丝冉冉飞去…… 我静静地站着，看它。可敬的蝴蝶，为了美，空破丝茧的束缚，为了美，战胜风雨的磨难，它不正向我阐述着生命的永恒的美丽么?点评:1、中心词:美丽，生命的美丽。抓住了中心词就抓住了文章主题。 2、题记和结尾，首尾呼应，深刻地点出文章主题。
2、原文美丽的蝴蝶生命是短暂的，但生命的美丽是永恒的。——题记骤雨渐歇，我走出闷热的屋子透透气。眼前倏地一闪，啊!一只五彩的蝴蝶!蓝色的裙裳，白色的丝带，蝴蝶如仙女般飞过。不远处，是如此艳丽的花，在雨的洗涤中呈现出别样的美丽。蝶儿翩跹于花丛中，扰乱我的视线。忽又飞来，落到我身旁的一棵大树的树干上。它在向我炫耀它的美丽吗?我驻足观赏。“噗!”蝶儿被一滴雨珠打中，落入树下的水洼之中。我愣住了，我不知道是否该捧起它，柔弱的翅膀在水中无力地拍着。我忽然发现我的呼吸跟着急促起来。渐渐地，渐渐地，奇迹出现了，它一点一点爬到水洼中的一朵小花上，竖起湿淋淋的翅膀，在风中微微颤动。我心里泛起一片喜悦。顽强的生命终于战胜了噩运。忽然一阵微风吹过，树上又落下无数雨滴。蝴蝶再一次不幸被击中，悲惨地落下。我心里一痛。那水面泛起浅浅的涟漪，这个小生命仍在不停地挣扎，它还活着!我似乎感到了一股强大的生命的悸动!连忙小心翼翼地将它捧起。那颤抖的翼，微微地展开闭合，我的心也随之一起一伏。柔弱的蝴蝶呀，你能不能挺过来呢?又一阵风吹过，天晴了，一道彩虹挂在天空。那勇敢的蝴蝶呀，它试了几次，终于从我手中一跃而起，向那花丝冉冉飞去……我静静地站着，看它。可敬的蝴蝶，为了美，空破丝茧的束缚，为了美，战胜风雨的磨难，它不正向我阐述着生命的永恒的美丽么?二、《生命，并没有结束》1、点评： 作者选取了三个有代表性的人物和他们的感人事迹——有文学家、有科学家；有中国的、有外国的；有著名的、有普通的——从中归纳出自己的观点：“生命没有高低贵贱之分,它们以各自不同的方式演绎着一个个不灭的传奇”，同时照应了题目。值得称道的不止是作者选材的得当，还有他对材料的掌握程度，如确切的时间和数字引用，表明了作者在平常积累上下了扎实的功夫
1、题目：应简洁、明确、有概括性，字数不宜超过20个字。
2、论文摘要：要有高度的概括力，语言精练、明确，中文摘要约100—200字;
3、关键词：从论文标题或正文中挑选3～5个最能表达主要内容的词作为关键词。
4、目录：写出目录，标明页码。
5、正文：
专科毕业论文正文字数一般应在3000字以上。
毕业论文正文：包括前言、本论、结论三个部分。
前言(引言)是论文的开头部分，主要说明论文写作的目的、现实意义、对所研究问题的认识，并提出论文的中心论点等。前言要写得简明扼要，篇幅不要太长。
本论是毕业论文的主体，包括研究内容与方法、实验材料、实验结果与分析(讨论)等。在本部分要运用各方面的研究方法和实验结果，分析问题，论证观点，尽量反映出自己的科研能力和学术水平。
结论是毕业论文的收尾部分，是围绕本论所作的结束语。其基本的要点就是总结全文，加深题意。
6、谢辞：简述自己通过做毕业论文的体会，并应对指导教师和协助完成论文的有关人员表示谢意。
7、参考文献：在毕业论文末尾要列出在论文中参考过的专著、论文及其他资料，所列参考文献应按文中参考或引证的先后顺序排列。
8、注释：在论文写作过程中，有些问题需要在正文之外加以阐述和说明。
9、附录：对于一些不宜放在正文中，但有参考价值的内
容，可编入附录中。
论文中的参考文献标注方法如下：
工具／原料：Dell游匣G15、win10、Word2016
1、首先打开需要添加需要标注的文献文章，并且选择需要添加文献的段落。
2、随后点击菜单栏里的引用选项。
3、紧接着再点击插入尾注。
4、插入尾注后，可以看到注释用的是“i”，我们可以对它进行更改。
5、然后再点击脚注。
6、随后再点击脚注和尾注下面的倒三角。
7、然后点击编号格式，选择数字形式。
8、点击“应用”，更改后就可以变为数字。
9、然后按Ctrl+H，打开查找和替换菜单。输入替换的内容完成后点击“全部替换”即可。最后标注就已经添加完成了。
论文正文中需按出现顺序标识参考文献编号，文献编号用阿拉伯数字置于方括号“[ ]”中，置于所引内容最末端，按上标处理。同一篇文献在文中如多处引用，选择其一最主要的地方加注就可以，其它地方无需标注。联想小新，Win10，Word2019，方法如下：
1、将鼠标光标移动到需要加入参考文献标注的地方。
2、依次点击菜单项“引用”-“脚注”-“插入脚注”，这时会在当前页末尾插入一个文献注释，在此处输入引用文献的相关说明。
3、在插入一脚注的同时，在刚才要引用标注的地方会显示一个数字1。
4、鼠标指针停留在这个数字1上会显示文献引用的说明内容。
5、将光标移动到第2处需要引用文献的地方，依次点击“引用”-“脚注”-“插入脚注”，默认会插入标注2。
全文中引用文献只能按顺序标注，论文中引用文献原文应加引号；若引用原意，文前用冒号或逗号，不用引号。
正确引用参考文献的格式！
1.学术期刊文献
［序号］作者．文献题名[J]．刊名,出版年份,卷号(期号)：起-止页码
2.学术著作
［序号］作者．书名[M]．版次(首次免注).翻译者.出版地:出版社, 出版年: 起-止页码
3.有ISBN号的论文集
［序号］作者．题名[A].主编．论文集名[C]．出版地：出版社,出版年：起-止页码
4.学位论文
［序号］作者．题名[D]．保存地：保存单位,年份
5.专利文献
［序号］专利所有者．专利题名[P]．专利国别：专利号,发布日期
6.技术标准
[序号］标准代号,标准名称[S]．出版地：出版者,出版年
7.报纸文章
[序号］作者．题名[N]．报纸名,出版日期(版次)
8.报告
［序号］作者．文献题名[R]．报告地：报告会主办单位,年份
9.电子文献
［序号］作者．电子文献题名[文献类型/载体类型]．文献网址或出处,发表或更新日期/引用日期(任选)
引用的参考文献应具备哪些条件
被引用的参考文献主要有以下几种：
1、是关于具体的实验的方法；
2、是支持性或者有冲突的证据；
3、是比较有用的类似的文献；
4、是有历史背景的和有意义的文献；
5、引用文献要新：在某种程度上体现了文章的先进性；
6、引用高质量文献：在一定程度上反映了该文章学术水平的高低，从总体上体现了该文章的科掌性、实用性和先进性。
7、提高自引文献量：作者自引是指作者引用了自己以前发表的文章作参考文献，期刊自引是指该期刊引用了该刊以前发表的文献。
8、引用文献要全：参考文献一定要全面，尽可能全面地引用态伏毁国内外相关研究成果。
9、多引期刊文献，少引书籍文献。