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文章发表图凋亡

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文章发表图凋亡

前期文章:

在上一篇文章中我们解读了,CRISPR-Cas9基因编辑诱导DSB(DNA双链断裂)并最终导致人多功能干细胞死亡的内容。其中最关键的是 Cas9造成的DSB,激发野生型P53反应,P53激活后将细胞引入凋亡之路 。话不多说,直接看下图:

想象一下这个过程:

(1)一个 sgRNA-Cas9复合体 在细胞核内游走, Cas9蛋白在DNA序列上快速的扫描PAM序列 ,合适的停顿一会儿,DNA解链, sgRNA尝试互补配对 。配对失败,此处不留爷自有留爷处!匹配成功,请看下一点。

(2)Cas9识别到NGG的PAM序列后, sgRNA配对成功,Cas9蛋白切割PAM序列下游第三个碱基处 (说是这么说,总也有切偏的时候), 产生DNA双链断裂(DSB) 。

(3) DSB发生在WT-P53(野生型P53)的细胞中 ,P53激活诱导该细胞走向:周期阻滞、衰老甚至凋亡。由于人多功能干细胞对DSB十分敏感,其P53反应也十分激烈,容易走向凋亡。这就是上一篇文章的主要发现。

(4)而当 DSB发生在mutant-P53(突变型P53)的细胞中 时,也有几种情况:(A)该细胞有 双链P53突变 ,则毋庸置疑, P53功能缺失,不再诱导凋亡,细胞得以存活 ;(B)该细胞有一条链为WT-P53,另一条链为mutant-P53,当这个细胞足够倒霉的时候,它的 mutant-P53链产生的mutant-P53蛋白,不仅自己不起功能,还反而抑制另外一条WT-P53起作用 !简直坏透了!此时无论如何,细胞仍然不会有正常的P53反应,细胞得以存活,且这些 mutant-P53可能会继续传递给后代 ,mutant细胞群不断壮大!

综上所述,显而易见, CRISPR-Cas9技术俨然成为一个筛选mutant-P53细胞的筛选因子 。长此以往,mutant-P53群落越来越大。P53自己突变就算了,关键是当其他的DNA损伤或者基因突变发生时, P53不再执行其“基因卫士”的功能,使得这些DNA损伤或者突变得以传递给后代,当DNA突变积累足够多/巧的时候,肿瘤可能会发生 。这就是CRISPR-Cas9技术应用的风险。想想有了前面那样一篇文章,那么后面这篇文章的出现是不是可以理解。

文章发表在2020年的 Nature Genetics 杂志

经过2018年 Nature Medicine 的文章,该文就是 明确指出DSB激活P53信号 ,同时他们做的 P53 mutant pool在CRISPR-Cas9编辑中能存活 ,也指示CRISPR-Cas9的mutant-P53富集作用。 是不是别人无法再做类似甚至相同的内容了呢?但这篇文章又缘何可以发这么高分?

背景: Cas9通常被投入到细胞系中,以实现CRISPR-Cas9介导的基因组编辑。 问题: Cas9表达本身所造成的后果未知。(个人思考:角度非常好,Cas9其实作为一种外源蛋白是否会引起免疫反应?Cas9是否会不依赖sgRNA直接切割,就如同一些核酸内切酶的星号活性一样?)

目的: 研究Cas9表达本身是否会引起基因组或者转录组的变化,其后果如何

补充背景: 中性基因编辑/操作(人为而非自然选择)可导致细胞系的遗传和转录多样化。例如人为的过表达或者敲除某些基因都会改变细胞系的遗传和转录多样化。然而,目前还不清楚引入特定的“中性”基因是否会对特地基因进行富集或筛选。尤其是Cas9这样常常使用的工具蛋白。

L1000测序+GSEA分析(如下图): 首先作者找到了165对Cas9过表达细胞及其亲本细胞,分别进行L1000测序。L1000测序即对987个landmark基因进行测序,以推测余下11350个基因的表达(就是测重要基因表达)。这里的技术重复不是我们在RNA-seq中常见到的3个,而是高达16个。经由L1000测序后发现有87个差异基因且差异在2倍以上,经由GSEA分析对比。证明Cas9过表达本身对遗传背景有扰动。

数据分析(如下图) :(1)左图c表示, P53 WT细胞上,可见Cas9过表达细胞群有P53相关基因上调 。而在P53 mutant组,Cas9组和对照组的P53相关基因无差别(自然了,都突变了还能有下游基因变化么)。(2)右图g表示,在40个P53 WT的细胞中,有相当一部分细胞在Cas9过表达后表现出P53相关激活基因富集的现象。因此, Cas9激活P53得到了直接证据,同时Cas9激活P53这个现象大部分发生在P53 WT组上 。原文中有相应的统计表格可查。

注意:这里仅仅是列举了部分代表性结果,作者还做了P53、P21的WB、PCR验证,同时还测试通过免疫荧光提供了Cas9诱导DNA损伤的证据。

基于上述结果:P53WT组,Cas9导致--细胞DNA损伤--P53激活--细胞生长被抑制、死亡。那Cas9相当于变相的筛选富集P53 mutant细胞。

Deep (283×) targeted exon sequencing for 447 cancer genes :于是作者找到4 2对P53WT状态 的细胞及其Cas9过表达株,对这些细胞进行447个癌症相关基因的深度测序。经分析后发现 Cas9过表达细胞相对于WT细胞有更多的非同义突变 (下图a)。同时突变累积TOP3为:SETBP1(与DNA复制相关)、SLC25A13(线粒体载体家族基因)以及TP53基因。 这里有一个疑问,TP53不是Top1呀,为啥不研究Top1呢?注意后文有回答

补充背景: 深度测序是指对一个基因组区域进行多次测序,深度可达数百次甚至数千次。这种测序可检测到只占原始样本1%的罕见克隆类型、细胞或微生物。深度测序对癌症、微生物学和其他涉及 罕见细胞群分析 的研究很有帮助。例如,深度测序可识别肿瘤中的突变,因为在癌症样本中通常包含有许多正常细胞,且肿瘤本身可能包含多种亚克隆。因此 本文选用深度测序,可识别到微量的基因突变,从而区分不同基因突变的亚群 。

从深度测序结果来看,不止TP53突变在Cas9过表达株中富集。那么Cas9富集基因突变细胞是没有bias还是特定富集TP53突变。为了解决这个问题,作者设计了以下实验:

细胞竞争实验 :作者将TP53 -null细胞用GFP标记,将P 53-null细胞和WT-P53细胞按照1:6混匀 ,并分组处理:(1)无处理组NIC;(2)空载组EV;(3)Cas9过表达组Cas9。经分组处理后使用流式细胞仪检测GFP细胞占比变化,如下图b所示, Cas9组的TP53-null细胞在14,21天培养后群体壮大,而ARID1A-null、FBXW7-null细胞则没有变化 (下图c)。因此 Cas9只特异性富集TP53突变细胞 ,于是回答了中我们提到的问题。

以上是本文的主要内容,当然后续作者还对CRISPR-Cas9导致TP53突变富集的机制进行了研究和分析,说是在TP53-WT细胞中,cas9诱导的DNA损伤增加了对功能性DNA修复机制的依赖,也做了一系列实验验证,感兴趣的小伙伴需要回原文查看。最后该文提供了一个使用Cas9进行研究的工作流程图,我想这是该文的另一精髓:

(1)首先思考使用的Cas9过表达细胞是否有是WT-P53。如果不是,则无需太但又P53对功能实验的影响;如果是,则需要检查P53通路的激活状态,可选用WB, RT-qPCR试验等。

(2)若Cas9细胞有一定的P53通路激活,则:在后续实验中考虑p53活性的基础水平;尽量避免过多传代Cas9细胞,以免TP53 mutant细胞富集。

(3)即使Cas9细胞有P53活性基础水平,但仍需是否混有TP53 失落亚型细胞:可通过DNA测序鉴定。

(4)鉴定Cas9过表达细胞株的DNA损伤水平,在后续实验中监控DNA损伤水平的变化,定期检测TP53突变状态。

这篇文章使用了多种测序技术,实验设计巧妙,虽不多但都在刀刃上,是一篇很好的干湿结合文章,值得一读,且文末讨论简洁而精彩。 上文讲的是CRISPR-Cas9诱导DSB导致细胞死亡,这篇讲的是CRISPR-Cas9无法使得TP53 mutant细胞死亡,简直是天生一对 。那么 CRISPR-Cas9是依赖DNA修复的技术 ,TP53是DNA修复的上游信号,是否CRISPR-Cas9对DNA修复功能也有影响呢?下一次, 我们将解读一篇关于CRISPR-Cas9技术应用中,TP53状态和DNA修复之间的纠缠 。

TP53是一个热门IP,过了这么多年仍然有大量的好文章发表,关于TP53和CRISPR-Cas9之间关系的好文章不仅仅这两篇,我们希望能在这段时间把这类型的经典文章读一遍,加深我们对CRISPR-Cas9技术的理解。感谢大家阅读,再次期盼反馈交流!

Single-cell landscape of immunological responses in patients with COVID-19

影响因子: : 32788748 期刊年卷:Nat Immunol 2020 09;219(9) 医学一区 免疫学 Q1 3/155

DOI:

这篇文章和上一篇文章思路、设计、方法基本一致,甚至结论也有相似之处,通讯作者都是院士,但是为什么发的分值相差距大呢?除了文章发表先后顺序外,在样本量和数据分析方面做得更细致一些,亚群分析更细致一些,另外图表也比上一篇美观,这些问题都值得我们反思!

作者实施了单细胞RNA测序(scRNA-seq),观察了中度至重度症状的COVID-19患者外周血单核细胞(PBMC)的免疫反应。作者的研究描绘了COVID-19疾病发展过程中血液免疫细胞的高分辨率转录组图谱,这将有助于更好地了解该疾病的保护性和致病性免疫反应。

在由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染引起的冠状病毒疾病2019(COVID-19)中,疾病严重程度与宿主免疫反应之间的关系尚未完全了解。在这里,作者对5位健康供体和13位COVID-19患者(包括中度,重度和恢复期患者)的外周血样本进行了单细胞RNA测序。通过确定免疫细胞的转录谱,并结合组装的T细胞受体和B细胞受体序列,作者分析了免疫细胞的功能特性。COVID-19患者中的大多数细胞类型均表现出强烈的干扰素-α反应和整体急性炎症反应。此外,高度细胞毒性效应T细胞亚群如CD4+ effector-GNLY (granulysin), CD8+ effector-GNLY and NKT CD160与中度患者的康复有关。在重症患者中,免疫系统的特征是干扰素反应紊乱,免疫力衰竭,T细胞受体组成偏向,T细胞广泛扩散。这些发现说明了疾病进展过程中免疫反应的动态性质。

scRNA-seq(10X基因组学)研究了13例患者和5例健康供体(HD)的PBMC的转录组谱(图 1a )。将13例COVID-19患者分为三种临床情况:中度( n  = 7),重度( n  = 4)和恢复期(conv; n  = 6,其中4例与中度病例配对)(图 1a, b ,还对每个受试者进行了单细胞T细胞受体(TCR)和B细胞受体(BCR)测序。经过统一的单细胞分析流程(请参阅 方法 ),从所有样本的PBMC中的122,542个细胞中获得了约6亿个独特的转录本。在这些细胞中,22,711个细胞(占%)来自HD,37,901个细胞(占%)来自中度状态,24,640个细胞(占%)来自严重状态,而37,290个细胞(占%来自恢复状态)状况。将所有高质量细胞整合到完整且可比较的数据集中,并在校正读取深度和线粒体读取计数后进行主成分分析(补充图 2a,b )。

图1:HD和COVID-19患者的PBMC的研究设计和单细胞转录谱。

使用基于图的统一流形近似和投影聚类(UMAP),作者根据规范基因标记的表达捕获了14种主要细胞类型或亚型的转录组(图 1c-e 和补充图 2a,b )。外周血中细胞亚群的组成

(naive-state T (naive T) cells (CD3+CCR7+), activated-state T (activated T) cells (CD3+PRF1+), mucosal-associated invariant T (MAIT) cells (SLC4A10+TRAV1-2+), γδ T cells (TRGV9+TRDV2+), proliferative T (pro T) cells (CD3+MKI67+), natural killer (NK) cells (KLRF1+), B cells (MS4A1+), plasma B cells (MZB1+), CD14+ monocytes (CD14+ mono; LYZ+CD14+), CD16+ monocytes (CD16+ mono; LYZ+FCGR3A+), monocyte-derived dendritic cells (mono DCs; CD1C+), plasmacytoid dendritic cells (pDCs; LILRA4+), platelets (PPBP+)

为了揭示三种情况(中度,重度和转化)中细胞组成的差异并与HDs进行比较,作者根据scRNA-seq数据计算了每个人的PBMC中14种主要细胞类型的相对百分比(图 2a–d )。活化的T细胞簇的相对百分比在中度患者中达到峰值,甚至在恢复期也没有恢复到正常水平。值得注意的是,幼稚T细胞,MAIT细胞和单DC的相对丰度随着疾病的严重程度而降低,后来在conv患者中这些种群得以恢复(图 2d )。相比之下,在conv患者中,pro T细胞,血浆B细胞,CD14 +mono和血小板的相对百分比随着疾病的严重程度而增加,后来又下降了。 2d )。重症患者中CD14 + mono的大量增加是根据最近的一项研究表明,病原性T细胞诱导的炎性单核细胞在COVID-19中引发了炎性风暴(参考文献 22 )。

图2:疾病状况的细胞组成差异。

接下来,为了研究SARS-CoV-2感染期间的抗病毒和病原体免疫反应,作者评估了两种重要途径的表达水平(基因本体论(GO)生物学过程术语:对干扰素(IFN)-α的反应和急性炎症反应)。跨四个条件的主要细胞类型。作者发现,在COVID-19患者的PBMC中,所有主要细胞类型中对IFN-α的反应均一且显著上调,并且在严重患者中,除血浆B细胞外,几乎所有主要细胞类型中对IFN-α的响应值均最高,其中中度患者的IFN-α反应最大(图 2e )。另外,除pro T细胞外,急性炎症反应在所选细胞类型的各种条件下均表现出一致且显著的差异。几种细胞类型显示出与疾病严重程度大致对应的急性炎症反应趋势,包括活化的T细胞,γδT细胞,NK细胞和CD16 + mono(图 2e )。此外,在严重患者中,血浆I型IFN,IFN-γ和其他炎性细胞因子水平最高(补充图 2c )。这些结果表明,在COVID-19患者中有很强的总体促炎反应(图 2e )。

为了进一步研究SARS-CoV-2感染后先天免疫细胞的转录组变化(图 3a,b ),作者比较了CD14 +和CD16 +单核细胞中度或重度条件与HD条件的表达模式。作者发现COVID-19患者的IFN反应,髓样白细胞活化,细胞因子产生和核因子(NF)-κB信号通路均涉及显著差异表达的基因(DEG)(图3c,d)。作者发现COVID-19患者的IFN反应,髓样白细胞活化,细胞因子产生和核因子(NF)-κB信号通路均涉及显著差异表达的基因(DEG)(图 3c,d )。 此外,严重条件下单核细胞中更多的DEG富含分子代谢和分解代谢过程以及细胞因子分泌(补充图 3a )。对于NK细胞,与单核细胞相似,与IFN反应,细胞因子产生,NF-κB信号通路和白细胞细胞毒性相关的DEGs在COVID-19患者中显著丰富(图 3e,f ),表明先天免疫细胞具有一致的反应感染SARS-CoV-2。此外,与中度患者相比,重症NK细胞的DEGs,例如 ITGB2, CCL5 和 CXCR2 ,与迁移相关的过程更为紧密相关(补充图 3b,c )。

**图3:在四个条件下个体的先天免疫细胞的特征。 全尺寸图片

与DEG富集结果一致,作者发现SARS-CoV-2感染后单核细胞和NK细胞均显示出明显的IFN和急性炎症反应,特别是在严重患者中(图 2e )。与HD条件相比,单核细胞和NK细胞中细胞凋亡和迁移的水平也被上调(图 3g )。与单核细胞和NK细胞中相当的凋亡水平不同,重度患者的先天免疫细胞比中度患者更容易迁移(图 3g 和补充图 3c )。这些结果表明,在患有COVID-19的患者中,大多数先天免疫细胞类型均表现出强烈的IFN反应。

为了表征个体在四种情况下个体T细胞亚群的变化,作者从PBMC中亚群化T细胞,并根据典型T细胞标志物的表达和分布获得12个亚群(图 4a,b ):

CD4 + T细胞的6种亚型(CD3E + CD4+), CD8 + T细胞的3种亚型(CD3E + CD8A +) NKT细胞的3种亚型(CD3E + CD4 – CD8A –TYROBP +)

图4:T细胞亚群的免疫学特征

源数据

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CD4 + T细胞簇的六个亚型 naive CD4+ (CD4+ naive) T cell (CCR7+SELL+), memory CD4+ (CD4+ memory) T cell (S100A4+GPR183+), effector memory CD4+ T cell (S100A4+GPR183+GZMA+) regulatory T (Treg) cell (FOXP3+IL2RA+) 亚型,

两种effector CD4 + T亚型: CD4+ effector-GZMK and CD4+ effector-GNLY。CD4+ effector-GNLY簇的特点是与细胞毒性,包括相关联的基因的高表达NKG7,GZMA,GZMB,GZMH和GNLY,而CD4+ effector-GZMK 簇显示出的高表达GZMK基因(图4b和补充图4a,b)。此外,CD4+ effector-GNLY细胞表现出高表达的TBX21,表明它们是1型辅助性T(T H1)样细胞(补充图4c)。相反,CD4+ effector-GZMK和effector memory CD4+ T cell具有高表达GATA3的2型辅助T(T H 2)细胞样特征(补充图4c)。

CD8 + T细胞簇的三个亚型

CD8+ (CD8+ naive) T cell subset (CCR7+SELL+) and two effector CD8+ T cell subsets (CD8+ effector-GZMK and CD8+ effector-GNLY),它们都具有高表达的GZMA和NKG7。 CD8+ effector-GZMK独特表达GZMK,而CD8+ effector-GNLY显示出相对高的表达水平GZMB / H和GNLY(图4B和补充图4A,B)。

NKT细胞簇的三个亚型被定义为 NKT (NKT naive) cells (CCR7+SELL+), CD56+ NKT (NKT CD56),CD160+ NKT (NKT CD160) (图 4a,b )**。

为了深入了解T细胞亚群中的特征,作者评估了每个簇在四个条件下的分布(图 4c 和补充图 4d,e )。值得注意的是,与HD相比,COVID-19患者的effector T cells (CD4+ naive, CD4+ memory, CD4+ effector memory, Treg, CD8+naive and NKT naive subsets)的比例下降(图 图4c 和补充图 4D )。即使在转化条件下,CD4+ naive, CD8+ naive and Treg 的比例簇没有恢复到HD的水平(图 4c 和补充图 4d )。相反,COVID-19患者的CD4+ effector-GNLY, CD8+ effector-GNLY, NKT CD56 and NKT CD160子集的活跃状态T细胞子集的比例增加,这些细胞毒性子集甚至以高比例存在在conv患者中(图 4c )。特别要注意的是,HDs中几乎不存在CD4+ effector-GNLY 亚群,但在中度,重度和转化性患者中高度丰富。此外,与中度患者相比,重度患者的NKT CD160亚群的丰度显著降低。

然后,作者评估了在四种情况下不同效应子状态T细胞亚群的细胞毒性和衰竭评分(图 4d 和补充图 4f )。CD4+ effector-GNLY, CD8+ effector-GNLY, NKT CD56 and NKT CD160子集显示出比其他子集更高的细胞毒性评分。在这些高度细胞毒性的簇中,HDs的细胞毒性评分最低,而中度状态则显示最高的细胞毒性状态,但CD4+ effector-GNLY亚群除外(图 4d,e 和补充图 4f )。同时,CD4+ effector-GZMK, CD8+ effector-GZMK and NKT CD160 亚群显示出比其他亚组更高的疲劳评分。在这些精疲力竭的亚组中,HDs的精疲力竭评分最低,而重症患者表现为最精疲力竭状态(图 4d,e 和补充图 4f ),这与先前检查重症患者CD8 + T细胞的功能研究一致并发现疲惫不堪的状态和功能受损 23 。

为了进一步研究SARS-CoV-2感染后T细胞中差异转录组的变化,作者比较了中度或重度之间的效应T细胞(排除CD4+ naive, CD4+ memory, CD8+ naive and NKT naive)的表达谱。HD条件。作者观察到,在COVID-19患者中上调的DEG参与了以下过程,包括IFN反应,细胞因子产生,细胞杀伤,白细胞-细胞粘附和细胞骨架组织(图 4f,g 和补充图 4i )。此外,使用凋亡和迁移评分系统,作者观察到严重患者的T细胞可能经历了迁移和凋亡(图 4h,i 和补充图 4g,h )。在重症患者的PBMC中的细胞死亡和迁移途径的活化显著表明,细胞死亡和淋巴细胞迁移可以与淋巴细胞减少,在患者中观察到严重COVID-19的常见现象(参考文献相关联 18 , 19 , 24 )。

接下来,为了深入了解各个T细胞之间的克隆关系以及在四个条件下V(D)J基因的使用,作者从TCR测序中重建了TCR序列(补充表 2 )。简而言之,除了三个NKT子集外,所有子集中具有匹配的TCR信息的细胞超过70%(图 5a,b )。首先,与HDs相比,COVID-19患者和恢复期患者的克隆扩增明显(图[5c–e]( )。在中度和慢性条件下的克隆扩增程度高于严重条件下的克隆扩增程度。同时,在严重的情况下,没有大的克隆扩增(克隆大小> 100)(图 5e ),表明严重的患者可能缺乏效应T细胞的有效克隆扩增。作者观察到T细胞亚群之间不同程度的克隆扩增(图 5c,d )。效应T细胞亚群CD4 +效应子GNLY,CD8 +效应子GZMK和CD8 +效应子GNLY表明克隆细胞(图的高比例 5a中,d 和补充图 5A )和包含簇间克隆细胞的高比例(图 5f ),提示效应子T细胞经历了动态状态转变(图 5a,f )。

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为了研究COVID-19和HD患者中TCR的动力学和基因偏好,作者比较了四种情况下V(D)J基因的使用情况(图 5g–i 和补充图 5b )。在四个条件下,前10个互补决定区3(CDR3)序列不同(图 5h )。中度和转化条件共享一些CDR3序列,因为来自这些条件的四个样本已配对。与其他三个条件相比,HD条件下前10个CDR3序列的使用百分比更低且更均衡。值得注意的是,作者发现在COVID-19患者中V(D)J基因的不同用法具有降低的多样性,这在 TRA 基因中更为明显(图 5i )。作者还确定了 重度患者与中度和 慢性患者相比 TRAJ39 和 TRAJ43的 过度表达 (图 5g )。 重症患者首选的TRBJ基因是TRBJ1-1,而中度和转化性患者首选TRBJ2-1(图 5i )。 **V(D)J基因的选择性使用表明不同的免疫优势表位可能驱动T细胞反应的分子组成,并且可能与SARS-CoV-2特异性感染相关。

为了追踪不同B细胞亚型的动态变化,作者根据规范B细胞标志物的表达和分布将B细胞分为六个子集(图 6a,b 和补充图 6a )。 naive B subset (MS4A1+IGHD+), memory B subset (MS4A1+CD27+), intermediate transition memory B subset (intermediate memory B; IGHD+CD27+), germinal center B subset (MS4A1+NEIL1+) and two plasma subsets, plasma B (MZB1+CD38+) and dividing plasma B (MZB1+CD38+MKI67+) .

图6:B细胞亚群的免疫学特征。 全尺寸图片

值得注意的是,与HD相比,COVID-19患者的活动状态B子集(germinal center B, plasma B and dividing plasma B subsets)的比例增加。相反,与HD患者相比,COVID-19患者的memory B cells比例下降(图 6c-e )。

为了进一步研究SARS-CoV-2感染后B细胞的差异转录组变化,作者比较了中度或重度条件下HD的B/plasma cells的表达谱。在COVID-19患者中最丰富的DEG参与了与IFN反应相关的基因(图 6f,g 和补充图 6c )。此外,重症患者中的DEG与蛋白质合成,成熟和运输相关的生物学过程有关(补充图 6b )。这些结果揭示了COVID-19患者B细胞亚群的转录组特征。

作者还从BCR测序中重建了BCR序列(补充表 3 ),并分析了BCR克隆扩增的状态。简而言之,每个簇中BCR的检出率均超过75%(图 7a,b )。作者发现来自重症患者的B细胞显示出比其他三种情况明显的克隆扩增(图 7c 和补充图 6d ),这表明重症患者的B细胞活性和体液免疫反应被强烈激活,这让人想起先前的观察较高的抗体滴度与更差的临床结果相关联 25 , 26 , 27 。这引起了这样一种担忧,即病原体导向的抗体可以促进疾病病理,导致抗体依赖性增强,类似于SARS 28 中观察到的增强。

图7:扩展的BCR克隆和V(D)J基因的选择性使用 全尺寸图片

接下来,作者分别评估了中度,重度和转化条件下每位患者中IgA,IgD,IgG和IgM的分布(未检测到IgE)。在大多数患者中,IgM是主要的免疫球蛋白(图 7d,e )。**与HD相比,COVID-19患者的IgG含量增加,而IgM降低。在恢复期患者中,IgG和IgM的水平恢复到与HDs相似的水平。

为了研究BCR的偏向V(D)J重排,作者比较了四种条件下V(D)J基因的使用情况(图 7f,g 和补充图 6e )。与其他三种情况相比,作者发现在重症患者中使用了更多的特定V(D)J,这表明重症患者的B细胞可能经历了独特而特定的V(D)J重排(图 7g )。 作者还发现IHDJ4在所有HD和患者中得到了综合利用(图 7f ),但与其他三种情况下的患者相比,重症患者中IGHJ4的IGHV配对IGHV基因却有所不同(图 7g ) 。 作者观察到IGHV3-7的过度表达在严重患者中(图 7f )。此外,重症患者中前两个配对的VJ频率为IGHV3-7 / IGHJ4和IGKV3-15 / IGKJ3(图 7g )。 总体而言 ,严重患者的B细胞克隆性增加以及 IGHV 和 IGKJ 基因的偏斜使用表明SARS-CoV-2感染与宿主B细胞中的V(D)J重排有关。值得注意的是, 在重症患者中选择性使用显性IGV基因,尤其是IGHV3-7和IGKV3-15,可能有助于疫苗的设计。

细胞凋亡论文

研究磷脂酶C-γ1(phospholipase C-γ1,PLC-γ1)信号通路对过氧化氢(hydrogen peroxide,H_2O_2)诱导的PC12细胞凋亡状态的影响;探讨PLC-γ1信号通路在H_2O_2诱导的PC12细胞凋亡中的下游相关信号分子及其表达变化规律。 方法:应用PLC-γ1特异性抑制剂U73122预处理H_2O_2诱导的PC12细胞以阻断PLC-γ1信号通路,Hoechst/PI双染观察细胞形态改变,MTT评估细胞活力,流式细胞仪分析凋亡细胞比例,DNA电泳验证细胞凋亡状态的改变,Western blot技术半定量PLC-γ1信号通路下游相关信号分子bcl-2及caspase-3的表达及其变化规律。 结果:H_2O_2对PC12细胞活力的影响呈时效关系。PLC-γ1信号通路阻断后,PC12细胞出现了凋亡形态学改变,细胞活力明显降低,流式细胞仪检测出现典型的凋亡亚二倍体峰,凋亡细胞所占比例达到%,DNA电泳呈现明显的梯形条带。Western blot结果提示50μM H_2O_2处理可引起caspase-3蛋白呈现出时间依赖性的表达下调,而对bcl-2蛋白表达无明显影响;在10μM U73122预处理的PC12细胞中,可见明显的bcl-2和caspase-3蛋白表达的下调,且caspase-3表达的下调也表现出时间依赖性。 结论:PLC-γ1信号通路在H_2O_2诱导的PC12细胞凋亡中发挥重要的保护作用。bcl-2和caspase-3两个信号分子可能与H_2O_2诱导的PC12细胞凋亡中的PLC-γ1信号通路有关,并作为下游信号分子,参与PLC-γ1信号通路在H_2O_2诱导PC12细胞凋亡中的凋亡抑制作用。机构:昆明医学院领域:外科学;关键词:磷脂酶C-γ1;U73122;过氧化氢;PC12;凋亡;bcl-2;caspase-3;0 169查看目录开通会员更优惠,尊享更多权益打开APP,下载管理本文硕士论文《昆明医学院》 2006年硕士论文论文一键智能排版排版交给我们,时间留给研究立即查看 >相似文献期刊硕士博士会议报纸氨基甲酰磺酸钠活化H_2O_2体系对烷基糖苷的脱色化学工程2021年10期烷基糖苷储存温度及H_2O_2含量对产品色泽的影响山西化工2022年02期超声波促进香紫苏醇H_2O_2氧化合成香紫苏内酯的研究现代化工2022年11期原位合成H_2O_2在水处理技术中的应用研究进展分析试验室2021年01期外源H_2O_2对复盐胁迫下木槿的生理响应机制北方园艺2021年04期外源H_2O_2对湖北百合试管苗玻璃化及抗氧化系统的影响黑龙江农业科学2021年04期高浓度H_2O_2浸泡联合不同时长超声处理核桩对纤维桩-树脂界面黏结强度的影响中国组织工程研究2021年34期过氧化氢(H_2O_2)介导的光合诱导系统信号东北农业大学学报2021年04期紫外-可见分光光度法测定H_2O_2氧化邻苯醌发色基团的实验研究化学工程师2021年08期碳酸钠催化超声波去除水样残留H_2O_2的动力学探究应用化工2019年12期更多 图书推荐西行1+1李晶鑫 等 中国民主法制出版社 2019-06-011号交警陈玉福 2020-09-171号通缉令陈玉福 2020-09-11刺局1:即兴局圆太极 北京时代华文书局 2018-09-01九重禁.第1季茶又清 台海出版社 2017-09-01从0到1写方案王一九 电子工业出版社 2021-09-01更多 相关工具书中外广播电视百科全书中国广播电视出版社中国方术大辞典中山大学出版社中外文化知识辞典黑龙江人民出版社中国方志大辞典浙江人民出版社中外民俗学词典浙江人民出版社世界民俗大观北京大学出版社更多 全部文献搜索搜 索App内打开登录注册充值文献期刊工具书图书文集首页搜索客户端充值帮助违法和不良信息举报电话:举报邮箱:©2023中国知网(CNKI)犹太人四千年(上册)作为世界上古老的文明之一,犹太文明蔓延了四千多年,可...物哀本书是日本近代著名画家竹久梦二的

应该就是细胞自主的,有序的发生死亡,而且就是自然老死的情况,并且也是一个主动的过程,等等,这些都是细胞凋亡的原理。

您好,PC12细胞是一种神经元细胞,它们可以在体外培养,并且在培养基中可以被诱导凋亡。凋亡是细胞死亡的一种特殊形式,它可以帮助细胞清除病毒或细胞损伤,从而保护细胞免受损害。PC12细胞凋亡形态变化的细胞损伤可以通过几种方式来发生,包括细胞膜损伤、细胞毒性、细胞内激素水平的变化以及细胞内细胞因子的变化。细胞凋亡形态变化的细胞损伤可以通过几种方式来发生,包括细胞膜损伤、细胞毒性、细胞内激素水平的变化以及细胞内细胞因子的变化。细胞凋亡形态变化的表现形式包括细胞膜的变性、细胞膜的溶解、细胞质的凝固、细胞质的收缩、细胞核的收缩、细胞核的溶解以及细胞内的蛋白质损伤等。细胞凋亡形态变化的表现形式可以通过显微镜观察来确定,并可以通过测定细胞内激素水平、细胞内细胞因子水平以及细胞内蛋白质水平来确定。

在一定的生理条件下,细胞也是为了维持体内的环境稳定,遵循自身的发展顺序,自己结束生命的过程。

细胞凋亡论文参考文献

坏死 这属于不正常结束细胞的生命进程 所以是坏死!

细胞凋亡指由于细胞内部程序激活而发生的自杀性死亡,艾滋病显然是使T细胞坏死

在显微镜下观察

细胞凋亡的检测细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式,根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别,可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多,下面介绍几种常用的测定方法。 一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征,人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜 (1) 未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 (2) 染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与 DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用终浓度一般为 ~1mg/ml。 结果评判:细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1)。 3 透射电子显微镜观察 结果评判:凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕,出现许多称为气穴现象(cavitations)的空泡结构(图2);Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法) 磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 方法 1 悬浮细胞的染色:将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞(×106)用PBS洗2次,加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V(20ug/ml)10ul,室温避光30min,再加入PI(50ug/ml)5ul,避光反应5min后,加入400ul Binding Buffer,立即用FACScan进行流式细胞术定量检测(一般不超过1h), 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。 2 贴壁培养的细胞染色:先用的胰酶消化,洗涤、染色和分析同悬浮细胞。 3 爬片细胞染色:同上,最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。 结果 [图4、图5] 注意事项 1. 整个操作动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞。 2. 操作时注意避光,反应完毕后尽快在一小时内检测。三、线粒体膜势能的检测 线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用,多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡,而线粒体跨膜电位DYmt的下降,被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件,它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前,一旦线粒体DYmt崩溃,则细胞凋亡不可逆转。 线粒体跨膜电位的存在,使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3,3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6(3)]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质,其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。 方法:将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123(1mM)或终浓度为DiOC6(25nM),JC-1(1mM),TMRM(100nM),37°C平衡30min,流式细胞计检测细胞的荧光强度。 注意事项 1. 始终保持平衡染液中pH值的一致性,因为pH值的变化将影响膜电位。 2. 与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白,他们将与部分染料结合,降低染料的浓度,引起假去极化。四、DNA片断化检测 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300kbp长的DNA大片段, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后,采用常规方法分离提纯DNA,进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色,在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少,还可在分离提纯DNA后,用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA标记,然后进行电泳和放射自显影,观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。 1. 大分子染色体DNA片段的测定细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300kbp长的DNA大片段。所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时,即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA,DNA像通过弯管一样,以其一端指向电场一极而通过凝胶,这种迁移模式称之为"爬行"。因此,细胞凋亡早期产生的50~300kbp长的DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后,大的DNA分子便滞流在爬行管中,直至新的电场轴向重新定向后,才能继续向前移动。DNA分子量越大,这种重排所需要的时间就越长。当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时,DNA就可以按其分子量大小分开。 参考文献 Brown,., Sun, ., and Cohen, .(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. . 268, 3037-3039 2. DNA Ladder 测定 方法:收获细胞(1′107)沉淀?细胞裂解液?13000rpm′5min, 收集上清?1%SDS和RnaseA(5mg/ml)56°C,2h?蛋白酶K()37°C,2h?1/10体积3M醋酸钠和倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA,4°C过夜?14000rpm′15min?最后将沉淀溶解在TE buffer中,加DNA Loading Buffer?琼脂糖凝胶电泳,EB染色并照相。 结果:[图6] 参考文献 Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507 3. 凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析 方法:收集细胞?70%冷乙醇(in PBS)4°C固定过夜?PBS洗涤,1000rpm′10min?RNase A()37°C消化30min?PI(50mg/ml)染色,室温避光15min?FACScan分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。 结果:[图7] 4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)优点:敏感度高,适合于检测少量样本,小部分凋亡细胞。如临床活组织检测。五 TUNEL法 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3'-OH形成,很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。 六、Caspase-3活性的检测 Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用,其中caspase-3为关键的执行分子,它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段,它被激活,活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞,caspase-3的活性明显下降。 1 Western blot 分析Procaspase-3的活化,以及活化的Caspase-3及对底物多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]等的裂解。 方法: 收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭,室温或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T(含 Tween 20的TBS)洗3次,5~10min/次→HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→ TBS-T洗3次, 5~10min/次?→ECL显影或NBT/BCIP显色。 结果:[图8-1、图8-2] 2 荧光分光光度计分析 原理:活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物,水解D4-X肽键。根据这一特点,设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时,AMC不能被激发荧光,短肽被水解后释放出AMC,自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小,可以测定caspase-3的活性,从而反映Caspase-3被活化的程度。 方法:收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?制备细胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC(caspase-3四肽荧光底物)?37°C反应1h?荧光分光光度计(Polarstar)分析荧光强度(激发光波长380nm,发射光波长为430-460nm)。 结果:[图9] 3 流式细胞术分析 方法:收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?加Ac-DEVD-AMC?37°C反应1h?UV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。 结果:[图10]七、凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析 TFAR19(PDCD5)是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因,前期的功能研究表明,它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素(FITC)标记的TFAR19单克隆抗体为探针,对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现,凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象,伴随着细胞核形态学的变化,持续较长时间,在凋亡小体中仍然可见。同时我们发现,凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸(PS)外翻和细胞核DNA的片段化,提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明,凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义,不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件,提供了一种新的技术和指标。 (一)TFAR19蛋白的细胞定位分析 材料试剂:FITC标记的单克隆抗体, 、 PBS,3%的多聚甲醛,PBS-T( 、 PBS 含 Tween 20),胎牛血清,荧光细胞洗液: 、 PBS含2%胎牛血清及 。FACS管,Tip头,移液器。 仪器:低温水平离心机, 37°C水浴箱,荧光显微镜,共聚焦激光扫描显微镜,流式细胞计 方法: 1 悬浮细胞的染色: (1)收获正常和诱导凋亡的细胞(′106),PBS洗2次,1000rpm′10min。 (2)3%多聚甲醛冰浴10min,PBS洗2次,1000rpm′10min。 (3)加入PBS-T溶液,37°C孵育15min,PBS洗2次,1000rpm′10min。 (4)加入200ml胎牛血清,室温反应30min。 (5)加入5ml FITC标记的TFAR19单抗(终浓度为1:40),4°C反应30min (6)荧光细胞洗液洗2次,1000rpm′10min。结果观察:将细胞沉淀滴片,荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察TFAR19在细胞中的定位。同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的平均荧光强度。[图11] 2:贴壁细胞的原位染色 (1) 贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中(内有洁净盖玻片),让其爬片生长,待长到50%~80%满时,凋亡诱导剂处理细胞。 (2) 将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色,染色步骤同上。 (3) 将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油(5ml)的载玻片上,荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜观察TFAR19在细胞中的定位。 结果观察:[图12] 3:临床病理切片的染色、检测。 4:原代细胞的培养、检测。 5:分析TFAR19蛋白在人体内各组织器官的分布及定位 (二)TFAR19蛋白的表达与临床疾病 1. ELISA法检测正常人和疾病状态下,以及疾病的不同时期,血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗体水平。 材料和试剂: 1. 包被Buffer: , 碳酸盐Buffer 2. 洗涤液: , PBS 含 Tween 20 3. 封闭液: 3%BSA(用洗涤液配制) 4. 酶标抗体的稀释:用封闭液稀释 5. OPD底物Buffer: 柠檬酸 DDW 100ml 6. 显色液(现配现用):底物Buffer 10mlOPD 2mg30% H2O2 2ml 7. 终止液 2Mol/L H2SO48. 重组人TFAR19, HRP标记的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器,ELISA Reader(OD490nm),洗板机 操作步骤 1. 用包被Buffer稀释的重组人TFAR19(1mg/ml)包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C过夜(一般24h以上)。 2. 洗涤Buffer洗板三次,加入封闭液,200 ml/well , 37°C孵育2h或4°C过夜。 3. 洗涤Buffer洗板三次,加入不同稀释度的病人血清(3个重复孔)100ml/well ,37°C孵育1h。设包被Buffer、洗涤Buffer 、封闭液为阴性对照。 4. 洗涤Buffer洗板三次,加入1:2500稀释的HRP标记的抗人IgG, 100ml/well,37°C孵育1h。 5. 洗涤Buffer洗板三次,加入显色液,100 ml/well,避光反应10~15min。 6. 加入H2SO4终止反应,50 ml/well。 7. ELISA Reader 读取OD490 光密度值,分析和比较病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗体的表达水平。 2. Western blot 分析原发性肿瘤细胞和正常细胞的TFAR19蛋白的表达水平。来源(北京大学人类疾病研究中心):——————————————————————————————————————————————————————————————————————————细胞坏死的鉴定细胞坏死是因病理而产生的被动死亡,如物理性或化学性的损害因子及缺氧与营养不良等均导致细胞坏死。坏死细胞的膜通透性增高,致使细胞肿胀,细胞器变形或肿大,早期核无明显形态学变化,最后细胞破裂。另外坏死的细胞裂解要释放出内含物,并常引起炎症反应;在愈合过程中常伴随组织器官的纤维化,形成瘢痕。

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