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梅县区张文婷论文发表

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梅县区张文婷论文发表

赵维刚,石家庄铁道学院副教授。姓名:赵维刚[1]职称:副教授学习经历本科:石家庄铁道学院硕士:北方交通大学博士:北京航空航天大学个人简历1994年毕业于石家庄铁道学院机械工程系,获学士学位;2001年毕业于北京交通机车车辆专业,获工学硕士学位,现为石家庄铁道学院大型结构诊断与控制研究所副教授。[1]在国内外学术刊物上发表论文10余篇。先后参加主研省部级项目10余项,其中获河北省科技进步一等奖2项,获河北省科技进步三等奖1项。[1]

可以写一些我国农业畜牧业类的文章,比如写国内畜牧业的发展中所遇到的困难和解决的办法等。摘要:畜牧业作为我国农业四大基础性支柱产业之一,对我国农村经济乃至国民经济的健康发展和社会的和谐进步影响深远。新中国成立至今,我国畜牧业实现了量和质的双重飞跃,正朝着现代化和可持续方向稳步发展。本文将利用产值、比例、增速等多项指标从时间横纵向相结合的角度深入分析对比我国整体及内部各行政区域的畜牧业发展情况和问题,并利用灰色模型GM(1,1)对未来3年我国的畜牧业产值进行预测和分析,指出当前我国畜牧业现代化发展进程中所面临的机遇和挑战,对实现我国现代化畜牧业的可持续健康发展有一定指导意义。

域外畜牧科技的引进及其本土化,是域外引进的畜牧良种、畜牧技术等适应中国的生存环境,并且融入到中国的社会、经济、文化、价值体系当中,逐渐形成有别于原生地的、具有本民族特色的新品种的过程。具体的畜牧良种方面,从自古的“六畜”、“奇畜”到今天的畜牧业发展都曾受到域外因素的影响。畜牧动物如此,畜牧植物也有引进及本土化的历程,以苜蓿为代表的牧草就在引入中国后发生了较大的功能性改造。中国的畜牧业发展史也是在借鉴外族经验与教训的同时才能不断创造辉煌。此外,畜禽饲养技术、畜牧兽医技术的不断成熟也掺杂着域外的因素,而域外引进的畜牧良种在提高了畜牧业地位的同时也促进了畜牧制度的完善与发展。因此研究域外畜牧科技的引进及其本土化意义十分重大。本文以域外畜牧科技的引进及其本土化为研究对象,对历史时期域外引进的主要畜牧动物、植物及畜牧技术进行系统梳理,并对其本土化的主要形式、影响因素及最后所带来的影响进行了论证分析。论文整体分为六章。第一章为绪论,主要包括研究背景、研究目的和意义、研究的依据、国内外研究现状以及本文的创新与不足之处。第二章论述域外畜牧科技的引进及其本土化的相关概念界定及对本土化理论的把握,对“域外”、“引种”、驯化与驯养之间的关系等进行了阐释。第三章主要是对畜牧良种的引进和本土化梳理,具体从劳役牲畜及畜牧植物-苜蓿两个方面分析其引进历程及本土化。第四章主要分析域外畜牧技术的引进、畜牧良种的引进对畜牧制度的发展发挥的作用。第五章论证域外畜牧科技引进及本土的形式与影响因素。第六章在分析域外畜牧科技引进与本土化过程中总结了其对中国社会的影响,在政治、经济、社会、文化等方面一一进行了阐述,也由此为着力点,从更宽泛的角度和更深入的挖掘文章的写作意义,以求切实能对域外畜牧科技的引进及其本土化有所研究创新。最后为结语部分,在总结经验、教训的同时做一些历史角度的思考,以期能对现实有所启发,也是完善了篇章的逻辑结构,是为本文的收尾。[1] 夏学禹. 论中国农耕文化的价值及传承途径[J]. 古今农业. 2010(03)[2] 余达忠. 农耕社会与原生态文化的特征[J]. 农业考古. 2010(04)[3] 汪慧玲,张文婷. 汉唐西北农牧分界线变迁原因研究[J]. 农村经济与科技. 2010(06)[4] 齐秀华. 游牧经济的生产力构成及其基本内涵[J]. 理论研究. 2009(06)[5] 罗志田. 与时偕行的中国农耕文化[J]. 中华文化论坛. 2009(S2)[6] 程芳. 浅论汉武帝“富国强兵”战略与抗击匈奴的胜利[J]. 黑龙江史志. 2009(19)[7] 王静. 魏晋南北朝的移民与饮食文化交流[J]. 南宁职业技术学院学报. 2008(04)[8] 樊志民. 农业进程中的“拿来主义”[J]. 生命世界. 2008(07)[9] 吴伊娜. 对游牧文化与农耕文化的一些认识[J]. 内蒙古科技与经济. 2008(04)[10] 额尔敦扎布. 游牧经济的合理内核——人与自然的和谐[J]. 内蒙古统战理论研究. 2007(01)

畜牧专业毕业论文不难的,但是一定要原创。我写的《域外畜牧科技的引进及其本土化研究》,也是莫文网给的帮助,很快就过了中国畜牧产业化经营问题研究河北省畜牧产业布局评价与优化研究国立中央大学畜牧兽医系史研究广西规模化猪场猪瘟免疫情况调查及首免日龄优化试验畜牧产业组织与企业行为研究中国畜牧养殖污染的生态环境胁迫效应分析宜宾县现代畜牧业发展研究阿勒泰畜牧兽医职业学校教师绩效管理体系研究我国畜牧养殖的时空分布特征及其生态成因分析研究山东六和集团畜牧产业链模式研究我国畜牧生产者的产品价格风险及对策杜尔伯特蒙古族自治县畜牧业发展研究我国农村畜牧兽医公共服务体系建设研究论我国《畜牧法》的完善我国畜牧经济可持续发展战略研究畜牧投资纵向一体化项目组织机制研究荆州市畜牧生产结构调整研究基于组态王的畜牧无害化处理监控系统的开发

张婷婷发表的论文

在经济学的论文中引用参考文献,具有重要的标志功能、评价功能、保护功能和链接功能,可以反映经济学论文的研究基础和科学依据,可供进一步检索有关资料,共享资源。下面我将为你推荐经济学论文参考文献的内容,希望能够帮到你!

[1]刘思华.生态马克思主义经济学原理[M].北京:人民出版社.2006

[2]叶耀丹.马克思主义生态自然观对中国生态文明建设的启示[D].成都:成都理工大学.2012

[3]陆畅.我国生态文明建设中的政府职能与责任研究[D].长春:东北师范大学.2012

[4]俞可平.科学发展观与生态文明[M].上海:华东师范大学出版社.2007:18

[5]朴光诛等.环境法与环境执法[M].北京:中国环境科学出版社.2004:23

[6]罗能生.非正式制度与中国经济改革和发展[M].北京:中国财政经济出版社.2002: 19

[7]党国英.制度、环境与人类文明一关于环境文明的观察与思考[N].新京报.2005-2-13

[8]张婷婷.生态文明建设的科技需求及政策研究[D].锦州:渤海大学.2012

[9]秦书生.生态文明视野中的绿色技术[J].科技与经济.2010(3): 82-85

[10]陈池波.论生态经济的持续协调发展[J].长江大学学报(社会科学版)2004(1):97-102

[11]张首先.社会主义与生态文明[J].理论与现代化.2010(1): 23-26

[12]黄光宇.陈勇.生态城市理论与规划设计 方法 [M].北京:科学出版社.2002

[13]张首先.生态文明研究[D].成都:西南交通大学.2010

[14]马仁忠.地理环境对种族、民族特征的影响[J].宿州 教育 学院学报.2002(4):

[15]冒佩华.王宝珠.市场制度与生态逻辑[J].教学与研究.2014(8):37-43.

[1]陈凌.应丽芬.代际传承:家族企业继任管理和创新〔J〕.管理世界.2003 ( 6): 89-9

[2]伯纳德‘萨拉尼着.陈新平、王瑞泽、陈宝明、周宗华译.税收经济学〔M〕.北京:中国人民大学出版社.2009:143-144.

[3]彼德·德鲁克.大变革时代的管理〔M〕.上海:上海译文出版社.1999版.

[4]陈凌.信息特征、交易成本和家族式组织〔J〕.经济研究.1998(7):27-33.

[5]Alan.S.BIinder. Toward an Economic Theory of Income Distribution〔 C〕.Cambridge, MA: MITPress, 1974,123:137-139.

[6]Adam.Smith. The Wealth of Nations ( 1776 )〔M〕.Chicago: University of Chicago Press,1976(reprint): 391.

[7]沈建法.城市化与人口管理[M].北京:科学出版社.1999

[8]张志强.徐中民.程国栋.生态足迹的概念及计算模型[J].生态经济.2000(10) : 8-10

[9]张恒义.刘卫东.林育欣.等.基于改进生态足迹模型的浙江省域生态足迹分析[J].生态学报.2009(5):2738-2748

[10]贺成龙.吴建华.刘文莉.改进投入产出法在生态足迹中的应用[J].资源科学.2008 (12) : 1933-1939,2008 (2) : 261-266

[11]郭军华.幸学俊.中国城市化与生态足迹的动态计量分析[J].华东交通大学学报.2009 (5) : 131-134.

[1] 刘毅. 现代性语境下的正当性与合法性:一个思想史的考察[D]. 中国政法大学 2007

[2] 刘毅. 树突状细胞在兔动脉粥样硬化模型中作用的研究[D]. 南方医科大学 2009

[3] 刘毅. 硅基微环谐振腔光信号处理与布里渊光纤激光器的理论和实验研究[D]. 天津大学 2014

[4] 刘毅. 未来移动通信系统中的协作传输技术研究[D]. 北京邮电大学 2010

[5] 刘毅. 基于图割的交互式图像分割算法研究[D]. 南京理工大学 2013

[6] 刘毅. 基于iTRAQ技术对HBV相关性肝癌血浆差异蛋白的鉴定及功能学研究[D]. 重庆医科大学 2014

[7] 刘毅. 整体性治理视角下的县级政府社会管理体制创新研究[D]. 华中师范大学 2014

[8] 刘毅. 几类切换模糊系统的镇定控制设计[D]. 东北大学 2009

[9] 刘毅. 区域循环经济发展模式评价及其路径演进研究[D]. 天津大学 2012

[10] 刘毅. β-抑制蛋白2对哮喘小鼠CD4~+T细胞表达和产生IL-17的影响及其机制研究[D]. 中南大学 2011

[11] 刘毅. SIRT3在原发性肝癌中的表达及其抑瘤作用的研究[D]. 中南大学 2012

[12] 刘毅. 南中国海与东南极中晚全新世气候环境变化记录与研究方法探索[D]. 中国科学技术大学 2012

[13] 刘毅. 晚期糖基化终产物对心肌微血管内皮细胞及糖尿病心肌缺血再灌注损伤的影响及机制[D]. 第四军医大学 2012

[14] 刘毅. 华喦花鸟画研究[D]. 南京艺术学院 2012

[15] 刘毅. 三甲基芹菜素阻断多种心脏钾通道与增加迟钠电流的作用研究[D]. 华中科技大学 2012

[16] 刘毅. 面向人群的并行多目标疏散模型研究[D]. 武汉理工大学 2012

[17] 刘毅. 采用外周血进行肿瘤分子诊断的转化医学研究[D]. 中国人民解放军军事医学科学院 2012

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著作: 田涛,许传玺,王宏治主编:《黄岩诉讼档案及调查报告 传统与现实之间-寻法下乡 上 黄岩诉讼档案》,法律出版社2004年。 田涛,许传玺,王宏治主编:《黄岩诉讼档案及调查报告 传统与现实之间-寻法下乡 下 黄岩调查报告》,法律出版社2004年。 期刊论文: 邓建鹏:《讼师秘本与清代诉状的风格——以“黄岩诉讼档案”为考察中心》,《浙江社会科学》,2005年第4期。 邓建鹏:《清代州县讼案的裁判方式研究——以“黄岩诉讼档案”为考查对象》,《江苏社会科学》,2007年第3期。 邓建鹏:《清代州县讼案和基层的司法运作——以黄岩诉讼档案为研究中心》,《法治研究》,2007年第5期。 胡谦:《从黄岩诉讼档案看晚清民间调处机制》,《兰台世界》,2008年第20期。 胡谦:《从黄岩诉讼档案看清代州县讼案诉状格式》,《兰台世界》,2009年第8期。 胡谦:《清代州县听讼制度的再认识:以黄岩诉讼档案为对象的分析》,《山西师大学报(社会科学版)》,2009年第5期。 陈瑞来,肖卜文:《清代官批民调制度政治分析:以黄岩诉讼档案为考察中心》,《广东教育学院学报》,2009年第2期。 于语和,刘志松:《同核相生:国家法、民间法关系的回眸与前瞻:从〈黄岩诉讼档案〉谈起》,《民间法》,2010年第0期。 杨华玲:《浅谈黄岩诉讼档案中的“珠语”》,《档案》,2012年第3期。 陈伟杰:《如何理解“第三领域”:从市民社会和法律多元的角度》,《社科纵横》,2012年第3期。 陆娓:《清代乡里调解制度研究:以“黄岩档案”与“巴县档案”为例》,《求索》,2013年第11期。 巴哈提牙尔·米吉提:《黄岩诉讼档案状词真实性研究》,《社会科学辑刊》,2013年第3期。 柯联民:《近代台州调解的实践与反恩:基于〈黄岩诉讼档案〉的研究》,《台州学院学报》,2013年第1期。 学位论文: 王琳:《清代民事细故诉讼驳回理由研究》,武汉大学2006年硕士论文。 胡东豪:《清代调解制度研究》,山东大学2010年硕士论文。 樊欣榕:《论〈黄岩诉讼档案〉中的“抱告”制度》,甘肃政法学院2014年硕士论文。 张婷婷:《〈黄岩诉讼档案〉的批语研究》,海南大学2015年硕士论文。 陈圆圆:《乡土社会的民事调解——以清代黄岩诉讼档案为中心》,浙江工业大学2016年硕士论文。 沈松森:《“理”的程序中细故案件处理方式研究——以黄岩诉讼档案为研究对象》,云南大学2016年硕士论文。 会议论文: 沈玮玮:《诉状、权利与治理:对黄岩诉讼档案研究的反思》,中国法律史学会2012年学术年会论文集。 报纸: 张永强:《解读黄岩清代诉讼档案》,北京法制日报,2003年12月8日。

张秀婷发表的论文

对公司年限没有要求\x0d\x0a开一个广告公司最低注册资金10万。\x0d\x0a开广告公司,分二种,一种是制作设计类的公司,这种比较简单,一种是有广告发布权的广告公司,这种需要经过行政审批,获得广告经营许可证,才能开办。广告经营许可证其实也不难办,现在很多地方开有行政办事大厅,工商注册、税务登记、行政许可,全部在一个大厅一站式的完成,你可到你当地的行政办事大厅或工商局咨询你当地审批广告经营资格的条件。\x0d\x0a注册资料:(1)个人资料(身份证、法人户口本复印件或户籍证明、居住地址、电话)\x0d\x0a(2)注册资金\x0d\x0a(3)拟订注册公司名称若干\x0d\x0a(4)公司经营范围\x0d\x0a(5)租房房产证、租赁合同办理流程:(1)企业名称核准 (工商局)\x0d\x0a(2)办私章,验资报告 (公安特行科、银行)\x0d\x0a(3)办理营业执照(工商局)\x0d\x0a(4)办理组织机构代码证(技术监督局)\x0d\x0a(5)办理税务登记证(税务局)\x0d\x0a(6)开立银行基本帐户(银行)\x0d\x0a(7)申领发票(税务局)\x0d\x0a经营范围可以是:广告设计、制作、代理、发布,礼仪服务,会务服务、会展服务。\x0d\x0a办证费用因地置移一般在一千元左右。\x0d\x0a由于地域不同具体情况可以咨询当地工商部门。

广告工程、商业展示类企业,可以向中国商务广告协会广告工程与展示委员会申请“广告工程企业资质”。这个资质我们公司办理过,资质分三个等级,这个协会是全国唯一一个“中”字头的,而且是广告工程与展示的协会,证书的含金量高,有这个参加投标的话,中标几率会很高。具体的,直接咨询协会秘书处就行,百度搜索“中国商务广告协会广告工程与展示委员会”就能找到官网。

今早地铁上被如下文字弄的泪眼婆娑: “我走了很远的路,吃了很多的苦,才将这份博士学位论文送到你的面前。二十二载求学路,一路风雨泥泞,许多不容易。如梦一场,仿佛昨天一家人才团聚过。”二十二载求学路,真的,无人可以感同身受你在其中所遭遇的一切,所谓自己的路自己走,要相信这些泥泞的路上,留下了面向坚定方向的脚印,都会对未来的生活有积极的益处! 在网上找到了这封信原文,感受颇深!因为与作者有部分相同经历,因此心血久久不能平静!自己也是来自乡下农村,一步步跨越各种独木桥,才走到今天。 从已经倒闭的高庄小学,到毛村初中,因为小学学习特别不好,小升初语文和数学只考了92分,就像撮菜筐似的把我分到了只要给钱就可以上的菜中! 那个时候,吃饭需要用自己产的粮食换成粮票吃饭。吃饭时是分组的,因为分饭不均匀打架斗殴是常事!初一一整年,自己连26个字母都没有背全,也因为跟同学打架,班主任让我叫了父母。 父母归家后,只对我说是转学还是退学,退学就去工地干活。赤裸裸的两条路供我自己选择,很庆幸当时自己选择了转学~也是从那时候开始,自己开始拼命学习。从此高中、大学、研究生一路读下去,途中虽有一些波折,但是自己都坚持走了下来! 等到现在,发现对我自己,读书是唯一可以改变命运的机会,也是为数不多的公平机会! 期间,自己也受很多的人的帮助,才一路走下来!都说淋过雨的人,会更愿意为别人撑伞~我也愿意随时成为一名撑伞人!愿你我都可以活成自己想要的模样,要相信世间的力量,自己一步一步走下去,要相信生活不会辜负你我的努力! 穿拖鞋的汉子 写于上海九号线地铁上

我叫陈晨,80后大学男老师。我出生在一个普通的家庭,从小就喜欢学习,尤其是数学,所以我毕业于一所著名的大学,并获得了数学专业的学士学位。毕业后,我受到了一所大学的邀请,成为一名数学老师。我热爱教学,喜欢和学生交流,乐于分享自己的学习经验,帮助学生更好地理解数学知识,提高学习效率。我也热衷于研究,经常参加学术会议,发表论文,探索数学的新领域,为学术界做出贡献。作为一名80后大学男老师,我致力于把自己的热情和智慧传播给每一位学生,让他们在学习中受益,在未来的人生中取得成功。纯手打,望采纳!

张婷发表的博士论文

张婷的梗是关于她的涨粉速度。具体如下:

相信不少人都曾在这段时间刷到过这位女博士的视频,她姣好的面容,优雅的谈吐,优秀的个人履历实在让人无法对她心生恶意。更为可贵的是,她还是靠读书改变命运的寒门学子的典型代表,靠着国家的资助和个人的努力,一路读到博士毕业。在如今的网络大环境中,这样一位充满正能量书卷气息又格外浓重的女生。女博士相宜发布视频仅一个月就吸引了九百多万的粉丝。

据说她原名为张婷,是西安建筑科技大学的工科博士,她的个人毕业信息在官网中均可以找到。而她博士就读的大学虽然不是双一流,211和985,但是也是著名的建筑老八校之一,仍属于比较优秀的存在。

公众人物

“公众人物榜样是条捷径”。培育社会主义核心价值观,社会倡导十分重要,典型引导不可或缺。相比于普通人,公众人物有着更大的话语权和影响力。在许多人心目中,公众人物代表着社会风尚,由于广受关注和尊重,其举手投足、一言一行,都对社会起着一定的示范作用。

博士后研究机构。张婷,硕士生导师,副教授,河南获嘉人,2007年6月河南大学凝聚态物理专业获硕士学位,2010年6月河南大学凝聚态物理专业获博士学位,2011年10月至2013年10月南京大学材料系从事博士后研究机构工作。

张婷2004年获得了青年教师讲课竞赛三等奖,2010年获得了兰州理工大学三育人奖,2011年获得了毕业设计优秀指导教师称号,并于同年获得了第八届挑战杯甘肃省大学生课外学术科技作品竞赛优秀指导教师称号。在科研方面主要从事吸附催化在大气脱硫及污水处理方面的应用研究,参与了多项研究课题。其中作为第二负责人的“复合脱硫剂的制备及吸附催化法脱除二氧化硫气体的研究”教育厅基金项目被甘肃省科技厅鉴定为国内领先,并于2010年获得甘肃省科技进步二等奖;参与的“微硅粉的提纯方法应用研究” 项目被甘肃省科技厅鉴定为国内领先。另外,本人还参与了“稀土金属冶炼过程废气治理关键技术研究”等项目。参加了多次国际学术会议,在各类学术期刊上发表学术论文10余篇,其中EI收录3篇,ISTP收录3篇;并参编两部教材。主要从事研究方向: 环境催化

张红梅发表的论文

目前主要从事计算机图形图像处理、模式识别等方面的研究工作,主要研究领域包括人工智能、软件开发技术等。主持完成项目:河南省科技攻关项目《谷物害虫实时监测与分类识别系统》,该项目获2007年河南省科技进步三等奖;河南省科技攻关项目《医用多媒体诊断系统》;河南省自然科学基金项目《人工神经网络应用于仓储物害虫的声音识别研究》;河南省科技攻关项目《基于内容的谷物害虫图像检索系统》(项目编号:0424220188),该项目获2008年河南省信息产业厅科技进步一等奖;河南省基础与前沿技术研究项目《基于图像处理技术的面包烘焙品质检验方法研究》。另外还参与完成了国家 “十五”科技攻关项目两项。主持在研项目:河南省科技厅重点攻关项目《基于Bag of Words模型的昆虫分类识别系统》;郑州市科技局工业攻关项目(项目编号:0910SGYG23258-3 《基于图像处理技术的小麦粉加工精度自动检测系统》。近期发表的论文主要有:“基于支持向量机的仓储物害虫分类识别研究” 计算机工程与应用 2005第41卷;“基于数字图像处理技术的储粮害虫分类识别研究” 河南工业大学学报(自然科学版)2005 第26卷 第1期;“谷物害虫图像识别中数理统计特征的提取” 计算机应用与软件 2005年3月;“支持向量机在仓储物害虫分类识别中的应用” 微电子学与计算机 2005 1月;“面包烘焙品质检验中纹理特征的提取” 计算机工程与设计 2005年9月;主编和参编教材主要有:《数据结构教程》,西安电子科技大学出版社;《C语言程序设计》,科学出版社;《 Visual Basic 程序设计教程》机械工业出版社;《 AutCAD中文版建筑制图100例》电子工业出版社等六部。

主持项目:1、河南省高校青年骨干教师基金“室内无线定位中的TOA估计技术研究”2、河南省基础与前沿技术研究项目“MIMO系统信号处理算法研究”3、河南省教育厅自然科学基金项目“MIMO-OFDM系统信道估计与检测算法研究”发表主要论文杨铁军,靳婷.一种动态整周模糊值求解算法及仿真分析[J]. 系统工程与电子技术,2007,Vol.39,No.1, p 28-31。编写教材1. 梁义涛,傅洪亮,杨铁军等,现代DSP技术及应用,清华大学出版社,2012年3月。2. 管爱红,张红梅,杨铁军等,MATLAB基础及应用教程,电子工业出版社,2009年8月。

【关键词】 树突状细胞;绿色荧光蛋白;RNA;转染 Effect of dendritic cells transfected with total RNA of HepG2 cell line using GFP marker in vitro 【Abstract】 AIM: To investigate the feasibility of GFP as a marker to observe the dendritic cells (DCs) transfected with total RNA of tumor cells and the feasibility of the transfected DCs serving as a vaccine for potential immunotherapy. METHODS: Plasmid pGFPC3 was transfected into HepG2 stably. Total RNA was extracted from the HepG2GFP using Trizol; DCs were induced by liver cancer patients peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and transfected with the total RNA. The effect of transfection was observed by a fluorescence microscope, the changes of phenotype were detected by flow cytometry, and the change of IL12 secretion in the supernatant of DCs was detected by ELISA assay. The cytotoxic effect of CTLs was assessed by MTT assay. RESULTS: GFP was expressed stably in the HepG2GFP cells that presented green fluorescence under a fluorescence microscope, so did DCs transfected with total HepG2GFP cell RNA. After transfection, the expression of membrane molecules such as CD80 (13.2% to 86.7%), HLADR (38.9% to 97.9%), CD83 (0.9% to 97.1%), CD86 (31.2% to 92.5%) was increased dramatically, IL12 secretion in the supernatant was elevated significantly 〔(61.3±8.1) ng/L to (287.4±29.3) ng/L, P<0.05〕. The CTLs activated by DCs transfected with total HepG2GFP RNA showed a potent specific lysis to HepG2 cells. CONCLUSION: GFP could be used as a marker to observe the effect of transfection of DCs with total tumor cell RNA. DCs transfected with total tumor cell RNA may serve as a promising vaccine of immunotherapy. 【Keywords】 dendritic cell;green fluorescent protein;RNA;transfection 【摘要】 目的:探讨GFP作为标记观察肝癌细胞RNA转染DCs效果的可行性及肿瘤细胞RNA转染DCs制备疫苗的可行性. 方法:绿色荧光蛋白质粒载体 pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2,Trizol法提取筛选后细胞HepG2GFP总RNA;分离肝癌患者外周血单核细胞体外诱导DCs细胞,总RNA转染DCs,荧光显微镜下观察转染效果,流式细胞仪检测转染前后DCs表型变化;ELISA法检测转染前后上清中IL12变化情况;MTT法检测效应细胞对靶细胞的杀伤率. 结果:pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2后可得到稳定表达GFP的细胞HepG2GFP,荧光显微镜下呈绿色荧光;总RNA转染的DCs荧光显微镜下呈绿色荧光,CD80(13.2%上升至86.7%),HLADR(38.9%上升至97.9%),CD83(0.9%上升至97.1%),CD86(31.2%上升至92.5%)表达明显升高,上清IL12分泌量ng/L显著增高(61.3±8.1→287.4±29.3,P<0.05);诱导的CTL能够对肝癌细胞株HepG2起特异性杀伤作用. 结论:GFP可以作为肿瘤细胞RNA转染树突状细胞的观察标记,肿瘤细胞RNA转染DCs可作为一种有效的肿瘤疫苗. 【关键词】 树突状细胞;绿色荧光蛋白;RNA;转染 【中图号】 R739.41 0引言 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一种常见的恶性肿瘤,适合手术治疗的患者只占一少部分,具有较高的复发率,预后很差,严重威胁人类健康〔1〕. DCs(dendritic cells, DCs)是体内功能强大的专职性抗原提呈细胞,它能够高效的摄取、处理抗原,并将处理后的多肽呈递给静息型T细胞,引起针对该抗原的特异性免疫反应〔2〕. 国内外类似的研究中,都没有明确的可以观察肿瘤RNA转染DCs效果的指标,我们应用绿色荧光蛋白质粒载体 pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2,提取筛选后细胞HepG2GFP总RNA转染DCs,观察转染后DCs绿色荧光蛋白表达及特异性表面标志及功能相关分子表达,检测其上清细胞因子分泌,探讨其作为肿瘤疫苗的可行性. 1材料和方法 1.1材料肝癌患者外周血单个核细胞来源于我科造血干细胞移植患者;HepG2肝癌细胞株由我科常规传代培养. 流式细胞仪(BD),DG3022A型酶联免疫检测仪(华东电子管厂),荧光显微镜Optiphot XIF(Nicon)等均为我院常备. FITCCD80,FITCHLADR,PECD83,PECD86抗体购自BD公司;rhGMCSF,rhIL4购自Peprorotec公司;TNFα购自我校生物技术中心;绿色荧光蛋白载体pGFPC3由陕西省肿瘤医院贾军博士惠赠;脂质体Transfection2000,Trizol Reagent购自Invitrogen;RPMI 1640培养基、胎牛血清、G418购自Gibco公司,Xvivo无血清培养基购自BioWhittaker;IL12 ELISA检测试剂盒购自Bioscience公司;MTT购自Sigma公司. 1.2方法参照Transfection2000说明书,pGFPC3转染HepG2,G418筛选2 mon. 筛选细胞命名HepG2GFP,荧光显微镜下观察. Trizol试剂提取HepG2GFP总RNA,紫外灯下观察,-80℃冻存备用. 同样方法提取HepG2总RNA. 取肝癌患者造血干细胞分离液,贴壁法分离单核细胞,贴壁细胞在细胞因子rhGMCSF,rhIL4作用下,诱导DCs. 倒置显微镜、电子显微镜观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表型. 1.2.1转染树突状细胞收集培养4 d的DCs,转入6孔板,转染HepG2GFP总RNA. 另设转染HepG2总RNA及空白对照组. 继续培养48 h. 荧光显微镜下观察. 1.2.2细胞因子分泌的测定48 h后,收集各组DCs上清,ELISA法检测转染前后各组细胞上清中IL12分泌量. 1.2.3CTL效应收集各组DCs,30 Gy 60Co照射后与复苏冻存的非贴壁细胞按20∶1比例混合接种于24孔板,培养5 d,收集的细胞即为效应细胞. 收集对数生长期的HepG2细胞作为靶细胞,将效应细胞与靶细胞按20∶1比例混合接种于96孔板. 同时设单一靶细胞组、单一效应细胞组. 培养24 h后,MTT法检测.以下述公式计算杀伤效率.CTL杀伤效率=〔1-(效靶A490-效应细胞A490)/靶细胞A490〕×100%.统计学方法:结果采用SPSS 10.0统计软件分析.2结果 2.1HepG2GFP总RNA转染DCs稳定转染及筛选后得到的HepG2GFP细胞,能够稳定的表达GFP,荧光显微镜下所有细胞都呈现绿色荧光(图1),传代20次以上仍无消失. 与对照细胞相比,GFP基因修饰细胞在形态、生长等特性上均无显著改变,也未见GFP表达对靶细胞的毒性. 使用Trizol提取HepG2GFP细胞总RNA后,取2 μL总RNA进行凝胶电泳,可见5 s,18 s和28 s条带(图2). 单个核细胞贴壁后,贴壁细胞在细胞因子GMCSF,IL4的作用下,培养第2日出现细胞集落,但细胞集落较小. 5 d后,集落明显增加、变大,出现具有毛刺状突起的细胞. 至7 d,集落开始减少,产生大量具有树枝状突起的细胞(图3A,B). 荧光显微镜下,HepG2GFP总RNA转染DCs组细胞呈绿色荧光,而HepG2总RNA转染组及空白对照组则无明显荧光表达(图4A,B,C). 图1荧光显微镜下pGFPC3稳定转染后HepG2胞浆荧光阳性 ×250(略) 图2HepG2GFP细胞的总RNA电泳(略) 图3树突状细胞形态(第7日)(略) 2.2流式细胞仪检测细胞表型诱导d 7,DCs表达CD80 13.2%,HLADR 38.9%,CD86 31.2%,CD83低表达,仅0.9%;转染后上述分子表达明显升高,分别为CD80 86.7%,HLADR 97.9%,CD86 92.5%,CD83 97.1%,提示转染后细胞具有成熟DCs特征. 图4总RNA转染DCs×250(略) 2.3ELISA检测IL12分泌HepG2GFP总RNA转染DCs组上清中IL12分泌明显增加,显著高于转染前〔(287.4±29.3) ng/L vs (61.3±8.1) ng/L; n=6,P<0.05〕. 2.4CTL介导细胞毒效应HepG2GFP总RNA转染DCs刺激的CTL对HepG2细胞杀伤率为(62.6±2.9)%,未转染的DCs刺激的T细胞对HepG2的杀伤作用为(20.8±1.5)%,无DCs刺激T细胞对HepG2的杀伤作用为(20.8±1.5)%,总RNA转染DCs刺激的CTL对HepG2细胞杀伤率明显高于两个对照组(n=6,P<0.05). HepG2GFP总RNA转染DCs刺激的CTL对SMMC7721和K562细胞杀伤率分别为(37.7±1.8)%和(26.8±1.1)%,对HepG2细胞杀伤率明显高于SMMC7721和K562细胞(n=6,P<0.05). 3讨论 DCs是体内功能最强大的专职性抗原提呈细胞,它在T细胞免疫中发挥着极其重要的作用〔2〕. 应用各种肿瘤抗原致敏DCs制备疫苗是近年来研究的热点 〔3-8〕. 肿瘤细胞总RNA转染DCs制备疫苗与其他方法相比,具有如下优越性:首先,它不受已知肿瘤抗原的限制,可诱导出多克隆的CTL;其次,转染所需的RNA可以通过扩增方法得到,很少量的肿瘤组织样本即可扩增得到大量的RNA〔8〕. 但目前国内外的研究中,尚未有可以明确观察总RNA转染DCs效率的方法. 我们应用稳定表达GFP的HepG2GFP总RNA转染DCs,以GFP为标记观察总RNA转染DCs的效率,探讨其作为肿瘤疫苗的可行性,为肝癌临床治疗提供实验基础. 本试验中,HepG2GFP总RNA转染后的DCs在荧光显微镜下观察,胞质呈现绿色荧光,证实GFP mRNA可以在DCs胞质内正常表达,同时说明肿瘤细胞总RNA同样也可以在DCs胞浆内进行翻译表达. 转染后CD83,CD80,CD86,HLADR表达明显升高,IL12分泌明显增加,说明RNA转染,促进了DCs的体外成熟. 成熟DCs主要通过MHCI类途径,将肿瘤细胞总RNA在DCs胞质内进行翻译表达的肿瘤抗原呈递给T淋巴细胞. 此途径诱导的T淋巴细胞主要为CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL). 本试验中,诱导的CTL对HepG2的细胞毒效应明显高于对照组T细胞,证实诱导的T淋巴细胞为肿瘤特异性的. 因此,在当前仍未发现肝癌特异性抗原情况下,应用肝癌细胞总RNA转染DCs制备瘤苗,诱导针对肝癌细胞的多克隆CTL,可以作为肝癌DCs疫苗的一个发展方向. 【参考文献】 〔1〕 Qin LX, Tang ZY. The prognostic molecular markers in hepatocellular carcinoma 〔J〕. World J Gastroenterol, 2002, 8(3):385-392. 〔2〕 张红梅,任军,张利旺,等. 外周血造血干细胞体外定向诱导树突状细胞及功能鉴定〔J〕. 第四军医大学学报,2003, 24(1):83-85. 〔3〕 Kaplan JM, Yu Q, Piraino ST, et al. Induction of antitumor immunity with dendritic cells transducted with adenovirus vector encoding endogenous tumorassociated antigens 〔J〕. J Immunol,1999, 163(2): 699. 〔4〕 Schnurr M, Galambos P, Scholz C, et al. Tumor cell lysatepulsed human dendritic cells induce a Tcell response against pancreatic carcinoma cells: An in vitro model for the assessment of tumor vaccines 〔J〕. Cancer Res, 2001, 61(17):6445-6450. 〔5〕 Barbuto JA, Ensina LF, Neves AR, et al. Dendritic celltumor cell hybrid vaccination for metastatic cancer 〔J〕. Cancer Immunol Immunother, 2004, 53: 1111-1118. 〔6〕 Heiser A, Maurice MA, Yancey DR, et al. Induction of polyclonal prostate cancerspecific CTL using dendritic cells transfected with amplified tumor RNA 〔J〕. J Immunol, 2001, 166: 2953-2960. 〔7〕 Heiser A, Coleman D, Dannull J, et al. Autologous dendritic cells transfected with prostatespecific antigen RNA stimulate CTL responses against metastatic prostate tumors 〔J〕. J Clin Invest, 2002, 109(3):409-417. 〔8〕 Kalady MF, Onaitis MW, Emani S, et al. Dendritic cells pulsed with pancreatic cancer total tumor RNA generate specific antipancreatic cancer T cells 〔J〕. J Gastrointest Surg, 2004, 8(2):175-181.

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