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在将CRISPR脱靶效应时，我们在文末提到CRISPR编辑效率与P53状态之间的关系，同时Cas9稳定表达可能会对细胞造成影响，从而增加CRISPR-Cas9的应用风险。不禁会有疑问：为何要将CRISPR与P53联系在一起？
我们首先要了解DNA损伤与P53之间的关系，如下图：
由上图可见：
左上角： 电离辐射（IR）等引起的 DNA双链断裂（DSB） ，可经由ATM信号从而激活P53；
右上角： UV等引起的 DNA单链断裂或损伤 ，可经由ATR信号，激活P53。
可见几乎任何一种DNA损伤都会导向至P53反应。而我们不止一次强调， CRISPR-Cas9的上半部分是引起DNA双链断裂（DSB），之后通过不同的修复方式达到精准基因编辑（HDR，MMEJ）或移码突变（NHEJ） 。于是， CRISPR作为一种可造成DNA”损伤“的技术，该技术的应用不可避免的引起P53反应。
但，P53反应和CRISPR技术应用隐患有何关系？
接着，我们可以简单来看看P53在生命体中到底有何作用。
抑癌基因： TP53（tumor suppressor protein）可以说只知名程度最高的抑癌基因之一（甚至可以说是第一）。在大部分肿瘤中都可检测到TP53突变，同时肿瘤细胞又常常表现出基因组紊乱的现象。因此，人们推测TP53的突变与肿瘤发生有关。随后有大量的动物实验和临床研究表明，TP53在体细胞突变引起的肿瘤中高度突变，同时germline TP53突变的病人也常会罹患一种甚至多种肿瘤疾病。
基因卫士 ：TP53作为DNA损伤的反应机制，在 正常情况下P53蛋白由于MDM2的泛素化从而被快速降解 ，因此属于不稳定状态。而 当DNA损伤出现时 ，MDM2被磷酸化从而失去泛素化P53的功能， P53的表达迅速增加 。而P53作为一种转录因子，迅速调控下游的各项指标。当 DNA损伤较轻时，P53会介导细胞周期阻滞 ，从而给予细胞DNA修复的机会，经过修复后的细胞可再次进入细胞周期。而 当DNA损伤十分严重无法修饰时，P53会将引导细胞走向凋亡 ，从而避免不良DNA损伤传递给子代。因而，TP53因其维持基因组稳定性的作用，达到抑癌的效果。
其他： P53的内容十分繁多，如P53在肿瘤中的变化 大多是错义突变而非缺 失，突变的部分 大多在DNA binding domain ，导致P53功能缺失的突变我们叫 “loss of function, LOF” 。而有一部分P53突变会产生突变体，该突变体不仅抑制剩余的野生型的P53的功能，同时自身还拥有新的功能，此时我们称之为 “gain of function, GOF” ，这时候的P53突变体可被称为oncogene。此外，如P53不仅仅在肿瘤细胞中有突变，其实在正常体细胞中也常检测到突变，有前两年有一篇文章详细介绍了这部分内容，并提出紫外线等是P53突变的主要原因之一，所以小伙伴们，防晒搞起来噻！
综上所述，P53作为一个维持人体基因组稳定性的重要基因，如果CRISPR技术打断了TP53的功能，那么其后果将相当严重 。
第一篇文章发便于2018年七月份的 Nature Medicine ，从标题上很明显看出内容为，P53可抑制CRISPR-Caas9在人多功能干细胞上的应用。
（1) 构建Cas9稳定表达的人多功能干细胞（human pluripotent stem cell，hPSC）
如下图所示，作者将一个双Tet-On 3G的Cas9及其筛选标记元件插入到AAVS1位点，改系统可控制Cas9表达的时间。同时sgRNA投放方式为慢病毒稳转。
(2) 瞬转Cas9-ribonucleoproteins (RNPs)
当作者提高基因编辑效率后，发现有不少人多功能干细胞在基因编辑后死亡，这就引起了作者的好奇：缘何死亡，机制为何？ 因此他们设计了以下实验并最终找到了原因。
在以往研究中，由于基因编辑效率很低，因此没有观测到CRISPR明显的细胞毒性。而当作者将编辑效率增加至80%以上以后，观测到了明显的细胞毒性现象。如下图所示， （e） 在图e中，通过四环素诱导Cas9表达，并结合sgRNA 对MAPT基因进行编辑 。 MAPT基因并不是人多能干细胞生存所必须的基因 ，换言之， 敲除该基因不应该对细胞的生存造成影响 。而结果却显示， 对MAPT基因编辑的同时，细胞团块缩小，证明有大量细胞死亡 。 （h） 在图h中，一样观测到了类似的现象。当然还有很多其他证据支持，最终文章的结论为，CRISPR-Cas9基因编辑会导致hPSC细胞的死亡。 那么CRISPR-Cas9基因编辑导致细胞死亡的原因到底为何？
为了验证CRISPR-Cas9诱导人多功能干细胞（hPSC）与Cas9诱导的DSB之间的 no bias 关系，而非特定基因编辑导致的死亡。作者对hPSC进行 CRISPR文库筛选 ，通过查看CRISPR文库内的sgRNA分布变化查看CRISPR-Cas9与hPSC死亡的关系。
注意：下图中出现的ddCas9是Cas9的一种变体，当没有Shield1的时候，ddCas9蛋白降解，无法行使其功能，只有在Shield1存在时ddCas9才能稳定行使功能。
如下图c-d所示： （ 1）在没有基因编辑发生的H1，iCas9+Dox组中 ，无论是target到目的基因的sgRNA还是没有target gene的sgRNA， 在12天的筛选之后都没有出现sgRNA分布的差异 。 （2）当外加Dox诱导Cas9表达，或者外加Shield1诱导ddCas9稳定之后 ，CRISPR-Cas9基因编辑的发生导致了有target的sgRNA分布出现了差异，证明有 一部分targeting sgRNA转染细胞已经在基因编辑过程中死亡。同时non-targeting sgRNA比例的增加，反向证实了一部分targeting sgRNA转染细胞的消失。以上结果证明了全基因组性的基因编辑导致细胞死亡，其原因可能是Cas9导致的基因毒性，而非特定的基因缺失导致的死亡。
而图e结果表示 ，这种对于CRISPR-Cas9毒性的敏感性主要表现在干细胞中，而常见的工具细胞和肿瘤细胞并没有这种现象。
以上结果虽证实了CRISPR-Cas9编辑过程造成hPSC死亡的因果关系， 但没办法把P53牵扯进来 。思路很简单，就把前面做的 MAPT gene editing的细胞送RNA-seq，看一下差异基因（左图a） 。差异基因自然有许多，但 P21作为P53的下游赫然在列，而且变化倍数非常大 。当然为了排除MAPT基因的影响， 还对其他基因编辑细胞进行了P21表达鉴定(右图d-g) ，进一步证实P21的变化，而P53作为P21的直接上游，应也是参与了这个过程。
上述所有结果都只是证明了 P53与CRISPR-Cas9诱导的hPSC死亡相关 ，但还是不能证明P53是hPSC在CRISPR-Cas9基因编辑过程中死亡的原因。因此作者构建了一个P53 mutant pool，这个pool中有一半以下是P53WT的细胞，一半以上是P53 mutant的细胞。 可以看到左图（c）中显示：（1）在control pool中激活CRISPR-Cas9基因编辑，细胞的融合度不断下降，证明有细胞死亡 ；（2）而在P53 mutant pool中，CRISPR-Cas9的激活，虽相对未激活组（P53 mutant pool -Dox），其融合度有所下降，但融合度相对 control+Dox组有所上调。我们分析可知， 融合度下降的原因在于P53WT细胞的死亡，而融合度上升则在于P53 mutant细胞的死亡抵抗 。 右图（e）中通过外加P53DD抑制野生型P53功能，细胞团块得到生长。
以上结果均表明，在P53功能失活之后，CRISPR-Cas9介导的死亡被抑制，因此证明了P53是CRISPR-Cas9介导hPSC死亡的原因。
作者切入点看起来很简单，但却也很巧妙。 CRISPR-Cas9作为诱导DSB的因素，常理来说一定会诱导P53的激活 ，而P53激活则会介导下游相关功能的体现（细胞周期阻滞、细胞衰老甚至死亡），这是一个很清晰明了的思路，但我们很多人都没有想过。且据我们经验， 人多功能干细胞常规的P53-P21表达水平非常低，WB和免疫荧光几乎无法检测到 。但 该类细胞对外界刺激非常敏感 ，如人胚胎干细胞只需要给予1-2 Gy的X光即可造成死亡。而成纤维细胞、间充质干细胞或者肿瘤细胞，给予10-30 Gy X光还无动于衷。由此可见，人多功能干细胞对DSB激活P53更为敏感，更易死亡。正是因为这种敏感的机制，才能使得人多功能干细胞的基因组一直比别的细胞更为稳定。虽然人多功能干细胞更为敏感，但不代表这种机制在其他常见细胞中不会发生。
由于P53 WT细胞可应对CRISPR-Cas9诱导的DSB，更易死亡，而P53 mutant细胞可以抵抗.。因此CRISPR-Cas9则成为了一个P53 mutant细胞的筛选因子，长此以往，细胞群落中P53 mutant的比例越来越高，其风险不言而喻。
这篇文章我在19年初就已读过，以为文章解读会写得比较容易，但当提笔写的时候发现有很多细节当时根本没有注意。 比如这篇文章纯熟的运用了CRISPR技术的多种手 段，从 普通敲除到inducible knockout ，而且它的 inducible还有多种方式（Cas9的诱导表达，Cas9的诱导稳定以及Cas9的诱导失活） ；从 单个基因的验证到全基因组的文库筛选 。因此我觉得这篇文章不仅仅是阐明CRISPR技术的应用风险一篇重要文章，同时也是我们全面学习CIRSPR技术的良好案例。文章非常棒， 值得回到原文好好细读。
本来这次推文还想解读两篇文献，考虑到篇幅只能将另一篇文献放在下一篇文章中了。写的时候还担心写简单了不够深入、写复杂了太过枯燥，内容是一展再展又一删再删。希望经过整修之后，内容不那么枯燥，还能有所帮助，感谢阅读并期回馈交流~
功能基因组学方法可以克服阻碍癌症药物开发的局限性，如缺乏确定可靠的靶点以及临床疗效差强人意。在这里，我们对来自30种癌症类型的324个人类癌细胞系进行了基因组规模的CRISPR-Cas9筛选，并开发了一个数据驱动框架，以优先选择癌症治疗方案。我们将细胞适应度效应与基因组生物标志物和药物开发的靶标易用性结合起来，系统地优先考虑已定义的组织和基因型中的新靶标。我们证实了我们最有希望的依赖之一，沃纳综合性ATP依赖解旋酶（Werner syndrome ATP-dependent helicase），作为多个癌症类型与微卫星不稳定的一个关键靶标。我们的分析提供了癌症依赖关系的资源，生成了一个框架来优先考虑癌症药物靶标，并提出了具体的新靶标。本研究中描述的原理可以为药物开发的初始阶段提供信息，为新的、多样化和更有效的癌症药物靶标组合做出贡献
患者肿瘤的分子特征影响临床反应，可用于指导治疗促进更有效的治疗和降低毒性。然而，大多数患者并没有得益于这种靶向治疗，部分原因是对候选靶点的了解有限。在癌症药物的开发中，缺乏疗效是由于90%的损耗率造成的，而且用于新靶点的分子药物依旧有限。有效识别和优先考虑肿瘤靶点的无偏策略可以扩大靶点的范围，提高成功率，并加快新癌症疗法的开发。
利用sgRNA文库的CRISPR-Cas9筛选已被用于研究基因功能及其在细胞适应性中的作用。基于crispr - cas9的基因组编辑具有很高的特异性，可以生成空等位基因，从而改变外显表型。在这里，我们提出了324个癌细胞系的基因组规模的CRISPR-Cas9适应度筛选和一项综合分析，使候选癌症治疗靶点的优先化成为可能(图1a),我们通过识别沃纳综合征ATP依赖解旋酶(WRN)作为微卫星不稳定性(MSI)肿瘤的靶点来说明这一点。
为了全面分类肿瘤细胞适配性( 全文的适应性都是这个意思：为细胞生长或生存所需的基因 )，我们对339个癌细胞系进行了941个CRISPR-Cas9适应度筛选，目标基因为18009个。遵循严格的质量控制,最终的分析包括324细胞系来自30个不同的癌症类型,在19个不同的组织。
这些细胞系是高度基因组注释细胞系的细胞模型集合的一部分，广泛代表患者肿瘤的分子特征，包括常见的癌症（如肺癌，结肠癌和乳腺癌）和特定未满足临床需求的癌症（ 如肺癌和胰腺癌）。对来自这324个细胞系的筛选数据的分析表明，在分类必需和非必需基因时具有高灵敏度，特异性和精确性，并且结果不受实验因素的偏倚。
在 特定分子或组织学环境中细胞适应性所需的基因 （这个就是文中说的背景依赖性核心基因）可能编码有利的药物靶标，因为在健康组织中诱导毒性作用的可能性降低。 相反，大多数测试细胞系常见或在癌症类型中常见的适合度基因（分别称为泛癌或癌症类型特异性核心适应性基因）可能参与细胞的基本过程并具有更大毒性。 因此，重要的是区分特定背景的适应性基因和核心适应性基因。
我们在每个细胞系中鉴定了1,459个适合度基因。 总共有41％（n = 7,470）的所有靶基因在一种或多种细胞系中诱导了适应性效应，并且这些基因的大多数（83％）在不到50％的测试细胞系中诱导了依赖性(图1b)。 为了识别核心适应性基因，我们开发了一种统计方法，即 自适应最优模型（ADaM） ，以自适应地确定基因被分类为核心适合度基因所需的最小数量的依赖细胞系(图1c)。 被定义为13种癌症类型中至少12种（也是适应性确定的）的核心适应性的基因被归类为泛癌核心适应性基因。 这产生了866个癌症类型特异性和 553 个泛癌症核心适应性基因。
在使用ADaM鉴定的泛癌核心适应性基因中，399先前被定义为必需基因，125是参与必需细胞过程的基因。其余132（24％）个基因是新发现的，并且在细胞管家基因和途径中也显着富集。与先前鉴定的参考核心适合度基因组相比。我们的泛癌核心适应度基因组显示更多基因过程中涉及的基因（中位数= 67％，相对于之前发表的基因组分别为28％和51％），而背景依赖性基因具有相似的假设发现率（FDRs）（取自先前的研究）。血癌细胞系具有最独特的核心适应性基因谱（31个独有的核心适应度基因）。癌症类型特异性核心适应性基因通常在匹配的健康组织中高度表达，与其在基本细胞过程中预测的作用一致，并表明如果用作靶标它们显示出潜在的毒性。值得注意的是， 五种基因在单一癌症类型中是核心适应性，并且在匹配的正常组织中基础水平低或不表达，这表明它们可以在这些组织中诱导癌细胞特异性依赖性。
总的来说，使用统计学方法，我们改进和扩展了我们对人类核心适应性基因的现有知识，并鉴定了具有高毒性可能性的基因，因此代表了不太有利的治疗靶点。 此外，由于拥有大规模的数据集，我们现在可以定义背景依赖适应性基因（每个癌症类型的中位数n = 2,813个基因）,其中许多具有与核心适应度基因相似或更强的失去适应性效应。
为了从我们的特定背景特定适应度基因列表中提名有希望的治疗目标，我们开发了一个计算框架，它整合了多种证据，为每个基因分配了一个目标优先级分数，范围0-100，并生成了候选的候选列表对于个体癌症类型或泛癌症候选者。为了排除由于潜在毒性而可能是不良靶标的基因，核心适合度基因被评为“0”。对于每个基因，70％的优先级得分来自CRISPR-Cas9实验证据，并根据适应度效应大小，适应性缺陷的显著性，目标基因表达，目标突变状态和其他证据，对依赖细胞系进行均值评估。其余30％的优先级分数是基于与靶标依赖性相关的遗传生物标记物的证据以及靶标在患者肿瘤中被体细胞改变的频率。对于生物标志物分析，我们进行了方差分析（ANOVA）（图2）以测试适合度基因与484种癌症驱动事件（151种单核苷酸变体和333种拷贝数变异体）或MSI之间的关联，在每种癌症类型中都有足够的大样本（n≥10细胞系）。我们基于针对具有批准或临床前癌症化合物的目标计算的得分（扩展数据图5c和补充表5）得出优先级评分阈值（分别为泛癌和癌症类型特异性分析的 55和41 ）。
我们共确定了628个独特的优先目标，包括92个泛癌和617个癌症类型特定目标。 在癌症类型中，优先目标的数量变化大约三倍，中位数为88个目标。 大多数癌症类型的优先目标（n = 457,74％）仅在一种（56％）或两种（18％）癌症类型中被识别，强调了它们的背景特异性。 在癌症类型特异性分析中也发现了最优先的泛癌靶点（88％）。 仅在泛癌症分析中确定的11个优先目标通常包括在来自多种癌症类型（例如，CREBBP和JUP）的一小部分细胞系中发生的依赖性或在有限数量的癌症类型中发生的依赖性。 可用细胞系阻止进行癌症类型特异性分析（例如，黑素瘤中的SOX10）。
在628个优先目标中，120个（19％）与使用具有高显着性和大效应大小（定义为A类靶标）的ANOVA鉴定的至少一种生物标志物相关，因此这些蛋白质对于药物开发特别有利。 例如，PIK3CA是乳腺癌，食道癌，结肠直肠癌和卵巢癌中的A类靶标; PI3K抑制剂正在临床开发用于PIK3CA13突变的癌症。 使用渐进不那么严格的显着性阈值扩展了目标，其中至少一个生物标志物关联由ANOVA确定，其被定义为B类（n = 61,10％），其次是C类（n = 117,19％）目标，一些 在多种癌症类型中鉴定出来的。 总之，这些结果强调了数据驱动的定量框架通过组合来自多种细胞系的CRISPR-Cas9筛选数据和相关基因组特征来确定靶标优先级的潜力。
在目前的药物开发策略的基础上，目标在药物干预的适用性方面各不相同，这为目标选择提供了依据。 使用目标易处理性评估来开发小分子和抗体，我们以前将每个基因分配到10个易处理桶中的1个（1表示最高的易处理性）。 我们将628个优先目标与其可控性交叉引用，并将它们分为三个易处理组。
可追踪性组1（桶1-3）包括临床或临床前开发中批准的抗癌药物或化合物的靶标，并包括40个独特的优先目标，例如乳腺癌中的ERBB2，ERBB3，CDK4，AKT1，ESR1，TYMS和PIK3CB以及PIK3CA。 ，IGF1R，MTOR和ATR在结直肠癌中的表达。在这40个优先目标中，20个具有至少一种针对癌症类型开发的药物，其中靶标被确定为优先，而其余20个靶标具有已经用于或开发用于治疗其他癌症类型的药物，提供重新利用这些药物的机会。第1组中的三分之一优先目标具有A类生物标志物，表明它们是非常理想的目标。一个例子是CSNK2A1，它由结直肠癌细胞系中高度显着的适合度基因CSNK2A1编码，扩增含有FLT3和WASF3的染色体片段（P = 6.65×10-6，玻璃△> 2.9）并被靶向silmasertib。具有标记的第1组中的其他优先目标显示ERBB2扩增时存在ERBB2或ERBB3依赖性，ASXL扩增食管癌细胞系中CDK2依赖性，PIK3CA突变存在时PIK3CA依赖性和PTEN乳腺癌细胞系中PIK3CB依赖性突变。
可追踪性组2（桶4-7）在临床开发中包含277个没有药物的优先目标，但有证据支持目标易处理性。其中，18％具有A类生物标志物，包括KRAS依赖于KRAS突变细胞系，USP7依赖于APC野生型结肠直肠细胞系，KMT2D依赖于乳腺癌细胞系，扩增含有PPM1D和CLTC的染色体片段和MYI扩增的骨和胃癌细胞系中的TRIAP1依赖性。值得注意的是，我们观察到具有MSI和泛癌的结肠直肠和卵巢细胞系中的A类生物标记物依赖于WRN。在第2组中与生物标志物无关的优先目标中，GPX4是多种癌症类型的靶标。对GPX4抑制的敏感性与上皮 - 间充质转变相关，并且我们观察到与GPX4依赖性细胞系中的上皮 - 间质转化相关的标志物的差异表达。这表明我们的目标优先级方案的未来改进如何能够捕获与扩展的分子特征集相关的优先目标，包括基因表达，染色质修饰和分化状态。
最后，第3组（第8-10栏）包括311个优先目标，这些目标没有任何支持或缺乏可以告知可行性的信息; 该组显着富含转录因子。 具有A类生物标志物的组3中的优先目标的实例包括乳腺癌中的FOXA1和GATA3，血液学和淋巴癌中的MYB，卵巢癌中的STX5和神经母细胞瘤细胞系中的PFDN5。
易处理性组1中的优先目标富含蛋白激酶，突出了针对这类目标的药物开发的主要焦点，与第2组和第3组相比，其包括功能更多的多样化靶组。 第2组中的目标最有可能通过常规方式新颖且易于处理，因此代表了药物开发的良好候选者。 较新的治疗方式，如蛋白水解 - 靶向嵌合体，可能会增加适合药物干预的蛋白质的范围，以包括第3组中的目标。总体而言，我们的框架提供了数据驱动的优先治疗目标列表，这些目标将是 癌症药物的发展。
为了证实我们的目标优先级策略，我们研究了WRN解旋酶作为MSI癌症的有希望的靶标。 WRN是五种RecQ家族DNA解旋酶之一，是唯一一种同时具有解旋酶和外切核酸酶结构域，并且在DNA修复，复制，转录和端粒维持中具有不同的作用。 MSI表型是由于MMR途径基因的沉默或失活导致的DNA错配修复（MMR）受损引起的。 MSI与高突变负荷相关，发生在20多种肿瘤类型中，常见于结肠癌，卵巢癌，子宫内膜癌和胃癌（3-28％）。
WRN的依赖性与泛癌ANOVA中的MSI以及结肠癌和卵巢癌细胞系的分析密切相关。 大多数MSI的子宫内膜和胃癌细胞系依赖于WRN; 然而，由于样本量小，与MSI的关联不显着（对于胃）或未进行测试。 MSI在许多其他肿瘤类型中是罕见的（<1％），例如肾，黑素瘤和前列腺癌，并且大多数（测试的5个中的4个）来自这些组织的MSI细胞系不依赖于WRN。 其他经过测试的RecQ家族成员（BLM，RECQL和RECQL5）与MSI细胞系中的适应性基因无关。 对MMR途径基因的非同义突变，启动子甲基化和纯合缺失的集中分析证实了WRN依赖性与MLH1启动子的高甲基化或MSH6突变之间的显着关联; 以及表观遗传调节因子MLL2（也称为KMT2D）的突变。
为了进一步验证WRN，我们进行了基于CRISPR的共竞争测定，其中比较了WRN敲除与野生型细胞的相对适应度。与来自结肠癌，卵巢癌，子宫内膜癌和胃癌的六种MSI细胞系中的野生型细胞相比，使用四种单独sgRNA的WRN敲除降低了WRN敲除的适应性。相比之下，来自这四种组织的所有微卫星稳定细胞系没有差异。一致地，WRN在克隆形成测定中对MSI细胞具有选择性的基础。值得注意的是，WRN敲除对细胞适应性具有有效影响，其效应大小与核心适应度基因相似。此外，我们从系统RNA干扰筛选中挖掘数据并确认MSI癌细胞系中的WRN依赖性，并证实通过RNA干扰的WRN下调强烈地损害了MSI HCT116细胞中的生长，从而在正交实验系统中提供了验证。尽管MMR缺乏与WRN依赖性之间存在很强的相关性，但在微卫星稳定的SW620细胞系中敲除MLH1并未诱导WRN依赖性;相反，HCT116细胞与含有MLH1和/或MSH3的染色体互补（以恢复其表达和纠正MMR缺陷） - 并不能恢复WRN敲除的效果。
为了确定适应性损失效应是否对WRN具有选择性并确定药物靶向的潜在策略，我们使用野生型或亚型Wrn的亚型（对我们使用的WRN sgRNA具有抗性）进行功能性拯救实验 ）外切核酸酶（E78A）或解旋酶（R799C或T1052G）结构域中的突变会损害蛋白质功能。 野生型或核酸外切酶缺陷型Wrn的表达拯救了MSN细胞中WRN的敲除，而解旋酶缺陷型Wrn的表达导致无（R799C）或弱（T1052G）拯救。 因此， WRN的解旋酶活性是必需的，并且是可用于治疗靶向的重要结构域。
为了评估MSI细胞对WRN消耗的体内敏感性，我们在HCT116细胞中开发了多西环素诱导型WRN sgRNA系统。 在小鼠中皮下移植表达WRN sgRNA的HCT116细胞后，用强力霉素治疗导致已建立肿瘤的显着生长抑制和增殖细胞数量的减少。 这些发现证实WRN是维持MSI结肠直肠癌细胞体内生长所必需的。
参考文献： Behan F M, Iorio F, Picco G, et al. Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR–Cas9 screens[J]. Nature, 2019, 568(7753): 511.
CRISPR （Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats）是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞（包括iPS）的特定的基因组位点上进行切割，修饰。 Rudolf Jaenisch 研究组将Cas9与Te1和Tet2特异的sgRNA共注射到小鼠的受精卵中，成功得到双基因敲除的纯合子小鼠，效率高达80%。 他们将Cas9/sgRNA 与带突变序列的引物共注射，能准确在小鼠两个基因引入所要的点突变。在ES细胞中他们更是成功的一次敲除了五个基因。与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变。但该系统是否有脱靶效应尚需进一步的研究。 传统的转基因和基因打靶技术，由于技术稳定成熟，可以对小鼠和大鼠的基因组序列进行各种修饰，仍将是模式动物的构建的主要技术。 核酸酶ZFN/TALEN 尤其是CRISPR/Cas技术如果能解决脱靶效应的话，有可能会广泛应用于小鼠，大鼠及其他模式动物的制备和研究中，成为传统的转基因和基因打靶技术的重要补充。
Crispr是一套正在改变世界的分子剪刀。这是一种切割DNA的酶，科学家们在2012年发现，他们可以将其用于廉价、有效的基因编辑：只需在CRISPR分子上标记一点RNA（一种粘在DNA上的基因物质的薄片）来引导它，而且它可以切割并“重写”持用者想要瞄准的任何DNA片段。
研究人员多年来一直在与CRISPR合作，对付艾滋病毒，从实验人类胚胎细胞中删除遗传疾病，提高跨物种器官移植的可能性。一些科学家甚至认真地讨论在CRISPR的帮助下复活这只早已灭绝的猛犸象。
，但直到现在，科学家们还没有直接观察到CRISPR的活动。他们知道这是有效的，因为如果CRISPR被用于某些细胞，这些细胞会产生DNA，并进行编辑。但是因为分子参与的规模很小，所以在行动中直接观察它们是非常困难的。科学家们刚刚用CRISPR做了10件了不起的事情：
但是“困难”并不意味着不可能。在11月10日发表在《自然通讯》杂志上的一篇论文中，由金泽大学的Shibata Mikihiro和东京大学的Hiroshi Nishimasu领导的一个研究小组对CRISPR的运行进行了可视化观察，Nishimasu在Twitter上分享了一个GIF，它显示了近乎实时的动作展开。
分析这里发生的事情有点困难，但是研究人员添加的箭头提供了帮助。那些长长的咖啡棕色线条？这些是DNA链。太阳黄的斑点？这就是CRISPR-Cas9酶，简称CRISPR，以及它的引导RNA。紫色箭头指向CRISPR咬入的链上的点，灰色箭头指示的第二段DNA在CRISPR吞下后分离。整个过程在GIF中加速，大约需要30秒。
研究人员使用一种称为原子力显微镜的技术拍摄了视频。在佐治亚理工学院纳米研究小组的一篇博客文章中，没有参与这篇新论文的研究员文杰·迈解释说，原子力显微镜涉及到一个课题，一个接一个地，非常快地，用一根非常锋利的针头，记录针头遇到的力。它允许研究人员建立粗糙但非常尖锐的纳米级图像和视频的影响区域。
这段视频揭示了第一次直接观察CRISPR行为，正如研究人员长期以来怀疑的那样。《大西洋月刊》昨天（11月13日）报道说，当研究人员在蒙大拿州Big Sky的一次会议上展示他们的视频时，全场都是经验丰富的CRISPR用户，他们喘不过气来。
是关于生命科学的原创文章。
到底该不该对人类胚胎进行基因编辑近日广州医科大学范勇团队发表论文，宣布他们用基因编辑技术制造出一个能对艾滋病毒免疫的人类胚胎。艾滋病毒要人体内存活、繁衍，需要跟人体免疫细胞表面上的一种蛋白质结合，进入免疫细胞。有极少数人这个蛋白质的基因发生了突变，艾滋病毒没法进入免疫细胞，这些人天生就对艾滋病毒免疫。范勇团队用一种称为CRISPR/Cas9的基因编辑技术对人类胚胎细胞里头的基因组进行改造，人为让该蛋白质基因发生突变，理论上这样产生的胚胎细胞将会对艾滋病毒具有免疫力。这是史上第二例用这种基因编辑技术改造人类胚胎细胞。第一例也是中国科学家完成的。那是在去年，中山大学生物学副教授黄军就团队用该技术修改了人类胚胎细胞中与β型地中海贫血症有关的基因。发表这两篇论文的学术期刊都没有什么影响力，然而它们都在国际上引起了广泛的关注，称得上是一年来中国生物医学领域在国际上最著名的成果，比国内那些动不动就号称有望获得诺贝尔奖的成果著名多了。然而它们之所以著名，并非因为它们有多高的学术价值。它们的意义只是证明了CRISPR/Cas9这种基因编辑技术可以用来改造人类胚胎细胞。但是这是我们预料中的。这种基因编辑技术是近年来生物医学研究的一大热门，此前已被其他实验室用于修改其他动物细胞的基因，包括猴子胚胎细胞的基因，人类胚胎细胞的基因也能被改造一点也不意外。它们之所以引起关注，就在于竟然“敢于”也改造人类胚胎细胞的基因，这在国外、特别是在西方国家，是一个很有争议的、甚至可以说是禁忌的课题。在黄军就团队的论文发表后，国际上甚至还专门开了一次会议，讨论基因编辑技术涉及的伦理问题，要求暂停用它来改造人类胚胎，禁止用于辅助生殖。
做科研必备6大文献数据库！
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在期刊上发表，需要根据你的专业和要求来选择期刊，比如建筑、经济、医学等等。对论文上网有没有要求，比如知网、万方、维普等。建议在参加评审前1-2年准备好论文。具体以当地评审要求为准。发表论文前一定要查看自己省份对评审论文的要求，各省对论文发表的要求有细微的差别，一般来说文章字数在2000~5000 字左右。每个单位对于评职称都会有相关的文件要求，比如：论文必须发表在国内正规刊物上，有CN刊号和ISSN刊号，或者明确强调需要知网、万方等数据库收录的刊物，这些都是要求。提前搞懂这些要求，才能更好地按照要求去准备论文。要了解清楚时间，这里说的时间，包含：版面时间、见刊时间、上网时间三个。(1)版面时间：每家杂志社都会提前收稿，或者收稿很慢，如果组稿编辑告诉你22年12月版面，1月出刊，则意思就是你的论文会刊登在22年的12月版面上，为什么说这个问题，因为有的用人单位要求论文必须发表在当年内，所以即使它是1月出刊，但是版面在22年12月，也是符合单位评职称要求的；(2)见刊时间：见刊时间就是作者看到论文发表被刊登在杂志里的时间，因为单位在评职称事，都会要求拿上论文发表所在刊物杂志，所以见刊时间很重要；(3)上网时间：上网就是我们说的论文被数据库（知网、万方、维普、龙源等）收录了，上网时间一般在见刊时间1-3个月内，了解这个时间，是因为有的单位对于论文发表的认可，单单见到刊物是不算的，必须要被数据库收录了才能评职称。
一般来说鲜明的要求写人的论文都已经给出题目，大部分是命题或者半命题，当然也存在让你拟题的可能。题目是文章的窗口，拟一个好题目，可以使文章增色不少，怎样拟好写人论文的题目呢？1、通常我们以写的人为题，这样可以一目了然让人了解你是在写人，在题目中，也可以加入一些修饰语，把这个人的主要特征写入，如《可爱的老爸》；或者把我对一个人的情感写入《难忘的他》
国内主要有5大期刊数据库一、中国知网提供的《中国学术期刊(光盘版)》也称中国期刊全文数据库由清华同方股份有限公司出版。收录1994年以来国内6 600种期刊,包括了学术期刊于非学术期刊,涵盖理工、农业、医药卫生、文史哲、政治军事与法律、教育与社会科学综合、电子技术与信息科学、经济与管理。收录的学术期刊同时作为“中国学术期刊综合评价数据库统计源期刊”。但是收录的期刊不很全面,一些重要期刊未能收录。二、中国生物医学文献数据库(CBMDISC)由数据库是中国医学科学院信息研究所开发研制,收录了自1978年以来1 600余种中国生物医学期刊。范围涉及基础医学、临床医学、预防医学、药学、中医学及中药学等生物医学的各个领域。三、中文生物医学期刊数据库(CMCC)由中国人民解放军医学图书馆数据库研究部研制开发。收录了1994年以来国内正式出版发行的生物医学期刊和一些自办发行的生物医学刊物1 000余种的文献题录和文摘。涉及的主要学科领域有:基础医学、临床医学、预防医学、药学、医学生物学、中医学、中药学、医院管理及医学信息等生物医学的各个领域。并具有成果查新功能医学全在线四、万方数据资源系统(China Info)由中国科技信息研究所,万方数据股份有限公司研制。该数据库收录的期刊学科范围广,包括了学术期刊于非学术期刊,提供约2 000种的电子期刊的全文检索。被收录的学术期刊都获得了“中国核心期刊(遴选)数据库来源期刊”的收录证书。个别期刊甚至将“遴选”改成“精选”,或者干脆去掉。很多作者因此误以为这就是核心期刊。五、维普数据库也称中文科技期刊数据库,维普科技期刊数据库,由中国科学技术信息研究所重庆分所出版。收录了1989年以来我国自然科学、工程技术、农业科学、医药卫生、经济管理、教育科学和图书情报等学科9 000余种期刊,包括了学术与非学术期刊。收录期刊数量很大,但不足之处是部分国家新闻出版总署公布的非法期刊也被收录了。一般的,学术期刊都能进入至少1个国内期刊数据库。期刊据数据库[3]不是期刊的评价体系,对科研处的期刊性质评价也就缺乏足够的意义,故不宜作为期刊性质评价的依据。1、万方数据万方数据提供中国大陆科技期刊检索，是万方数据股份有限公司建立的专业学术知识服务网站。隶属于万方数据资源系统，对外服务数据由万方数据资源系统统一部署提供。2、全国报刊索引收录全国包括港台地区的期刊8000种左右，月报道量在1.8万条以上，年报道量在44万条左右，书本式用户有3500多家，现又出版光盘数据库。反映了中国政治、经济、军事、科学、文化、文学艺术、历史地理、科技等方面的发展情况，提供了国内外最新学术进展信息。该索引是我国收录报刊种类最多，内容涉及范围最广，持续出版时间最长，与新文献保持同步发展的权威性检索刊物，也是查找建国以来报刊论文资料最重要的检索工具。正文采用分类编排，先后采用过《中国人民大学图书分类法》和自编的《报刊资料分类表》，1980年起，仿《中国图书馆图书分类法》分21类编排，1992年全面改用《中国图书资料分类法》（第三版）编排，2000年开始用《中国图书馆分类法》（第四版）标引，计算机编排。在著录上，《全国报刊索引》从1991年起采用国家标准——《检索期刊条目著录规则》进行著录，包括题名、著译者姓名、报刊名、版本、卷期标识、起止页码、附注等项。同时，“哲社版”采用电脑编排，增加了“著者索引”、“题中人名分析索引”、“引用报刊一览表”，方便了读者的使用。3、超星数字图书馆为目前世界最大的中文在线数字图书馆，提供大量的电子图书资源提供阅读，其中包括文学、经济、计算机等五十余大类，数十万册电子图书，300 万篇论文，全文总量 4亿余页，数据总量30000GB，大量免费电子图书，并且每天仍在不断的增加与更新。覆盖范围：涉及哲学、宗教、社科总论、经典理论、民族学、经济学、自然科学总论、计算机等各个学科门类。本馆已订购67万余册。 收录年限：1977年至今。4、维普资讯维普资讯是科学技术部西南信息中心下属的一家大型的专业化数据公司,是中文期刊数据库建设事业的奠基人,公司全称重庆维普资讯有限公司。目前已经成为中国最大的综合文献数据库。从1989年开始，一直致力于对海量的报刊数据进行科学严谨的研究、分析，采集、加工等深层次开发和推广应用。5、中宏数据库中宏数据库由国家发改委所属的中国宏观经济学会、中宏基金、中国宏观经济信息网、中宏经济研究中心联合研创。是由18类大库、74类中库组成，涵盖了九十年代以来宏观经济、区域经济、产业经济、金融保险、投资消费、世界经济、政策法规、统计数字、研究报告等方面的详尽内容，是目前国内门类最全，分类最细，容量最大的经济类数据库。
01 中国知网 中国知网是国家和清华大学等为主导的论文资源共享平台。中国知网可以说是国内论文数据库中，资料最全，涵盖范围最广的一个网站。需要写论文的朋友们可以到这个网站去寻找你要的论文资料。 02 万方学术搜索网 万方学术搜索网是由中国科技信息研究所和万方数据共同联合创建的论文资源共享平台。在这个网站上有很多关于学术如何跟生产相结合的论文，有这方面需求的学生朋友们可以去这个平台看一看。 03 维普咨询 维普咨询可以说是国内最早的一个论文数据库网站之一。它里面的论文资源也是非常丰富的。该网站收入了比较全的自然科学类论文和三农类的论文材料，有写这方面论文的学生朋友们，可以考虑一下去维普咨询看一看。 04 龙源期刊网 龙源期刊网中的论文资源也是比较丰富的，只是该网站下载相关的论文信息是要收费的。我不建议花钱去找论文资源。 05 中国生物医学文献数据库和中文生物医学期刊数据库 如果你是从事医药行业或者是研究生物的学子，可以到中国生物医学文献数据库和中文生物医学期刊数据库，去寻找写论文的资源。 06 学校图书馆的相关网站 任何一座大学的图书馆中的电脑上都有一些比较好的论文资源，如果在上述网站中没有找到合适的论文资源，可以到你所在的学校的图书馆电脑上中去找一下有没合适的论文资源。
常用的电子期刊数据库如下：
1）中国知识基础设施工程网（CNKI数据库）。
“中国知识基础设施工程网”即“中国知网”，它是由清华同方股份有限公司和清华大学中国学术期刊（光盘版）杂志社负责牵头建立的国家知识基础设施。
其CNKI系列数据库包括期刊、报纸、学位论文、会议论文、标准、专利等，收录了自1994年以来的国内公开出版的8000多种期刊和报纸等出版物上发表的文章的全文。该数据库取得有关出版机构的授权，与印刷版出版物同步发布。
以PDF或CAJ格式呈现，与印刷版形式完全一致，确保文献资源的及时、准确、可靠。该网络平台既有社会科学文献，又有自然科学文献，是目前国内最大的中文文献数据资源库。
尤其是近年来，其推动与有关期刊签定独家授权协议，使得该数据库中积累了很多其他数据库所没有的重要期刊文献资源。
2）万方数据知识服务平台。
“万方数据知识服务平台”是由万方数据股份有限公司开发的建立在互联网上的大型中文网络信息资源系统。它由面向企业界、经济界服务的商务信息子系统、面向科技界的科技信息子系统以及数字化期刊子系统组成。
科技信息子系统是集中国科技期刊全文、中国科技论文与引文、中国科技机构与中国科技名人的论文和毕业论文等近百个数据库为一体的科技信息群。该系统由相关出版单位授权，文献发布形式与中国知网类似，资源覆盖自然科学和社会科学领域的期刊、图书、专利、标准等。
数字化期刊子系统使得用户可在网上直接获取万方数据库新提供的部分电子期刊的全文。
3）中国科技期刊数据库。
中国科技期刊数据库是由重庆维普咨询公司开发的一种综合性数据库，也是国内图书情报界的一大知名数据库。它收录了近千种中文期刊和报纸以及外文期刊，可供查询和下载。
以上几种数据库，大部分高校图书馆都购买了使用权，校内用户都可以免费使用和下载。这些数据库一般都有详尽的使用说明，学生可以了解。
发表论文的平台如下：
1.知网
这里所说的是知网，是清华大学和清华同方共同办的这个数据库。在前些年他也叫中国期刊网，由于后来有人自己建了个网站也叫中国期刊网，自己收录期刊，假李逵装真李逵。玩文字游戏，导致很多作者上当。
所以现在知网对外不称中国期刊网了，就是叫知网。从论文发表来说，知网是最权威的，最有说服力的数据库。
凡是知网收录的期刊，一定是正规的，可以放心大胆的发表的，但是最近这两年知网变得更严格，所以知网收录的期刊发表费用比较贵一些。
2.万方数据库
万方数据库，也是一个比较大的论文数据库，仅次于知网。其权威性和重要性就等于是一个弱化版的知网，但是也是比较大。
从期刊正规性来说，如果一个期刊，知网不收录，但是万方数据库收录，说明还是比较正规的，虽然不如知网收录的那么正规。但是对于一般单位来说够用。
对于大学这样的单位可能必须要求知网。而对于一些企业单位，只要万方数据库能检索到已经发表的论文，就算不错了。所以，万方数据库也是一个必须参考的标准。
3.维普网
维普网在前些年实际上假刊比较多，比较泛滥，这两年所说期刊审核严格，上面审核严格，但是维普网收录的期刊从正规性和权威性上来说，都是严重不如知网和万方数据库。
对于很多要求不高的单位，或者评一些初级职称的单位，只有维普网收录的期刊还能管点用。稍微严格一些的，就不大灵光了。
没有什么不可以的，只要伱敢发只要系统不说伱你就成功了一大半适当的学习一下这些文案：
这是不可以的，只要是发过的都是不可以再去发的，自己的文章也是一样的。
诺严格来说是不可以的了，不如不严格的话是可以的，没有人说的话是可以的额
硕士论文发表在中国知网把可以再发表在其它期刊。因为知网是分数据库的。如果是说的硕士论文是发表在知网上的博硕士论文库里的话，是可以选择一部分改成文章发到期刊上的，这样文章是算期刊全文库的。如果是说已经有一部分作为期刊文章发表，那么就不能再在其他期刊上发表了。
硕博论文，个人用户在知网是没有后台的，自己是硕士博士，然后去知网上传文章不就行了吗，各个大学，有博士点，硕士点的大学，会在知网有入口，学校在这里上传本校硕士生博士生的毕业论文。上传成功后，其他人可以在硕博论文界面检索下载。
制度须知
从高校培养办法看，在培养目标里面都明确写着:硕士研究生教育承担着既为博士生教育输送合格生源，又为经济建设与社会发展培养各类高层次专门人才的任务。硕士生的培养应强调专业基础理论和专业知识的学习。
重视综合素质提高和创新、创业精神的培养，提高分析与解决问题的能力，根据实际需要和不同面向确定培养目标、培养类型和培养模式。