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基因克隆（gene cloning）或分子克隆,又称为重组DNA技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。例如,要获得人类基因组中的某个基因，我们就需要借助基因克隆技术，进行目的基因的分离、克隆和扩增。因此，接下来，我就从基因克隆工具和具体的实验流程两方面进行介绍。 （ 1 ）限制性内切酶 首先介绍的是限制性核酸内切酶，它是细菌的“限制-修饰系统”防御机制的重要一员。限制修饰系统(Restriction-Modification System, R-M system )，即限制酶和甲基化酶系统（图1） [1]。研究者将能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖的酶称为 限制性核酸内切酶 （Restriction endonuclease，RE，简称限制性内切酶或限制酶）。而宿主细菌的DNA通过甲基化酶的甲基化后，DNA的酶切位点被保护起来，不会被限制酶切割。 根据限制性内切酶的结构，识别位点，切割位点等特性可以将RE分成四类（表1）[2]，基因克隆中常用的是II型限制性内切酶。不过像IV型内切酶这种可以识别修饰化DNA，可以用于表观遗传学的研究。 II型限制性内切酶是目前发现的最多的一类内切酶，根据其识别位点与切割位点的特性又可以分成不同的亚型[3]，例如我们常见的识别回文序列的内切酶， Eco R I，属于Type IIP类型，这种酶的切割位点在识别位点内部；而像现在在CRISPR/Cas9相关基因克隆中用到的 Bpi I等酶，则属于Type IIS型，它的切割位点离识别位点有几个到几十个碱基的距离。 既然是限制性内切酶，那么酶切DNA后就会留下不同的末端类型，这其中就包括粘性末端和平末端（图3）。所谓的粘性末端，就是酶切后有5’端或者3’端有突出碱基的末端类型，因此又分为5’ Overhang end，例如 Hin d III，和3’ Overhang end， 例如 Pst I两种。那些酶切后没有突出碱基的就属于平末端类型， 例如 Eco R V。 DNA碱基之间靠5’, 3’ 磷酸二酯键连接，限制性内切酶切割DNA后，出现的是5’-P 和3’-OH（图4）。 另外，根据限制性内切酶的功能，其又有同裂酶、异裂酶、同尾酶、可变酶和修饰敏感内切酶等类型（图5）。其中，同裂酶(isoschizomer)，又称异源同工酶，即从不同原核生物中分离出来的不同的Ⅱ型酶，有相同的识别特点和切割位点，例如 Age I和 Bsh T I。异裂酶则是指可以识别相同的核苷酸序列，但会在不同的位点切割 DNA，例如 Sma I和 Xma I。同尾酶(isocaudarmer)指不同来源的酶其识别和切割序列有一定的相关性，作用后能产生相同的粘性末端，例如 Age I和 Xma I，这一类的酶酶切后的产物可以进行连接，在基因克隆中有着重要的用途。可变酶则指所识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过6个碱基对，例如 Bst E II识别序列为：GGTNACC，其中N为一可变碱基，可以是A/T/C/G四种中的任何一个；而 Bst N I 的识别序列为CCWGG，其中的W则表示A或者T。修饰敏感内切酶是对DNA修饰（例如甲基化修饰）敏感的限制性内切酶，例如 Bcl I对甲基化的识别位点不能切割，但无甲基化的则可以进行切割； Dpn I则刚好相反，有甲基化才能切割。 限制性内切酶有那么多种，到底选择那种进行呢？ 首先，我们需要进行酶切位点分析，可以使用在线（ Sequence Manipulation Suite 和 analyze-sequence, Addgene ）或者本地版（SnapGene）的分析工具进行序列分析。然后结合同裂酶、异裂酶、同尾酶、可变酶特性进行RE选择，并且同时要考虑所选限制性内切酶对修饰敏感性。另外，根据试剂使用中使用的酶的数量，我们将酶切反应可以分为单酶切、双酶切和分步酶切。 单酶切 ：同一个体系进行一种酶切反应； 双酶切 ：同一个体系进行两种酶的酶切反应（针对反应条件一致的限制性内切酶）； 分步酶切 ：样品进行完第一个酶切反应后进行纯化，再进行第二个酶切反应（针对反应条件不一样的限制性内切酶）。明确了以上信息后，我们就可以进行酶切反应了。一个酶切反应涉及样品类型，缓冲液，酶量以及反应温度和反应时间等。这些都可以参考限制性内切酶的产品使用说明进行操作。 （ 2 ） DNA 连接酶 限制性内切酶负责将DNA切开，DNA连接酶则是用来重新连接DNA的工具。DNA连接酶是一类催化双链DNA中相邻碱基的5’磷酸和3’羟基间磷酸二酯键形成的酶（图6）。因为是双链，所以一般要求连接位点不能出现碱基错配。不过实际应用中，DNA连接酶也会将有少量错配的DNA进行连接。DNA连接酶主要有两种：T4 DNA连接酶（平末端和粘性末端均可连接），大肠杆菌DNA连接酶（只能连接粘性末端）。 （ 3 ） DNA 聚合酶 之前我们介绍过PCR聚合酶链式反应，其中使用的就是DNA聚合酶。实际上，DNA聚合酶长具备三种酶活性（图7）：用于新链DNA合成的DNA聚合酶活性，用于错误参入碱基校正的3’-5’核酸外切酶活性，还有5’-3’ 核酸外切酶活性，在DNA复制中用于去除RNA 引物。借助这一活性，可以进行Nick translation，用于标记核苷酸参入等。但并不是每一种DNA聚合酶都这三种酶活性，NEB官网提供了一系列DNA聚合酶及其具备的功能活性（ DNA Polymerase Selection Chart-NEB ）。 根据所使用的DNA聚合酶类型不同，PCR产物的末端有3’-A粘性末端和平末端两种类型。其中Taq DNA polymerase因为缺乏3’-5’ exonuclease活性，其PCR的保真度低，且PCR产物的3’端多一个粘性末端A；而 高保真DNA polymerase保留3’-5’ exonuclease活性，有很高的校正活性，其PCR产物为平末端。 （ 4 ）无缝克隆技术 除了上面介绍的用于传统基因克隆中国的相关工具外，研究者开发了新型的基于插入片段和线性化载体的末端进行同源重组的基因克隆技术，即无缝克隆技术（Seamless Cloning），主要包括Gibson Assembly[4]和Getway Clone两种。这里我们重点介绍其中的Gibson Assembly。 Gibson Assembly技术包含了DNA 5' 外切酶(5' Exonuclease)、DNA聚合酶(DNA Polymerase)和DNA连接酶(DNA Ligase)活性的重组酶(assembly enzyme)，通过同源重组的方法可以将一个或多个DNA片段按照预定方向、快速、高效和精确地插入到线性化载体中，并且最终构建的克隆没有任何额外的碱基序列，因此被称作“无缝克隆”。如图9中Gibson Assembly所示，红色和绿色2个片段为需要连接的双链DNA片段，它们末端有相同的15-25个重叠序列（黑色），首先在50℃条件下，T5 exonuclease核酸外切酶降解5’端的一些碱基，形成3’端突出的单链，3’端单链互补退火；然后Phusion高保真聚合酶补上两条单链之间的缺口；最后Taq DNA ligase将相邻的单链切口连接补齐形成完整的DNA双链（图6）。 在Gibson Assembly基础上，研究者开发了TEDA[5]，仅添加T5 exonuclease核酸外切酶同样可以实现重组克隆，它与借助细胞体内的DNA修复机制进行缺损DNA的修复（图6）。 （ 5 ）工具载体 接下来我们介绍基因克隆中常用的工具载体。按照功能分，载体分为克隆载体和表达载体（表2）。其中克隆载体含有能在原核细胞中复制的元件，用来克隆和扩增基因；表达载体除了具备克隆载体的基本元件外，还具有转录/翻译所必须的DNA顺式元件。以下，我们将以SnapGene或addgene分析的载体结构图进行相关功能元件的说明。 以pUC19为例，说明克隆载体中的功能元件（图10）。 复制起始位点（ Origin of replication ， ORI ）： ORI是一段DNA序列，质粒复制的起始位置。DNA解螺旋酶可以作用于这段序列，然后DNA的双链被分开，复制随即开始。质粒必须是能够复制的，否则随着细菌的生长，质粒的数量将会被迅速稀释。 筛选标记，主要指抗生素抗性基因。 在含有抗生素的培养基中培养细菌，能够生长的就是含有目的质粒，因为，不含质粒的细菌已经被“杀死”了，原核中常用的抗性筛选基因有Amp和Kan。 Lac Z ：β-半乳糖苷酶基因，也是一种筛选标记，用于蓝白斑筛选。 多克隆位点（ multiple cloning site, MCS ）， 这是一段短DNA片段，包括多个限制性酶切的单一位点，便于外源基因的插入。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 以为例，说明表达载体中的功能元件（图11）。 表达载体除了有克隆载体相关元件，如复制起始位点Ori，原核筛选标记Amp外，还有一些其他的功能元件，如表3所示。 表达载体主要用于表达蛋白或者RNA，例如现在基因编辑中常用的一个表达载体PX458（图12），可以同时表达Cas9蛋白和sgRNA。因此上面也会携带一些其他的功能元件（表4）。 上面介绍的和PX458均是瞬时表达载体并不能在人类等细胞中进行复制，随着细胞的分裂，单个细胞中的质粒不断的被稀释，因此这些载体只能起到瞬时表达的效果。而慢病毒表达载体则可以介导表达元件整合到人类细胞的基因组中，这些表达元件可以随着基因组DNA的复制而复制，因此可以实现稳定表达。 我们常用的慢病毒载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，将其进行收集和浓缩后可直接感染宿主细胞或者动物模型，将外源基因有效地整合到宿主的染色体上，从而达到外源基因的持久性表达。我们以pGreenPuro为例说明慢病毒表达载体中一些关键的功能元件（图13，表5）。（6）感受态细胞 感受态细胞是采用理化方法诱导过的细胞，它可以吸收周围环境中的DNA分子。实验室中我们常使用 E. coli 进行感受态细胞的制备，主要包括克隆用的感受态细胞和表达用的感受态细胞（图14）。 如果仅仅是进行质粒扩增，我们一般使用克隆感受态细胞。如果要进行原核蛋白质表达，我们则选择表达感受态细胞。并且感受态细胞的基因型也有很多类，是通过不同基因的缺失形成的，因而使细胞具有不同的特性，以满足不同的需要。例如，进行克隆载体和瞬转表达载体的扩增，常选用 E. coli DH5α，TOP10菌株；而慢病毒载体则一般选择低重组率的 E. coli Stbl3菌株。而对于非甲基化载体的扩增，则需要选择 E. c oli dam-/dcm- 等甲基化酶缺失的菌株。2. 基因克隆流程 前面了解了基因克隆使用的相关工具酶和载体，接下来，我们介绍基因克隆的实验流程。细分的话，包括以下10个步骤（表6）。 下面我们以lncRNA PVT1的克隆和表达，分别采用T/A克隆，传统酶切-酶连克隆和无缝克隆进行示例。(1) T/A克隆 T/A克隆是把PCR片段与一个具有3’-T突出的载体DNA连接起来的方法（图15）。使用该方法进行基因克隆时不需要考虑酶切位点问题，但需要选择Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，其产物的3’端才会多一个突出的A；此外，T/A克隆选用商业化的T载体，其为线性化的载体，在3’端有一个突出的T；并且基因片段连入T载体是没有方向性的，正反都有可能。 我们首先从NCBI上获取PVT1（human）的基因序列信息（ https :// ），然后使用SnapGene等进行PCR引物设计（图16）。以PVT1全长序列（1081nt）为模板，设计的引物正向引物的5’端与PVT1序列的5’端相同，反向引物的5’端与PVT1序列的3’端互补。然后使用Taq DNA 聚合酶，以细胞的cDNA为模板进行PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳或割胶回收目的大小片段（图17）。 胶回收的基因片段与商业化的T载体（pMD-18T）连接，形成重组DNA载体pMD18-PVT1（图18），经转化（图19）和菌落PCR（图20）后筛选到候选阳性克隆，再使用Sanger测序（图21）进行插入序列的鉴定，获得阳性克隆。（2） 传统酶切 - 酶连克隆 传统酶切-酶连克隆主要是采用相同的限制性内切酶（或者同尾酶）分别酶切载体和基因片段，然后使用DNA连接酶进行连接，转化。以下，我们同样以PVT1为例，将其使用传统方法克隆至表达载体上。 我们在获得PVT1的基因全长序列后，需要首先进行酶切位点分析，例如使用SnapGene进行常用6碱基识别位点的限制性内切酶位点分析（图22）。同时，我们分析中MCS中可用的酶切位点，我们排除PVT1有的限制性内切酶并排除同尾酶（避免载体的自连），即可得到可用的限制性内切酶。在这里我们选择 Nhe I和 Eco R I（图23）。 接下来，我们以PVT1的全长序列为模板设计克隆引物（SnapGene设计的引物序列与T/A克隆中一样），不过我们还要在引物的5’端添加选择好的限制性内切酶的酶切位点以及相应的保护碱基（图24）。同样使用Taq DNA 聚合酶或者其他高保真DNA聚合酶，以细胞的cDNA为模板进行PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳或割胶回收目的大小片段。 回收的PVT1 PCR产物和载体均使用 Nhe I和 Eco R I进行双酶切，其中PVT1由于酶切后的序列为一个约1000bp的片段和一个约5bp的片段，无需进行割胶回收，直接使用PCR产物纯化柱进行酶切产物纯化即可（图25）。而的酶切由于可能存在未完全切开的质粒（在后续转化中会形成大量的假阳性克隆），需要进行琼脂糖凝胶电泳，割取线性化的载体片段进行胶回收（图25）。然后将PVT1和酶切片段使用DNA连接酶进行连接，转化。同样，使用菌落PCR和Sanger测序进行阳性克隆子的筛选（图26）。（3） 无缝克隆 无缝克隆的一个重要优势是不需要考虑待克隆片段中的酶切位点情况，因此直接选择相应的酶切位点将载体线性化后，根据载体的线性化末端进行同源引物的设计，PCR扩增目的基因并纯化后直接进行重组连接和转化（图27）。以下，我们同样以PVT1克隆至载体为例进行说明。 获得PVT1和的全长序列后可以使用SnapGene，CE Design（Vazyme）和In-Fusion Clone（Takara）等在线或本地软件进行同源臂引物的设计。 使用同源臂引物，以细胞cDNA为模板，使用高保真DNA聚合酶为模板进行PCR，胶回收相应片段。载体使用 Nhe I和 EcoR I进行双酶切后，割胶回收载体片段。然后添加无缝克隆试剂进行重组连接，转化后进行阳性克隆的筛选与鉴定。 而实际上，无缝克隆还有另外一个重要的优势：可以同时进行多片段的重组克隆，而这对于传统酶切-酶连克隆是一个很大的挑战。基于传统克隆技术可能需要克隆一个片段后，再在特定位置选择酶切位点，插入第二个片段，依次推进，这样不仅实验周期长，并且会在每个片段之间引入了额外的酶切位点碱基序列，可能影响到基因的完整性。不过可以通过融合PCR的方式，设计末端重叠的引物进行各个克隆片段的融合，但长的基因片段的PCR扩增本身也存在着失败率提高的问题（表8）。 总结 本部分我们主要介绍了基因克隆中使用的工具酶和载体，并以PVT1的克隆和表达载体的构建为例，分别介绍了T/A克隆、传统酶切-酶连克隆和无缝克隆技术的实验流程。 参考文献 1. Vasu,K. and V. Nagaraja, Diverse functions of restriction-modification systems in addition to cellular Biol Rev, 2013. 77 (1): p. 53-72. 2. Loenen, ., et al., Highlights of the DNA cutters: a short history of the restriction Acids Res, 2014. 42 (1): p. 3-19. 3. Pingoud, A., . Wilson, and , Type II restriction endonucleases--a historical perspective and Acids Res, 2014. 42 (12): p. 7489-527. 4. Gibson, ., et al., Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred Methods, 2009. 6 (5): p. 343-5. 5. Xia, Y., et al., T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed Acids Res, 2019. 47 (3): .
基因克隆超简单，如果不是什么特别难扩的基因，一两个周就完成了
现在的技术水平的话，基因克隆是比较容易做的。一般的基因克隆如果从生物体直接取基因的话，包括下面几个步骤提取植物或者动物的基因组DNA（有试剂盒）————做PCR把你需要的基因扩增出来（顺利的话2天搞定）——把扩增出来的基因做酶切——然后把基因连接到你想插入的载体里面（顺利的话1-2天）——鉴定克隆好的基因很多的步骤都有商品化的试剂或者试剂盒， 只要你思路清晰，做起来很快的。 1-2周就能完成。
根据自身的情况不同，所花费的时间也不一样，一般情况下本科毕业论文一般需要2-3周才能完成。
完成一篇毕业论文,一般要经过以下几个步骤：
一、选题 二、收集、研究相关文献 三、确立论点,拟定写作提纲 四、撰写初稿 五、修改定稿（图片中补充了几个小点）
选题是论文写作的灵魂。只有对具有研究意义的论文进行选题，才能促进学术研究和实践任务的完成。没有利用论文选题的价值，即使我们对论文有了深入的把握并撰写论文，也没有实际意义，作为选题是撰写毕业论文的第一步，这也直接决定了我们论文的内容方向。
要想写出一篇令导师喜欢的毕业论文，注意研究角度要有新意。进行科学研究，就是找问题，没有新问题就谈不上研究，更谈不到创新，论文也就没有写作的价值，因此，确定研究方向只有从新的角度去研究、研究以前没有人研究过的问题，或者是研究过探讨过但说法不一的问题去分析论证，才会得出与众不同的结论，才会见出新意。
在写论文的时候，一定要注意重复率。学校都会对文章的重复率有要求，本科的重复率在20%-30%之间，严格的可能要求10%，大家可以在完成以后找安全性高的网站查重一下，在确定重复率之后，对于超出重复率要求的文章进行再次修改。
希望我的回答对你有所帮助。
看个人的速度吧，各专业的速度也不一样，10-15天差不多。你说的大学生如果是指大专、本科毕业论文写作的话，大专和本科在字数要求上相差无几，8000-10000字左右，长的也不会超过15000字，通常情况下半个月左右差不多就可以写完了。1．准备工作。先选择论文方向，搜集资料，琢磨出几个题目跟导师沟通，在导师的辅导下定一个题目。2．准备资料。先在知网、万方、维普、龙源等网站上下载跟论文相关的资料，进行阅读后留下有用的，做到心里有数。3．拟提纲。到这个环节就基本上论文的大致框架已经成型了。4．正文写作。根据题目、提纲和搜集到的参考资料正式写论文，一天写个2000-3000字应该问题不大。一篇大学生论文正式动笔的时间大概也就是2、3天，加上前期的准备工作和初稿完成后的修改、润色、调整，半个月左右的时间是足够了的。当然也不尽然，特别是工科的论文可能要画图之类的时间稍长点。还有写作速度偏慢追求完美的，那就多留出一些时间以免时间来不及。
本科论文的写作时间因人而异，主要受以下因素的影响：1. 选题和研究范围：选题越复杂、研究范围越广，需要耗费的时间就越多。2. 研究方法和数据收集：不同的研究方法和数据收集方式需要不同的时间和精力。例如，一些定量研究可能需要更多的时间来设计问卷、收集样本和分析数据等。3. 文献查阅和综述：对相关文献进行充分的查阅和综述是论文写作的重要步骤之一，这需要花费较长的时间和精力。4. 写作能力和经验：写作能力和经验的不同会导致写作速度和质量的差异。综合考虑以上因素，一般来说，本科论文的写作时间在一个月到半年之间比较常见。当然，在写作期间，需要合理安排时间、制定计划、分配任务、保持积极心态等，以保证论文的质量和完成时间。同时，还需要注重论文的规范性和学术水平，遵循学术道德和规范，确保论文的可信度和价值。
导师对论文的学术评语及申请答辩意见如下：
一、学术评语
xxx同学的学位论文，将计算机辅助设计技术覆盖产品设计的全过程是当前CAD研究的主要内容。传统意义下的CAD技术着重于辅助产品的详细设计和绘图输出，因而有较大的局限性。本文以图形单元作为产品设计资讯的载体，通过运动分析、功能映射、变型设计、关联设计等手段，将计算机辅助设计技术全面地融入产品概念设计过程，取得了一系列有创造性的研究成果：
1.将零件结构划分为零件、功能结构和基因单元三个层次，以功能结构为单位组织基因单元，有利于实现基于功能的零件概念设计。
2.提出了产品骨架单元的提取方法，通过插入、删除、替代、分解、整合、克隆、派生等多种骨架单元置换手段，在保持功能不变的条件下，对产品进行变型设计。与传统的基于尺寸的产品参数化设计不同，上述变形设计能导致产品结构的变化，因而为创新型设计提供了有效的CAD手段。骨架单元表示完整地体现了该结构与产品中其他结构的约束关系。在保证产品中各结构单元有序性、一致性的前提下，减少了所附加大数据量，有利于在概念设计中，对设计方案反复进行斟酌与修改。
3.在关联设计中，归纳总结了五种关联的约束模型，为详细设计阶段自动生成导出单元提供了设计依据。
4.以图形单元置换、叠代技术为核心，构造了单元化产品信息建模原型系统。在此基础上开发了MCADDS系统，并在冲剪机床设计XJD型转辙机传统系统设计中获得了成功的应用。
5.论文内容丰富、条理清晰、结构完整，特别是在运用CAD技术辅助产品的变型设计以及在设计过程中对设计方案的反复修改方面有重要突破。本文是一篇优秀的博士学位论文，建议提交答辩。
从某种角度来说，研究生学位论文评语既是对研究生学位论文研究工作的评价，也反映了评阅人综合水平。既反映了评阅人的学术水平，也反映了评阅人的写作文风。它属于应用写作中一种专业应用文写作，值得我们研究。
一、申请答辩意见
1、该生认真系统的学习了时间序列的理论和方法，查阅大量文献，在论文写作过程中虚心听取指导教师的`意见。论文内容充实，层次结构合理科学，格式规范，语言表达清楚、流畅。达到本科生毕业论文水平。同意参加答辩。
2、小静同学的论文《调频电路及其设计》选题具有实际意义，完成了规定的任务，论文采利用导频制调频立体声发射接收技术及高性能的专用发射与接收集成电路，设计了一套基于BA和C-A的小型无线调频立体声系统，表明作者很好的掌握了调频通信方面的知识。毕业论文撰写符合规范要求，论文达到了本科毕业论文的要求。同意该生参加学位论文答辩。
1-2周基因克隆从生物体直接取基因,提取植物或者动物的基因组DNA(有试剂盒)————做PCR把你需要的基因扩增出来(顺利的话2天搞定)——把扩增出来的基因做酶切——然后把基因连接到你想插入的载体里面(顺利的话1-2天)——鉴定克隆好的基因（顺利的话4-7天）。克隆技术是快速成苗技术与多代循环技术相结合的综合性技术，在计算机控制的智能环境下，再加上营养液以及激素的人工补充，使植物的离体材料快速成苗，但如果不结合多代循环技术，就不能实现高速扩繁。一个离体材料只能成为一株小苗，如果采用多代循环技术（也叫以苗繁苗），就能实现种苗生产量的几何级倍增。
在设备齐全的情况下，从最初分析开始呢，需要的时间大体是： 1 分析序列，设计简并引物，送公司合成引物需要等4-5天。等的过程中提取RNA和反转录时间足够了。 2 引物合成送到后，使用制备好的脑 cDNA模板利用简并引物进行PCR，然后电泳检测，这个阶段紧凑的话1-2天。 3 如果成功克隆出了目的条带，那么就要回收，做TA克隆，然后测序。简并引物克隆出的条带貌似不太适合直接回收测序的。这个过程，片段回收、与T载体连接过夜、连接后转化至感受态细菌、涂板过夜培养、单克隆小量培养、鉴定单克隆、阳性克隆送样测序、测序结果回来。这个过程需要8-10天。 4 如果测序成功了，那么继续做RACE。重复1、 2、 3步 。一切顺利的话，30-40天的功夫吧。。。
一、克隆技术的科学意义及经济价值 克隆技术的突破,首先标志着人类对生命的认识水平与改造能力的提高,这本身是人类文明的长足进步。作为生物工程的一项重要成果,克隆技术为解决某些日益尖锐的问题和矛盾提供了多种可能的途径和方法。 (一)克隆技术给医学领域带来美好应用前景。在人类基因组的带动下,人们正在进行治疗性克隆试验,旨在生产克隆的或单性生殖的人类胚胎以获取干细胞,为人类研究癌症、艾滋病、老年痴呆、帕金森氏症等疑难病症,从基因层面揭示疾病产生的分子生物学机制,预报人体的机能和病理变化,找到标本兼治的治疗方法。克隆生物工程技术将克服中西药的弊端,将使医学在21世纪发生革命性的变化。治疗性克隆和干细胞研究为人体缺失器官的修复和重建带来希望,不但能治疗或预防器官功能衰竭,而且能防治衰老,解决目前我们面临的寿命延长而生命质量低下的难题。寿终无年、青春常驻的梦想在21世纪有可能会逐步成为现实。 (二)克隆技术有助于加速动植物育种过程。作为人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破,克隆技术反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步,为挽救濒临灭绝物种提供了多种可能和广阔的发展前景。利用优良动物品种的体细胞提供细胞核来克隆动物,可以避免自然条件下育种所受到的动物生育周期和生育效率的限制,缩短育种年限,提高育种效率,按照自己的意愿创造出有更高经济价值的动物新品种来;可以再现物种,保护和拯救濒危动物。同时,运用克隆技术可以超越自然节奏,主动调控生物链及生态环境,减少环境污染,保护地球这一万物共有的家园。 (三)克隆技术将引起制药业和农业生产的革命。利用体细胞克隆技术使外源基因整合到受体细胞中并稳定地遗传到子代,可以用来大量繁殖许多有价值的基因,直接生产出人类适用的医药用蛋白等高效药物。如治疗糖尿病的胰岛素、有希望使侏儒患者重新长高的生长激素和能抗多种疾病感染的干扰素等。克隆山绵羊将会出现人类新的制药厂,生产人类健康需求的应有尽有的药用动物或动物药。据计算,一头转基因山羊一年提供的人凝血因子LX活性蛋白相当于上海全年献血总量所含同类蛋白的总和。人们一旦突破克隆生物技术,就能改变农作物的基因型,产生大量抗病、抗虫、抗盐碱和 遗传性质稳定的新品种,培育动物的优良品种,培育生产奶量高,奶中富含人体所需营养物质的乳牛,以满足人体对营养的需求。 二、克隆技术的负面作用与问题思考 科学技术是一把双刃剑,它对于社会的作用是双重的,克隆技术也不例外。克隆技术的发展伴随着对伦理道德的影响的冲击,其负面作用不容忽视。 自“多莉”羊诞生以来,关于克隆技术的争论日渐激烈。克隆技术的迅速发展,不仅为自然科学领域瞩目,也受到了社会科学领域的科学家的关注。因为,一旦这一技术被应用于人类自身,既克隆人的产生,那将是对人类社会伦理道德的一项严峻挑战。克隆人可能对社会道德、社会伦理产生不可预料的负面影响:第一,它危害了伦理学的不伤害原则。从“多莉”羊的实例可以看出克隆动物的成功率很低,如果在人身上做成功率可能更低,而且很可能会产生出许多畸形的、具有严重缺陷的克隆人,自然会造成对他们的伤害;第二,克隆人违背了伦理学的自主原则。被克隆者作为人所享有的独特性被粗暴的剥夺了;第三,克隆人违背了伦理学的平等原则。克隆人也是人,我们不能将他们仅仅当作为他人的目的服务的手段和工具。 对克隆技术持否定态度的人看到了克隆人可能引发的一系列社会、伦理、法律等问题。从政治角度看,克隆人的出现可能使人类自身的安全受到威胁;从经济角度看,克隆人可能使人的生产劳动发生畸形分化,如让克隆人当奴仆以及作为人的工具;从人类学和社会学角度看,克隆人与供体者的关系将是社会不稳定的潜在因素;从法学角度看,克隆人将给法治社会制造不易化解的困境;从心理学角度看,克隆人有难以逾越的心理障碍;从进化论角度看,克隆人不利于人类的进化;从哲学角度看,克隆人消除人的个性,破坏人类的多样性。在克隆人可能引发的社会性问题中,最大量、最复杂的恐怕还是道德伦理问题。从社会伦理角度看,克隆人对人类发展的干预会影响人种的自然构成和自然发展。克隆人的出现将使两性结合繁殖后代的传统生殖模式被打破、人伦关系模糊以及人口性别比例失调,甚至可能被别有用心的人利用制造人类灾难;从家庭伦理角度看,克隆技术用于人体繁殖,会加剧家庭多元化趋向,还会从根本上改变人的亲系关系,确定人类亲系关系的标准也将发生改变;从性伦理学角度看,它完全改变了人类自然的、基于性爱的生育方式,使人口的生产与性爱分离,破坏人类的情感;从生命伦理学角度看,它破坏了人拥有独特基因的权利,有可能导致人种的退化,还会使正常的生与死的概念发生动摇。
基因工程是在分子生物学和分子遗传学综合发展基础上于 20 世纪 70 年代诞生的一门崭新的生物技术科学。下面是由我整理的基因工程学术论文，谢谢你的阅读。 基因工程学术论文篇一 摘 要：基因工程是在分子生物学和分子遗传学综合发展基础上于 20 世纪 70 年代诞生的一门崭新的生物技术科学。基因工程是一项很精密的尖端生物技术。可以把某一生物的基因转殖送入另一种细胞中，甚至可把细菌、动植物的基因互换。当某一基因进入另一种细胞，就会改变这个细胞的某种功能。这项工程创造出原本自然界不存在的重组基因。它不仅为医药界带来新希望，在农业上提高产量改良作物，并且对环境污染、能源危机提供解决之道，甚至可用在犯罪案件的侦查。基因工程的发展现状和前景是怎么样呢，而又有哪些利弊? 关键词：基因工程;发展现状;发展前景;基因工程利弊 一、基因工程 (一)基因工程的概念及发展 1.概念 基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。 2.发展 生物学家于20 世纪50 年代发现了DNA 的双螺旋结构，从微观层面更进一步认识了人类及其他生物遗传的物质载体，这是人类在生物研究方面的一次重大突破。60 年代以后，科学家开始破译生物遗传基因的遗传密码，简单地说，就是将控制生物遗传特征的每一种基因的核苷酸排列顺序弄清楚。在搞清楚某些单个基因的核苷酸排列顺序基础上，进而进行有计划、大规模地对人类、水稻等重要生物体的全部基因图谱进行测序和诠释。 (二)基因工程的发展现状及前景 1.发展现状 (1)基因工程应用于农业方面。运用基因工程方法，把负责特定的基因转入农作物中去，构建转基因植物，有抗病虫害，抗逆，保鲜，高产，高质的优点。 下面列举几个代表性方法。 ①增加农作物产品营养价值如：增加种子、块茎蛋白质含量，改变植物蛋白必需氨基酸比例等。 ②提高农作物抗逆性能如：抗病虫害、抗旱、抗涝、抗除草剂等性能。 ③生物固氮的基因工程。若能把禾谷等非豆科植物转变为能同根瘤菌共生，或具固氮能力，将代替无数个氮肥厂。④增加植物次生代谢产物产率。植物次生代谢产物构成全世界药物原料的 25% ，如治疗疟疾的奎宁、治疗白血病的长春新碱、治疗高血压的东莨菪碱、作为麻醉剂的吗啡等。 ⑤运用转基因动物技术，可培育畜牧业新品种。 二、基因工程应用于医药方面 目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快产业之一，前景广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等。对预防人类肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。 并且应用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中试，并进入临床验证阶段;专门用于治疗肿瘤的“肿瘤基因导弹”也将在不久完成研制，它可有目的地寻找并杀死肿瘤，将使癌症的治愈成为可能。 三、基因工程应用于环保方面 工业发展以及其它人为因素造成的环境污染已远远超出了自然界微生物的净化能力，基因工程技术可提高微生物净化环境的能力。美国利用DNA 重组技术把降解芳烃、萜烃、多环芳烃、脂肪烃的4 种菌体基因链接，转移到某一菌体中构建出可同时降解4 种有机物的“超级细菌”，用之清除石油污染，在数小时内可将水上浮油中的2/3 烃类降解完，而天然菌株需 1 年之久。90 年代后期问世的DNA 改组技术可以创新基因，并赋予表达产物以新的功能，创造出全新的微生物，如可将降解某一污染物的不同细菌的基因通过PCR 技术全部克隆出来，再利用基因重组技术在体外加工重组，最后导入合适的载体，就有可能产生一种或几种具有非凡降解能力的超级菌株，从而大大地提高降解效率。 (一)发展前景 基因工程应用重组DNA 技术培育具有改良性状的粮食作物的工作已初见成效。重组DNA 技术的一个显著特点是，它注往可以使一个生物获得与之固有性状完全无关的新功能，从而引起生物技术学发生革命性的变革，使人们可以在大量扩增的细胞中生产哺乳动物的蛋白质，其意义无疑是相当重大的。将控制这些药物合成的目的基因克隆出来，转移到大肠杆菌或其它生物体内进行有效的表达，于是就可以方便地提取到大量的有用药物。目前在这个领域中已经取得了许多成功的事例，其中最突出的要数重组胰岛素的生产。 重组DNA 技术还有力地促进了医学科学研究的发展。它的影响所及有疾病的临床诊断、遗传病的基因治疗、新型疫苗的研制以及癌症和艾滋病的研究等诸多科学，并且均已取得了相当的成就。 (二)基因工程的利与弊 1.基因工程的利 遗传疾病乃是由于父或母带有错误的基因。基因筛检法可以快速诊断基因密码的错误;基因治疗法则是用基因工程技术来治疗这类疾病。产前基因筛检可以诊断胎儿是否带有遗传疾病，这种筛检法甚至可以诊断试管内受精的胚胎，早至只有两天大，尚在八个细胞阶段的试管胚胎。做法是将其中之一个细胞取出，抽取DNA，侦测其基因是否正常，再决定是否把此胚胎植入母亲的子宫发育。胎儿性别同时也可测知。 基因筛检并不改变人的遗传组成，但基因治疗则会。目前全世界正重视发展永续性农业，希望农业除了具有经济效益，还要生生不息，不破坏生态环境。基因工程正可帮忙解决这类问题。基因工程可以改良农粮作物的营养成分或增强抗病抗虫特性。可以增加畜禽类的生长速率、牛羊的泌乳量、改良肉质及脂肪含量等。 2.基因工程的弊 广泛的基因筛检将会引起一连串的社会问题。虽然基因筛检可帮助医生更早期更有效地治疗病人，但可能妨碍他的未来生活就业。基因工程会产生“杀虫剂”的作物，也可能对大环境有害，它们或许会杀死不可预期的益虫，影响昆虫生态的平衡。转基因食品不同于相同生物来源之传统食品，遗传性状的改变，将可能影响细胞内之蛋白质组成，进而造成成份浓度变化或新的代谢物生成，其结果可能导致有毒物质产生或引起人的过敏症状，甚至有人怀疑基因会在人体内发生转移，造成难以想象的后果。转基因食品潜在危害包括：食物内所产生的新毒素和过敏原;不自然食物所引起其它损害健康的影响;应用在农作物上的化学药品增加水和食物的污染;抗除草剂的杂草会产生;疾病的散播跨越物种障碍;农作物的生物多样化的损失;生态平衡的干扰。 四、结束语 随着社会科技的进步，基因工程的发展将成为必然。尽管它会给我们带来一些危害但是仍然为我们带来了很多好处。不仅为我们提供了新的能源而且促进了各国的经济的发展，所以在我们发展基因工程的同时应该尽力避免一些危害，而让有利的方面尽可能应用。 参考文献： [1]陈宏.2004.基因工程原理与应用.北京：中国农业 出版社 [2]胡银岗.2006.植物基因工程.杨凌.西北农林科技大学出版社 [3]刘祥林.聂刘旺.2005.基因工程.北京：科学出版社 [4]陆德如.陈永青.2002.基因工程.北京：化学工业出版社 [5]王关林.方宏筠.2002.植物基因工程.北京：科学出版社 基因工程学术论文篇二 基因工程蛋白药物发展概况 【摘要】近些年，随着生物技术的发展，基因工程制药产业突飞猛进，本文就一些相关的重要蛋白药物的市场概况和研究进展作一概述。 【关键词】基因工程 蛋白药物 发展概况 中图分类号：R97 文献标识码：B 文章编号：1005-0515(2011)6-255-03 基因工程制药是随着生物技术革命而发展起来的。1980 年，美国通过Bayh-Dole 法案，授予科学家 Herbert Boyer 和 Stanley Cohen 基因克隆专利，这是现代生物制药产业发展的里程碑。1982 年，第一个生物医药产品在美国上市销售，标志着生物制药业从此走入市场[1]。 生物制药业有不同于传统制药业的特点：首先，生物制药具有“靶向治疗”作用;其次，生物制药有利于突破传统医药的专利保护到期等困境;再次，生物制药具有高技术、高投入、高风险、高收益特性;此外，生物制药具有较长的产业链[1]。生物制药业这一系列的特点决定了其在21世纪国民经济中的重要地位，历版中国药典收录的生物药物品种也是逐渐增多[2](图一)。 当前生物制药业的发展趋势在于不断地改进、完善和创新生物技术，在基因工程药物研发投入逐年增加的基础上，我国生物制药的产值及利润增长迅猛， 2006-2008年三年就实现了利润翻番[2](表一)。随着研究的深入，当前生物药的热点逐渐聚焦到通过新技术大量生产一些对医疗有重要意义且成分确定的蛋白上。研究表明，在我国的基因工程药物中，蛋白质类药物超过50%[3]。而这些源自基因工程菌表达的蛋白，如疫苗、激素、诊断工具、细胞因子等在生物医学领域的应用主要包括4个方面：即疾病或感染的预防;临床疾病的治疗;抗体存在的诊断和新疗法的发现。利用基因工程技术(重组DNA技术)生产蛋白主要有三方面的理由：1.需求性，天然蛋白的供应受限制，随需求的不断增加，数量上难以满足，使它得不到广泛应用;2.安全性，一些天然蛋白质的原料可能受到致病性病毒的污染，且难以消除或钝化;3.特异性，来自天然原料的蛋白往往残留污染，会引起诊断试验所不应有的背景[4]。 以下将介绍一些基因工程产物的市场概况和研究发展。 1 促红细胞生成素 是细胞因子的一种，在骨髓造血微环境下促进红细胞的生成。1985年科学家应用基因重组技术，在实验室获得重组人EPO(rhEPO)，1989年安进(Amgen)公司的第一个基因重组药物Epogen获得FDA的批准，适应症为慢性肾功能衰竭导致的贫血、恶性肿瘤或化疗导致的贫血、失血后贫血等[5,6]。 2001年，EPO的全球销售额达亿美元，2002年达亿美元，2003年全世界EPO的年销售额超过50亿美元。创下生物工程药品单个品种之最，是当今最成功的基因工程药物。用过EPO的大多数病人感觉良好，在治疗期间无明显毒副作用或功能失调。重组体CHO细胞可以放大到生产规模以满足对EPO的需求。 2 胰岛素 自1921 年胰岛素被Banting 等人成功提取并应用于临床以来，已经挽救了无数糖尿病患者的生命。仅2000年，胰岛素在全球范围内就大约延长了5100万名I型糖尿病病人的寿命。20世纪80年代初，人胰岛素又成为了商业现实;80 年代末利用基因重组技术成功生物合成人胰岛素，大肠杆菌和酵母都被用作胰岛素表达的寄主细胞[7]。 国内外可工业化生产人胰岛素的企业只有美国的礼来公司、丹麦的诺和诺德公司、法国的安万特公司和中国北京甘李生物技术有限公司等，胰岛素类似物也仅在上述4个国家生产，且每个公司只能生产艮效或速效类似物巾的个品种，主要原因是要达到生物合成人胰岛素产业化的技术难度特别大，若无高精尖的高密度发酵技术、纯化技术和工业化生产经验是无法实现的[8]。 3 疫苗 在人类历史上，曾经出现过多种造成巨大生命和财产所示的疫症，而在预防和消除这些疫症的过程中疫苗发挥了十分关键的作用。所以疫苗被评为人类历史上最重大的发现之一。 疫苗可分为传统疫苗(t raditional vaccine) 和新型疫苗(new generation vaccine)或高技术疫苗( high2tech vaccine)两类,传统疫苗主要包括减毒活疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗,新型疫苗主要是基因工程疫苗。疫苗的作用也从单纯的预防传染病发展到预防或治疗疾病(包括传染病) 以及防、治兼具[2]。 随着科技的发展，对付艾滋病、癌症、肝炎等多种严重威胁人类生命安全的疫苗开发取得巨大进展，这其中也孕育着巨大的商业机会[9]， 2007年全球疫苗销售额就已达到163亿美元，据美林证券公布的一份研究报告显示，全球疫苗市场正以超过13%的符合增长率增长。而我国是疫苗的新兴市场，国内疫苗市场发展潜力巨大，年增长率超过15%。 在以细胞培养为基础的疫苗、抗体药物生产中，Vero细胞、BHK21细胞、CHO细胞和Marc145细胞是最常用的细胞，这些细胞的反应器大规模培养技术支撑着行业的技术水平[4]。建立细胞培养和蛋白表达技术平台，进一步完善生物反应器背景下的疫苗生产支撑技术是当前国际疫苗产业研究的重点。 4 抗体 从功能上划分，抗体可分为治疗性抗体和诊断性抗体;从结构特点上划分，抗体可分为单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可有效地治疗各种疾病，比如自身免疫性疾病、心血管病、传染病、癌症和炎症等[10,11]。抗体药物的一大特点在于其较低甚至几乎可以忽略的毒性。另外一个优势是，抗体本身也许既可被当作一种治疗武器，也可被用作传递药物的一种工具。除了全人源化抗体以外，与小分子药物、毒素或放射性有效载荷有关的结合性抗体也已经在理论上显示出了强大的潜力，尤其是在癌症治疗方面[12]。 治疗性抗体是世界销售额最高的一类生物技术药物,2008 年治疗性抗体销售额超过了300 亿美元,占了整个生物制药市场40%。在美国批准的99 种生物技术药物中,抗体类药物就占了30 种;在633 种处于临床研究的生物技术药物中, 有192 种为抗体药物,而在抗癌及自身免疫性疾病的治疗研究中,治疗性抗体占了一半[2]。截止2007年，美国FDA批准上市的抗体药物见表二[13]。 参考文献 [1] 章江益, 孙瑜, 王康力. 美国生物制药产业发展及启示[J]. 江苏科技信息. 2011, 1(5): 11-14. [2] 王友同, 吴梧桐, 吴文俊. 我国生物制药产业的过去、现在和将来. 药物生物技术[J]. 2010, 17(1): 1-14. [3] 吴梧桐, 王友同, 吴文俊. 21世纪生物工程药物的发展与展望[J]. 药物生物技术. 2000, 7(2): 65-70. [4] 储炬, 李友荣. 现代工业发酵调控学(第二版)[M]. 化学工业出版社. [5] Koury MJ, Bondurant MC. Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cell[J]. Cell Physiol, 1988, 137(1):65. [6] Cuzzole M, Mercurial F, Brugnara C. Use of recombinant human Erthro-poietin outside the setting of uremia[J]. Blood, 1997, 89(12): 4248-4267. [7] 李萍, 刘国良. 最新胰岛素制剂的研究进展概述[J]. 中国实用内科杂志. 2003, 23(1): 19-20. [8] 张石革, 梁建华. 胰岛素及胰岛素类似物的进展与应用[J]. 药学专论. 2005, 14(11): 21-23. [9] 徐卫良. 生物制品供应链优化与供货提前期缩短问题研究――基于葛兰素史克(中国)疫苗部的实例分析(硕士学位论文). 上海交通大学, 2005. [10] Presta LG. Molecular engineering and design of therapentic antilodies[J]. Curr Opin Immunol, 2008, 20(4): 460. [11] Liu XY, Pop LM, Vitetta ES. Engineering therapeutic monoclonal antibodies[J]. Immunol Rev, 2008, 222: 9. [12] 陈志南. 基于抗体的中国生物制药产业化前景. 中国医药生物技术[J]. 2007, 1(1): 2. [13] 于建荣, 陈大明, 江洪波. 抗体药物研发现状与发展态势[J]. 生物产业技术. 2009, 1(3): 49.看了"基因工程学术论文"的人还看: 1. 高中生物选修三基因工程知识点总结 2. 高二生物基因工程知识点梳理 3. 浅谈基因工程在农业生产中的应用 4. 植物叶绿体基因工程发展探析 5. 关于蔬菜种植的学术论文
1． 克隆技术与遗传育种 在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2． 克隆技术与濒危生物保护 克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3． 克隆技术与医学 在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？ 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。 （如果我的回答能够解决你的问题，请采纳，谢谢……！！！）
不知道大家对基因克隆方面的技术了解多少，经过较长时间的总结和实践，有了一些自己的体会，拿出来与大家分享一下，给大家做一个抛砖引玉的作用吧。（1）是酶切位点的选择. 我的实验室有三种常用的酶,在设计PCR产物的酶切位点之前首先要看看哪两个酶之间是可以进行同时酶切的.因为这三家公司的双酶切表的组合完全不同,最佳的方案是我们能够按照需要去选择合适的酶.（2）PCR引物的设计。 做过实验的战友都清楚,有的时候很多PCR引物的选择是没有选择的,如果实在是没办法的条件下,只能在PCR引物的5端加入人为设计的碱基而把引物的扩增部分后移或前移来避开难以扩增的部位,我不知道说清楚没有,如果引物序列OK,可以忽略上句话.所以大多数情况下引物我们是没得选择的,那么我们只能从PCR扩增条件上下功夫.（3）PCR扩增 对于PCR扩增其实不同的基因可能策略不同.首先很多新手会忽略引物的浓度问题,把PCR的实验条件进行了全方位优化,50ul体系中buffer 5ul、Mg2+ 1mM、dNTP 、引物每支1ul（配成10umol/L浓度)、PCR酶一般是、其余部分用水补平,混匀,离心一下,进行PCR扩增.其中引物从公司拿到干粉后我一般用水溶解至100umol/L浓度保存,吸取少量稀释十倍后用于PCR反应,这个浓度是最佳的.所以PCR体系中引物并不是越多越好,同样的模板的量也很关键,一般我都在10ng-100ng之间,太少或太多都会抑制PCR反应.当然,不同的基因其退火温度差异较大,建议第一次做直接做梯度PCR,设置的温度范围宽些,总会有扩出来的.反正把反应体系加好把温度控制好,如果这样仍然扩不出来,那就直接调整DNA模版的量吧,其他的因素应该不是原因（当然得保证引物,以及酶的质量得前提下）.（4）PCR产物的酶切,我认为PCR产物切得尽可能的充分对克隆很重要,毕竟保护性碱基只有几个.（5）质粒的酶切.虽然质粒的酶切很简单但是却很讲究,决定着克隆的成败.质粒提取我一般都用试剂盒,质粒提取完毕后我会用紫外分光光度法对质粒进行定量测定,根据A260的值计算出质粒的量,然后再进行酶切,一般酶切体系60ul,60ul体系中我只切总量1ug的质粒,一次切两管,酶切过夜后切胶回收或者不切胶直接回收,这取决于两个限制性内切酶之间的距离,十几bp以内我就直接回收了,如果偏大就要切胶回收.（6）连接连接我采用的是Promega公司的T4 DNA连接酶,它的特点是22度连接三小时以上几款,这样我就可以在上午把质粒片段以及PCR片段回收后马上做连接,连接一个白天到下午可以做转化了,涂板,过夜培养第二天早上看结果.然后挑克隆（一般我一个基因就挑四个克隆足已）培养一白天,下午稍晚些提质粒,然后马上酶切鉴定,一般酶切鉴定体系中我都做20ul体系,酶用微升就够了（呵呵,该省的就省点吧）,酶切一个小时跑胶就可以知道克隆是否成功了.这样从PCR到克隆鉴定完毕,一共三天.这个是个人在基因克隆
你好，我现在也正在做分子克隆，与你共勉~
分子克隆
基因克隆技术给人类生活带来美好的前景，故寄予了无限的期望。下面是我整理了基因克隆技术论文，有兴趣的亲可以来阅读一下!
差异表达基因克隆技术的新进展
提要 分离并克隆差异表达基因是 目前 功能性基因 研究 的热点。mRNA差异展示是筛选差异表达基因最有效的技术之一，它的主要不足是有一定假阳性。RDA、SSH、DSD、LSH技术能够克服假阳性，但也具有一定的不足，应根据需要选择运用。随着能扩增长片段及具有自动校正功能的Taq酶出现及 应用 ，这些技术将会不断完善与 发展 ，具有广阔的应用前景。
关键词 差异表达基因;克隆
现代 分子生物学研究表明，人类基因组约由10万左右的不同基因组成，这些基因选择性的表达决定了机体整个生命过程，基因表达的变化处于控制生物学调节机制的中心位置。因此，分离并克隆差异表达基因不仅有助于阐明生命的粤秘，而且还能为基因诊断与 治疗 提供重要的 理论 依据。近几年来，差异表达基因克隆技术不断完善与发展，已成为研究肿瘤和疾病等相关基因的重要手段。
一、mRNA差异展示
mRNA差异展示(mRNA differential display,DDRT-PCR)是目前筛选差异表达基因最有效的 方法 之一，其基本原理是：3´端采用锚定引物，与mRNA3´poly a结合，进行反转录，形成mRNA：cDNA杂交分子，5´端采用20条随机引物，与锚定引物一起进行PCR扩增，其产物经测序胶显示出来，再回收鉴定克隆差异条带。1992年Liang和Pardee[1]建立此技术时，5´端采用20条随机引物，每条由10个碱基组成，3´端采用12条引物即T12MN(M=A、C或G，N=A、G、C、T)。这种组合从统计学上几乎能完全覆盖所有的mRNA序列，差异表达的基因会全部呈现出来。实践证明，这种方法有效，但假阳性率在50%～70%左右，差异条带在Northern印迹上重现性差，后续处理也比较复杂。1994年Ito[2]等对3´端引物进行了改进，把12条引物改为3条，即T12A、T12C、T12G，使得实验操作简化。1995年Ayala[3]等提出了在3´端锚定引物与5´端随机引物上皆增加10个碱基，使得上下游引物Tm值在60℃左右，PCR循环参数也改为前5个循环采用Liang和Pardee推荐的参数，即94℃30s，40℃2min,72℃30s。经这样改进，显著地增强了差异条带的重复性和敏感性，同时使得差异条逼带的克隆十分方便。1996年4月，Liang和Pardee[4]对5´端此物进行了改进，引物条数改为8条，皆带上HindⅢ酶切位点，每条由13个碱基组成，3´端锚定引物采用3条，也带上HindⅢ酶切位点，每条由18个碱基组成，PCR循环条件仍采用94℃30s,40℃2min,72℃30s,40个循环，最后在72℃延伸7min。1998年[5]我们在Liang和Pardee改进的基础上，对PCR循环参数进行了改进，即前5个循环采用94℃30s,40℃2min,72℃30s,后35个循环采用94℃30s,55℃2min,72℃30s，最后在72℃延伸7min。经这样改进，既保持了扩增效率，又增强了差异条带的特异性及重复性，降低了假阳性率。
总之，mRNA差异展示具有简便、快速、所需起始材料少、同时可在多个材料之间或不同处理材料之间进行比较等优点，但具有较高频率的假阳性和短小的差异片段的缺点，给后续处理带来一系列 问题 ，虽然此技术经过了一些起改进，但这两个缺点仍限制着此方法的充分应用。
二、代表性差示 分析
代表性差示分析(representational difference analysis,RDA)最早由Lisitsyn等提出的。1994年，Hubank和Schatz[6]将其应用于克隆差异表达基因，其基本原理是：靶方(Tester,T)和驱动方(Driver,D)的cDNA在进行差方式分析前均用一种识别4碱基序列的限制酶作切割处理，形成平均长度为256bp的cDNA片段代表群，第一次T与D杂交反应时，两者总量比为1：100，第二次增加到1：400，第三次增加到1：8000，再利用PCR以指数形式扩增双链模板，而仅以线性形式扩增单链模板这一特性，通过降低cDNA群体复杂度和多次更换cDNA两端接头，来特异扩增目的基因片段。特别是T减D杂交反应后仅设置了72℃ 复性与延伸及95℃变性这两个循环参数，共20个循环，从而使PCR产物特异性大大提高。此技术最大的优势是差异条带在Northern印迹上重现性好，假阳性少。缺点是所需起始材料较多，更多信赖于PCR技术，T与D之间若存在较多差异，或T中存在某些基因上调表达，则难达到预期目的，而且工作量比DDRT-PCR大，周期长。
三、抑制性扣除杂交
抑制性扣除杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)，是1996年Diatchenk[7]等提出的一种新的克隆基因技术，其基本原理是：先将T与D方cDNA用限制酶切割为小片段，将T方平均分为两份，分别连接不同的接头，然后与过量的D方cDNA进行不充分杂交。根据复性动力学原理，浓度高的单链分子迅速复发，而浓度低的单链分子仍以单链形式存在。然后混合两份杂交样品，同时加入新的变性D方cDNA进行第二次扣除杂交，杂交完全后补平末端，加入合适引物接头(接头1与接头2引物)进行PCR扩增。当DNA两条链含相同接头时，其PCR扩增受到抑制，而含不同接头的双链DNA分子才可进行指数扩增，其产物即为目的片段。
此技术避免了消减杂交过程中分离单双链DNA的步骤，可成千倍地扩增目的片段，能分离出T方上调表达的基因，与DDRT-PCR相比，具有假阳性少重复性强的优点，它的最大不足就是需要较多的起始材料，更多依赖于PCR技术，不能同时进行数个材料之间或不同处理材料之间的比较。
四、差异消减展示
差异消减展示(differential subtraction display,DSD)是1998年Jose等[8]提出的，它是在DDTR-PCR呈现出差异条带之后，同时回收差异条带与对照方的相应范围的条带，靶方回收的差异条带用非生物素标记的引物与dNTPs进行PCR扩增，而对照方回收的差异条带用含生物素标记的dATP的dNTPs进行PCR扩增，其产物进行消减杂交，用链亲和素去除共有的产物，剩下的产物由带有α-32P dATP的dNTPs进行扩增，再重复差异展示，回收差异条带并克隆。此技术最大的优势是获得差异条带在Northern印迹上重现性好，假阳性少，敏感性强，可获得长片段，起始材料要求少，可获取低丰度差异表达基因，缺点是步骤繁琐，工作量大，周期性长，更多依赖于PCR技术。
另外，赵忠良博士把长片段PCR扩增(LPCR)与消并减杂交技术结合起来，建立了LPS技术，并运用此技术从抗原呈细胞中获取了170多个差异表达基因。此技术的基因原理是：T与D方分离出cDNA后，运用5´端帽子引物与3´端锚定引物，对cDNA进行大量扩增，其产物直接进行消减杂交，然后过柱子，去除相同的基因，剩余的部分再与D方cDNA进行二轮消减杂交，再过柱子，去除非差异部分，剩下的差异部分进行第三轮消减杂交，其产物进行分级分段克隆。这种 方法 最大的好处是：起始材料需要少，可获得差异基因，假阳性少，有可能获得全长差异表达基因。
总之，随着高效扩增的Taq酶与具有自动校正功能的Taq酶的出现，长片段PCR扩增技术的优化，差异表达基因克隆技术将会不断 发展 ，但 目前 主要有以上几种方法，各有其优缺点， 研究 者应根据自己的实际情况，选择合适的技术方法，以其达到自己预期的目的。
参考 文献
1 Liang P et (14):967
2 Ito T et letters,1994;351:231
3 Ayala M et ;18(5):842
4 GenHunter Corporation,RNA imageTM,kit(cat ) for mRNA diflerential& nbsp;display,1996,April,12
5 Cui DX et of the Fourth Military university,1998;18(6):601
6 Hubank M et Acids Res,1994;22:5640
7 Diatchenko L et Natl Sci USA,1996;93:6025
8 Jose RP et Biochemistry,1998;257:161
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这种情况应该是不可以的，如果你要是做了基因克隆，你可以去问医生，看医生怎么说，如果你想要这个宝，你可以去问一下医生，看医生的意见是什么，如果不要，你也可以去问一下医生，看医生是什么意见，你也可以再考虑一下的啊，你要考虑好啊，你也可以问一下医生，看医生的意见是什么，你也可以再考虑一下的啊，不要太着急了啊，你要是太着急了，对你自己也不好啊，你说呢，你说是不是啊，你自己考虑吧，我说的是真的啊，不骗你啊，你要是不相信我，你可以去问医生。