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宏基因组测序，是对特定环境（或者特定生境）样品中的微生物群体基因组进行序列的测定，以分析微生物群体基因组成及功能，解读微生物群体的多样性与丰度，探求微生物与环境，微生物与宿主之间的关系，发掘和研究新的、具有特定功能的基因。宏基因组测序研究避开了微生物分离培养的过程，扩展了微生物资源的利用空间，为研究微生物相互作用提供了有效工具。阅微基因采用第二代高通量测序技术进行宏基因组学研究，无需构建克隆文库，可以直接对环境样品中的基因组片段进行测序，这避免了文库构建过程中利用宿主菌对样品进行克隆而引起的系统偏差，简化了宏基因组研究的基本操作，提高了测序效率，从而极大地促进了宏基因组学的发展。通过大量测序，可以获得样品的群落结构信息，如微生物物种在该环境下的分布情况及成员间协作关系等，通过还可以确定一些特殊的主要基于或者DNA片段。对于多个样品，还可做相应的比较分析，发掘样品间的相同点与不同点。宏基因组测序，可以用于疾病研究，微生物种群分析，环境多样性分析，遗传多样性分析，只要有微生物的地方，就可以用到宏基因组测序
亲！！我想问问你怎么下载NCBI上的数据库的，有的好大啊！我现在需要microbe的序列，但是那个好像10G，下 了一半又得从头开始下，无语了。能教我一下吗？另外，您是在国内还是国外内？是研究生还是本科生还是工作人员呢？以前发过论文嘛？如果您的发现确实是新的，确实有突破(有可能别人已经发过相似的论文，只不过您不知道而已)，是可以发的。
宏基因组测序能得到菌种组装信息、基因预测结果、物种丰度，功能丰度、耐药基因信息、组间比较差异分析、环境因子关联分析等结果。可以用于医学领域、畜牧领域、农业领域、环境领域、生物能源和特殊极端环境等方面的研究。
发表文章的话，测序基因必须上传测序公司给出的测序结果包含两部分：一是测序结果,二是测序对应的信号波峰,信号主要是反应测序结果的可靠性的.如上图所示,信号很好,那就说明测序没有问题.你可以大胆的进行序列比较,也就是alignment.我用DNAMAN给你演示一下吧 首先依次点击file-open special-AB1/SCF trace 打开扩展名为.ab1的测序图谱,查看没有问题.接下来序列比较：依次点击sequence-alignment-mutiple sequence alignment 出现一个对话框 ,点击file添加扩展名.seq的基因序列----就是你所说的（目的基因序列,野生型和突变型）,选DNA,按提示下一步直到完成.对比结果就出来了.
转录组测序能作为毕业论文。
转录组（transcriptome）广义上指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA；狭义上指所有mRNA的集合。
蛋白质是行使细胞功能的主要承担者，蛋白质组是细胞功能和状态的最直接描述，转录组成为研究基因表达的主要手段，转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必然纽带，转录水平的调控是研究最多的，也是生物体最重要的调控方式。
毕业论文（graduation study）：
按一门课程计，是普通中等专业学校、高等专科学校、本科院校、高等教育自学考试本科及研究生学历专业教育学业的最后一个环节，为对本专业学生集中进行科学研究训练而要求学生在毕业前总结性独立作业、撰写的论文。
群体遗传学最早起源于英国数学家哈迪和德国医学家温伯格于1908年提出的遗传平衡定律。以后，英国数学家费希尔、遗传学家霍尔丹(Haldane JBS)和美国遗传学家赖特(Wright S)等建立了群体遗传学的数学基础及相关计算方法，从而初步形成了群体遗传学理论体系，群体遗传学也逐步发展成为一门独立的学科。群体遗传学是研究生物群体的遗传结构和遗传结构变化规律的科学，它应用数学和统计学的原理和方法研究生物群体中基因频率和基因型频率的变化，以及影响这些变化的环境选择效应、遗传突变作用、迁移及遗传漂变等因素与遗传结构的关系，由此来探讨生物进化的机制并为育种工作提供理论基础。从某种意义上来说， 生物进化就是群体遗传结构持续变化和演变的过程， 因此群体遗传学理论在生物进化机制特别是种内进化机制的研究中有着重要作用。在20世纪60年代以前，群体遗传学主要还只涉及到群体遗传结构短期的变化，这是由于人们的寿命与进化时间相比极为短暂，以至于没有办法探测经过长期进化后群体遗传的遗传变化或者基因的进化变异，只好简单地用短期变化的延续来推测长期进化的过程。而利用大分子序列特别是DNA序列变异来进行群体遗传学研究后，人们可以从数量上精确地推知群体的进化演变， 并可检验以往关于长期进化或遗传系统稳定性推论的可靠程度。同时， 对生物群体中同源大分子序列变异式样的研究也使人们开始重新审视达尔文的以“自然选择”为核心的生物进化学说。20世纪60年代末、70年代初，Kimura、King和Jukes相继提出了中性突变的随机漂变学说: 认为多数大分子的进化变异是选择性中性突变随机固定的结果。此后，分子进化的中性学说得到进一步完善，如Ohno关于复制在进化中的作用假说: 认为进化的发生主要是重复基因获得了新的功能，自然选择只不过是保持基因原有功能的机制；Britten甚至推断几乎所有的人类基因都来自于古老的复制事件。尽管中性学说也存在理论和实验方法的缺陷， 但是它为分子进化的非中性检测提供了必要的理论基础。“选择学说”和“中性进化学说”仍然是分子群体遗传学界讨论的焦点。研究进展于DNA序列变异检测手段的实验分子群体遗传学研究始于1983年， 以Kreitman发表的“黑腹果蝇的乙醇脱氢酶基因位点的核苷酸多态性”一文为标志。以植物为研究对象的实验分子群体遗传学论文最早发表于20世纪90年代初期， 但是由于当时DNA测序费用昂贵等原因， 植物分子群体遗传学最初发展比较缓慢， 随着DNA测序逐渐成为实验室常规的实验技术之一以及基于溯祖理论的各种计算机软件分析程序的开发和应用， 实验分子群体遗传学得到了迅速的发展， 相关研究论文逐年增多， 研究的植物对象主要集中在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.)及重要的农作物如玉米(Zea mays L.)、大麦(Hordeum vulgare L.)， 水稻(Orazy sativa L.)、高粱(Sorghum bicolor L.)、向日葵(Helianthus annuus L.)等上。其研究内容涵盖了群体遗传结构(同源DNA分化式样)、各种进化力量如突变， 重组，连锁不平衡、选择等对遗传结构的影响、群体内基因进化方式(中性或者适应性进化)、群体间的遗传分化及基因流等。同时， 通过对栽培物种与野生祖先种或野生近缘种的DNA多态性比较研究， 分子群体遗传学在研究作物驯化的遗传学原因及结果等也取得了重要的进展， 如作物驯化的遗传瓶颈， 人工选择对驯化基因核苷酸多态性的选择性清除(selective sweep)作用等等。群体遗传学的研究基础是DNA序列变异。同源DNA序列的遗传分化程度是衡量群体遗传结构的主要指标， 其分化式样则是理解群体遗传结构产生和维持的进化内在驱动力诸如遗传突变、重组、基因转换的前提。随着DNA测序越来越快捷便利及分子生物学技术的飞速发展， 越来越多的全基因组序列或者基因序列的测序结果被发表， 基因在物种或群体中的DNA多态性式样也越来越多地被阐明。植物中， 对拟南芥和玉米基因组的DNA多态性的调查最为系统，研究报道也较多。例如， Nordborg等对96个样本组成的拟南芥群体中的876个同源基因片段(0.48 Mbp)的序列单核苷酸多态性进行了调查， 共检测到17 000多个SNP， 大约平均每30 bp就存在1个SNP位点。而Schmid等的研究结果显示: 拟南芥基因组核甘酸多态性平均为0.007( W)。Tenaillon等对22个玉米植株的1号染色体上21个基因共14 420 bp序列的分析结果显示玉米具有较高的DNA多态性(1SNP/27.6 bp、 =0.0096)。Ching等研究显示: 36份玉米优系的18个基因位点的非编码区平均核苷酸多态性为1SNP/31 bp， 编码区平均为1SNP/124 bp， 位点缺矢和插入则主要出现在非编码区。此外， 其他物种如向日葵、马铃薯(Solanum tuberosum)、高粱、火矩松(Pinus taeda L.)、花旗松(Douglas fir)等中部分基因位点的DNA多态性也得到调查， 结果表明不同的物种的DNA多态性存在较大的差异。
北美洞穴里的收获
在美国俄勒冈州古老的佩斯利洞穴里，考古学家们常常会有不错的收获。在洞里的沉积物中，埋藏着大量的石器矛尖、动物骨骼、植物纤维、绳索和兽皮。放射性碳年代测试法表明，它们的年代都非常久远了。2014年，一位名叫艾斯克·威勒斯列夫的丹麦科学家慕名而来，希望在佩斯利洞穴找到一些古骆驼或者古野马的遗骸化石。他正在研究一个在“圈外人士”看来异常深奥难懂的课题——测序远古生物的DNA，即，用科学的方法将遗传物质从有着成千上万年历史的样本中分离出来。
俄勒冈州立大学的丹尼斯·詹金斯教授就是一位“圈外人士”，他作为佩斯利洞穴考古项目的负责人，起初并不太看好威勒斯列夫的工作。詹金斯说道：“我觉得，他（威勒斯列夫）可以来这里考察并撰写论文，但如果他的研究让我不爽，那么我不会允许他带走任何样品。”但最终，威勒斯列夫不仅为哥本哈根大学的实验室带回了古骆驼和古野马的骨头，另外还带回了14块人类粪便的化石。詹金斯后来承认，威勒斯列夫的考古结果让他惊掉了下巴，因为威勒斯列夫从6块粪便化石中提取出了线粒体DNA。这些线粒体DNA显示出粪便的主人属于单倍群A2和B2——本土印第安人的两个主要遗传谱系的起点，它们的年代甚至比北美已知最古老的克洛维斯人还要早1000多年。
很显然，威勒斯列夫的发现会重新校准人们对美洲大陆早期原住居民的认识，这已经不是威勒斯列夫第一次用古代基因重写人类历史了。他已经测序过许多古人类的基因，比如格林兰岛上一个4000岁的古爱斯基摩人、西伯利亚冻土的一个24000岁高龄的小孩以及美国蒙大拿州的一个12000多岁的婴儿。在短短几年里，威勒斯列夫的这些研究解开了人类早期历史中的许多秘密。
探险西伯利亚
威勒斯列夫并不是第一个试图分析古生物遗传物质的人，早在20世纪80年代，这种开创性的研究已经应用在尼安德特人和古埃及木乃伊身上了。但是，威勒斯列夫很小的时候就对远古历史有着一种异常的痴迷，这使他能够在这个竞争愈发激烈的研究领域长期处在前沿的位置。
威勒斯列夫出生于哥本哈根附近的郊区，孩童时期，他常常随着家人到古老森林中做家庭旅行。登山、滑雪、伐木等活动使他对北极探险养成了兴趣，而古代狩猎者的传说又让他迷上了生物学和历史学。威勒斯列夫决定，等到差不多的年龄，自己一定要到更广阔的冻土——西伯利亚探险一番。
进入大学后，威勒斯列夫觉得时机成熟了，他和双胞胎弟弟一起划着一叶扁舟，在西伯利亚的河网旅行，在河床的冻土地带，他见到了一些远古巨型动物的遗骸，比如猛犸象。威勒斯列夫听说，在西伯利亚冻原的北部，生存着神秘的尤卡吉尔人。这些人是一群北极古代人的遗族，以捕猎麋鹿和驼鹿为生，由于他们长期在世界上气候最严酷的地区生活，贫困、侵略和疾病已经将尤卡吉尔人带至了灭绝的边缘。“没人知道他们在哪里，”威勒斯列夫说道，“当时在地图上标有一些村庄，然而我却连他们的影子都没找到。”此后的几年里，威勒斯列夫沿着19世纪人类学家的脚步在西伯利亚苦苦追寻，终于，一位浑身伤疤累累的老猎人将威勒斯列夫带到了尤卡吉尔人的部落。然而，令威勒斯列夫感到有些意外的是，尤卡吉尔人并不是一个完全与世隔绝的孤立部落，事实上，他们几乎所有人的祖先都有俄罗斯人和其他族群的血统，威勒斯列夫也只找到了一个讲尤卡吉尔人当地语言的老人。
复原古人类基因
博士毕业后，威勒斯列夫开始把寻找古人类基因作为重要任务，他希望能够理清诸如尤卡吉尔人祖先的古代人的历史。
2006年，威勒斯列夫和同事来到格陵兰岛，试着从带有被猎杀痕迹的动物骸骨上寻找古代猎人残留的DNA。在一个多月的时间里，威勒斯列夫潜入格陵兰岛的地下，穿上全套防护服，以免污染样本。然而，当他们回到哥本哈根大学并对骸骨进行研究时，却失望地发现其中没有人类的DNA。幸运的是，威勒斯列夫却从另一个意想不到的途径获得了古人类的基因。早在1980年代，科学家已经在格陵兰岛找到了一束4000多年前的毛发。它被完好储存起来，却忘在了地下室。威勒斯列夫随即找到了毛发，从那束毛发中提取了人类DNA，并以强大的新技术重建了古格陵兰人的基因组。这是科学家首次复原出完整的古人类基因组。
通过这束毛发的DNA，威勒斯列夫可以推断出许多信息。比如，这簇头发来自萨卡克文明（古爱斯基摩文明的一种），它的所有者极有可能是一个健壮的男性，拥有黑色的皮肤与褐色的双眼。其中，最有趣的是这束毛发属于一个古爱斯基摩人，而且他并非格陵兰岛现在的居民——因纽特人的直系祖先。分析完此人的基因组之后，威勒斯列夫认为，古爱斯基摩人在大约5000多年前从西伯利亚离开，来到加拿大和格陵兰岛，并在那里生活了几个世纪后灭绝了。古爱斯基摩人并非如今因纽特人的祖先，他们只是被因纽特人取代了。
格陵兰岛古人类基因组给了威勒斯列夫一些新的启发。他原本认为，世界上的主要人种分布在世界不同的地区并且有十分独立的遗传历史。然而，现在他发现，这种想法也许过于简单化，早期人类的迁移历史还有许多秘密需要揭开。
测序“玛尔塔小孩”
和“蒙大拿婴儿”
在首次成功复原出古人类基因组之后，威勒斯列夫继续发表了一系列研究，从很大程度上改变了我们对人类历史的认识。人类起源于20万年前的非洲，然后一批批迁移到世界的各个角落。格陵兰岛的毛发就证明，古人类曾经从西伯利亚来到了北美，然后又穿越北美大陆来到了格陵兰岛。为了进一步理解美洲移民的历史，威勒斯列夫研究了一具埋在西伯利亚东部的古人类骸骨。
这块骸骨样本来自西伯利亚一个名叫玛尔塔的小村庄，被称作“玛尔塔小孩”。威勒斯列夫从这具遗骸中获得了高质量的DNA样本，他测出了小孩的DNA序列。分析结果表明，这个孩子生活在距今2.4万年之前，是个男孩，死时只有4岁。最令他吃惊的是，玛尔塔小孩染色体上的DNA序列更加符合欧洲人的特点，却完全没有找到任何东亚人特有的遗传标记。换句话说，他来自欧洲，同时并不是现代东亚人的祖先。而且，更奇怪的是，玛尔塔小孩的基因组序列和美洲人非常相似，带有大量只有美洲原住民才有的遗传特征。这个结果让威勒斯列夫大吃一惊，因为它和现有的人类学理论完全不同。
随后，威勒斯列夫来到加拿大的蒙大拿州，开始着手测序一个12600岁的婴儿的DNA。这个婴儿名叫Anzick-1，在蒙大拿的一个农场中被发现，是北美大陆有史以来发现的最古老的人类的遗骸，男婴死时约12到18个月大，他与100多件古物同葬，包括鱼叉及鹿角制的工具等，这些古物显示出，男婴遗骸属于北美洲的克洛维斯文化时期。
几十年来，考古学家曾假设北美洲的第一批原住民是克洛维斯人，他们在约1.3万年前于北美洲中西部和西南部留下了大量带有特色的古物。威勒斯列夫的DNA测序结果也证实了这一点，Anzick-1的基因与所有现代土著居民的基因组都显示出密切的亲戚关系，而且Anzick-1显示出自己是属于亚洲人的后裔，而非欧洲人后裔。威勒斯列夫推断，这证明克洛维斯人至少是当今80%甚至100%的本土印第安人的祖先，而且他们的祖先来自亚洲。
新的理论和新的问题
结合了“玛尔塔小孩”和“蒙大拿婴儿”的基因组，威勒斯列夫提出一种新的理论，试图解决北美洲长期以来存在的关于土著居民血统的争论。
此前已有的考古学证据表明，美洲原住民的祖先很可能是在1.5万年以前跨过白令海峡到达美洲大陆的。当时地球正处于冰期，海平面下降导致白令海峡出现了一个陆桥，为迁徙的古人类提供了一条临时通道。此后地球回暖，海平面上升，路桥被淹没，亚洲和美洲又被分开了，直到哥伦布发现美洲大陆才又重新联系上。但是，美国的一些考古学证据与这个理论不相符，比如，美国华盛顿州曾经挖掘出具有欧洲人特征的古人类头盖骨。于是，考古学界又有一个新的理论，认为美洲原住民是欧洲和东亚人混血的结果，但该理论认为欧洲人是跨过大西洋，从东边进入美洲大陆的。
威勒斯列夫的研究结果改进了这个新理论。“玛尔塔小孩”所属的族群虽然来自欧洲，但却为美洲原住民贡献了基因组，同时，大多数印第安人的基因组源自亚洲，但和许多东亚的古老族群又不完全一样。威勒斯列夫认为最可能的解释就是，这个玛尔塔小孩所属的族群最初从欧洲迁徙到西伯利亚，他们在这里遇到了另一支东亚族群，两者发生通婚，大量基因交流融合在一起。随后，这支新的人类族群在1.5万年之前跨过了白令海峡，他们才是美洲原住民的真正祖先。
然而，这里还是有一个问题没有解开——克洛维斯人是最早的美洲土著居民么？威勒斯列夫对佩斯利洞穴粪便化石的分析结果表明，化石中包含着北美大陆最古老的人类基因，距今已有14300年，其年代比克洛维斯人还早1000年。克勒斯列夫认为，克洛维斯人和佩斯利山洞的居民可能都源于第一批从亚洲迁徙来的移民，但他们在何时与何地为何变成了两个不同的族群，目前还是谜题。不过，威勒斯列夫对此并不担心，他表示，我们已经有了探寻历史和真相的新方法——测序远古DNA，这将为我们解答更多的古人类谜题。
本文源自大科技*百科新说2016年第9期杂志文章、欢迎广大读者关注我们大科技的微信号：hdkj1997
人类现在已经完成了对人类基因组最完整的测序，这对于医学领域来说也是非常重要的突破。在此之间，人类都是断断续续的对基因进行测序。
科研人员揭示的完整人类基因组序列，是世界上最复杂的谜题之一，这一研究使得人类第一次看到最完整的、无间隙的DNA碱基基因序列，对于人类了解基因组变异的全谱，以及某些疾病的遗传贡献至关重要，将会推动与癌症、出生缺陷和衰老相关的研究与科学发展。
因为这个难题是科学家一直探索的问题，他的发现对以后的研究有很大的帮助。
次解锁的新训练大约90%来自染色体的着丝粒。在形成精子或卵子的减数分裂过程中，着丝粒是成对染色体分离时附着的地方，这些区域结构独特，包含长段重复序列，而且DNA和蛋白质几乎在这一区域缠绕的格外紧密。在这次发表的一系列成果中，研究人员着重分析了金素中的重复片段，在人类演化遗传多样性的形成以及疾病中的重要作用。
4月16日，百奥智汇创始人、科学顾问张泽民教授在北京大学的课题组与合作者在国际顶级学术期刊《Cell》上发表了题为＂Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Myeloid-Targeted Therapies in Colon Cancer＂的文章，利用单细胞转录组测序技术对结直肠癌患者的肿瘤微环境，特别是浸润髓系细胞类群首次进行了系统性的刻画，同时利用小鼠模型，对anti-CSF1R抑制剂和anti-CD40激动剂两种靶向髓系细胞的免疫治疗策略潜在的作用机理给出了解释。 该研究建立了结合肿瘤患者及小鼠模型的单细胞转录组来研究肿瘤免疫治疗的范例，为人们研究其他疾病中免疫细胞以及开发新的治疗方案提供了思路。对于该研究，上海市免疫学研究所苏冰所长、上海交通大学医学院叶幼琼研究员等相关专家点评道：该工作全面地解析结肠癌的肿瘤微环境细胞图谱，阐明细胞与细胞之间的相互作用，对靶向肿瘤免疫微环境为基础的肿瘤治疗提供了更详细的理论基础，为今后靶定髓系细胞的精准治疗提供助力，具有重要的临床转化意义。 在该研究中，研究者共使用了Smart-seq2、10x 3′ Gene Expression、10x V(D)J + 5′ Gene Expression等 3种单细胞测序技术 ，以及tSNE、UMAP、PCA、RNA velocity、URD、PAGA、STARTRAC、GSVA富集分析、热图、小提琴图、气泡热图、轨迹图、Circos图、火山图、生存分析等 十多种生物信息学分析及展示方法。 值得一提的是， 这些实验技术和分析方法，百奥智汇皆可实现。 下面，百奥我就为大家详细解析，带大家了解这些技术和方法是如何在研究中应用的。 1.10x Genomics和Smart-seq2技术比较 该研究首先评估并比较了10x Genomics和Smart-seq2两种单细胞测序技术的结果。结果显示，与10x scRNA-seq平台相比，Smart-seq2捕获了更多的基因，包括细胞因子，CD分子，配体/受体和转录因子，并且显示出较弱的批次效应 ，从而可以对调节途径进行更深入的分析（图2），而10x平台则获得了更多的分群。因此，作者将两种技术同时使用，从而能够最大化地确定细胞类型或稀有种群的数量，改善细胞聚类的结果，得出更准确的结论。 2.tSNE降维——展示分群、基因表达模式、组织分布等多层信息 该研究使用无监督聚类、PCA、CGA等方法对来自18位CRC患者肿瘤、邻近组织和血液样本的10× 3′ Gene Expression （ 43,817个细胞）和Smart-seq2（10,468）单细胞测序结果进行整合聚类分析，然后用tSNE进行降维展示，分别得到38个和36个群，包括6个内皮细胞群，2个成纤维细胞群，13个髓系细胞群，4个ILC群，18个T细胞群和5个B细胞群等（图3）。对于淋巴细胞，研究通过特异的的免疫球蛋白重链特征基因加以区分（图4）。同时，研究还在tSNE结果中展示了各细胞的组织分布情况（图5）。对于Smart-seq2非免疫细胞的测序结果，该研究利用tSNE将其分为12个亚群，包括4个恶性细胞亚群和8个非恶性细胞亚群（图6）。其中，由推断的拷贝数变异（CNV）定义的恶性细胞表现出高度的基因表达异质性，形成了患者特异性的分群（图7）。 3.热图、气泡热图——展示细胞间基因表达模式的差异 单个tSNE图或组图可展示单个或数个基因在不同细胞群中的表达情况，但在展示多个样本大量基因的全局表达情况时就相对吃力。此时就需要用到热图。而气泡热图则是在热图的基础上加入了基因表达细胞在特定细胞群中占比的信息，从而对细胞群进行更详细的表征。在该研究中，作者用热图展示了10x测序分析得到的38个白细胞群中的差异基因表达差异（图8），以及整合10x和Smart-seq2测序分析得到的48个群的基因表达差异（图9）。研究还分析了13个髓系细胞中的特征基因表达情况（其中9个以气泡热图展示），并据此将它们区分为肥大细胞（hM01），树突状细胞(hM02-04)，单核细胞(hM05-07，hM11)，组织驻留性巨噬细胞（hM08-10）和 肿瘤相关巨噬细胞（TAMs，hM12-13）。 4.扩散图、RNA velocity、URD、PAGA——推断和展示细胞发育轨迹 为进一步探索 TAMs 的来源，该研究利用扩散图中嵌入的RNA velocity对随机选择的单核细胞和巨噬细胞的发育轨迹进行推断和展示，鉴定出了从表达CD14的单核细胞向FCN1+ 单核样细胞和不同的巨噬细胞群体的强烈定向流动（图11），体现二者在发育上的前后顺序。进一步利用URD和PAGA这两种正交算法分析巨噬细胞的转录轨迹，发现巨噬细胞发育成TAMs（图12，图13）。综合上述轨迹推断结果，研究发现TAM主要来自独特的肿瘤浸润性单核样细胞前体。其中， C1QC+ 和 SPP1+ TAM都从浸润肿瘤的单核细胞样前体形成，而 SPP1+ TAM也可能源自 NLRP3+ RTM（图14）。 5.火山图、富集分析、热图、URD图——多角度展示两类TAMs差异 对于两类在发育轨迹上存在显著差异的TAMs，作者进一步使用热图、火山图、富集分析等方法进行了分析，从多角度揭示了它们的差异。由于细胞的发育轨迹受转录调控网络控制，作者先分析了两类TAMs转录因子的表达差异，结果以热图显示。其中，C1QC+ TAMs显示出MAF/MAFB和FOS/JUNS高表达，而PP1+ TAMs则高表达CEBPB和ZEB2。然后，作者又用火山图展示两类TAMs中显著差异表达的基因。该图包含两个维度，其中纵轴P value体现显著性，横轴fold change展示差异性。 结果显示，C1QC+ TAMs显示出补体C1Q、TREM2、MERTK和CD80等基因的高表达， 而SPP1+ TAMs显示出SPP1、MARCO和VEGFA的特异性表达。随后，作者又使用基因集合变异分析（GSVE）分析了两类TAMs在通路上的差异。GSVE是一种以非监督方式对一个群体评估通路活性差异的基因集富集（GSE）分析方法。 该研究的结果显示，SPP1+ TAMs显示出肿瘤血管生成，ECM受体相互作用、肿瘤脉管系统、大肠腺瘤和转移性肝癌等通路的特异性富集，而C1QC+ TAMs则显示出补体激活以及抗原加工和呈递途径的富集（图17）。此外，SPP1 + TAMs还显示了大肠腺瘤和转移性肝癌通路的特异性富集和相关基因的表达（图17和图18），表明在它们CRC中有促癌/促转移作用。 6.相互作用网络图和Circos图——展示细胞间相互作用、受体配体相互作用 更进一步地，作者在CRC中建立了细胞间相互作用网络图。将该研究中的单细胞测序数据集与GTEx、TCGA的组织整体RNA测序数据集进行整合分析，发现TAM和cDC作为预测网络的核心，与其他细胞类型的联系最多（图19，图20）。其中，C1QC+ TAM和两组cDC主要与其他免疫细胞（尤其是T细胞亚群）相互作用（图20），提示其在抗肿瘤T细胞应答中起调节作用。再进一步的细胞群间的受体——配体相互作用分析显示，在与髓系细胞和T细胞有关的配体-受体对中，CXCL10-CXCR3在C1QC + TAM中富集，暗示了C1QC+ TAM具有募集或激活T细胞的潜在作用。而SPP1+ TAMs中富集的SPP1-ITGAV、SDC2-MMP2、FN1-ITGA5等配体-受体对，则暗示了其在可能与某些整合蛋白相互作用，以促进CRC的肿瘤发生。 7.相似性分析、热图——展示跨物种的细胞群相似性 为了将上述对人髓系细胞异质性的研究发现与临床应用相结合，作者接下来将相同的实验和分析方法用于两种对肿瘤免疫治疗的小鼠模型中，其中Renca对CSF1R阻断抗体敏感，而MC38对CD40激动剂抗体敏感（图21）。 作者使用10x Genomics平台对免疫治疗后小鼠的肿瘤中分离出的免疫细胞进行了单细胞转录组测序，并与人髓系细胞群进行了相似性分析，确定了多个跨物种相对应的髓系种群，包括两种cDC群和两种TAM群（图22）。此外，对小鼠TAM群进行与人类TAM群相同的途径分析发现，小鼠TAM群体也基于它们的血管生成，低氧和T细胞相互作用基因特征而分离（图23）。这些数据表明人类CRC患者和小鼠肿瘤模型之间存在功能相似的TAM群体。 8.细胞丰度、生存分析——体现不同细胞类群的抗药性 进一步的耐药性研究显示，抗CSF1R治疗后F4/80高表达的巨噬细胞优先减少（图24），说明不同的巨噬细胞群体对抗CSF1R治疗的敏感性不同。同时，治疗后小鼠细胞群中mC12和mM14簇几乎完全丢失，TAM簇mM11，mM13和mM15的减少最小（图24），说明TAMs对CSF1R阻断的治疗具有抗性。同时，抗CSF1R的TAM亚群优先表达参与血管生成和免疫抑制的基因，如Vegfa，Cd274和Arg1。为了将在小鼠中的发现与人类CRC相关联，作者使用生存分析比较了具有不同水平C1QC+ TAM和SPP1+ TAM基因特征患者的生存率，发现低C1QC+ TAM、高SPP1 +TAM组合与CRC患者的预后更差相关（图26）。 这些发现表明，抗CSF1R治疗可能不足以耗尽所有具有促进肿瘤生长潜力的巨噬细胞，这一特性可能是其单药疗效差的原因。类似的分析应用于抗CD40治疗则发现，抗CD40治疗能够激活cDC1细胞，CCL22等激活的基因特征与CRC患者的总体生存期呈正相关（图27），这可能部分解释了抗CD40激动剂治疗CRC的机制。 9.STARTRAC——分析T细胞的迁移、克隆扩增和发育转变 众所周知，T细胞在肿瘤免疫治疗中发挥重要作用。为进一步探索抗CD40激动剂治疗CRC的机制，作者基于TCRα和β链序列，应用STARTRAC算法分析抗CD40治疗后T细胞的迁移、克隆扩增和发育转变，以了解抗CD40激动剂治疗对肿瘤浸润性T细胞功能的影响。结果显示，抗CD40激动剂治疗后，Ccl5+ Tem CD8+ T细胞具有比其他CD8+ T细胞亚群更高的迁移指数（图28）。进一步剖析Ccl5+ Tem亚群内的TCR克隆型表明，克隆扩增较高的细胞在肿瘤和肿瘤引流淋巴结之间表现出更多的TCR共享，表明这些细胞在抗CD40处理后具有更强的迁移能力（图29）。同时，Ccl5+ Tem和Cxcr6+ Trm CD8+ T细胞之间的过渡指数在基线时显着高于CD8+ T细胞亚群中其他对的过渡指数，表明某些Cxcr6+ 肿瘤中的Trm细胞可能在某一过程中由浸润的Ccl5+ Tem细胞发育转变而来，这一过程在抗CD40治疗后得到了进一步增强（图30）。 这些数据表明，抗CD40治疗对肿瘤浸润性T细胞的扩增，迁移和发育转变具有独特影响，能够加强Ccl5+ Tem的迁移和克隆扩增能力，及其向Cxcr6+ Trm CD8+ T细胞转变的能力。 10.相关性分析——揭示细胞间存在相互作用 在研究中作者发现，Th1类细胞与成熟和未成熟的cDC1细胞均显示正相关，表明这两类细胞之间存在相互作用。在此基础上，结合该研究中发现的Bhlhe40 + Th1类细胞在抗CD40治疗后的占比以及特异性扩增、Bhlhe40 + CD4 + T细胞能够产生更多IFNγ，以及之前研究发现的表达IFNG的BHLHE40 + Th1样细胞富集于MSI CRC患者人群中且显示出对ICB治疗的良好反应等结果，作者认为抗CD40治疗导致增加的Bhlhe40 + Th1样细胞可能为在该模型中CD40激动剂治疗能够成功与抗PD1协同的机制提供了解释。 总的来说，该研究的思路是： 先通过单细胞转录组、免疫组测序等技术，对CRC患者的肿瘤微环境进行细胞分群、基因差异表达、细胞发育轨迹、细胞间相互作用等多水平、多维度的详细表征，发现了肿瘤浸润髓系细胞类群中两类特殊的细胞类群TAM和cDC可能在CRC的抗肿瘤T细胞应答、肿瘤发生等过程起调节作用。然后利用小鼠模型，将上述发现应用于对anti-CSF1R抑制剂和anti-CD40激动剂两种靶向髓系细胞的免疫治疗策略的潜在作用机理的解释中。 参考文献： Lei Z. et al., Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Myeloid-Targeted Therapies in Colon Cancer. Cell . 2020.
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